广东林业科技 2004年第20卷第2期51
用HPLC 测定松墨天牛体内的保幼激素
钱明惠1,2 范军祥1 秦长生1
(1. 广东省林业科学研究院 广州 510520; 2. 华南农业大学昆虫学系) Ξ
摘要 用反相高效液相色谱法检测了松墨天牛1～5龄幼虫、蛹和成虫体内的保幼激素(J H ) 滴度, 检测到J H3和J H2, 未检测到J H1。松墨天牛体内的J H3及J H2滴度变化随虫龄的增大而呈下降趋势,5龄幼虫的滴度最小, 与蛹和成虫含量接近。
关键词 松墨天牛 保幼激素 HPLC 滴度
松墨天牛(Monocham us alternat us Hope ) 是松材线虫B ) 的主要媒介昆虫, 它传播的松材线虫病是松树的一种毁灭性病害H ) 是一类高萜烯类化合物, 它由昆虫的咽侧体分泌, J H 在昆虫体内含量甚微, , J H 的滴度很困难。昆虫体内的保幼激素滴度的测定, mellonella ) 蛹或黄粉甲(Tenebrio moliter ) 蛹生物测定的方法。, 以后发展到用气相色谱(MS ) 分析, 现在已有运用高效液相(HPLC ) 、气质联谱() 、核磁共振(NMR ) 及放射免疫(RIA ) 等多种分析测定方法的报道[1～4]。为探讨J H 对松墨天牛的生理调控机制, 为其防治提供理论基础, 本实验用反相高效液相色谱法(RP 2HPLC , Re 2versed 2Phase High Performance Liquid Chromatography ) 分别测定了松墨天牛1～5龄幼虫、蛹和雌、雄成虫的J H 滴度(J H titre ) 。
1 材料和方法
1. 1 供试虫源
松墨天牛取自东莞莲花山庄和广东省林科院后山的松材线虫病死松树上。
1. 2 试剂
J H1、J H2、J H3标准样品为捷克Sci Tech 公司的产品。甲醇、正已烷、乙醚均为国产分析纯试剂, 经室内重蒸后使用。
1. 3 仪器及色谱条件
仪器:美国HP 公司Agilent 21100型高效液相色谱仪, 德国Eppendorf 5415R 和5415C 离心机, 上海新芝生物技术研究所的J Y922II 超声波细胞破碎仪。色谱条件:美国250. 0mm ×4. 6mm Restek C 18柱, 流动相
μ为甲醇∶水(68∶32) , 流速1ml/min , 紫外检测λ=218nm , 进样量10l , 以峰面积定量。
1. 4 样品制备
将松墨天牛1,2,3,4,5龄幼虫、蛹和雌、雄成虫各1头称重量后, 分别置于玻璃匀浆器中, 根据重量分别加入提取液(甲醇∶乙醚=1∶1) 1～4ml 匀浆, 然后用超声波破碎仪振荡3～5min , 加入2ml 已烷, 再超声振荡10min 后以4000r/min 离心10min 取上清液。用已烷反复提取5次, 汇总上清液, 上机前用高纯N 2吹干, 用流动相定容。
2 结果与分析
2. 1 全过程标准回收率结果
取一定量的J H 标准样品于提取液中, 进行全过程提取处理, 最后测得的全过程标准回收率,J H1、J H2、J H3分别是89. 2%,87. 6%,91. 7%。标样上机检测结果(见图1A ) 表明,3种标样分离效果很好, 且出峰稳定, 回收率也较高, 本实验采用的检测条件可用于J H 滴度的测定。
Ξ广东省自然科学基金项目(034002) 。
A. 标准保幼激素; B. 3龄幼虫保幼激素; C. 4龄幼虫保幼激素; D. 5龄幼虫保幼激素; E. 雌成虫保幼激素
图1 标样及部分样品的HPLC 色谱图
2. 2 松墨天牛体内保幼激素滴度测定
分别测定了1～5龄松墨天牛幼虫、蛹和雌、雄成虫提取液中J H 的含量, 结果见表1, 图1。
表1 松墨天牛各龄幼虫、蛹和成虫的J H 滴度
虫态
1龄幼虫
2龄幼虫
3龄幼虫
4龄幼虫
5龄幼虫J H3(X ±SD ) (ng/mg ) 8. 96±1. 046. 42±0. 744. 52±0. 892. 63±0. 141. 62±0. 33
1. 80±0. 59
1. 83±0. 80
1. 79±0. 70J H2(X ±SD ) (ng/mg ) 96. 18±11. 9452. 04±16. 5932. 21±28. 4029. 24±11. 2320. 29±4. 8923. 77±6. 8423. 93±10. 5722. 56±2. 33蛹雌虫雄虫
高效液相色谱检测器的检测结果表明:J J H2势, 即1龄幼虫J H 滴度最大,5龄幼虫J H 。各样品的保留时间与标准样本的保留时间一致, 多次重复实验检测结果, , 未检测到J H1, 说明用HPLC 测定松墨天牛体内J H 的方法具相对的稳定性, J H2、J H3的结论相符[5]。
参考文献
1 杨亦桦, 戴华国, 韩航如等. 用HPLC 测定稻褐飞虱体内的保幼激素. 华东昆虫学报,1997(2) :24～27
2 唐健, 平霄飞, 汤富彬等. 用气质联谱测定褐飞虱体内的保幼激素. 中国水稻科学,2001,15(2) :142～144
3 欧阳迎春, 李胜. 保幼激素及其代谢产物的HPLC 分离方法的改进和应用. 昆虫学报,2003,46(3) :282～287
4 Steiner B. , Wilhelm R. P. , Burgin C. G et al. Titres of juvenile hormone Ⅰ, Ⅱand Ⅲin S podoptera littoralis (Noctuidae ) from the egg to the pupal moult and their modification by the egg 2larval parasitoid Chelonus inanitus (Braconidae ) . Journal of In 2sect Physiology , 1999, 45:401～413
5 特纳,R. B. 昆虫分析生物化学. 北京:科学出版社,1984
Titres of Juvenile H ormone in Monochamus alternatus (H ope) by HPLC
Qian Minghui 1,2 Fan J unxiang 1 Qin Changsheng 1
(1. Guangdong Forest Research Institute , Guangzhou , 510520; 2. S outh China Agricultural University )
Abstract The titres of juvenile hormone in Monocham us alternat us (Hope ) from 1st instar larvae to adult are measured by HPLC. The results showed that J H Ⅱ, J H Ⅲwere found and J H Ⅰwasn ’t. Titres of J Hs decreased from 1st to 5th instar larvae. Titres fluctuated in a similar manner in 5th instar larvae , pupae , male and female adult.
K ey w ords Monocham us alternat us , juvenile hormone , HPLC , titre
广东林业科技 2004年第20卷第2期51
用HPLC 测定松墨天牛体内的保幼激素
钱明惠1,2 范军祥1 秦长生1
(1. 广东省林业科学研究院 广州 510520; 2. 华南农业大学昆虫学系) Ξ
摘要 用反相高效液相色谱法检测了松墨天牛1～5龄幼虫、蛹和成虫体内的保幼激素(J H ) 滴度, 检测到J H3和J H2, 未检测到J H1。松墨天牛体内的J H3及J H2滴度变化随虫龄的增大而呈下降趋势,5龄幼虫的滴度最小, 与蛹和成虫含量接近。
关键词 松墨天牛 保幼激素 HPLC 滴度
松墨天牛(Monocham us alternat us Hope ) 是松材线虫B ) 的主要媒介昆虫, 它传播的松材线虫病是松树的一种毁灭性病害H ) 是一类高萜烯类化合物, 它由昆虫的咽侧体分泌, J H 在昆虫体内含量甚微, , J H 的滴度很困难。昆虫体内的保幼激素滴度的测定, mellonella ) 蛹或黄粉甲(Tenebrio moliter ) 蛹生物测定的方法。, 以后发展到用气相色谱(MS ) 分析, 现在已有运用高效液相(HPLC ) 、气质联谱() 、核磁共振(NMR ) 及放射免疫(RIA ) 等多种分析测定方法的报道[1～4]。为探讨J H 对松墨天牛的生理调控机制, 为其防治提供理论基础, 本实验用反相高效液相色谱法(RP 2HPLC , Re 2versed 2Phase High Performance Liquid Chromatography ) 分别测定了松墨天牛1～5龄幼虫、蛹和雌、雄成虫的J H 滴度(J H titre ) 。
1 材料和方法
1. 1 供试虫源
松墨天牛取自东莞莲花山庄和广东省林科院后山的松材线虫病死松树上。
1. 2 试剂
J H1、J H2、J H3标准样品为捷克Sci Tech 公司的产品。甲醇、正已烷、乙醚均为国产分析纯试剂, 经室内重蒸后使用。
1. 3 仪器及色谱条件
仪器:美国HP 公司Agilent 21100型高效液相色谱仪, 德国Eppendorf 5415R 和5415C 离心机, 上海新芝生物技术研究所的J Y922II 超声波细胞破碎仪。色谱条件:美国250. 0mm ×4. 6mm Restek C 18柱, 流动相
μ为甲醇∶水(68∶32) , 流速1ml/min , 紫外检测λ=218nm , 进样量10l , 以峰面积定量。
1. 4 样品制备
将松墨天牛1,2,3,4,5龄幼虫、蛹和雌、雄成虫各1头称重量后, 分别置于玻璃匀浆器中, 根据重量分别加入提取液(甲醇∶乙醚=1∶1) 1～4ml 匀浆, 然后用超声波破碎仪振荡3～5min , 加入2ml 已烷, 再超声振荡10min 后以4000r/min 离心10min 取上清液。用已烷反复提取5次, 汇总上清液, 上机前用高纯N 2吹干, 用流动相定容。
2 结果与分析
2. 1 全过程标准回收率结果
取一定量的J H 标准样品于提取液中, 进行全过程提取处理, 最后测得的全过程标准回收率,J H1、J H2、J H3分别是89. 2%,87. 6%,91. 7%。标样上机检测结果(见图1A ) 表明,3种标样分离效果很好, 且出峰稳定, 回收率也较高, 本实验采用的检测条件可用于J H 滴度的测定。
Ξ广东省自然科学基金项目(034002) 。
A. 标准保幼激素; B. 3龄幼虫保幼激素; C. 4龄幼虫保幼激素; D. 5龄幼虫保幼激素; E. 雌成虫保幼激素
图1 标样及部分样品的HPLC 色谱图
2. 2 松墨天牛体内保幼激素滴度测定
分别测定了1～5龄松墨天牛幼虫、蛹和雌、雄成虫提取液中J H 的含量, 结果见表1, 图1。
表1 松墨天牛各龄幼虫、蛹和成虫的J H 滴度
虫态
1龄幼虫
2龄幼虫
3龄幼虫
4龄幼虫
5龄幼虫J H3(X ±SD ) (ng/mg ) 8. 96±1. 046. 42±0. 744. 52±0. 892. 63±0. 141. 62±0. 33
1. 80±0. 59
1. 83±0. 80
1. 79±0. 70J H2(X ±SD ) (ng/mg ) 96. 18±11. 9452. 04±16. 5932. 21±28. 4029. 24±11. 2320. 29±4. 8923. 77±6. 8423. 93±10. 5722. 56±2. 33蛹雌虫雄虫
高效液相色谱检测器的检测结果表明:J J H2势, 即1龄幼虫J H 滴度最大,5龄幼虫J H 。各样品的保留时间与标准样本的保留时间一致, 多次重复实验检测结果, , 未检测到J H1, 说明用HPLC 测定松墨天牛体内J H 的方法具相对的稳定性, J H2、J H3的结论相符[5]。
参考文献
1 杨亦桦, 戴华国, 韩航如等. 用HPLC 测定稻褐飞虱体内的保幼激素. 华东昆虫学报,1997(2) :24～27
2 唐健, 平霄飞, 汤富彬等. 用气质联谱测定褐飞虱体内的保幼激素. 中国水稻科学,2001,15(2) :142～144
3 欧阳迎春, 李胜. 保幼激素及其代谢产物的HPLC 分离方法的改进和应用. 昆虫学报,2003,46(3) :282～287
4 Steiner B. , Wilhelm R. P. , Burgin C. G et al. Titres of juvenile hormone Ⅰ, Ⅱand Ⅲin S podoptera littoralis (Noctuidae ) from the egg to the pupal moult and their modification by the egg 2larval parasitoid Chelonus inanitus (Braconidae ) . Journal of In 2sect Physiology , 1999, 45:401～413
5 特纳,R. B. 昆虫分析生物化学. 北京:科学出版社,1984
Titres of Juvenile H ormone in Monochamus alternatus (H ope) by HPLC
Qian Minghui 1,2 Fan J unxiang 1 Qin Changsheng 1
(1. Guangdong Forest Research Institute , Guangzhou , 510520; 2. S outh China Agricultural University )
Abstract The titres of juvenile hormone in Monocham us alternat us (Hope ) from 1st instar larvae to adult are measured by HPLC. The results showed that J H Ⅱ, J H Ⅲwere found and J H Ⅰwasn ’t. Titres of J Hs decreased from 1st to 5th instar larvae. Titres fluctuated in a similar manner in 5th instar larvae , pupae , male and female adult.
K ey w ords Monocham us alternat us , juvenile hormone , HPLC , titre