昆虫学报Acta Entomologica Sinica , March 2007, 50(3) :222-233ISS N 045426296
家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PCR 2D GGE
和16S rD NA 文库序列分析
相 辉, 李木旺
1
1,3
, 赵 勇, 赵立平, 张月华, 黄勇平
2231, 3
(11中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所, 上海 200032; 21上海交通大学生命科学与技术学院生物技术系, 上海 200240;
31中国农业科学院蚕业研究所, 江苏镇江 212018)
摘要:采用基于16S rDNA 的变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient , ) 文库序列分析的手段, 研究了重要经济昆虫家蚕Bombyx mori 2SC N2幼虫中肠内的细菌群落多样性, 文库序列分析表明,PCR 扩增得到的16S
rDNA (phylotype ) , 大多数属于Proteobacteria , 其次是Lactobacillales 。
此外, 2、Bacillales 、Clostridiales 和Actinobacteria , 尚有5种系统发育型不能确定其所属类型。2, 肠球菌属Enterococcus 是其中肠细菌的优势菌群, 栖热菌属Thermus 是次优势菌群。优势菌肠球菌属的组成在品系和不同食料喂养条件下有着一定的变化, 无桑饲料喂养条件下SC N2品系中肠内还出现了新的次优势菌葡萄球菌(Staphylococcus ) 。DGGE 图谱显示家蚕低龄幼虫和高龄幼虫肠道细菌格局存在差异, 推测可能与其发育期生理状态的差异有关。本研究结果提示家蚕肠道特殊菌群的出现可能与其特殊的食性有一定的关系, 食料改变、生长受阻后肠道微生态平衡也发生变化。
关键词:家蚕; 专食性; 广食性; 中肠细菌; 变性梯度凝胶电泳; 16S rDNA 文库分析中图分类号:Q96811 文献标识码:A 文章编号:045426296(2007) 0320222212
B acterial community in midguts of the silkw orm larvae estimated by PCR Π
D GGE and 16S rD NA gene library analysis
XI ANG Hui , LI Mu 2Wang
1
1,3
, ZH AO Y ong , ZH AO Li 2Ping , ZH ANG Y ue 2Hua , H UANG Y ong 2Ping
2231, 3
(11Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology , Shanghai Institutes for Biological Sciences , Chinese Academy of Sciences , Shanghai 200032, China ; 21Department of Biotechnology , Shanghai Jiao T ong University , Shanghai 200240, China ; 31Sericultural Research Institute , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Zhenjiang , Jiangsu 212018, China )
Abstract :We inventoried the bacteria community and the effects of diet on bacterial com position in larval midguts of tw o strains (the m onophag ous C108and the polyphag ous SC N2) of the silkw orm , Bombyx mori L. , an economically im portant insect , using 16S PCR 2DGGE and clone libraries. DNA sequence analysis indicated that the PCR 2am plified 16S rDNA genes represented 41phylotypes of bacteria. M ost of them belonged to the Proteobacteria and Lactobacillales , whereas less dominant taxa including members of the Deinococcus 2Thermus , Bacillales , Clostridiales and Actinobacteria were als o found in the midgut bacterial community. Phylotypes of Enterococcus were the m ost dominant group in both strains tested , followed by Thermus . Bacterial com position or population structure of Enterococcus varied between the tw o strains and in the same strain fed with different diets. Especially , when strain SC N2was fed with mulberry 2free artificial diet , a midgut phylotype belonging to Staphylococcus appeared with a fairly high proportion. DGGE profiles dem onstrated that there were differences in the bacterial pattern between y oung and old larvae. This might be
基金项目:国家重点基础研究发展规划“973”项目(2005C B121000)
作者简介:相辉, 女,1978年7月生, 陕西人, 博士研究生, 从事昆虫发育及肠道微生物研究,E 2mail :xhui @sippe.ac. cn 3通讯作者Author for correspondence , E 2mail :y ongping @sippe.ac. cn 收稿日期Received :2006205212; 接受日期Accepted :2006208230
3期相 辉等:家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PCR 2DGGE 和16S rDNA 文库序列分析
223
related with the differences of physiology between the tw o developmental stages. The results suggested that the appearance of special bacteria might ass ociate with the special phagy of the silkw orm , and un fit diet might destroy the balance of midgut microbiota to block normal growth of the silkw orm.
K ey w ords :Bombyx mori ; m onophag ous ; polyphag ous ; midgut bacteria ; DGGE ; 16S rDNA libraries
昆虫肠道中栖居着大量的微生物, 构成了肠道的
微生态体系。微生物对昆虫的生长和发育起着重要作用, 如可能参与昆虫的消化、营养吸收、繁殖(Cam pbell , 1989) , 甚至信息素的合成(Brand et al . , 1975; Dillon et al . , 2002) , 同时还间接抵抗病原微生物的侵袭(Dillon et al . , 2005) 。相对于哺乳动物, 昆虫与其肠道微生物共生关系的研究刚刚起步, (Brune and , ; D ouglas et al . , al . , 2003) 和重要农业害虫蝗虫(Dillon and Charnley , 2002) , 而对其他种类昆虫的肠道微生物的研究则很少。鳞翅目是昆虫纲的一个重要类群, 已有的研究表明鳞翅目昆虫的肠道内栖息着相当数量的微生物类群(McK illip et al . , 1997; Broderick et al . , 2004) , 这些微生物对于该类昆虫的营养和代谢同样起着重要的作用。
T akizawa 和Iizuka (1968) 在早期有过一些针对鳞翅目家蚕的肠道微生物的研究报道。国内研究者曾采用传统的培养手段初步调查了家蚕肠道微生物种类(马文石,1982; 李蒙英等,2000) 。已经发现的家蚕肠道主要菌群有肠球菌Enterococcus spp. 、葡萄球菌Staphylococcus spp. 、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae 和腊样芽孢杆菌Bacillus cereus (T akizawa and Iizuka , 1968; 李蒙英等,2000) 。张剑飞等(2002) 的研究发现了丰富的细菌种类和动态变化, 其中微球菌Micrococcus spp. 和芽孢杆菌Bacillus spp. 占优势。从这些研究中可以看出, 虽然人们对家蚕肠道细菌有一定的认识, 但可能是由于蚕种质资源及其肠道细菌的多样性或者研究手段的差异, 目前尚没有较为一致的意见。
由于细菌自身的特点, 使得研究昆虫与其肠道细菌相互关系变得复杂。因为很多种细菌无法培养, 传统的依靠培养手段应用于细菌菌落结构研究往往有很大的局限性(Vaughan et al . , 2000) 。基于原核生物的16S rDNA 的分子生物学技术的应用, 如利用核糖体16S rDNA 作为分子标记的变性梯度电泳(denaturing gradient gel electrophoresis , DGGE ) (Muyzer et al . , 1998) 以及文库(clone libraries ) 序列分析(Ohkuma and K udo , 1996) 为发现和区分无法培
养的微生物提供了手段。16S rDNA 存在于所有原核生物细胞中, 被广泛用于细菌的系统学研究(Schmidt and Relman , 1994) , 是细菌种类鉴定的一个重要参考依据, 已经应用在一些昆虫肠道微生物多(Rees on et , ; Broderick et al . , 。由于对其营养利, 对养蚕业中的生产率低、叶丝转化率低、蚕病发生率高等问题还难以提出有效的解决方案, 我国每年因蚕病损失的茧量达10%以上。研究家蚕肠道微生物体系来指导提高饲料利用率、培育广食性品种、增强抗病品种选育等, 已成为蚕业生产的发展方向之一。
本研究采用核糖体16S rDNA 作为分子标记的变性梯度电泳以及文库序列分析这两种分子生物学手段, 对不同饲料喂养条件下家蚕两种食性范围差异较大品系的肠道细菌区系进行了研究, 试图探讨肠道细菌与家蚕食性可能的联系以及食料对其肠道微生态结构可能的影响, 进而为家蚕品种改良和疾病防治提供理论依据。
1 材料和方法
111 供试家蚕品系及饲养方法
供试家蚕为专食性品系C108和选育出的广食性品系SC N2。蚕卵由中国农科院镇江蚕业研究所提供。专食性品系C108食性较为单一, 主要食桑叶和含桑饲料, 但食含桑饲料时生长较慢, 食无桑饲料时蚁蚕死亡率达100%; 广食性品系SC N2食性相对较宽, 主食桑叶和含桑饲料的同时也能忍受无桑饲料, 食含桑饲料时生长减慢, 食无桑饲料时死亡率较高, 生长极为缓慢(表1) 。蚕卵在25℃培养箱中孵育。经催青孵化后, 蚁蚕按照如下方式喂养:C108蚁蚕分为2组:桑叶组, 以新鲜桑叶在紫外光下消毒10min 后喂养; 含桑饲料组, 用含有桑叶粉的无菌饲料喂养。SC N2蚁蚕分为3组:桑叶组及含桑饲料组处理方法同前; 无桑饲料组, 以不含桑叶粉的饲料喂养。桑叶及饲料均由中国农科院镇江蚕业研究所提供。
224昆虫学报Acta Entomologica Sinica 50卷
表1 家蚕2个品系幼虫在不同饲料喂养条件下的体重(n =10, 平均值±标准差)
家蚕品系
S train C108
食料类型
T ype of diet
体重Body weight (kg ) (×10-3)
3龄3rd instar 0105±01010103±0101330107±01010105±0101330133
5龄5th instar 0167±01080123±0105331107±01100168±01113315±010733
桑叶Mulberry leaves 含桑饲料Artificial diet
(containing mulberry powder )
SCN2桑叶Mulberry leaves 含桑饲料Artificial diet
(containing mulberry powder )
无桑饲料Artificial diet
(mulberry free )
注N otes :部分家蚕到4龄已出现严重的生长停滞, 5stopped growing at the 4th instar and many of them died before getting into the 5th :
龄第2天时, 各取5头, 无菌操作条件下解剖出中肠, 仔细取出并抛弃中肠内含物, 在无菌水中缓慢清洗后放入一个灭菌的2m L 离心管中, -20℃条件下保存以便用于DNA 的
个循环降低1℃, 其他条件不变; 最后15个循环退火温度为55℃, 其他条件不变; 72℃延伸10min 。
PCR 产物经过一次扩增(95℃015min , 50℃015min , 72℃1min , 循环3次; 72℃延伸10min )
提取。长到5龄2～3天时, 以同样的方法取样和保存。总DNA 的提取参考Lau 等(2002) 的方法, 溶于200μL 无菌去离子水中, 以分光光度计(E ppendorf )
后, 用PCR 产物纯化试剂盒(申能博彩) 纯化。114 16S rDNA 文库的构建及序列分析
测定浓度。113 PCR 扩增
) 用引物27f (5′2AG AG TTTG AT CCTGG CT C AG 23′(Edwards et al . , 1989) 和1492r (5′2T ACGGY T ) (Weisburg et al . , 1991) 扩ACCTTG TT ACG ACTT 23′
对5龄各个处理组的16S rDNA PCR 产物构建
文库。已纯化的16S 全长PCR 产物(115kb 左右) 连接到pMD182T 载体(T aK aRa ) 后转入大肠杆菌E .
coli 。每个文库至少挑取95个阳性克隆, 以m13通
增家蚕中肠的16S rDNA 以构建文库。25μL PCR 反应体系中包含:DNA 模板5μL , 引物(10μL Πm L ) 各015μL , dNTPs (10mm ol Πm L ) 015μL , 10×T aq PCR
2+
reaction bu ffer (含Mg ) 215μL 和015U 的Ex T aq
用引物扩增得到的产物(115kb 左右, 约80ng ) , 用
af a Ⅰ和Hin f Ⅰ(T aK aRa ) 两种限制性内切酶37℃消化4h 左右, 酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测, 得到所有克隆的限制性酶切图谱。根据该图谱分别对每一个文库中的所有克隆进行分型, 每一种类型即是分类操作单位(operational tax onomic unit ,OT U ) (M oyer et al . , 1996) 。属于同一个OT U 的克隆即使
DNA 聚合酶(T aK aRa ) 。PCR 反应在PCR 仪(TECH NE , Flexigene ) 上进行。扩增程序为:95℃预
变性115min ; 95℃015min , 60℃015min , 72℃3min , 循环5次; 95℃015min ,55℃015min ,72℃3min , 循环5次; 95℃015min , 50℃015min , 72℃3min , 循环25次; 72℃延伸10min 。
DGGE 的16S rDNA V3区扩增所用的引物为:343f
(5′) 和534r 2ACT CCT ACGGG AGG C AG C AG 23′
et
al . ,
不是完全一样, 也在系统分类学上非常接近(M oyer
et al . , 1996) , 所以我们选一个代表进行测序。5个处理进行测序的样品数分别为:C108桑叶组, 27; C108含桑饲料组, 24; SC N2桑叶组, 31; SC N2含桑
饲料组, 14; SC N2无桑饲料组, 31。某一种系统发育型的克隆数占该文库所有克隆数的比例作为该系统发育型的相对丰度。
用Chromas V. 2123(T echnelysium ) 软件对测序结果进行扫描和处理。对从16S rDNA 第27碱基处开始, 包含V3区的前550bp 的有效序列信息, 在NC BI
(5′) (Nakatsu 2ATT ACCG CGG CTG CTGG 23′
2000) 。在正向引物的5′端加入一段称作“G C 钳”的
富含G C 的序列(5′2CG CCCG CCG CG CG CGG CGGG C
) 以提高PCR 产物在进GGGG CGGGGG CCCGGGGG 23′行变性梯度电泳时的稳定性。PCR 反应体系同前。
3期相 辉等:家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PCR 2DGGE 和16S rDNA 文库序列分析
225
数据库(http :ΠΠw w w. ncbi. nlm. nih. g ov ΠBLAST ) 中进行
比对, 寻找同源性最高的序列。同源性以一致序列所占的百分比(identity ) 作为标准。
用S orens on πs 成对相似性系数(Cs ) 比较不同处理组间中肠细菌群落的相似性。我们以属水平进行比较, Cs =0表示两种处理组肠道细菌菌落没有相同的属, Cs =100表示两种处理组肠道细菌菌落拥有完全相同的属。
(a +b ) ]×100。Cs =[2j Π
公式中, a 表示细菌群落a 中所有的属数, b 表示细菌群落b 中所有的属数, j 表示a , b 群落中公有的属数。115 变性梯度凝胶电泳(D 采用Bio 2A ) 8(W ΠV ) , %(100%=7mm ol ΠL 尿素和40%去离子甲酰胺[VΠV ]) 的聚丙烯酰胺变性胶(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=3715∶1,W ΠW ) 对16S rDNA V3区扩增片段(200bp 左右) 进行DGGE 分析。PCR 产物经浓缩后加入2μL 6×载样缓冲液(T aK aRa ) , 在Bio 2Rad D 2code 系统中,60℃, 200V 电压下电泳4h 。电泳结束后用SY BR 2I 染色剂(BMA ) 染色30min 后在凝胶成像系统(天能) 中
体16S rDNA 不在统计范围内) 。41种系统发育型中大多数属于Proteobacteria , 其中属于Alpha Proteobacteria 的有8种, Beta Proteobacteria 10种, G amma Proteobacteria 3种。Lactobacillales 也是一个优势类群, 属于它的系统发育型有9种。此外, 属于Deinococcus 2Thermus 、Bacillales 、Clostridiales
和
Actinobacteria 的系统发育型分别有2种、1种、1种和2种, 另外还有5种不能确定其所属类型。家蚕的这2个品系中, 肠球菌属是中肠细菌的优势菌群, 72%(表3) , 最低(4) (不在统计范, 所占比例%(桑叶叶绿体16S rDNA 不在统计范围内) , 最低为4132%(表3) 。
优势菌群肠球菌属Enterococcus 中, 种类多样性较为丰富, 所比对到的序列一致性较高的种类有E . mundtii , E . casseliflavus , E . gallinarum 和E . saccharolyticus , 并且这4种属于优势种; 而E . dispar , E . canintestini 和E . sp. 所占比例很低, 分别为0162%,3109%和0162%(表4) 。
栖热菌属Thermus 中, 比对到的主要是Thermus scotoductus (原始数据未显示) , 对这些系统发育型进行完整测序, 序列一致性≥99%。测序结果已被美国G enBank 数据库收录, 登录号为DQ861411, 在390和417bp 处出现单核苷酸多态, 在197bp 处碱基为胞嘧啶C , 而不是Thermus scotoductus 的胸腺嘧啶T; 在954bp 处碱基为腺嘌呤A , 而不是Thermus scotoductus 的鸟嘌呤G 。212 2个品系中肠道细菌的比较及食料对肠道细菌群落结构的影响
从表3中可以看出, 属水平上2个品系的肠道优势菌组成相似。其中占据优势的都是肠球菌Enterococcus , 而次优势菌也都是栖热菌Thermus (表3) 。然而, 肠球菌属在2个品系肠道中呈现出较为丰富的多样性, 并且食料的差异对于肠球菌优势种类的组成有较为明显的影响(表4) 。同食桑叶时, C108品系肠道优势菌为E . mundtii 的系统发育型,
成像。用消毒的手术刀割下目的条带, 置于115m L 离心管中, 加入30μL 无菌去离子水, 用灭菌牙签仔细捣碎胶条,4℃放置过夜后, 取5μL 作为模板, 用前述343f 和534r 引物进行PCR 反应(95℃015min ,50℃015min ,72℃1min , 循环10次; 72℃延伸10min ) 。用纯化试剂盒(申能博彩) 纯化产物后连
接到pMD182T 载体(T aK aRa ) , 转化入大肠杆菌。克隆经m13通用引物检测后, 每个条带随机挑选3个阳性克隆测序。
用Chromas V. 2123(T echnelysium ) 软件对测序结果进行扫描和处理。对从16S rDNA 第343bp 处开始,V3区的200bp 左右的有效序列信息, 在NC BI 数据库(http :ΠΠw w w. ncbi. nlm. nih. g ov ΠBLAST ) 中进行比对, 寻找同源性最高的序列。同源性以一致序列所占的百分比作为标准。
2 结果与分析
211 家蚕5龄幼虫中肠细菌的多样性
16S rDNA 文库序列分析结果表明, 家蚕C108
而SC N2品系则是E . casseliflavus ; 同食含桑饲料
时,C108品系除了与SC N2品系都含有E . mundtii , E . casseliflavu 这两种优势菌的系统发育型外, 它还有E . gallinarum 这种优势菌的系统发育型, 其在SC N2品系肠道中没有出现, 可认为是C108的特有
和SC N2品系5龄幼虫中肠共发现41种细菌系统发育型(phylotype ) (表2) (食桑叶组分离到的大量叶绿
优势菌。SC N2品系食无桑饲料时, E . saccharolyticus 的系统发育型成为其中肠优势菌, 此
226昆虫学报Acta Entomologica Sinica 50卷
3期相 辉等:家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PCR 2DGGE 和16S rDNA 文库序列分析
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228昆虫学报Acta Entomologica Sinica 50卷
种系统发育型在C108品系中丰度极低(0162%) , 可认为是SC N2的特有优势菌。并且在食无桑饲料时,SC N2品系肠道中还出现了一种丰度较高的系统
发育型, 以98%的序列一致性比对到葡萄球菌属的Staphylococcus sp. , 也为该品系特有的次优势菌。
表3 家蚕幼虫中肠细菌属的相对丰度(%)
C108
SCN2
类群
G roup
属
G enus
桑叶
Mulberry
leaves
含桑饲料
Artificial diet (containing mulberry powder )
桑叶
Mulberry leaves
含桑饲料
Artificial diet (containing mulberry powder )
无桑饲料
Artificial diet (mulberry free )
Cucumis sativus chloroplast
6616727137
82172185
54174
81059126
乳杆菌目Lactobacillales Enterococcus Abiotrophia
16116
其他Others
异常球菌2栖热菌门Deinococcus 2Thermus α2变形菌纲Alpha P B
Methylobacterium Ochrobactrum
07112102
61323116
1516011111
[1**********]5
1185
其他Others
β2变形菌纲Beta P B
Aquaspirillum Ralstonia Acidovorax Massilia Thermothrix Janthinobacterium Aquabacterium
11230162
3103
1105
0162
11051105
[1**********]2
1185
1105
3103
21471185
2175
11173
0162
1101
0192
1185
2111
[1**********]2
其他Others
γ2变形菌纲G amma P B 芽孢杆菌目Bacillales 梭菌目Clostridiales 放线菌门Actinobacteria 未确定
Unidentified
Acinetobacter Frateuria Staphylococcus Veillonella Arthrobacter Actinomyces
未培养细菌
Uncultured bacterium
表4 家蚕幼虫中肠肠球菌属系统发育型的确定及其所占的比例
T able 4 N earest m atch identification and relative abund ance of Enterococcus phylotypes in midguts of the silkw orm larvae
C108
SCN2
基因库中同源性
最高的序列
M ost closely related hit in G enBank
桑叶
序列号
Accession no.
Mulberry leaves
含桑饲料
Artificial diet
(containing m ulberry powder )
桑叶
Mulberry leaves
含桑饲料
Artificial diet
(containing m ulberry powder )
无桑饲料
Artificial diet (mulberry free )
一致性
Identity
(%) Proportion (%) (%) Proportion (%) (%) Proportion (%) (%) Proportion (%) (%)
AY 43900611AF03990311A J30183311U3093111AF06100711A J88890611AM08402911
99
50
9995989899
[***********]20162
999999
95
75136
9998
5916320118
99
占中肠一致性占肠道一致性占肠道一致性占肠道一致性细菌比例Identity 细菌比例Identity 细菌比例Identity 细菌比例Identity 占肠道细菌比例
Proportion (%)
[**************]62
E . mundtii E . casseliflavus E . gallinarum E . saccharolyticus E . dispar E . canintestini E . sp.
3期相 辉等:家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PCR 2DGGE 和16S rDNA 文库序列分析
229
群落相似性比较结果显示(表5) , 在属水平,2
个品系同食桑叶时肠道细菌群落相似度较高(58182>50) , 而其他处理组的相似度都较低。此种算法没有考虑到丰度的差异。另一方面, 从表3中可以看出, 食料的差异没有改变属水平上优势菌的组成, 所有食料处理下优势菌都是肠球菌Enterococcus , 而次优势菌也都是栖热菌Thermus 。不过肠球菌中优势
菌种的种类因食料的差异而有所差异。E . mundtii 和E . casseliflavu 的系统发育型在桑叶及含桑饲料处理组中是优势种, 但是在无桑饲料喂养条件下, 取而代之成为优势种的是E . saccharolyticus 。并且在无桑饲料喂养条件下,SC N2品系肠道中还出现了一种新的次优势菌葡萄球菌Staphylococcus sp. 。
表5 家蚕2个品系在不同食料喂养条件下肠道细菌群落Cs 系数
C1082含桑饲料
C1082artificial diet (containing mulberry
powder )
C1082桑叶C1082mulberry leaves C1082C1082artificial (containing mulberry ) SCN22桑叶SCN22mulberry leaves SCN22含桑饲料SCN22artificial diet (containing mulberry powder )
SCN22桑叶1SCN22(33133
SCN22无桑饲料SCN22artificial diet (mulberry free )
33133
[**************]
2610719105
25100
213 D GGE 图谱分析、序列鉴定及与16S rDNA 文
库分析结果的比较
对C108和SC N2品系家蚕5龄幼虫进行肠道细菌DGGE 图谱分析。结果表明(图1) , 同食桑叶时2个品系DGGE 图谱格局相似, 这与建库分析结果吻合; 同食饲料时格局也相似, 而建库分析结果则表
明这三种处理间相似性并不高。2个品系家蚕5龄幼虫肠道出现公有条带A , 且该条带不随食料的改变而改变。分别割取SC N22桑叶组和C108含桑饲料组的A 条带(分别记作A1,A2) 的测序结果仅能精确到肠球菌属Enterococcus (表6) 。食桑叶组中出现的特有条带C 经测序被证实是叶绿体DNA 。但
图1 2个品系家蚕的3龄和5龄幼虫在不同食料喂养条件下肠道细菌DGGE 图谱
Fig. 1 DGGE profiles of midgut microflora of the 3rd and 5th instar larvae of the tw o silkw orm strains feeding on different diets
1h :C1082桑叶组C1082mulberry leaves ; 3h :SC N22桑叶组SC N22mulberry leaves ; 1m :C108含桑饲料组C1082artificial diet (containing mulberry powder ) ; 3m :SC N2含桑饲料组SC N22artificial diet (containing mulberry powder ) ; 3l :SC N2无桑饲料组SC N22artificial diet (mulberry free ) . 箭头所指为共有条带, 这3个条带(A , B , C ) 被割胶回收测序Arrows showed the comm on bands (A ,B ,C ) , which had been cut and sequenced (marked with A1, A2, B1, and C1, respectively ) .
230昆虫学报Acta Entomologica Sinica 50卷
是图谱中, 含桑和无桑饲料喂养条件下出现了一个特有条带B , 测序结果与A1一致。建库序列分析并没有发现此种特有分类型。
3龄幼虫中肠细菌DGGE 图谱与5龄幼虫有一定的异同。从图1中可以看出,3龄幼虫的桑叶和人工饲料处理组的DGGE 图谱格局存在差异, 没有
相同的优势条带出现。桑叶喂养条件下的DGGE 图谱与5龄幼虫的相似; 然而人工饲料喂养条件下,3龄幼虫DGGE 图谱中出现较多的特有条带, 与5龄幼虫的格局差异很大。而品系间DGGE 图谱差异不明显。
表6 D GGE 割胶回收条带的序列与NCBI 数据库比对结果
条带编号
Band no. A1
基因库中同源性最高的序列
M ost closely related hit in G enBank
Enterococcus sp.
E . canintestini E . devriesei
序列号
[***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][**************]2
一致性
Identity (%)
[***********][***********][***********][***********]
Uncultured . E . E . Uncultured Enterococcus sp. E . flavescens E . pseudoavium E . sulfureus E . sp.
A2B1C1
E . mundtii E . sp.
同A1(The same as A1)
Cucumis sativus chloroplast
Uncultured angiosperm clone
Fragariax ananassa
Uncultured bacterium clone
Trewia nudiflora Alnus glutinosa
A . glutinosa chloroplast Ricinis communis Adriana glabrata
(1988) 曾对一种蝗虫Melanoplus sanguinipe 肠道内的
3 讨论
利用分子生物学手段对家蚕幼虫中肠细菌多样性进行研究的结果表明, 其细菌群落结构相对于白蚁等昆虫来说比较简单, 最多有17种系统发育型(C1082含桑饲料组) , 而最少只有7个(SC N22含桑饲料组) , 这和已报道的鳞翅目昆虫多样性程度相类似(Broderick et al . , 2004) 。DGGE 图谱也显示, 其多样性程度较低。在这2个家蚕品系的幼虫中肠细菌群落中, 昆虫肠道中广泛存在的肠球菌Enterococcus 和栖热菌Thermus 是优势菌群:肠球菌在细菌群落中所占比例最高可达82172%, 栖热菌Thermus 达到15160%。而曾经有报道的肠杆菌Enterobacter 和微
肠球菌进行研究, 发现该属很多种类能够产生乙酸盐, 并推测大量乙酸盐的积累是蝗虫肠道pH 低的主要原因。这对于鳞翅目昆虫高pH 的肠道可能有一定意义。Broderick 等(2004) 对舞毒蛾幼虫肠道细菌调查的结果也显示肠球菌是该蛾肠道普遍存在的优势菌, 作者认为降低肠道pH 值可能保护寄主免受一些毒素的攻击。在家蚕中, 已有研究发现肠球菌是其消化道中的高频微生物(T akizawa and Iizuka , 1968) 。这类优势菌群可能有降低家蚕肠道pH 的作
用。家蚕肠道内肠球菌有丰富的生理生化特性(鲁兴萌等,1999) 和遗传多样性(王彦文等,2005) , 可能与家蚕致病性相联系(鲁兴萌等,2003) 。也有研究发现肠球菌能抑制家蚕微孢子虫发芽, 进而有可能有助于抵抗家蚕微孢子病(鲁兴萌和汪方炜,2002) 。
球菌Micrococcus , 在本研究中没有发现。Mead 等
3期相 辉等:家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PCR 2DGGE 和16S rDNA 文库序列分析
231
它们的功能和意义目前尚不特别清楚。栖热菌
Thermus , 在关于家蚕和在其他昆虫肠道细菌的研究中从未有过报道。该属主要生长在较高温度的环境中(Hugenholtz et al . , 1998) , 属于嗜热菌类。在家蚕幼虫肠道中却以一定的数量出现, 其原因尚有待研究, 可能和家蚕特殊的肠道环境有关。此外, 本研究只是根据16S rDNA 序列一致性而确定这些系统发育型属于栖热菌属, 还需要进一步用分离和培养的方法对该系统发育型进行生理生化特性的分析, 以探讨该菌群在家蚕生理和代谢中可能的作用。家蚕中肠肠球菌Enterococcus 多样性结构呈现动态变化的趋势E . casseliflavus 、E . f . E . gallinarum . 分类地位。, 不同的研究中报道的优势菌种有所不同, E . casseliflavus 、E . f aecalis 和E . avium 均有报道是优势种(鲁兴萌等,1999, 2003) 。本研究发现的肠球菌优势种的类型分别属于E . mundtii , E . casseliflavus , E . gallinarum 和E . saccharolyticus 。有极少数属于
E . dispar 和E . canintestini 。除了E . casseliflavus
寄主的功能菌(Broderick et al . , 2004) , 而可能是这种不适宜的食料打破了健康肠道内微生物群落结构的平衡性。
家蚕不同发育时期的生理特征有所不同, 尤其低龄幼蚕(1～3龄前期) 和高龄幼蚕(3龄后期～5龄) 之间差异显著, 因此出现生理二期现象(陈克平, 1998) 。张剑飞等(2002) 研究发现家蚕肠道细菌格局也存在相对应的“二期性”。本研究利用DGGE 对该现象进行初步的探讨, 从图谱上看出, 桑叶, 并不明显, 而饲料, , 肠道细菌的“二期性”提示肠道菌群和家蚕生理可能是密切相关的。
DGGE 分析由于其操作方便和高通量的优点而被广泛用于微生物多样性调查研究中。但是DGGE 图谱的分析仍然有很大的局限性。首先,DGGE 能够展示的只是优势菌群的结构, 检测低丰度种类仍有困难。本研究中,DGGE 比文库序列分析手段展示的细菌群落多样性要低。其次, 因为用于DGGE 分析的16S rDNA V3区片段只有200bp 左右, 其信息量是否能确定细菌的分类地位, 仍值得怀疑。DGGE 在有些情况下能够区分同一个种的不同基因型(Rees on et al . , 2003) , 但也有时不能鉴定到种水平。在本实验中可能就出现了这样的情况。因此, 要准确可信地分析细菌多样性, 还需要其他手段的配合使用。
本实验采用分子生物学、不依赖于培养的方法, 首次较为系统报道了家蚕幼虫中肠道内细菌多样性。家蚕肠道系统细菌种类组成有一定的特殊性, 例如栖热菌的出现。但这一特征是否由其食桑叶这种特殊而单一的食性长期选择的结果, 还不清楚。无桑饲料的开发可能成为家蚕产业的一个方向。在广食性品系的筛选培育过程中, 注意其肠道微生态结构的改变, 可能对其生理有一定的参考意义。另一方面, 不仅是家蚕, 现在人们对昆虫肠道细菌的了解也都仍然是初步的。食料, 寄主生理状态对其肠道细菌的组成都产生影响, 这种改变对于寄主自身有怎样的作用, 目前仍然还没有能够深入到这个层面。因此进一步了解优势菌及其动态变化, 将对于探讨寄主2寄生、共生微生物之间复杂的关系这一热点问题有重要的意义。
致谢 郭秋红、高雷在取材过程中给与了帮助, 魏桂
外, 其他种类以前均未报道过。从本研究结果也可
以看出, 肠球菌的组成受喂养条件的影响而有所差异。尤其在无桑饲料喂养条件下家蚕生长严重受阻的时候, 中肠内出现一种新的占优势系统发育型, 属于E . saccharolyticus 。曾有报道家蚕在感染微粒子病时, 肠球菌种类多样性结构发生变化, E . f aecium 成为优势种(鲁兴萌等,2003) 。而在本研究中, 无桑食料喂养下家蚕特殊的生理状况下出现的这种肠球菌可能与家蚕食料变化后引起的生理变化有关。
SC N2品系食无桑饲料时中肠还出现另一类特
有的, 较占优势的系统发育型, 属于葡萄球菌Staphylococcus 。葡萄球菌广泛分布于自然界, 也有报道它是家蚕肠道的一种优势菌(T akizawa and Iizuka , 1968; 李蒙英等,2000) 。在本研究中, 该分类型出现在特殊食料喂养下的肠道环境中, 对其寄主有怎样的影响, 还不清楚。从表1可以看出, 无桑饲料对家蚕生长有很大的影响。广食性品系SC N2虽然能够忍受无桑饲料, 但是这种食性的改变可能是由于某种食性相关基因的突变而导致(Asaoka , 2000) 。食无桑饲料后, 家蚕生长和发育严重受阻, 肠道环境也因食料的改变而有所改变。无桑饲料喂养条件下SC N2品系的肠道细菌群落组成发生的改变可能并不是由于食料选择了某些特殊的, 有益于
232昆虫学报Acta Entomologica Sinica
Microb . Ecol . , 43:455-4661
50卷
芳在DGGE 实验中提出了建议, 谨表谢意。
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(责任编辑:黄玲巧)
昆虫学报Acta Entomologica Sinica , March 2007, 50(3) :222-233ISS N 045426296
家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PCR 2D GGE
和16S rD NA 文库序列分析
相 辉, 李木旺
1
1,3
, 赵 勇, 赵立平, 张月华, 黄勇平
2231, 3
(11中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所, 上海 200032; 21上海交通大学生命科学与技术学院生物技术系, 上海 200240;
31中国农业科学院蚕业研究所, 江苏镇江 212018)
摘要:采用基于16S rDNA 的变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient , ) 文库序列分析的手段, 研究了重要经济昆虫家蚕Bombyx mori 2SC N2幼虫中肠内的细菌群落多样性, 文库序列分析表明,PCR 扩增得到的16S
rDNA (phylotype ) , 大多数属于Proteobacteria , 其次是Lactobacillales 。
此外, 2、Bacillales 、Clostridiales 和Actinobacteria , 尚有5种系统发育型不能确定其所属类型。2, 肠球菌属Enterococcus 是其中肠细菌的优势菌群, 栖热菌属Thermus 是次优势菌群。优势菌肠球菌属的组成在品系和不同食料喂养条件下有着一定的变化, 无桑饲料喂养条件下SC N2品系中肠内还出现了新的次优势菌葡萄球菌(Staphylococcus ) 。DGGE 图谱显示家蚕低龄幼虫和高龄幼虫肠道细菌格局存在差异, 推测可能与其发育期生理状态的差异有关。本研究结果提示家蚕肠道特殊菌群的出现可能与其特殊的食性有一定的关系, 食料改变、生长受阻后肠道微生态平衡也发生变化。
关键词:家蚕; 专食性; 广食性; 中肠细菌; 变性梯度凝胶电泳; 16S rDNA 文库分析中图分类号:Q96811 文献标识码:A 文章编号:045426296(2007) 0320222212
B acterial community in midguts of the silkw orm larvae estimated by PCR Π
D GGE and 16S rD NA gene library analysis
XI ANG Hui , LI Mu 2Wang
1
1,3
, ZH AO Y ong , ZH AO Li 2Ping , ZH ANG Y ue 2Hua , H UANG Y ong 2Ping
2231, 3
(11Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology , Shanghai Institutes for Biological Sciences , Chinese Academy of Sciences , Shanghai 200032, China ; 21Department of Biotechnology , Shanghai Jiao T ong University , Shanghai 200240, China ; 31Sericultural Research Institute , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Zhenjiang , Jiangsu 212018, China )
Abstract :We inventoried the bacteria community and the effects of diet on bacterial com position in larval midguts of tw o strains (the m onophag ous C108and the polyphag ous SC N2) of the silkw orm , Bombyx mori L. , an economically im portant insect , using 16S PCR 2DGGE and clone libraries. DNA sequence analysis indicated that the PCR 2am plified 16S rDNA genes represented 41phylotypes of bacteria. M ost of them belonged to the Proteobacteria and Lactobacillales , whereas less dominant taxa including members of the Deinococcus 2Thermus , Bacillales , Clostridiales and Actinobacteria were als o found in the midgut bacterial community. Phylotypes of Enterococcus were the m ost dominant group in both strains tested , followed by Thermus . Bacterial com position or population structure of Enterococcus varied between the tw o strains and in the same strain fed with different diets. Especially , when strain SC N2was fed with mulberry 2free artificial diet , a midgut phylotype belonging to Staphylococcus appeared with a fairly high proportion. DGGE profiles dem onstrated that there were differences in the bacterial pattern between y oung and old larvae. This might be
基金项目:国家重点基础研究发展规划“973”项目(2005C B121000)
作者简介:相辉, 女,1978年7月生, 陕西人, 博士研究生, 从事昆虫发育及肠道微生物研究,E 2mail :xhui @sippe.ac. cn 3通讯作者Author for correspondence , E 2mail :y ongping @sippe.ac. cn 收稿日期Received :2006205212; 接受日期Accepted :2006208230
3期相 辉等:家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PCR 2DGGE 和16S rDNA 文库序列分析
223
related with the differences of physiology between the tw o developmental stages. The results suggested that the appearance of special bacteria might ass ociate with the special phagy of the silkw orm , and un fit diet might destroy the balance of midgut microbiota to block normal growth of the silkw orm.
K ey w ords :Bombyx mori ; m onophag ous ; polyphag ous ; midgut bacteria ; DGGE ; 16S rDNA libraries
昆虫肠道中栖居着大量的微生物, 构成了肠道的
微生态体系。微生物对昆虫的生长和发育起着重要作用, 如可能参与昆虫的消化、营养吸收、繁殖(Cam pbell , 1989) , 甚至信息素的合成(Brand et al . , 1975; Dillon et al . , 2002) , 同时还间接抵抗病原微生物的侵袭(Dillon et al . , 2005) 。相对于哺乳动物, 昆虫与其肠道微生物共生关系的研究刚刚起步, (Brune and , ; D ouglas et al . , al . , 2003) 和重要农业害虫蝗虫(Dillon and Charnley , 2002) , 而对其他种类昆虫的肠道微生物的研究则很少。鳞翅目是昆虫纲的一个重要类群, 已有的研究表明鳞翅目昆虫的肠道内栖息着相当数量的微生物类群(McK illip et al . , 1997; Broderick et al . , 2004) , 这些微生物对于该类昆虫的营养和代谢同样起着重要的作用。
T akizawa 和Iizuka (1968) 在早期有过一些针对鳞翅目家蚕的肠道微生物的研究报道。国内研究者曾采用传统的培养手段初步调查了家蚕肠道微生物种类(马文石,1982; 李蒙英等,2000) 。已经发现的家蚕肠道主要菌群有肠球菌Enterococcus spp. 、葡萄球菌Staphylococcus spp. 、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae 和腊样芽孢杆菌Bacillus cereus (T akizawa and Iizuka , 1968; 李蒙英等,2000) 。张剑飞等(2002) 的研究发现了丰富的细菌种类和动态变化, 其中微球菌Micrococcus spp. 和芽孢杆菌Bacillus spp. 占优势。从这些研究中可以看出, 虽然人们对家蚕肠道细菌有一定的认识, 但可能是由于蚕种质资源及其肠道细菌的多样性或者研究手段的差异, 目前尚没有较为一致的意见。
由于细菌自身的特点, 使得研究昆虫与其肠道细菌相互关系变得复杂。因为很多种细菌无法培养, 传统的依靠培养手段应用于细菌菌落结构研究往往有很大的局限性(Vaughan et al . , 2000) 。基于原核生物的16S rDNA 的分子生物学技术的应用, 如利用核糖体16S rDNA 作为分子标记的变性梯度电泳(denaturing gradient gel electrophoresis , DGGE ) (Muyzer et al . , 1998) 以及文库(clone libraries ) 序列分析(Ohkuma and K udo , 1996) 为发现和区分无法培
养的微生物提供了手段。16S rDNA 存在于所有原核生物细胞中, 被广泛用于细菌的系统学研究(Schmidt and Relman , 1994) , 是细菌种类鉴定的一个重要参考依据, 已经应用在一些昆虫肠道微生物多(Rees on et , ; Broderick et al . , 。由于对其营养利, 对养蚕业中的生产率低、叶丝转化率低、蚕病发生率高等问题还难以提出有效的解决方案, 我国每年因蚕病损失的茧量达10%以上。研究家蚕肠道微生物体系来指导提高饲料利用率、培育广食性品种、增强抗病品种选育等, 已成为蚕业生产的发展方向之一。
本研究采用核糖体16S rDNA 作为分子标记的变性梯度电泳以及文库序列分析这两种分子生物学手段, 对不同饲料喂养条件下家蚕两种食性范围差异较大品系的肠道细菌区系进行了研究, 试图探讨肠道细菌与家蚕食性可能的联系以及食料对其肠道微生态结构可能的影响, 进而为家蚕品种改良和疾病防治提供理论依据。
1 材料和方法
111 供试家蚕品系及饲养方法
供试家蚕为专食性品系C108和选育出的广食性品系SC N2。蚕卵由中国农科院镇江蚕业研究所提供。专食性品系C108食性较为单一, 主要食桑叶和含桑饲料, 但食含桑饲料时生长较慢, 食无桑饲料时蚁蚕死亡率达100%; 广食性品系SC N2食性相对较宽, 主食桑叶和含桑饲料的同时也能忍受无桑饲料, 食含桑饲料时生长减慢, 食无桑饲料时死亡率较高, 生长极为缓慢(表1) 。蚕卵在25℃培养箱中孵育。经催青孵化后, 蚁蚕按照如下方式喂养:C108蚁蚕分为2组:桑叶组, 以新鲜桑叶在紫外光下消毒10min 后喂养; 含桑饲料组, 用含有桑叶粉的无菌饲料喂养。SC N2蚁蚕分为3组:桑叶组及含桑饲料组处理方法同前; 无桑饲料组, 以不含桑叶粉的饲料喂养。桑叶及饲料均由中国农科院镇江蚕业研究所提供。
224昆虫学报Acta Entomologica Sinica 50卷
表1 家蚕2个品系幼虫在不同饲料喂养条件下的体重(n =10, 平均值±标准差)
家蚕品系
S train C108
食料类型
T ype of diet
体重Body weight (kg ) (×10-3)
3龄3rd instar 0105±01010103±0101330107±01010105±0101330133
5龄5th instar 0167±01080123±0105331107±01100168±01113315±010733
桑叶Mulberry leaves 含桑饲料Artificial diet
(containing mulberry powder )
SCN2桑叶Mulberry leaves 含桑饲料Artificial diet
(containing mulberry powder )
无桑饲料Artificial diet
(mulberry free )
注N otes :部分家蚕到4龄已出现严重的生长停滞, 5stopped growing at the 4th instar and many of them died before getting into the 5th :
龄第2天时, 各取5头, 无菌操作条件下解剖出中肠, 仔细取出并抛弃中肠内含物, 在无菌水中缓慢清洗后放入一个灭菌的2m L 离心管中, -20℃条件下保存以便用于DNA 的
个循环降低1℃, 其他条件不变; 最后15个循环退火温度为55℃, 其他条件不变; 72℃延伸10min 。
PCR 产物经过一次扩增(95℃015min , 50℃015min , 72℃1min , 循环3次; 72℃延伸10min )
提取。长到5龄2～3天时, 以同样的方法取样和保存。总DNA 的提取参考Lau 等(2002) 的方法, 溶于200μL 无菌去离子水中, 以分光光度计(E ppendorf )
后, 用PCR 产物纯化试剂盒(申能博彩) 纯化。114 16S rDNA 文库的构建及序列分析
测定浓度。113 PCR 扩增
) 用引物27f (5′2AG AG TTTG AT CCTGG CT C AG 23′(Edwards et al . , 1989) 和1492r (5′2T ACGGY T ) (Weisburg et al . , 1991) 扩ACCTTG TT ACG ACTT 23′
对5龄各个处理组的16S rDNA PCR 产物构建
文库。已纯化的16S 全长PCR 产物(115kb 左右) 连接到pMD182T 载体(T aK aRa ) 后转入大肠杆菌E .
coli 。每个文库至少挑取95个阳性克隆, 以m13通
增家蚕中肠的16S rDNA 以构建文库。25μL PCR 反应体系中包含:DNA 模板5μL , 引物(10μL Πm L ) 各015μL , dNTPs (10mm ol Πm L ) 015μL , 10×T aq PCR
2+
reaction bu ffer (含Mg ) 215μL 和015U 的Ex T aq
用引物扩增得到的产物(115kb 左右, 约80ng ) , 用
af a Ⅰ和Hin f Ⅰ(T aK aRa ) 两种限制性内切酶37℃消化4h 左右, 酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测, 得到所有克隆的限制性酶切图谱。根据该图谱分别对每一个文库中的所有克隆进行分型, 每一种类型即是分类操作单位(operational tax onomic unit ,OT U ) (M oyer et al . , 1996) 。属于同一个OT U 的克隆即使
DNA 聚合酶(T aK aRa ) 。PCR 反应在PCR 仪(TECH NE , Flexigene ) 上进行。扩增程序为:95℃预
变性115min ; 95℃015min , 60℃015min , 72℃3min , 循环5次; 95℃015min ,55℃015min ,72℃3min , 循环5次; 95℃015min , 50℃015min , 72℃3min , 循环25次; 72℃延伸10min 。
DGGE 的16S rDNA V3区扩增所用的引物为:343f
(5′) 和534r 2ACT CCT ACGGG AGG C AG C AG 23′
et
al . ,
不是完全一样, 也在系统分类学上非常接近(M oyer
et al . , 1996) , 所以我们选一个代表进行测序。5个处理进行测序的样品数分别为:C108桑叶组, 27; C108含桑饲料组, 24; SC N2桑叶组, 31; SC N2含桑
饲料组, 14; SC N2无桑饲料组, 31。某一种系统发育型的克隆数占该文库所有克隆数的比例作为该系统发育型的相对丰度。
用Chromas V. 2123(T echnelysium ) 软件对测序结果进行扫描和处理。对从16S rDNA 第27碱基处开始, 包含V3区的前550bp 的有效序列信息, 在NC BI
(5′) (Nakatsu 2ATT ACCG CGG CTG CTGG 23′
2000) 。在正向引物的5′端加入一段称作“G C 钳”的
富含G C 的序列(5′2CG CCCG CCG CG CG CGG CGGG C
) 以提高PCR 产物在进GGGG CGGGGG CCCGGGGG 23′行变性梯度电泳时的稳定性。PCR 反应体系同前。
3期相 辉等:家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PCR 2DGGE 和16S rDNA 文库序列分析
225
数据库(http :ΠΠw w w. ncbi. nlm. nih. g ov ΠBLAST ) 中进行
比对, 寻找同源性最高的序列。同源性以一致序列所占的百分比(identity ) 作为标准。
用S orens on πs 成对相似性系数(Cs ) 比较不同处理组间中肠细菌群落的相似性。我们以属水平进行比较, Cs =0表示两种处理组肠道细菌菌落没有相同的属, Cs =100表示两种处理组肠道细菌菌落拥有完全相同的属。
(a +b ) ]×100。Cs =[2j Π
公式中, a 表示细菌群落a 中所有的属数, b 表示细菌群落b 中所有的属数, j 表示a , b 群落中公有的属数。115 变性梯度凝胶电泳(D 采用Bio 2A ) 8(W ΠV ) , %(100%=7mm ol ΠL 尿素和40%去离子甲酰胺[VΠV ]) 的聚丙烯酰胺变性胶(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺=3715∶1,W ΠW ) 对16S rDNA V3区扩增片段(200bp 左右) 进行DGGE 分析。PCR 产物经浓缩后加入2μL 6×载样缓冲液(T aK aRa ) , 在Bio 2Rad D 2code 系统中,60℃, 200V 电压下电泳4h 。电泳结束后用SY BR 2I 染色剂(BMA ) 染色30min 后在凝胶成像系统(天能) 中
体16S rDNA 不在统计范围内) 。41种系统发育型中大多数属于Proteobacteria , 其中属于Alpha Proteobacteria 的有8种, Beta Proteobacteria 10种, G amma Proteobacteria 3种。Lactobacillales 也是一个优势类群, 属于它的系统发育型有9种。此外, 属于Deinococcus 2Thermus 、Bacillales 、Clostridiales
和
Actinobacteria 的系统发育型分别有2种、1种、1种和2种, 另外还有5种不能确定其所属类型。家蚕的这2个品系中, 肠球菌属是中肠细菌的优势菌群, 72%(表3) , 最低(4) (不在统计范, 所占比例%(桑叶叶绿体16S rDNA 不在统计范围内) , 最低为4132%(表3) 。
优势菌群肠球菌属Enterococcus 中, 种类多样性较为丰富, 所比对到的序列一致性较高的种类有E . mundtii , E . casseliflavus , E . gallinarum 和E . saccharolyticus , 并且这4种属于优势种; 而E . dispar , E . canintestini 和E . sp. 所占比例很低, 分别为0162%,3109%和0162%(表4) 。
栖热菌属Thermus 中, 比对到的主要是Thermus scotoductus (原始数据未显示) , 对这些系统发育型进行完整测序, 序列一致性≥99%。测序结果已被美国G enBank 数据库收录, 登录号为DQ861411, 在390和417bp 处出现单核苷酸多态, 在197bp 处碱基为胞嘧啶C , 而不是Thermus scotoductus 的胸腺嘧啶T; 在954bp 处碱基为腺嘌呤A , 而不是Thermus scotoductus 的鸟嘌呤G 。212 2个品系中肠道细菌的比较及食料对肠道细菌群落结构的影响
从表3中可以看出, 属水平上2个品系的肠道优势菌组成相似。其中占据优势的都是肠球菌Enterococcus , 而次优势菌也都是栖热菌Thermus (表3) 。然而, 肠球菌属在2个品系肠道中呈现出较为丰富的多样性, 并且食料的差异对于肠球菌优势种类的组成有较为明显的影响(表4) 。同食桑叶时, C108品系肠道优势菌为E . mundtii 的系统发育型,
成像。用消毒的手术刀割下目的条带, 置于115m L 离心管中, 加入30μL 无菌去离子水, 用灭菌牙签仔细捣碎胶条,4℃放置过夜后, 取5μL 作为模板, 用前述343f 和534r 引物进行PCR 反应(95℃015min ,50℃015min ,72℃1min , 循环10次; 72℃延伸10min ) 。用纯化试剂盒(申能博彩) 纯化产物后连
接到pMD182T 载体(T aK aRa ) , 转化入大肠杆菌。克隆经m13通用引物检测后, 每个条带随机挑选3个阳性克隆测序。
用Chromas V. 2123(T echnelysium ) 软件对测序结果进行扫描和处理。对从16S rDNA 第343bp 处开始,V3区的200bp 左右的有效序列信息, 在NC BI 数据库(http :ΠΠw w w. ncbi. nlm. nih. g ov ΠBLAST ) 中进行比对, 寻找同源性最高的序列。同源性以一致序列所占的百分比作为标准。
2 结果与分析
211 家蚕5龄幼虫中肠细菌的多样性
16S rDNA 文库序列分析结果表明, 家蚕C108
而SC N2品系则是E . casseliflavus ; 同食含桑饲料
时,C108品系除了与SC N2品系都含有E . mundtii , E . casseliflavu 这两种优势菌的系统发育型外, 它还有E . gallinarum 这种优势菌的系统发育型, 其在SC N2品系肠道中没有出现, 可认为是C108的特有
和SC N2品系5龄幼虫中肠共发现41种细菌系统发育型(phylotype ) (表2) (食桑叶组分离到的大量叶绿
优势菌。SC N2品系食无桑饲料时, E . saccharolyticus 的系统发育型成为其中肠优势菌, 此
226昆虫学报Acta Entomologica Sinica 50卷
3期相 辉等:家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PCR 2DGGE 和16S rDNA 文库序列分析
227
228昆虫学报Acta Entomologica Sinica 50卷
种系统发育型在C108品系中丰度极低(0162%) , 可认为是SC N2的特有优势菌。并且在食无桑饲料时,SC N2品系肠道中还出现了一种丰度较高的系统
发育型, 以98%的序列一致性比对到葡萄球菌属的Staphylococcus sp. , 也为该品系特有的次优势菌。
表3 家蚕幼虫中肠细菌属的相对丰度(%)
C108
SCN2
类群
G roup
属
G enus
桑叶
Mulberry
leaves
含桑饲料
Artificial diet (containing mulberry powder )
桑叶
Mulberry leaves
含桑饲料
Artificial diet (containing mulberry powder )
无桑饲料
Artificial diet (mulberry free )
Cucumis sativus chloroplast
6616727137
82172185
54174
81059126
乳杆菌目Lactobacillales Enterococcus Abiotrophia
16116
其他Others
异常球菌2栖热菌门Deinococcus 2Thermus α2变形菌纲Alpha P B
Methylobacterium Ochrobactrum
07112102
61323116
1516011111
[1**********]5
1185
其他Others
β2变形菌纲Beta P B
Aquaspirillum Ralstonia Acidovorax Massilia Thermothrix Janthinobacterium Aquabacterium
11230162
3103
1105
0162
11051105
[1**********]2
1185
1105
3103
21471185
2175
11173
0162
1101
0192
1185
2111
[1**********]2
其他Others
γ2变形菌纲G amma P B 芽孢杆菌目Bacillales 梭菌目Clostridiales 放线菌门Actinobacteria 未确定
Unidentified
Acinetobacter Frateuria Staphylococcus Veillonella Arthrobacter Actinomyces
未培养细菌
Uncultured bacterium
表4 家蚕幼虫中肠肠球菌属系统发育型的确定及其所占的比例
T able 4 N earest m atch identification and relative abund ance of Enterococcus phylotypes in midguts of the silkw orm larvae
C108
SCN2
基因库中同源性
最高的序列
M ost closely related hit in G enBank
桑叶
序列号
Accession no.
Mulberry leaves
含桑饲料
Artificial diet
(containing m ulberry powder )
桑叶
Mulberry leaves
含桑饲料
Artificial diet
(containing m ulberry powder )
无桑饲料
Artificial diet (mulberry free )
一致性
Identity
(%) Proportion (%) (%) Proportion (%) (%) Proportion (%) (%) Proportion (%) (%)
AY 43900611AF03990311A J30183311U3093111AF06100711A J88890611AM08402911
99
50
9995989899
[***********]20162
999999
95
75136
9998
5916320118
99
占中肠一致性占肠道一致性占肠道一致性占肠道一致性细菌比例Identity 细菌比例Identity 细菌比例Identity 细菌比例Identity 占肠道细菌比例
Proportion (%)
[**************]62
E . mundtii E . casseliflavus E . gallinarum E . saccharolyticus E . dispar E . canintestini E . sp.
3期相 辉等:家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PCR 2DGGE 和16S rDNA 文库序列分析
229
群落相似性比较结果显示(表5) , 在属水平,2
个品系同食桑叶时肠道细菌群落相似度较高(58182>50) , 而其他处理组的相似度都较低。此种算法没有考虑到丰度的差异。另一方面, 从表3中可以看出, 食料的差异没有改变属水平上优势菌的组成, 所有食料处理下优势菌都是肠球菌Enterococcus , 而次优势菌也都是栖热菌Thermus 。不过肠球菌中优势
菌种的种类因食料的差异而有所差异。E . mundtii 和E . casseliflavu 的系统发育型在桑叶及含桑饲料处理组中是优势种, 但是在无桑饲料喂养条件下, 取而代之成为优势种的是E . saccharolyticus 。并且在无桑饲料喂养条件下,SC N2品系肠道中还出现了一种新的次优势菌葡萄球菌Staphylococcus sp. 。
表5 家蚕2个品系在不同食料喂养条件下肠道细菌群落Cs 系数
C1082含桑饲料
C1082artificial diet (containing mulberry
powder )
C1082桑叶C1082mulberry leaves C1082C1082artificial (containing mulberry ) SCN22桑叶SCN22mulberry leaves SCN22含桑饲料SCN22artificial diet (containing mulberry powder )
SCN22桑叶1SCN22(33133
SCN22无桑饲料SCN22artificial diet (mulberry free )
33133
[**************]
2610719105
25100
213 D GGE 图谱分析、序列鉴定及与16S rDNA 文
库分析结果的比较
对C108和SC N2品系家蚕5龄幼虫进行肠道细菌DGGE 图谱分析。结果表明(图1) , 同食桑叶时2个品系DGGE 图谱格局相似, 这与建库分析结果吻合; 同食饲料时格局也相似, 而建库分析结果则表
明这三种处理间相似性并不高。2个品系家蚕5龄幼虫肠道出现公有条带A , 且该条带不随食料的改变而改变。分别割取SC N22桑叶组和C108含桑饲料组的A 条带(分别记作A1,A2) 的测序结果仅能精确到肠球菌属Enterococcus (表6) 。食桑叶组中出现的特有条带C 经测序被证实是叶绿体DNA 。但
图1 2个品系家蚕的3龄和5龄幼虫在不同食料喂养条件下肠道细菌DGGE 图谱
Fig. 1 DGGE profiles of midgut microflora of the 3rd and 5th instar larvae of the tw o silkw orm strains feeding on different diets
1h :C1082桑叶组C1082mulberry leaves ; 3h :SC N22桑叶组SC N22mulberry leaves ; 1m :C108含桑饲料组C1082artificial diet (containing mulberry powder ) ; 3m :SC N2含桑饲料组SC N22artificial diet (containing mulberry powder ) ; 3l :SC N2无桑饲料组SC N22artificial diet (mulberry free ) . 箭头所指为共有条带, 这3个条带(A , B , C ) 被割胶回收测序Arrows showed the comm on bands (A ,B ,C ) , which had been cut and sequenced (marked with A1, A2, B1, and C1, respectively ) .
230昆虫学报Acta Entomologica Sinica 50卷
是图谱中, 含桑和无桑饲料喂养条件下出现了一个特有条带B , 测序结果与A1一致。建库序列分析并没有发现此种特有分类型。
3龄幼虫中肠细菌DGGE 图谱与5龄幼虫有一定的异同。从图1中可以看出,3龄幼虫的桑叶和人工饲料处理组的DGGE 图谱格局存在差异, 没有
相同的优势条带出现。桑叶喂养条件下的DGGE 图谱与5龄幼虫的相似; 然而人工饲料喂养条件下,3龄幼虫DGGE 图谱中出现较多的特有条带, 与5龄幼虫的格局差异很大。而品系间DGGE 图谱差异不明显。
表6 D GGE 割胶回收条带的序列与NCBI 数据库比对结果
条带编号
Band no. A1
基因库中同源性最高的序列
M ost closely related hit in G enBank
Enterococcus sp.
E . canintestini E . devriesei
序列号
[***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][***********][**************]2
一致性
Identity (%)
[***********][***********][***********][***********]
Uncultured . E . E . Uncultured Enterococcus sp. E . flavescens E . pseudoavium E . sulfureus E . sp.
A2B1C1
E . mundtii E . sp.
同A1(The same as A1)
Cucumis sativus chloroplast
Uncultured angiosperm clone
Fragariax ananassa
Uncultured bacterium clone
Trewia nudiflora Alnus glutinosa
A . glutinosa chloroplast Ricinis communis Adriana glabrata
(1988) 曾对一种蝗虫Melanoplus sanguinipe 肠道内的
3 讨论
利用分子生物学手段对家蚕幼虫中肠细菌多样性进行研究的结果表明, 其细菌群落结构相对于白蚁等昆虫来说比较简单, 最多有17种系统发育型(C1082含桑饲料组) , 而最少只有7个(SC N22含桑饲料组) , 这和已报道的鳞翅目昆虫多样性程度相类似(Broderick et al . , 2004) 。DGGE 图谱也显示, 其多样性程度较低。在这2个家蚕品系的幼虫中肠细菌群落中, 昆虫肠道中广泛存在的肠球菌Enterococcus 和栖热菌Thermus 是优势菌群:肠球菌在细菌群落中所占比例最高可达82172%, 栖热菌Thermus 达到15160%。而曾经有报道的肠杆菌Enterobacter 和微
肠球菌进行研究, 发现该属很多种类能够产生乙酸盐, 并推测大量乙酸盐的积累是蝗虫肠道pH 低的主要原因。这对于鳞翅目昆虫高pH 的肠道可能有一定意义。Broderick 等(2004) 对舞毒蛾幼虫肠道细菌调查的结果也显示肠球菌是该蛾肠道普遍存在的优势菌, 作者认为降低肠道pH 值可能保护寄主免受一些毒素的攻击。在家蚕中, 已有研究发现肠球菌是其消化道中的高频微生物(T akizawa and Iizuka , 1968) 。这类优势菌群可能有降低家蚕肠道pH 的作
用。家蚕肠道内肠球菌有丰富的生理生化特性(鲁兴萌等,1999) 和遗传多样性(王彦文等,2005) , 可能与家蚕致病性相联系(鲁兴萌等,2003) 。也有研究发现肠球菌能抑制家蚕微孢子虫发芽, 进而有可能有助于抵抗家蚕微孢子病(鲁兴萌和汪方炜,2002) 。
球菌Micrococcus , 在本研究中没有发现。Mead 等
3期相 辉等:家蚕幼虫中肠细菌群落多样性的PCR 2DGGE 和16S rDNA 文库序列分析
231
它们的功能和意义目前尚不特别清楚。栖热菌
Thermus , 在关于家蚕和在其他昆虫肠道细菌的研究中从未有过报道。该属主要生长在较高温度的环境中(Hugenholtz et al . , 1998) , 属于嗜热菌类。在家蚕幼虫肠道中却以一定的数量出现, 其原因尚有待研究, 可能和家蚕特殊的肠道环境有关。此外, 本研究只是根据16S rDNA 序列一致性而确定这些系统发育型属于栖热菌属, 还需要进一步用分离和培养的方法对该系统发育型进行生理生化特性的分析, 以探讨该菌群在家蚕生理和代谢中可能的作用。家蚕中肠肠球菌Enterococcus 多样性结构呈现动态变化的趋势E . casseliflavus 、E . f . E . gallinarum . 分类地位。, 不同的研究中报道的优势菌种有所不同, E . casseliflavus 、E . f aecalis 和E . avium 均有报道是优势种(鲁兴萌等,1999, 2003) 。本研究发现的肠球菌优势种的类型分别属于E . mundtii , E . casseliflavus , E . gallinarum 和E . saccharolyticus 。有极少数属于
E . dispar 和E . canintestini 。除了E . casseliflavus
寄主的功能菌(Broderick et al . , 2004) , 而可能是这种不适宜的食料打破了健康肠道内微生物群落结构的平衡性。
家蚕不同发育时期的生理特征有所不同, 尤其低龄幼蚕(1～3龄前期) 和高龄幼蚕(3龄后期～5龄) 之间差异显著, 因此出现生理二期现象(陈克平, 1998) 。张剑飞等(2002) 研究发现家蚕肠道细菌格局也存在相对应的“二期性”。本研究利用DGGE 对该现象进行初步的探讨, 从图谱上看出, 桑叶, 并不明显, 而饲料, , 肠道细菌的“二期性”提示肠道菌群和家蚕生理可能是密切相关的。
DGGE 分析由于其操作方便和高通量的优点而被广泛用于微生物多样性调查研究中。但是DGGE 图谱的分析仍然有很大的局限性。首先,DGGE 能够展示的只是优势菌群的结构, 检测低丰度种类仍有困难。本研究中,DGGE 比文库序列分析手段展示的细菌群落多样性要低。其次, 因为用于DGGE 分析的16S rDNA V3区片段只有200bp 左右, 其信息量是否能确定细菌的分类地位, 仍值得怀疑。DGGE 在有些情况下能够区分同一个种的不同基因型(Rees on et al . , 2003) , 但也有时不能鉴定到种水平。在本实验中可能就出现了这样的情况。因此, 要准确可信地分析细菌多样性, 还需要其他手段的配合使用。
本实验采用分子生物学、不依赖于培养的方法, 首次较为系统报道了家蚕幼虫中肠道内细菌多样性。家蚕肠道系统细菌种类组成有一定的特殊性, 例如栖热菌的出现。但这一特征是否由其食桑叶这种特殊而单一的食性长期选择的结果, 还不清楚。无桑饲料的开发可能成为家蚕产业的一个方向。在广食性品系的筛选培育过程中, 注意其肠道微生态结构的改变, 可能对其生理有一定的参考意义。另一方面, 不仅是家蚕, 现在人们对昆虫肠道细菌的了解也都仍然是初步的。食料, 寄主生理状态对其肠道细菌的组成都产生影响, 这种改变对于寄主自身有怎样的作用, 目前仍然还没有能够深入到这个层面。因此进一步了解优势菌及其动态变化, 将对于探讨寄主2寄生、共生微生物之间复杂的关系这一热点问题有重要的意义。
致谢 郭秋红、高雷在取材过程中给与了帮助, 魏桂
外, 其他种类以前均未报道过。从本研究结果也可
以看出, 肠球菌的组成受喂养条件的影响而有所差异。尤其在无桑饲料喂养条件下家蚕生长严重受阻的时候, 中肠内出现一种新的占优势系统发育型, 属于E . saccharolyticus 。曾有报道家蚕在感染微粒子病时, 肠球菌种类多样性结构发生变化, E . f aecium 成为优势种(鲁兴萌等,2003) 。而在本研究中, 无桑食料喂养下家蚕特殊的生理状况下出现的这种肠球菌可能与家蚕食料变化后引起的生理变化有关。
SC N2品系食无桑饲料时中肠还出现另一类特
有的, 较占优势的系统发育型, 属于葡萄球菌Staphylococcus 。葡萄球菌广泛分布于自然界, 也有报道它是家蚕肠道的一种优势菌(T akizawa and Iizuka , 1968; 李蒙英等,2000) 。在本研究中, 该分类型出现在特殊食料喂养下的肠道环境中, 对其寄主有怎样的影响, 还不清楚。从表1可以看出, 无桑饲料对家蚕生长有很大的影响。广食性品系SC N2虽然能够忍受无桑饲料, 但是这种食性的改变可能是由于某种食性相关基因的突变而导致(Asaoka , 2000) 。食无桑饲料后, 家蚕生长和发育严重受阻, 肠道环境也因食料的改变而有所改变。无桑饲料喂养条件下SC N2品系的肠道细菌群落组成发生的改变可能并不是由于食料选择了某些特殊的, 有益于
232昆虫学报Acta Entomologica Sinica
Microb . Ecol . , 43:455-4661
50卷
芳在DGGE 实验中提出了建议, 谨表谢意。
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(责任编辑:黄玲巧)