菌种鉴定的分子生物学方法
——16S rDNA测序鉴定菌种
一. 原理
细菌中包括有三种核糖体RNA,分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。5S rRNA虽易分析,但核苷酸太少,没有足够的遗传信息用于分类研究;23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍,分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中,又具有保守性和存在的普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高,因此,现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA,rRNA基因由保守区和可变区组成。在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性,根据这些保守区可以设计出细菌通用物,可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段,并且这些引物仅对细菌是特异性的,也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补,而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此,16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展,越来越多的微生物的16S rDNA序列被测定并收入国际基因数据库中,只要将基因序列放入基因数据库进行对比,便可快速的鉴定所测定的细菌种属,这样用16Sr DNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
二. 技术路线
该方法包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。具体技术路线如下:
三. 方法步骤
(一)细菌基因组DNA提取(酶解法)
1. 挑取单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。
2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中,8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。 3. 加140 μLTE打散细菌,再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。37℃放置10分钟。 4. 加入400 μL Digestion Buffer,混匀。再加入3 μL 蛋白酶K,混匀,55℃温育5分钟。 5. 加入260 μL乙醇,混匀,全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟,倒去收集管内的液体。
6. 加入500 μL 70%乙醇(Wash Solution),10000 rpm离心0.5分钟。 7. 重复第六步。
8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5mL的离心管。 9. 加入50μL预热(60℃)的洗脱缓冲液,室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟,流下的液体即为基因组DNA。
10. 电泳。取3μL溶液电泳检测质量。
注:如果待测菌为乳酸菌等不产生芽孢的菌类,且菌种非常纯净单一,则可以用直接煮沸法。 (二)PCR扩增
1. 根据16S rDNA序列设计保守的扩增引物。
27 F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 1492 R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 2. PCR扩增体系:
按下表加入引物、模板、Mix和ddH2O,建立PCR扩增体系(50μL)
3. PCR将EP管放入PCR仪,盖好盖子,调好扩增条件。扩增程序如下为:
4. PCR拿出EP管,从中取出5 μL反应产物,加入1 μL上样缓冲液。点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。电泳30 min。在紫外灯下检测扩增结果。 (三)扩增片段的回收
根据上步实验结果,如果扩增产物为唯一条带,可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切
割核酸条带,并回收目的片段。 1. 称量一2mL的EP管质量,记录。
2. 在紫外灯下切割含目的条带的凝胶,放入2 mL的P管内,称量。计算凝胶质量。 3.每100 mg凝胶加入100 μL Binding Buffer,混匀。60℃温育至凝胶融化。 4.全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟,倒去收集管内的液体。 5.加入500 μLBinding Buffer,10000 rpm离心1分钟,倒去收集管内的液体。 6.加入70%乙醇(Wash Solution),10000 rpm离心0.5分钟。
7.再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。 8.加入30μL预热的洗脱缓冲液,室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟,流下的液体即为回收的DNA片段。 (四)DNA片段测序
将回收的片段送至生物公司测序,测序引物为16S PCR引物。 (五)序列比对
将测序的结果在NCBI上进行序列比对,根据比对结果得出鉴定菌种。 *主要仪器:
1. PCR仪(用于进行PCR扩增反应,一般国产价格在2-3万元,最低也要1.8万左右) 2.电泳仪(用于琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,一般国产几个在3000左右)
附录:实验试剂表。
菌种鉴定的分子生物学方法
——16S rDNA测序鉴定菌种
一. 原理
细菌中包括有三种核糖体RNA,分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。5S rRNA虽易分析,但核苷酸太少,没有足够的遗传信息用于分类研究;23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍,分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中,又具有保守性和存在的普遍性等特点,序列变化与进化距离相适应,序列分析的重现性极高,因此,现在一般普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA,rRNA基因由保守区和可变区组成。在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性,根据这些保守区可以设计出细菌通用物,可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段,并且这些引物仅对细菌是特异性的,也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补,而细菌的16S rDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此,16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展,越来越多的微生物的16S rDNA序列被测定并收入国际基因数据库中,只要将基因序列放入基因数据库进行对比,便可快速的鉴定所测定的细菌种属,这样用16Sr DNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
二. 技术路线
该方法包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。具体技术路线如下:
三. 方法步骤
(一)细菌基因组DNA提取(酶解法)
1. 挑取单菌落接种到10 mL LB培养基中37℃振荡过夜培养。
2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中,8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。 3. 加140 μLTE打散细菌,再加入60 μL 10 mg/ml的溶菌酶。37℃放置10分钟。 4. 加入400 μL Digestion Buffer,混匀。再加入3 μL 蛋白酶K,混匀,55℃温育5分钟。 5. 加入260 μL乙醇,混匀,全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟,倒去收集管内的液体。
6. 加入500 μL 70%乙醇(Wash Solution),10000 rpm离心0.5分钟。 7. 重复第六步。
8. 再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5mL的离心管。 9. 加入50μL预热(60℃)的洗脱缓冲液,室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟,流下的液体即为基因组DNA。
10. 电泳。取3μL溶液电泳检测质量。
注:如果待测菌为乳酸菌等不产生芽孢的菌类,且菌种非常纯净单一,则可以用直接煮沸法。 (二)PCR扩增
1. 根据16S rDNA序列设计保守的扩增引物。
27 F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 1492 R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' 2. PCR扩增体系:
按下表加入引物、模板、Mix和ddH2O,建立PCR扩增体系(50μL)
3. PCR将EP管放入PCR仪,盖好盖子,调好扩增条件。扩增程序如下为:
4. PCR拿出EP管,从中取出5 μL反应产物,加入1 μL上样缓冲液。点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。电泳30 min。在紫外灯下检测扩增结果。 (三)扩增片段的回收
根据上步实验结果,如果扩增产物为唯一条带,可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切
割核酸条带,并回收目的片段。 1. 称量一2mL的EP管质量,记录。
2. 在紫外灯下切割含目的条带的凝胶,放入2 mL的P管内,称量。计算凝胶质量。 3.每100 mg凝胶加入100 μL Binding Buffer,混匀。60℃温育至凝胶融化。 4.全部转入UNIQ-10柱中。10000 rpm离心1分钟,倒去收集管内的液体。 5.加入500 μLBinding Buffer,10000 rpm离心1分钟,倒去收集管内的液体。 6.加入70%乙醇(Wash Solution),10000 rpm离心0.5分钟。
7.再10000 rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5ml的离心管。 8.加入30μL预热的洗脱缓冲液,室温放置3分钟。12000 rpm离心2分钟,流下的液体即为回收的DNA片段。 (四)DNA片段测序
将回收的片段送至生物公司测序,测序引物为16S PCR引物。 (五)序列比对
将测序的结果在NCBI上进行序列比对,根据比对结果得出鉴定菌种。 *主要仪器:
1. PCR仪(用于进行PCR扩增反应,一般国产价格在2-3万元,最低也要1.8万左右) 2.电泳仪(用于琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,一般国产几个在3000左右)
附录:实验试剂表。