生物技术通报
・技术与方法・
８ｌｏＴＥｃＨＮｏＬｏＧＹ
ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００９年第２期
分子生物学技术在生物修复中的应用研究进展
许科伟ｔ周青１，２
（・江南大学Ｔ业生物技术教育部重点实验室，无锡２１４１２２；：江南大学环境与土木下程学院，无锡２１４１２２）摘要：
随着分子生物学技术如分子杂交、ＰＣＲ、电泳技术等的发展。微生物学研究领域发生了深刻的变革，灵敏
的检测和精确的细菌鉴定成为可能。微生物分子生态学作为分子生物学与微生物生态学交叉而形成的学科，在生物修复方面得到广泛应用。从分子生物学实验技术角度综述了各种微生物分子生物学技术在生物修复中的应用研究情况。
关键词：
微生物分子生态学生物修复分子杂交ＰＣＫ电泳
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生物修复（ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）主要是利用天然存在的或特别培养的微生物在可调控环境条件下将有毒污染物转化为无毒物质的处理技术【１１。生物修复主要依靠细菌、真菌甚至高等植物以及细胞游离酶的自然代谢过程降解、去除环境中的污染物，消除或减弱环境污染物的毒性，减少污染物对人类健康和生态系统的风险．是一类低耗、高效和环境安全的生物技术。从广义上说，生物修复包括微生物修复、植物修复和细胞游离酶生物修复等三大主要类型。目前，作为环境科学研究中一个富有挑战性的前沿领域。生物修复的研究已进入一个相当活跃的时期．可以预见．生物修复将是２１世纪初环境技术的主攻方向之一【２１。
从上个世纪６０年代以来．污染物降解菌的分
收稿日期：２００８—０７—０７
基金项目：国家发改委稀土专项基金（ＩＦＺ０５１２１０）
作者简介：许科伟（１９７７．），男．在读博十。研究方向：环境科学通讯作者：周青，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｑｅｅｏ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｉｎ．ｅｒｌ
离、污染物微生物代谢途径分析以及微生物中污染降解基因等方面均有迅速的发展。传统的微生物分离培养方法不能满足微生物原位识别及形态学研究的需要。并且在多样性和动力学研究方面还存在着严重的局限性．不仅培养过程复杂耗时。只能反映显微镜条件下极少部分的菌落数，而且大多数不可培养的微生物则不能被检出。
分子生态学不是简单的分子技术在生态学问题中的应用，而是代表着一个新兴的学科，具有着生态学和分子生物学相互交叉的强大活力．分子生态学作为一门学科的建立，拓宽了人们的研究视野。研究污染物降解菌的多样性以及微生物种群适应污染环境的机理．对于评价污染物的环境毒理、生物降解性以及污染环境的自净具有重要的参考
万方数据
２００９年第２期
许科伟等：分子生物学技术在生物修复中的应用研究进展
价值Ｉ３１。
１分子生态学中主要研究方法
分子生态学研究始终依赖和跟踪分子标记技术和分子检测技术。分子标记技术包括限制性片段长度多态（ＲＦＬＰ）、单核苷酸多态（ＳＮＰ）、扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ）、随机扩增ＤＮＡ多态性（ＲＡＰＤ）、可变的串连重复多态（ＶＮＴＲＰ）和ＰＣＲ技术；分子检测技术包括ＤＮＡ（或ＲＮＡ）序列分析、片段分析，单链构象多态性（ＳＳＣＰ）、变性梯度（ＤＧＧＥ），温度梯度凝胶电泳（ＴＧＧＥ）、变性高效液相色谱（ＤＨＰ—ＬＣ）。同时，由于现代生物信息学的发展，使蛋白质技术（直接研究基因的表达产物）的使用成为可能
（图１）【４．５１。
多
图１分子生态学种群研究流程图
２分子生物学研究方法在生物修复中的应用
生物修复是一项利用微生物代谢潜力来修复被污染环境的技术。其重要的特点是它包含了很多复杂的微生物种群和群落，有些种群从中起到关键性的作用，所以深入的了解污染区域中的微生物生态对于提高生物修复的效果有着非常重要的意义。而分子生态学作为一个强有力的工具可以提高工作的效率和效果。在农药、石油烃、多环芳烃以及重金属等修复中应用都非常广泛［６１。
２．１
标记核酸探针杂交技术荧光原位杂交（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，
ＦＩＳＨ）是将基因探针用荧光染料标记，再使之与固
万方数据
定在载玻片上的微生物样品杂交。将未杂交的荧光探针洗去后用普通荧光显微镜或是共聚焦激光扫描显微镜进行观察和摄像。采用这一技术可以同时对不同类群的细菌在细胞水平上进行原位的定性定量分析和空间位置标示。荧光原位杂交技术广泛用于分析复杂环境的微生物群落构成．可以在自然生境中监测和鉴定微生物，并能对未被培养的微生物进行检测【７１。ｒＲＮＡ为靶序列寡核苷酸或ＰＮＡ（荧光蛋白质一核苷酸特异探针原位杂交）探针的荧光原位杂交能提供微生物的形态学、数量、空间分布等信息，现已成为环境科学研究领域中的热点技术阎。Ｌａｎｔｈｉｅｒ等【９】在降解ＰＣＰ的ＵＡＳＢ反应器内接种一种脱氯细菌ＰＣＰ一１．采用ＦＩＳＨ测试经过生物强化后形成的厌氧颗粒污泥微结构。真细菌和古细菌分
别采用探针ＥＵＢ３３８和ＡＲＣ９１５检测，ＰＣＰ．１用３
个特异探针检测。ＦＩＳＨ结果显示，古菌主要分布在颗粒污泥内部，而最后阶段污泥表面会形成一层较
薄的ＰＣＰ．１菌层．这种结构能够确保其他厌氧微生
物免受ＰＣＰ毒作用。Ｙａｎｇ等［１０ｌ成功地应用Ｄｈｅｌ２５９ｔＣＥ）降解菌Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ在污染环境中的存在性，分布以及丰度进行了监测。
核酸印迹杂交（Ｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）是从核酸混
合液中检测特定核酸分子的传统方法。其原理是双链的核酸分子在某些理化因素作用下解开双链，而在条件恢复后又可依碱基配对规律与探针形成双
链结构。根据检测样品的不同又分为ＤＮＡ印迹杂交和ＲＮＡ印迹杂交。在１６ＳｒＤＮＡ／ＲＮＡ技术中最常用到的是ＲＮＡ印迹杂交。ＹｏｓｈｉｆｕｍｉＳｈｉｎｏｄａ等【１１１用ＲＮＡ印迹杂交和实时定量反转录ＰＣＲ分析甲苯好氧和厌氧降解中两种关键酶产生基因（甲苯双加氧酶ｔａｄ基因和苯甲基合成酶ｂｓｓ基因）的主要诱导因素，结果显示，这两种基因都是由甲苯诱导产生的．同时。ｔｏｄ基因是在好氧条件下产生，而ｂｓｓ基因则是在好氧和厌氧条件下诱导产生的。ＲＮＡ印迹杂交还可以用来定量测得特定微生物种群
１６Ｓ
ｒＲＮＡ在总ｒＲＮＡ中的比例。检测出的标记物的
量可以用来表示与探针结合的靶ｒＲＮＡ的量，特定微生物ｒＲＮＡ的相对量可以用其探针信号与普适探针信号的比值表示．并由此得到目标微生物在样
Ｄ．ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ．１９５的原位荧光探针对四氯乙烯（Ｐ．
生物技术通报Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ２００９年第２期
品中的丰度．但在生物修复中未见相关报道。
２．２
以ＰＣＲ为基础的ｒＲＮＡ及ｒＤＮＡ分析技术聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术。是一种在体外模
拟天然ＤＮＡ复制过程，快速扩增特异性ＤＮＡ序列的技术。ＰＣＲ技术本身十分简单。可以将数量很少的原始模板ＤＮＡ分子进行倍增．能在最大程度上满足有关科学研究工作的需要。细菌核糖体小亚基ＲＮＡ基因为所有的细菌共有。且其与细菌整个基因组的变化相比。具有高度的保守性。通过１６ＳｒＲＮＡ基因保守区引物进行ＰＣＲ扩增是现在的一个主要研究手段。ＰＣＲ技术可以研究某一特定环境中微生物区系组成。进而了解种群动态，也可以研究特定微生物种群的动态。Ｋａｏｒｔ２１等利用ＰＣＲ技术扩增ＰＣＰ降解菌的１６ＳｒＤＮＡ，确定其中优势菌种
为Ｐ．ｍｅｍｔｏｃｉｎａＮＳＹＳＵ。利用ＰＣＰ作为惟一碳源，为
利用土著菌或接种细菌原位或异位生物修复ＰＣＰ污染土壤或水体提供了理论依据。Ｌｌｏｙｄａ等【１３１用１６ＳｒＤＮＡ分析人工湿地中微生物硫酸盐还原机理。结果表明。在试验开始２３ｄ后。微生物群落中固氮菌起占据的重要的生态位。溶解性氮成为了修复中的主要限制性因素。
近年来．ＰＣＲ技术得到了迅速发展，产生许多衍生技术，包括逆转录ＰＣＲ（ＲＴ．ＰＣＲ）、定量ＰＣＲ（ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ）、多重ＰＣＲ（ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ）、嵌套式ＰＣＲｔｌ４】和原位ＰＣＲ等，生物修复研究中应用比较多的是以下几种。
逆转录ＰＣＲ（ＲＴ．ＰＣＲ）是以ＲＮＡ为模板，经逆转录获得与ＲＮＡ互补的ＤＮＡ链即ｃＤＮＡ，然后以ｅＤＮＡ链为模板进行ＰＣＲ扩增而获得目的基因或检测基因表达，灵敏性大大提高。例如，Ｃｈｅｎｇ等【１５１运用ＰＣＲ和ＲＴ．ＰＣＲ技术成功地发现了两种高效的聚乙烯合成酶基因ＥｌＰＫＳｌ和ＥＩＰＫＳ２，这两种基因可以有效地提高微生物生物修复能力。
定量ＰＣＲ（ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ）是在ＰＣＲ定性技术的基础上发展起来的核酸定量技术。因为单纯
ＰＣＲ所提供的定性结果不足以阐述许多问题的本
质。因此，对核酸进行定量检测也是ＰＣＲ发展的趋向之一。包括最大可能数ＰＣＲ（ＭＰＮ．ＰＣＲ）和竞争性定量ＰＣＲ（ＱＣ．ＰＣＲ）。Ｓｃｈｗａｒｔｚ等【１６Ｉ利用定量ＰＣＲ（ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ）对于菲降解细菌Ａｒｔｈｒｏｂ．
万方数据
ａｃｔｅｒ在土壤混合种群环境下的生长情况做了定量的测定：该菌种数量从接种时的５．５５ｘ１０５（ｃｆｕ）ｇ－ｌ增加到１００ｈ后的１．９７×１０７（ｃｆｕ）ｇ一，最大种群密度在１５０ｈ后．最大降解速率达到之前达到，种群密度在５６％菲矿化后保持恒定。Ｂａｋｅｒ等【１７Ｉ用特异性ｐＭＭＯ（颗粒性甲烷氧化酶基因片段）引物做竞争性定量ＰＣＲ．来检测在三氯乙烯修复中起重要作用的甲烷氧化菌群结构，结果表明，型甲烷氧化菌相对于Ⅱ型甲烷氧化菌呈优势地位。
ＰＣＲ与分子标记和分子检测相结合的技术有以下３种：（１）ＰＣＲ．ＲＦＬＰ方法１１８Ｉ是将ＰＣＲ引物中的一条加以荧光标记。反应后用合适的限制酶切、电泳分析．再根据片段的大小不同以及标记片段种类和数量的不同分析群落的结构组成及功能多样性，可以用来监测因环境改变而引起的微生物种群的变化。同时由于其灵敏性高和分析量大，也是一个有竞争力的分析方法。Ｐｏｒｔｅｏｕｓ等１１９】运用ＰＣＲ．ＭＥＲＦＬＰ（多重）研究在生物修复中的有益菌Ｐｓｅｕｄ．ｏｌｒｔｏｎｄ￥．结果表明这种方法是非常有效的工具并充实了环境中Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ的ｒＤＮＡ基因文库。Ｓｔｕａｒｔ—Ｋｅｌｌ等ｆ∞１通过对萘降解质粒进行ＲＦＬＰ分析，发现这些降解质粒之间非常接近．从而证明萘降解质粒的转移在微生物群落适应污染环境中具有重要作用；（２）ＰＣＲ．ＳＳＣＰ方法原本用于临床鉴定基因突变。近年来被应用到微生物生态学研究中。单链ＤＮＡ片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的。当有一个碱基发生改变时。会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变。空间构象有差异的单链ＤＮＡ分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同，可通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）敏锐地将构象上有差异的分子分离开。Ｐｏｈｌｅｒｌ等【２１１的生物修复实验基于１６ＳｒＲＮＡ扩增，运用ＳＣＣＰ指纹技术对酸性采矿湖围隔中总细菌和硫酸盐还原细菌（ＳＲＢ）群落结构和动态进行了成功监测；（３）ＰＣＲ．ＲＡＰＤ方法是由Ｗｉｌｌｉａｍｓ发展起来的随机扩增多态性ＤＮＡ分子遗传标记技术，能快速进行基因多态性研究，并且由于不涉及印迹杂交、放射性自显影等技术，因此简便易行。姚健等［２２１用ＲＡＰＤ方法分析了农药严重污染对土壤微生物群落的
２００９年第２期
许科伟等：分子生物学技术在生物修复中的应用研究进展
７１
ＤＮＡ序列多样性的影响．用１４个随机引物扩增出共９５个可靠的片段。经过对ＤＮＡ序列多态性的分析和ＤＮＡ丰度、修饰丰度、Ｓｈａｎｎｏｎ．Ｗｅａｖｅｒ指数和相似性系数的计算，结合土壤微生物量的测定，结果表明化学农药可在ＤＮＡ水平上影响微生物多态
性。
２．３
ＤＮＡ扩增片段电泳检测技术
ＤＮＡ分子双螺旋结构是由氢键和碱基的疏水
作用共同作用的结果。温度、有机溶剂和ｐＨ等因素可以使氢键受到破坏，导致双链变性为单链。ＤＧＧＥ技术检测核酸序列是通过不同序列的ＤＮＡ片段在各自相应的变性剂浓度下变性．发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降。最后在其相应的变性剂梯度位置停滞，经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差异。可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性以及ＰＣＲ扩增ＤＮＡ片段的多态性。ＴＧＧＥ技术的基本原理与ＤＧＧＥ技术相似．含有高浓度甲醛和尿素的凝胶温度梯度呈线性增加，这样的温度梯度凝胶可以有效分离ＰＣＲ产物及目的片段。ＴＧＧＥ技术与化学变性剂形成梯度的ＤＧＧＥ技术相比，梯度形成更加便捷，重现性更强。近来电泳检测技术已成为微生物生态中一个重要的手段，它可以分析群落多样性、研究群落动态、监测细菌富集和分离等Ｉ矧。
Ｄｅｌ
Ｐａｎｎｏ等【矧人使用ＤＧＧＥ技术测定一年内
土壤微宇宙中微生物群落在生物修复过程中质量和数量的变化，得出受污染土壤中的微生物群落结构与受控条件下的有较大不同。并判断其结构与接种污泥的量有关。ＫａｚｕｎａｒｉＳｅｉ等［２５Ｊ用ＰＣＲ．ＤＧＧＥ来研究海水受芳香化合物污染后，降解苯酚类，水杨酸盐等微生物的群落行为及其整个群落结构的变化，监测的效果表明，用此方法可以说明这些细菌种群的行为特性．也可以用来估计微生物生态系统的修复效果。Ｆａｎｔｒｏｕｓｓｉ等陋１提取了使用３种除草
剂的土壤微生物的总ＤＮＡ。通过通用引物ＰＣＲ扩
ｒＤＮＡ基因．然后用ＤＧＧＥ分析４种不同
土壤的微生物的群落结构的变化．通过统计ＤＧＧＥ条带分析了４种土壤群落的相似性。并通过测序，发现一种至今未被培养的类群。Ｅｉｃｈｎｅｒ等【刎成功
万方数据
地运用ＴＹＧＥ分析经过扩增的１６ＳｒＲＮＡ，测定由于受到苯酚严重污染高度复杂的活性污泥生态系统的结构变化。２．４耦合技术
由以上的很多应用来看．许多技术是联合使用的。另外，由于使用ＰＣＲ扩增技术一般不能准确反
映微生物的量（除定量ＰＣＲ）．引物的设计方法和数
据库对某些微生物还是很不完善的．在实际应用和结果的分析上也较其它方法有一定的难度Ｉ簋】。可以把现在比较流行磷ｔｈ‘Ｊｈ‘肪酸分析法（ＰＬＦＡ）［２３１、细胞甲基脂肪酸脂（ＦＡＭＥ）图谱分析、醌类图谱分析法等结合起来，更好地区别和鉴定不同的微生物种类，在环境微生物生态的测定中将得到越来越广泛的重视和应用。
Ｗａｇｎｅｒ．Ｄｏｂｌｅｒ等【２９１采用ＦＡＭＥ图谱分析、１６ＳｒＤＮＡ的序列比较、ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法，将苯降解菌主要类群归为Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ。其他还有Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒ等。Ｋｕｒｉｓｕ［驯等在高温接触氧化过程中采用ＰＣＲ．ＤＧＧＥ法．用ＦＩＳＨ法及醌类图谱法同时分析来研究微生物的群体结构．得到ＭＫ．７为这一处理系统的优势醌类种类。含有ＭＫ，７的微生物包括８及８变形杆菌、黄杆菌／噬纤维菌群和（Ｇ＋Ｃ）含量低的革兰氏阳性菌如Ｂａｃｉｌｌｕｓ而ＦＩＳＨ的结果表明．Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｅｒｔｔｕｓ和Ｂ．ｔｈｅ删／ｏ．
ｓｐｐ。
主要由Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ及兼性高温和中温杆菌组成。
３
结语
微生物分子生态学技术已经越来越多地应用
于生物修复研究和应用中。提高了生物修复的效果，增强了目的性，同时还可以用于评估修复过程中生态系统的健康程度【，１１。相对于传统的生物培养技术等，它具有快速、灵敏、精确等优点，更重要的是．基于这些技术。可以跟踪某些基因工程菌的扩散和迁移．有利于提高修复的生态安全性。有理由相信。在不久的将来，它必将成为生物修复中的一参考文献
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关键词：
微生物分子生态学生物修复分子杂交ＰＣＫ电泳
Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎ
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生物修复（ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）主要是利用天然存在的或特别培养的微生物在可调控环境条件下将有毒污染物转化为无毒物质的处理技术【１１。生物修复主要依靠细菌、真菌甚至高等植物以及细胞游离酶的自然代谢过程降解、去除环境中的污染物，消除或减弱环境污染物的毒性，减少污染物对人类健康和生态系统的风险．是一类低耗、高效和环境安全的生物技术。从广义上说，生物修复包括微生物修复、植物修复和细胞游离酶生物修复等三大主要类型。目前，作为环境科学研究中一个富有挑战性的前沿领域。生物修复的研究已进入一个相当活跃的时期．可以预见．生物修复将是２１世纪初环境技术的主攻方向之一【２１。
从上个世纪６０年代以来．污染物降解菌的分
收稿日期：２００８—０７—０７
基金项目：国家发改委稀土专项基金（ＩＦＺ０５１２１０）
作者简介：许科伟（１９７７．），男．在读博十。研究方向：环境科学通讯作者：周青，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｑｅｅｏ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｉｎ．ｅｒｌ
离、污染物微生物代谢途径分析以及微生物中污染降解基因等方面均有迅速的发展。传统的微生物分离培养方法不能满足微生物原位识别及形态学研究的需要。并且在多样性和动力学研究方面还存在着严重的局限性．不仅培养过程复杂耗时。只能反映显微镜条件下极少部分的菌落数，而且大多数不可培养的微生物则不能被检出。
分子生态学不是简单的分子技术在生态学问题中的应用，而是代表着一个新兴的学科，具有着生态学和分子生物学相互交叉的强大活力．分子生态学作为一门学科的建立，拓宽了人们的研究视野。研究污染物降解菌的多样性以及微生物种群适应污染环境的机理．对于评价污染物的环境毒理、生物降解性以及污染环境的自净具有重要的参考
万方数据
２００９年第２期
许科伟等：分子生物学技术在生物修复中的应用研究进展
价值Ｉ３１。
１分子生态学中主要研究方法
分子生态学研究始终依赖和跟踪分子标记技术和分子检测技术。分子标记技术包括限制性片段长度多态（ＲＦＬＰ）、单核苷酸多态（ＳＮＰ）、扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ）、随机扩增ＤＮＡ多态性（ＲＡＰＤ）、可变的串连重复多态（ＶＮＴＲＰ）和ＰＣＲ技术；分子检测技术包括ＤＮＡ（或ＲＮＡ）序列分析、片段分析，单链构象多态性（ＳＳＣＰ）、变性梯度（ＤＧＧＥ），温度梯度凝胶电泳（ＴＧＧＥ）、变性高效液相色谱（ＤＨＰ—ＬＣ）。同时，由于现代生物信息学的发展，使蛋白质技术（直接研究基因的表达产物）的使用成为可能
（图１）【４．５１。
多
图１分子生态学种群研究流程图
２分子生物学研究方法在生物修复中的应用
生物修复是一项利用微生物代谢潜力来修复被污染环境的技术。其重要的特点是它包含了很多复杂的微生物种群和群落，有些种群从中起到关键性的作用，所以深入的了解污染区域中的微生物生态对于提高生物修复的效果有着非常重要的意义。而分子生态学作为一个强有力的工具可以提高工作的效率和效果。在农药、石油烃、多环芳烃以及重金属等修复中应用都非常广泛［６１。
２．１
标记核酸探针杂交技术荧光原位杂交（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，
ＦＩＳＨ）是将基因探针用荧光染料标记，再使之与固
万方数据
定在载玻片上的微生物样品杂交。将未杂交的荧光探针洗去后用普通荧光显微镜或是共聚焦激光扫描显微镜进行观察和摄像。采用这一技术可以同时对不同类群的细菌在细胞水平上进行原位的定性定量分析和空间位置标示。荧光原位杂交技术广泛用于分析复杂环境的微生物群落构成．可以在自然生境中监测和鉴定微生物，并能对未被培养的微生物进行检测【７１。ｒＲＮＡ为靶序列寡核苷酸或ＰＮＡ（荧光蛋白质一核苷酸特异探针原位杂交）探针的荧光原位杂交能提供微生物的形态学、数量、空间分布等信息，现已成为环境科学研究领域中的热点技术阎。Ｌａｎｔｈｉｅｒ等【９】在降解ＰＣＰ的ＵＡＳＢ反应器内接种一种脱氯细菌ＰＣＰ一１．采用ＦＩＳＨ测试经过生物强化后形成的厌氧颗粒污泥微结构。真细菌和古细菌分
别采用探针ＥＵＢ３３８和ＡＲＣ９１５检测，ＰＣＰ．１用３
个特异探针检测。ＦＩＳＨ结果显示，古菌主要分布在颗粒污泥内部，而最后阶段污泥表面会形成一层较
薄的ＰＣＰ．１菌层．这种结构能够确保其他厌氧微生
物免受ＰＣＰ毒作用。Ｙａｎｇ等［１０ｌ成功地应用Ｄｈｅｌ２５９ｔＣＥ）降解菌Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ在污染环境中的存在性，分布以及丰度进行了监测。
核酸印迹杂交（Ｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）是从核酸混
合液中检测特定核酸分子的传统方法。其原理是双链的核酸分子在某些理化因素作用下解开双链，而在条件恢复后又可依碱基配对规律与探针形成双
链结构。根据检测样品的不同又分为ＤＮＡ印迹杂交和ＲＮＡ印迹杂交。在１６ＳｒＤＮＡ／ＲＮＡ技术中最常用到的是ＲＮＡ印迹杂交。ＹｏｓｈｉｆｕｍｉＳｈｉｎｏｄａ等【１１１用ＲＮＡ印迹杂交和实时定量反转录ＰＣＲ分析甲苯好氧和厌氧降解中两种关键酶产生基因（甲苯双加氧酶ｔａｄ基因和苯甲基合成酶ｂｓｓ基因）的主要诱导因素，结果显示，这两种基因都是由甲苯诱导产生的．同时。ｔｏｄ基因是在好氧条件下产生，而ｂｓｓ基因则是在好氧和厌氧条件下诱导产生的。ＲＮＡ印迹杂交还可以用来定量测得特定微生物种群
１６Ｓ
ｒＲＮＡ在总ｒＲＮＡ中的比例。检测出的标记物的
量可以用来表示与探针结合的靶ｒＲＮＡ的量，特定微生物ｒＲＮＡ的相对量可以用其探针信号与普适探针信号的比值表示．并由此得到目标微生物在样
Ｄ．ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ．１９５的原位荧光探针对四氯乙烯（Ｐ．
生物技术通报Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ２００９年第２期
品中的丰度．但在生物修复中未见相关报道。
２．２
以ＰＣＲ为基础的ｒＲＮＡ及ｒＤＮＡ分析技术聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术。是一种在体外模
拟天然ＤＮＡ复制过程，快速扩增特异性ＤＮＡ序列的技术。ＰＣＲ技术本身十分简单。可以将数量很少的原始模板ＤＮＡ分子进行倍增．能在最大程度上满足有关科学研究工作的需要。细菌核糖体小亚基ＲＮＡ基因为所有的细菌共有。且其与细菌整个基因组的变化相比。具有高度的保守性。通过１６ＳｒＲＮＡ基因保守区引物进行ＰＣＲ扩增是现在的一个主要研究手段。ＰＣＲ技术可以研究某一特定环境中微生物区系组成。进而了解种群动态，也可以研究特定微生物种群的动态。Ｋａｏｒｔ２１等利用ＰＣＲ技术扩增ＰＣＰ降解菌的１６ＳｒＤＮＡ，确定其中优势菌种
为Ｐ．ｍｅｍｔｏｃｉｎａＮＳＹＳＵ。利用ＰＣＰ作为惟一碳源，为
利用土著菌或接种细菌原位或异位生物修复ＰＣＰ污染土壤或水体提供了理论依据。Ｌｌｏｙｄａ等【１３１用１６ＳｒＤＮＡ分析人工湿地中微生物硫酸盐还原机理。结果表明。在试验开始２３ｄ后。微生物群落中固氮菌起占据的重要的生态位。溶解性氮成为了修复中的主要限制性因素。
近年来．ＰＣＲ技术得到了迅速发展，产生许多衍生技术，包括逆转录ＰＣＲ（ＲＴ．ＰＣＲ）、定量ＰＣＲ（ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ）、多重ＰＣＲ（ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ）、嵌套式ＰＣＲｔｌ４】和原位ＰＣＲ等，生物修复研究中应用比较多的是以下几种。
逆转录ＰＣＲ（ＲＴ．ＰＣＲ）是以ＲＮＡ为模板，经逆转录获得与ＲＮＡ互补的ＤＮＡ链即ｃＤＮＡ，然后以ｅＤＮＡ链为模板进行ＰＣＲ扩增而获得目的基因或检测基因表达，灵敏性大大提高。例如，Ｃｈｅｎｇ等【１５１运用ＰＣＲ和ＲＴ．ＰＣＲ技术成功地发现了两种高效的聚乙烯合成酶基因ＥｌＰＫＳｌ和ＥＩＰＫＳ２，这两种基因可以有效地提高微生物生物修复能力。
定量ＰＣＲ（ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ）是在ＰＣＲ定性技术的基础上发展起来的核酸定量技术。因为单纯
ＰＣＲ所提供的定性结果不足以阐述许多问题的本
质。因此，对核酸进行定量检测也是ＰＣＲ发展的趋向之一。包括最大可能数ＰＣＲ（ＭＰＮ．ＰＣＲ）和竞争性定量ＰＣＲ（ＱＣ．ＰＣＲ）。Ｓｃｈｗａｒｔｚ等【１６Ｉ利用定量ＰＣＲ（ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ）对于菲降解细菌Ａｒｔｈｒｏｂ．
万方数据
ａｃｔｅｒ在土壤混合种群环境下的生长情况做了定量的测定：该菌种数量从接种时的５．５５ｘ１０５（ｃｆｕ）ｇ－ｌ增加到１００ｈ后的１．９７×１０７（ｃｆｕ）ｇ一，最大种群密度在１５０ｈ后．最大降解速率达到之前达到，种群密度在５６％菲矿化后保持恒定。Ｂａｋｅｒ等【１７Ｉ用特异性ｐＭＭＯ（颗粒性甲烷氧化酶基因片段）引物做竞争性定量ＰＣＲ．来检测在三氯乙烯修复中起重要作用的甲烷氧化菌群结构，结果表明，型甲烷氧化菌相对于Ⅱ型甲烷氧化菌呈优势地位。
ＰＣＲ与分子标记和分子检测相结合的技术有以下３种：（１）ＰＣＲ．ＲＦＬＰ方法１１８Ｉ是将ＰＣＲ引物中的一条加以荧光标记。反应后用合适的限制酶切、电泳分析．再根据片段的大小不同以及标记片段种类和数量的不同分析群落的结构组成及功能多样性，可以用来监测因环境改变而引起的微生物种群的变化。同时由于其灵敏性高和分析量大，也是一个有竞争力的分析方法。Ｐｏｒｔｅｏｕｓ等１１９】运用ＰＣＲ．ＭＥＲＦＬＰ（多重）研究在生物修复中的有益菌Ｐｓｅｕｄ．ｏｌｒｔｏｎｄ￥．结果表明这种方法是非常有效的工具并充实了环境中Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ的ｒＤＮＡ基因文库。Ｓｔｕａｒｔ—Ｋｅｌｌ等ｆ∞１通过对萘降解质粒进行ＲＦＬＰ分析，发现这些降解质粒之间非常接近．从而证明萘降解质粒的转移在微生物群落适应污染环境中具有重要作用；（２）ＰＣＲ．ＳＳＣＰ方法原本用于临床鉴定基因突变。近年来被应用到微生物生态学研究中。单链ＤＮＡ片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的。当有一个碱基发生改变时。会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变。空间构象有差异的单链ＤＮＡ分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同，可通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）敏锐地将构象上有差异的分子分离开。Ｐｏｈｌｅｒｌ等【２１１的生物修复实验基于１６ＳｒＲＮＡ扩增，运用ＳＣＣＰ指纹技术对酸性采矿湖围隔中总细菌和硫酸盐还原细菌（ＳＲＢ）群落结构和动态进行了成功监测；（３）ＰＣＲ．ＲＡＰＤ方法是由Ｗｉｌｌｉａｍｓ发展起来的随机扩增多态性ＤＮＡ分子遗传标记技术，能快速进行基因多态性研究，并且由于不涉及印迹杂交、放射性自显影等技术，因此简便易行。姚健等［２２１用ＲＡＰＤ方法分析了农药严重污染对土壤微生物群落的
２００９年第２期
许科伟等：分子生物学技术在生物修复中的应用研究进展
７１
ＤＮＡ序列多样性的影响．用１４个随机引物扩增出共９５个可靠的片段。经过对ＤＮＡ序列多态性的分析和ＤＮＡ丰度、修饰丰度、Ｓｈａｎｎｏｎ．Ｗｅａｖｅｒ指数和相似性系数的计算，结合土壤微生物量的测定，结果表明化学农药可在ＤＮＡ水平上影响微生物多态
性。
２．３
ＤＮＡ扩增片段电泳检测技术
ＤＮＡ分子双螺旋结构是由氢键和碱基的疏水
作用共同作用的结果。温度、有机溶剂和ｐＨ等因素可以使氢键受到破坏，导致双链变性为单链。ＤＧＧＥ技术检测核酸序列是通过不同序列的ＤＮＡ片段在各自相应的变性剂浓度下变性．发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降。最后在其相应的变性剂梯度位置停滞，经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差异。可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性以及ＰＣＲ扩增ＤＮＡ片段的多态性。ＴＧＧＥ技术的基本原理与ＤＧＧＥ技术相似．含有高浓度甲醛和尿素的凝胶温度梯度呈线性增加，这样的温度梯度凝胶可以有效分离ＰＣＲ产物及目的片段。ＴＧＧＥ技术与化学变性剂形成梯度的ＤＧＧＥ技术相比，梯度形成更加便捷，重现性更强。近来电泳检测技术已成为微生物生态中一个重要的手段，它可以分析群落多样性、研究群落动态、监测细菌富集和分离等Ｉ矧。
Ｄｅｌ
Ｐａｎｎｏ等【矧人使用ＤＧＧＥ技术测定一年内
土壤微宇宙中微生物群落在生物修复过程中质量和数量的变化，得出受污染土壤中的微生物群落结构与受控条件下的有较大不同。并判断其结构与接种污泥的量有关。ＫａｚｕｎａｒｉＳｅｉ等［２５Ｊ用ＰＣＲ．ＤＧＧＥ来研究海水受芳香化合物污染后，降解苯酚类，水杨酸盐等微生物的群落行为及其整个群落结构的变化，监测的效果表明，用此方法可以说明这些细菌种群的行为特性．也可以用来估计微生物生态系统的修复效果。Ｆａｎｔｒｏｕｓｓｉ等陋１提取了使用３种除草
剂的土壤微生物的总ＤＮＡ。通过通用引物ＰＣＲ扩
ｒＤＮＡ基因．然后用ＤＧＧＥ分析４种不同
土壤的微生物的群落结构的变化．通过统计ＤＧＧＥ条带分析了４种土壤群落的相似性。并通过测序，发现一种至今未被培养的类群。Ｅｉｃｈｎｅｒ等【刎成功
万方数据
地运用ＴＹＧＥ分析经过扩增的１６ＳｒＲＮＡ，测定由于受到苯酚严重污染高度复杂的活性污泥生态系统的结构变化。２．４耦合技术
由以上的很多应用来看．许多技术是联合使用的。另外，由于使用ＰＣＲ扩增技术一般不能准确反
映微生物的量（除定量ＰＣＲ）．引物的设计方法和数
据库对某些微生物还是很不完善的．在实际应用和结果的分析上也较其它方法有一定的难度Ｉ簋】。可以把现在比较流行磷ｔｈ‘Ｊｈ‘肪酸分析法（ＰＬＦＡ）［２３１、细胞甲基脂肪酸脂（ＦＡＭＥ）图谱分析、醌类图谱分析法等结合起来，更好地区别和鉴定不同的微生物种类，在环境微生物生态的测定中将得到越来越广泛的重视和应用。
Ｗａｇｎｅｒ．Ｄｏｂｌｅｒ等【２９１采用ＦＡＭＥ图谱分析、１６ＳｒＤＮＡ的序列比较、ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法，将苯降解菌主要类群归为Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ。其他还有Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｔｅｒｒａｂａｃｔｅｒ等。Ｋｕｒｉｓｕ［驯等在高温接触氧化过程中采用ＰＣＲ．ＤＧＧＥ法．用ＦＩＳＨ法及醌类图谱法同时分析来研究微生物的群体结构．得到ＭＫ．７为这一处理系统的优势醌类种类。含有ＭＫ，７的微生物包括８及８变形杆菌、黄杆菌／噬纤维菌群和（Ｇ＋Ｃ）含量低的革兰氏阳性菌如Ｂａｃｉｌｌｕｓ而ＦＩＳＨ的结果表明．Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｅｒｔｔｕｓ和Ｂ．ｔｈｅ删／ｏ．
ｓｐｐ。
主要由Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ及兼性高温和中温杆菌组成。
３
结语
微生物分子生态学技术已经越来越多地应用
于生物修复研究和应用中。提高了生物修复的效果，增强了目的性，同时还可以用于评估修复过程中生态系统的健康程度【，１１。相对于传统的生物培养技术等，它具有快速、灵敏、精确等优点，更重要的是．基于这些技术。可以跟踪某些基因工程菌的扩散和迁移．有利于提高修复的生态安全性。有理由相信。在不久的将来，它必将成为生物修复中的一参考文献
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