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・综述・
分子生物学技术在肠道正常菌群研究中的应用
楼金 (综述) 陈洁(审校)
(浙江大学医学院附属儿童医院消化科,杭州310003)
【摘要】 对肠道正常菌群的研究方法主要有传统的微生物学方法和分子生物学方法。近几年来大量的分子生物学技术应用于肠道菌群的研究,取得了很大的进展,这些方法具有快速、方便、全面等优点。本文就
16SrRNA、16S～23SrRNA基因区间、随机扩增多态性DNA、变性梯度凝胶电泳、荧光原位杂交法、脉冲场凝胶
电泳等技术在肠道菌群研究中的应用进展作一综述。
【关键词】 细菌,厌氧; DNA,核糖体; 聚合酶链反应; 分子生物学
【中图分类号】 R378 【文献标识码】 A 【文章编号】 10012(2004)012 正常菌群在人体内分布很广,具有代表性究最有成效知肠道内栖息着大约114,是人体细胞总数的10～20倍,约400～500种。其中90%～9919%是厌氧菌。大量的研究结果表明,肠道内的细菌对人体的生长发育、免疫功能、营养、发病机制及健康等起着重要的作用。肠道内细菌的分离、鉴定和定量对于研究肠道内菌群的功能以及与机体的相互关系非常重要。
传统方法主要是通过微生物的选择性培养,再进行鉴定和分类。培养技术只能定量检测可培养的细菌,不能鉴定未知的细菌,低估了正常菌群的数量和多样性,同时不能阐明肠道微生物之间或与宿主的相互关系。而且,培养方法费时、费力,易受操作方法的影响。近年来大量的分子生物学技术应用于肠道微生态的研究,使我们对肠道微生物有了更完整的评价,对肠道中不能培养的细菌的研究在增加。1 16SrRNA及其基因16SrDNA的研究近几年来国内外学者采用各种分子生物学方法对细菌的16SrRNA进行研究,得到了广泛的细菌16SrRNA序列库。利用16SrDNA可以检测肠道中不能培养或生长缓慢的细菌。普遍存在的rDNA序列分析已经成为分类和检测细菌、评价种系关系的一个理想的工具。111 聚合酶链反应法 Suau等[1]用针对16SrRNA的细菌域通用引物,采用聚合酶链反应(PCR)法特异性扩增粪便标本的DNA,得到284个平均长度500bp的16SrDNA片段。对这些片段进行测序和种系分析发
82个分子菌种,其中:类杆菌、球形梭菌、柔嫩梭菌。只有24%的克隆与目前已知能培养的细菌相对应,而将近76%的扩增得到的rDNA序列与已知的细菌不一致,可能是肠道中迄今为止未知的细菌。因此,他认为,直接对粪便标本分析16SrDNA可以发现许多肠道中新的菌种,并且由此获得的肠道菌群的分子多态性为进一步分析不同年龄、饮食、胃肠道疾病和不同区域的人群的肠道菌群多样性提供了基础和比较框架。112 变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一个遗传指纹技术。首先从胃肠道标本中提取DNA,再用通用引物PCR法扩增16SrDNA。扩增产物包含了这个标本中存在的所有细菌的16SrDNA片段。不同细菌的16SrDNA片段通过DGGE凝胶时,可以在不同的尿素和甲酰胺浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中发生部分变性,迁移速度明显下降,从而加以分离。16SrDNA片段的分离产生了一个细菌群体的图谱,每一个DNA片段类型代表一个菌种[2]。温度梯度凝胶电泳(TGGE)与DGGE机制相同,不同的是凝胶中所采用的不是尿素和甲酰胺浓度梯度而是温度梯度。DGGE凝胶电泳与16SrRNA探针结合鉴定特异性的种、属、域。有用的PCR产物可以洗脱下来,再扩增进行序列分析。113 DNA2RNA杂交 DNA2RNA杂交法可以计算肠道中特殊菌群的比例。这种方法从标本中提取细菌RNA,在膜上与一系列放射性标记的寡核苷酸探针(每一个探针代表一个特殊的菌群)进行斑点杂交。以通用探针为对照,根据杂交程度来判断细菌所占的比例。Sghir等[3]在27个人的研究中,6个寡核苷酸探针可以检测占70%的通用探针检测到的16SrRNA,其中类杆菌2普氏杆菌2卟啉单胞菌占37%,球形梭菌占
作者简介:楼金 (19762),男,浙江东阳人,在读硕士研究生,从事小儿消化专业研究工作
・2・16%,柔嫩梭菌占14%,乳酸杆菌2链球菌2肠球菌、双
歧杆菌、肠杆菌各占1%。在DNA2RNA杂交法的应用
中,寡核苷酸探针只能从已知的细菌中获得,因此,该方法首先应对细菌进行种系分析或16SrDNA序列分析。
114 寡核苷酸微距阵法 寡核苷酸微距阵技术(oligonucleotidemicroarray)可以在一个载玻片上同时检测多个甚至数十个基因或目标DNA,它主要应用于基因的研究。Wang等[4]将其应用于粪便标本中细菌的检测。他们根据20种肠道菌种的16SrDNA序列设计了60个探针,置于载玻片上的微距阵中,制备了寡核苷酸微距阵玻片。用通用引物从粪便标本中扩增花青苷5(cyanine5)标记的16SrDNA,根据扩增产物与微距阵中的探针杂交程度的不同,没有杂交的距阵则不显示。Wang等[5],用硝酸纤维素薄膜距阵代替昂贵的微距阵设备,同样取得很好效果。115 扩增核糖体DNA限制性分析 对rDNA扩增产物用限制性内切酶进行酶切,根据酶切后不同的片段分析,对不同的菌株进行鉴别。Veatura等[6]用两个限制性内切酶对106株16种不同的双歧杆菌菌种的16SrDNA进行酶切,鉴定结果与特异性引物PCR扩增的结果一致,认为扩增核糖体DNA限制性分析是一个快速、敏感、容易控制的鉴定双歧杆菌的有效方法。116 其他11611 荧光原位杂交法 荧光原位杂交法(FISH)是采用免疫荧光标记的的寡核苷酸探针与目标检测物进行原位杂交,计算杂交率来定量检测和鉴定细菌。FISH优先检测活的有足够靶分子的细菌,对数量上占优势的细菌最适合。与PCR方法相比,它不需要选择性纯化或扩增步骤,可以提供一个更详细的微生物图谱。Franks等[7]设计了少部分能识别大部分种系免疫荧光标记的寡核苷酸探针,与16SrRNA序列相结合。结果这些探针能检测到大约2/3的大便标本中的细菌。在检测到的细菌中,类杆菌、梭菌、直肠真杆菌等占了将近一半。Moter等[8]认为FISH的结果很容易出现假阴性和假阳性结果。由于部分微生物可以发出自免疫荧光,出现假阳性结果。免疫荧光探针不易进入到细菌内、靶目标或探针的空间结构复杂,可出现假阴性。如果细菌中rRNA含量过低,则检出率下降。寡核苷酸探针通过不同细菌的细胞壁容易程度不一致,结果会出现偏差。11612 脉冲场凝胶电泳技术 脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)可以分离大小为50～1000kb的DNA片段,甚
至可以观察整个染色体,可用于分离细菌染色体等大分子DNA。PFGE已经成功的应用于分析不同细菌中的染色体构成,同时结合特异性的酶切技术用于菌种间或同一菌种不同菌株的鉴定。此外,它还可以为判断基因组的大小和基因图谱的建立提供有用的资料。O′Riordan等[9]应用PFGE结合限制性酶用于双歧杆菌种间及菌株间的鉴定。他认为尽管PFGE技术费时费力,但对很多菌属的菌株鉴别来讲它还是比核糖分型技术、十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳、随机扩增多态性DNA(RAPD)等更有效。
11613 重复细菌DNA元件的PCR扩增 重复细菌DNAPCR(Rep2)(在[10]认为Rep2PCR扩增,它有以下特点:有很适用于优势菌株,是一个应用于分类大量革兰氏阴性和阳性细菌的一个可靠工具。它是一个快速、易于操作、可重复性好的工具,可以达到菌株的水平。11614 三步任意引物PCR 任意引物PCR(AP2PCR)可以获得特征性的DNA片段,但只要反应条件的一点小小改变,就会影响条带的产生,重复性差。Cusick等[11]设计了三步任意引物PCR(TAP2PCR),用三个不同的退火温度,同时应用于三步反应,使条带的鉴定对温度变化敏感。认为TAP2PCR是一个简单、快速、价廉的技术。2 16S～23SrRNA基因区间序列的研究 16SrRNA的进化速度非常慢,基因序列保守,无法区分种系非常接近的菌种或同一菌种的不同菌株。而16S～23SrDNA区间序列的进化速度是16SrRNA的10倍,再加上16SrRNA端及23SrRNA端的高度保守序列,使16S～23SrDNA区间序列成为鉴别细菌的一个新的方法。Tannock等[12]对40个乳酸杆菌菌株16S～23SrRNA基因区间进行PCR扩增和序列分析,并与基因库中的参考菌株进行对比,发现9715%或更高的一致性。Tilsala2Timisjarvi等[13]设计了两条引物(1621A和23
21B),特异性的扩增16S～23SrRNA基因区间,成功的检测到类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、德氏乳杆菌等。3 转运RNA基因
Bale等[14]设计了针对转运RNA基因(tDNA)保守区的引物,对82种乳酸杆菌菌株的tDNA区间进行PCR扩增,扩增产物进行毛细管电泳,发现21种菌株可以在菌种水平上得到鉴定,其余的大致上可以分为两组。该方法可以区分只有一个碱基对长短差异的扩增片段,但敏感性较低。
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4 功能性基因的研究
在肠道细菌的研究中,特异性PCR引物或探针主要以16SrRNA基因序列为靶目标。然而在某些细菌如双歧杆菌中,16SrRNA序列高度保守,在每个染色体中有多个16SrRNA基因的拷贝。这些特点影响了根据16SrRNA核苷酸序列的鉴定和定量PCR方法的结果[2]。因此,国外学者用PCR法对某一基因序列分析来检测和鉴定双歧杆菌。目前研究较多的是双歧杆菌的转醛酶基因、乳酸脱氢酶基因和recA基因。双歧杆菌产生至少14种转醛酶(可以通过蛋白质电泳和血清学方法鉴别),这提示转醛酶的异构体的氨基酸序列不同,因此,转醛酶基因的核苷酸序列在菌种中亦不同。Requena等[15]用ForTal、RevTal2GC引物对双歧杆菌转醛酶基因进行PCR扩增,再进行,长双歧杆菌的两种亚型型、的敏感性。Roy,Kullen等利用recA基因对双歧杆菌进行鉴别,均取得了满意的结果。然而在功能性基因的研究中,选取一个很好的可以区分不同菌株的功能性基因很困难。5 RAPD RAPD应用随机设计的短的引物通过PCR方法获取随机扩增DNA片段,菌种之间DNA的变异可以通过RAPD片段大小和数量的不同加以区别。这个方法是以整个细菌的DNA基因组为研究对象,因此具有很高的敏感性和特异性,它可以对细菌在菌株的水平上进行鉴别。Vincent等[16]应用RAPD技术采用五个不同单一引物反应对六种双歧杆菌进行区别。他们认为与传统方法相比,RAPD技术有用且快速。DaudKhaled等[17]在单一的反应中应用两个引物进行多重RAPD对乳酸杆菌进行鉴别,其结果比单一的RAPD的结果重复性更高。Bouton等[18]认为RAPD或Rep2PCR分析的是扩增产物的序列和多态性,而PFGE基于限制性酶多态性分析整个细菌的DNA染色体。因此认为应用不同的分子技术对细菌的鉴定和分类会产生不同的结果,如果结合应用PCR和PFGE法,对菌群的鉴别更有效。
PCR技术的发展为微生态的发展开拓了崭新的新局面。对细菌rRNA及rDNA的分析提供了一个区别于传统的伯杰氏细菌分类系统的新的分类系统。分子生物学技术已经广泛应用于世界上很多实验室,对肠道微生态的研究产生巨大的推动作用。但回顾近20年来的发展,PCR技术同样存在许多问题。vonWintzingerode等[19]在1997年就对rRNA的PCR技术应用中所存在的问题作一综述,他认为在PCR分析中
每一物理、化学、生物学的步骤均会引起误差,包括样本的采集、细胞的裂解和核酸物质(RNA/DNA)的提取、PCR的扩增过程、16SrRNA基因扩增产物的分离、16SrRNA基因序列分析均会引起结果的误差。因此在肠道微生态的研究中,我们应该根据不同的研究对象,采取不同的分子生物学方法或联合应用某两种或几种方法,必要时可以结合应用传统的培养和生化鉴定方法才可能对肠道微生态有一个更全面的了解。
参 考 文 献
1SuauA,BonnetR,SutrenM,etal.analysisofgenesencoding16S
rRNAfromcomplexcommunitiesmanynovelmolecularspeciesthe].Microbiol,1999,65(11):47992GW.microflorausingmolecularmethods,,56(Suppl4):S44249.
3A,GrametG,SuauA,etal.Quantificationofbacterialgroupswithinhumanfecalflorabyoligonucleotideprobehybridization[J].ApplEnvironMicrobiol,2000,66(5):226322266.
4WangRF,BeggsML,RobertsonLH,etal.Designandevaluationofoligonucleotide2microarraymethodforthedetectionofhumanintestinalbacteriainfecalsamples[J].FEMSMicrobiolLett,2002,213(2):1752182.5WangRF,KimSJ,RobertsonLH,etal.Developmentofamembrane2arraymethodforthedetectionofhumanintestinalbacteriainfecalsamples[J].MolCellProbes,2002,16(5):3412350.
6VenturaM,ElliM,RenieroR,etal.MolecularmicrobialanalysisofBifidobacteriumisolatesfromdifferentenvironmentsbythespecies2specificamplifiedribosomalDNArestrictionanalysis(ARDRA)[J].FEMSMicrobiolEcol,2001,36(223):1132121.7FranksAH,HarmsenHJ,RaangsGC,etal.Variationsofbacterialpopula2tionsinhumanfecesmeasuredbyfluorescentinsituhybridizationwithgroup2specific16SrRNA2targetedoligonucleotideprobes[J].ApplEnvironMicrobiol,1998,64(9):333623345.8MoterA,GobelUB.Fluorescenceinsituhybridization(FISH)fordirectvisualizationofmicroorganisms[J].JMicrobiolMethods,2000,41(2):852112.9O′RiordanK,FitzgeraldGF.DeterminationofgeneticdiversitywithinthegenusBifidobacteriumandestimationofchromosomalsize[J].FEMSMicrobiolLett,1997,156(2):2592264.10GeversD,HuysG,SwingsJ.Aplicabilityofrep2PCRfingerprintingfor
identificationofLactobacillusspecies[J].FEMSMicrobiolLett,2001,205(1):31236
11CusickSM,O′sullivanDJ.Useofasingle,triplicatearbitrarilyprimed2
PCRprocedureformolecularfingerprintingoflacticacidbacteria[J].ApplEnvironMicrobiol,2000,66(5):222722231.12TannockGW,Tilsala2TimisjarviA,RodtongS,etal.Identificationoflactobacillus
isolatesfromthegastrointestinaltract,silage,andyoghurtby16S223SrRNAgeneintergenicspacerregionsequencecomparisons[J].ApplEnviroMicrobiol,1999,65(9):426424267.
13Tilsala2TimisjarviA,AlatossavaT.Developmentofoligonucleotideprimers
fromthe16S223SrRNAintergenicsequencesforidentifyingdifferentdairyandprobioticlacticacidbacteriabyPCR[J].IntJFoodMicrobiol,1997,35(1):49256.
14BaeleM,VaneechoutteM,VerhelstR,etal.Identificationoflactoba2cillus
speciesusingtDNA2PCR[J].JMicrobiolMethods,2002,50(3):2632271.15RequenaT,BurtonJ,MatsukiT,etal.Identification,detection,and
enumerationofhumanbifidobacteriumspeciesbyPCRtargetingthetransaldolasegene[J].ApplEnvironMicrobiol,2002,68(5):242022427.16VincentD,RoyD,MondouF,etal.Characterizationofbifidobacteriabyrandom
DNAamplification[J
].IntJFoodMicrobiol,1998,43(3):1852193.
17DaudKhaledAK,NeilanBA,HenrikssonA,etal.Identificationand
phylogeneticanalysisofLactobacillususingmultiplexRAPD2PCR[J].FEMSMicrobiolLett,1997,153(1):1912197.
18BoutonY,GuyotP,BeuvierE,etal.UseofPCR2basedmethodsandPFGE
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analysis[J].FEMSMicrobiolRev,1997,21(3):2132229.
(收稿日期:2003208213)
(本文编辑:程晓秋)
fortypingandmonitoringhomofermentativelactobacilliduringComtécheeseripening[J].IntJFoodMicrobiol,2002,76(122):27238.19vonWintzingerodeF,GobelUB,StackebrandtE.Determinationof
microbialdiversityinenvironmentalsamples:pitfallsofPCR2basedrRNA
感染性腹泻与肠道神经系统
黄祖雄1(综述) 叶礼燕2(审校)
(11福建医科大学福州总医院临床医学院儿科,福州350025;21南京军区福州总医院儿科,福州350025)
【摘要】 肠道液体的分泌和吸收受肠道神经系统(entericnervoussystem,ENS)的调控。近年来研究表明
ENS参与感染性腹泻的病理生理过程。ENS可能通过肠壁内的神经反射或外来初级感觉神经的轴突反射,促
进肠道液体分泌。通过作用于肠道神经的某一位点来减少肠道液体分泌, 【关键词】 腹泻; 肠神经系统; 止泻药
【中图分类号】 R44212 【文献标识码】 A2(2 ,毒。口服补液盐的问世大大降低了腹泻的病死率,口服补液盐仍是目前的主要治疗手段,但这种方法并不能减轻腹泻的病程和粪便量。因此,学者们一直致力于研究抑制肠道分泌、促进水钠吸收的止泻药物。近年来发现肠道神经系统(entericnervoussystem,ENS)参与感染性腹泻的发生,通过作用于肠道神经某一位点来减少肠道液体分泌,可能为止泻药物的研究指出新方向。
1 ENS的调节作用 肠道液体的吸收和分泌受交感神经、副交感神经和ENS的多重调控。ENS是位于胃肠壁内的自主神经系统,呈网状结构,大约含108个神经元,由肌间神经丛和黏膜下神经丛组成,前者控制胃肠运动,后者调节胃肠的分泌和吸收。ENS独立于大脑而行使其功能,但同时受脑的调节,每300个神经元由一来自中枢神经系统的交感、副交感传出纤维调控[1]。ENS含有20多种神经递质,其中乙酰胆碱、血管活性肠肽(VIP)和神经降压素等,可直接作用于肠细胞或间接作用于其它黏膜下神经元,促进肠液体分泌;而脑啡肽、生长抑素和神经肽Y等递质则可能通过抑制神经元活性,起到抗分泌或促进肠的水钠吸收作用。这些递质间构成相互协同、相互拮抗的复杂网络,使肠道的水、电解质吸收代谢处于相对平衡状态[2]。另外,ENS还可与邻近的免疫细胞相互作用,通过释放一些神经递质(如VIP、生长抑素等),影响炎症反应的发生;而免疫
细胞也可通过旁分泌形式释放介质,影响ENS对肠道
液体分泌的调节[3]。交感神经则可通过释放去甲肾上腺素,作用于ENS,抑制VIP能和胆碱能分泌运动神经元,减少肠腔液体分泌;副交感神经在肠液体分泌吸收中的作用尚不清楚。2 感染性腹泻与ENS
传统观点认为霍乱毒素(CT)通过环磷酸腺苷途径直接作用于隐窝细胞,刺激Cl-的分泌,并抑制肠绒毛上皮对Na+、Cl-的吸收,导致液体在肠腔累积过多超过结肠的吸收能力。但这主要是来自体外实验(如离体肠段试验)的结果,不能完全解释CT所致的大量水样便。Lundgren等[4]在研究CT致腹泻作用时,最早发现ENS参与腹泻的发生。他认为肠绒毛突向肠腔,与内容物密切接触,而隐窝细胞则位于深处,并不易直接与肠腔内容物接触,因此局部的微环境可直接影响绒毛对Na+、Cl-的吸收过程,但隐窝细胞的局部控制更可能有赖于间接的作用机制(如ENS作用)。利用经标记的CT研究发现,CT并不与肠腔的隐窝细胞直接接触,提示确实存在另外一种机制刺激隐窝细胞的Cl-分泌。
大量体内试验[4,5]证实,CT除了直接作用于肠细胞,还可能激活ENS后继发隐窝细胞的过度分泌。研究发现神经毒素、河豚毒素、六季双铵和利多卡因等神经阻滞剂可抑制CT所诱导的小肠液体分泌;利用苯扎氯铵破坏肠肌间神经丛后,CT便无法引起此段小肠的分泌反应;CT引发的腹泻还常伴有52羟色胺(52HT)、VIP和神经降压素等胃肠神经肽的增加;CT作用于肠黏膜后,可使肌间和黏膜下神经丛fos原癌产物表达增加,后者是神经活动的可靠标志。毫无疑问,ENS参与了霍乱的发生。Lundgren等的前驱工作使人
作者简介:黄祖雄(1978-),男,福建莆田人,在读硕士研究生,儿科感染消化专业
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分子生物学技术在肠道正常菌群研究中的应用
楼金 (综述) 陈洁(审校)
(浙江大学医学院附属儿童医院消化科,杭州310003)
【摘要】 对肠道正常菌群的研究方法主要有传统的微生物学方法和分子生物学方法。近几年来大量的分子生物学技术应用于肠道菌群的研究,取得了很大的进展,这些方法具有快速、方便、全面等优点。本文就
16SrRNA、16S～23SrRNA基因区间、随机扩增多态性DNA、变性梯度凝胶电泳、荧光原位杂交法、脉冲场凝胶
电泳等技术在肠道菌群研究中的应用进展作一综述。
【关键词】 细菌,厌氧; DNA,核糖体; 聚合酶链反应; 分子生物学
【中图分类号】 R378 【文献标识码】 A 【文章编号】 10012(2004)012 正常菌群在人体内分布很广,具有代表性究最有成效知肠道内栖息着大约114,是人体细胞总数的10～20倍,约400～500种。其中90%～9919%是厌氧菌。大量的研究结果表明,肠道内的细菌对人体的生长发育、免疫功能、营养、发病机制及健康等起着重要的作用。肠道内细菌的分离、鉴定和定量对于研究肠道内菌群的功能以及与机体的相互关系非常重要。
传统方法主要是通过微生物的选择性培养,再进行鉴定和分类。培养技术只能定量检测可培养的细菌,不能鉴定未知的细菌,低估了正常菌群的数量和多样性,同时不能阐明肠道微生物之间或与宿主的相互关系。而且,培养方法费时、费力,易受操作方法的影响。近年来大量的分子生物学技术应用于肠道微生态的研究,使我们对肠道微生物有了更完整的评价,对肠道中不能培养的细菌的研究在增加。1 16SrRNA及其基因16SrDNA的研究近几年来国内外学者采用各种分子生物学方法对细菌的16SrRNA进行研究,得到了广泛的细菌16SrRNA序列库。利用16SrDNA可以检测肠道中不能培养或生长缓慢的细菌。普遍存在的rDNA序列分析已经成为分类和检测细菌、评价种系关系的一个理想的工具。111 聚合酶链反应法 Suau等[1]用针对16SrRNA的细菌域通用引物,采用聚合酶链反应(PCR)法特异性扩增粪便标本的DNA,得到284个平均长度500bp的16SrDNA片段。对这些片段进行测序和种系分析发
82个分子菌种,其中:类杆菌、球形梭菌、柔嫩梭菌。只有24%的克隆与目前已知能培养的细菌相对应,而将近76%的扩增得到的rDNA序列与已知的细菌不一致,可能是肠道中迄今为止未知的细菌。因此,他认为,直接对粪便标本分析16SrDNA可以发现许多肠道中新的菌种,并且由此获得的肠道菌群的分子多态性为进一步分析不同年龄、饮食、胃肠道疾病和不同区域的人群的肠道菌群多样性提供了基础和比较框架。112 变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳 变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一个遗传指纹技术。首先从胃肠道标本中提取DNA,再用通用引物PCR法扩增16SrDNA。扩增产物包含了这个标本中存在的所有细菌的16SrDNA片段。不同细菌的16SrDNA片段通过DGGE凝胶时,可以在不同的尿素和甲酰胺浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中发生部分变性,迁移速度明显下降,从而加以分离。16SrDNA片段的分离产生了一个细菌群体的图谱,每一个DNA片段类型代表一个菌种[2]。温度梯度凝胶电泳(TGGE)与DGGE机制相同,不同的是凝胶中所采用的不是尿素和甲酰胺浓度梯度而是温度梯度。DGGE凝胶电泳与16SrRNA探针结合鉴定特异性的种、属、域。有用的PCR产物可以洗脱下来,再扩增进行序列分析。113 DNA2RNA杂交 DNA2RNA杂交法可以计算肠道中特殊菌群的比例。这种方法从标本中提取细菌RNA,在膜上与一系列放射性标记的寡核苷酸探针(每一个探针代表一个特殊的菌群)进行斑点杂交。以通用探针为对照,根据杂交程度来判断细菌所占的比例。Sghir等[3]在27个人的研究中,6个寡核苷酸探针可以检测占70%的通用探针检测到的16SrRNA,其中类杆菌2普氏杆菌2卟啉单胞菌占37%,球形梭菌占
作者简介:楼金 (19762),男,浙江东阳人,在读硕士研究生,从事小儿消化专业研究工作
・2・16%,柔嫩梭菌占14%,乳酸杆菌2链球菌2肠球菌、双
歧杆菌、肠杆菌各占1%。在DNA2RNA杂交法的应用
中,寡核苷酸探针只能从已知的细菌中获得,因此,该方法首先应对细菌进行种系分析或16SrDNA序列分析。
114 寡核苷酸微距阵法 寡核苷酸微距阵技术(oligonucleotidemicroarray)可以在一个载玻片上同时检测多个甚至数十个基因或目标DNA,它主要应用于基因的研究。Wang等[4]将其应用于粪便标本中细菌的检测。他们根据20种肠道菌种的16SrDNA序列设计了60个探针,置于载玻片上的微距阵中,制备了寡核苷酸微距阵玻片。用通用引物从粪便标本中扩增花青苷5(cyanine5)标记的16SrDNA,根据扩增产物与微距阵中的探针杂交程度的不同,没有杂交的距阵则不显示。Wang等[5],用硝酸纤维素薄膜距阵代替昂贵的微距阵设备,同样取得很好效果。115 扩增核糖体DNA限制性分析 对rDNA扩增产物用限制性内切酶进行酶切,根据酶切后不同的片段分析,对不同的菌株进行鉴别。Veatura等[6]用两个限制性内切酶对106株16种不同的双歧杆菌菌种的16SrDNA进行酶切,鉴定结果与特异性引物PCR扩增的结果一致,认为扩增核糖体DNA限制性分析是一个快速、敏感、容易控制的鉴定双歧杆菌的有效方法。116 其他11611 荧光原位杂交法 荧光原位杂交法(FISH)是采用免疫荧光标记的的寡核苷酸探针与目标检测物进行原位杂交,计算杂交率来定量检测和鉴定细菌。FISH优先检测活的有足够靶分子的细菌,对数量上占优势的细菌最适合。与PCR方法相比,它不需要选择性纯化或扩增步骤,可以提供一个更详细的微生物图谱。Franks等[7]设计了少部分能识别大部分种系免疫荧光标记的寡核苷酸探针,与16SrRNA序列相结合。结果这些探针能检测到大约2/3的大便标本中的细菌。在检测到的细菌中,类杆菌、梭菌、直肠真杆菌等占了将近一半。Moter等[8]认为FISH的结果很容易出现假阴性和假阳性结果。由于部分微生物可以发出自免疫荧光,出现假阳性结果。免疫荧光探针不易进入到细菌内、靶目标或探针的空间结构复杂,可出现假阴性。如果细菌中rRNA含量过低,则检出率下降。寡核苷酸探针通过不同细菌的细胞壁容易程度不一致,结果会出现偏差。11612 脉冲场凝胶电泳技术 脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)可以分离大小为50～1000kb的DNA片段,甚
至可以观察整个染色体,可用于分离细菌染色体等大分子DNA。PFGE已经成功的应用于分析不同细菌中的染色体构成,同时结合特异性的酶切技术用于菌种间或同一菌种不同菌株的鉴定。此外,它还可以为判断基因组的大小和基因图谱的建立提供有用的资料。O′Riordan等[9]应用PFGE结合限制性酶用于双歧杆菌种间及菌株间的鉴定。他认为尽管PFGE技术费时费力,但对很多菌属的菌株鉴别来讲它还是比核糖分型技术、十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳、随机扩增多态性DNA(RAPD)等更有效。
11613 重复细菌DNA元件的PCR扩增 重复细菌DNAPCR(Rep2)(在[10]认为Rep2PCR扩增,它有以下特点:有很适用于优势菌株,是一个应用于分类大量革兰氏阴性和阳性细菌的一个可靠工具。它是一个快速、易于操作、可重复性好的工具,可以达到菌株的水平。11614 三步任意引物PCR 任意引物PCR(AP2PCR)可以获得特征性的DNA片段,但只要反应条件的一点小小改变,就会影响条带的产生,重复性差。Cusick等[11]设计了三步任意引物PCR(TAP2PCR),用三个不同的退火温度,同时应用于三步反应,使条带的鉴定对温度变化敏感。认为TAP2PCR是一个简单、快速、价廉的技术。2 16S～23SrRNA基因区间序列的研究 16SrRNA的进化速度非常慢,基因序列保守,无法区分种系非常接近的菌种或同一菌种的不同菌株。而16S～23SrDNA区间序列的进化速度是16SrRNA的10倍,再加上16SrRNA端及23SrRNA端的高度保守序列,使16S～23SrDNA区间序列成为鉴别细菌的一个新的方法。Tannock等[12]对40个乳酸杆菌菌株16S～23SrRNA基因区间进行PCR扩增和序列分析,并与基因库中的参考菌株进行对比,发现9715%或更高的一致性。Tilsala2Timisjarvi等[13]设计了两条引物(1621A和23
21B),特异性的扩增16S～23SrRNA基因区间,成功的检测到类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、德氏乳杆菌等。3 转运RNA基因
Bale等[14]设计了针对转运RNA基因(tDNA)保守区的引物,对82种乳酸杆菌菌株的tDNA区间进行PCR扩增,扩增产物进行毛细管电泳,发现21种菌株可以在菌种水平上得到鉴定,其余的大致上可以分为两组。该方法可以区分只有一个碱基对长短差异的扩增片段,但敏感性较低。
・3・
4 功能性基因的研究
在肠道细菌的研究中,特异性PCR引物或探针主要以16SrRNA基因序列为靶目标。然而在某些细菌如双歧杆菌中,16SrRNA序列高度保守,在每个染色体中有多个16SrRNA基因的拷贝。这些特点影响了根据16SrRNA核苷酸序列的鉴定和定量PCR方法的结果[2]。因此,国外学者用PCR法对某一基因序列分析来检测和鉴定双歧杆菌。目前研究较多的是双歧杆菌的转醛酶基因、乳酸脱氢酶基因和recA基因。双歧杆菌产生至少14种转醛酶(可以通过蛋白质电泳和血清学方法鉴别),这提示转醛酶的异构体的氨基酸序列不同,因此,转醛酶基因的核苷酸序列在菌种中亦不同。Requena等[15]用ForTal、RevTal2GC引物对双歧杆菌转醛酶基因进行PCR扩增,再进行,长双歧杆菌的两种亚型型、的敏感性。Roy,Kullen等利用recA基因对双歧杆菌进行鉴别,均取得了满意的结果。然而在功能性基因的研究中,选取一个很好的可以区分不同菌株的功能性基因很困难。5 RAPD RAPD应用随机设计的短的引物通过PCR方法获取随机扩增DNA片段,菌种之间DNA的变异可以通过RAPD片段大小和数量的不同加以区别。这个方法是以整个细菌的DNA基因组为研究对象,因此具有很高的敏感性和特异性,它可以对细菌在菌株的水平上进行鉴别。Vincent等[16]应用RAPD技术采用五个不同单一引物反应对六种双歧杆菌进行区别。他们认为与传统方法相比,RAPD技术有用且快速。DaudKhaled等[17]在单一的反应中应用两个引物进行多重RAPD对乳酸杆菌进行鉴别,其结果比单一的RAPD的结果重复性更高。Bouton等[18]认为RAPD或Rep2PCR分析的是扩增产物的序列和多态性,而PFGE基于限制性酶多态性分析整个细菌的DNA染色体。因此认为应用不同的分子技术对细菌的鉴定和分类会产生不同的结果,如果结合应用PCR和PFGE法,对菌群的鉴别更有效。
PCR技术的发展为微生态的发展开拓了崭新的新局面。对细菌rRNA及rDNA的分析提供了一个区别于传统的伯杰氏细菌分类系统的新的分类系统。分子生物学技术已经广泛应用于世界上很多实验室,对肠道微生态的研究产生巨大的推动作用。但回顾近20年来的发展,PCR技术同样存在许多问题。vonWintzingerode等[19]在1997年就对rRNA的PCR技术应用中所存在的问题作一综述,他认为在PCR分析中
每一物理、化学、生物学的步骤均会引起误差,包括样本的采集、细胞的裂解和核酸物质(RNA/DNA)的提取、PCR的扩增过程、16SrRNA基因扩增产物的分离、16SrRNA基因序列分析均会引起结果的误差。因此在肠道微生态的研究中,我们应该根据不同的研究对象,采取不同的分子生物学方法或联合应用某两种或几种方法,必要时可以结合应用传统的培养和生化鉴定方法才可能对肠道微生态有一个更全面的了解。
参 考 文 献
1SuauA,BonnetR,SutrenM,etal.analysisofgenesencoding16S
rRNAfromcomplexcommunitiesmanynovelmolecularspeciesthe].Microbiol,1999,65(11):47992GW.microflorausingmolecularmethods,,56(Suppl4):S44249.
3A,GrametG,SuauA,etal.Quantificationofbacterialgroupswithinhumanfecalflorabyoligonucleotideprobehybridization[J].ApplEnvironMicrobiol,2000,66(5):226322266.
4WangRF,BeggsML,RobertsonLH,etal.Designandevaluationofoligonucleotide2microarraymethodforthedetectionofhumanintestinalbacteriainfecalsamples[J].FEMSMicrobiolLett,2002,213(2):1752182.5WangRF,KimSJ,RobertsonLH,etal.Developmentofamembrane2arraymethodforthedetectionofhumanintestinalbacteriainfecalsamples[J].MolCellProbes,2002,16(5):3412350.
6VenturaM,ElliM,RenieroR,etal.MolecularmicrobialanalysisofBifidobacteriumisolatesfromdifferentenvironmentsbythespecies2specificamplifiedribosomalDNArestrictionanalysis(ARDRA)[J].FEMSMicrobiolEcol,2001,36(223):1132121.7FranksAH,HarmsenHJ,RaangsGC,etal.Variationsofbacterialpopula2tionsinhumanfecesmeasuredbyfluorescentinsituhybridizationwithgroup2specific16SrRNA2targetedoligonucleotideprobes[J].ApplEnvironMicrobiol,1998,64(9):333623345.8MoterA,GobelUB.Fluorescenceinsituhybridization(FISH)fordirectvisualizationofmicroorganisms[J].JMicrobiolMethods,2000,41(2):852112.9O′RiordanK,FitzgeraldGF.DeterminationofgeneticdiversitywithinthegenusBifidobacteriumandestimationofchromosomalsize[J].FEMSMicrobiolLett,1997,156(2):2592264.10GeversD,HuysG,SwingsJ.Aplicabilityofrep2PCRfingerprintingfor
identificationofLactobacillusspecies[J].FEMSMicrobiolLett,2001,205(1):31236
11CusickSM,O′sullivanDJ.Useofasingle,triplicatearbitrarilyprimed2
PCRprocedureformolecularfingerprintingoflacticacidbacteria[J].ApplEnvironMicrobiol,2000,66(5):222722231.12TannockGW,Tilsala2TimisjarviA,RodtongS,etal.Identificationoflactobacillus
isolatesfromthegastrointestinaltract,silage,andyoghurtby16S223SrRNAgeneintergenicspacerregionsequencecomparisons[J].ApplEnviroMicrobiol,1999,65(9):426424267.
13Tilsala2TimisjarviA,AlatossavaT.Developmentofoligonucleotideprimers
fromthe16S223SrRNAintergenicsequencesforidentifyingdifferentdairyandprobioticlacticacidbacteriabyPCR[J].IntJFoodMicrobiol,1997,35(1):49256.
14BaeleM,VaneechoutteM,VerhelstR,etal.Identificationoflactoba2cillus
speciesusingtDNA2PCR[J].JMicrobiolMethods,2002,50(3):2632271.15RequenaT,BurtonJ,MatsukiT,etal.Identification,detection,and
enumerationofhumanbifidobacteriumspeciesbyPCRtargetingthetransaldolasegene[J].ApplEnvironMicrobiol,2002,68(5):242022427.16VincentD,RoyD,MondouF,etal.Characterizationofbifidobacteriabyrandom
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・4・
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(收稿日期:2003208213)
(本文编辑:程晓秋)
fortypingandmonitoringhomofermentativelactobacilliduringComtécheeseripening[J].IntJFoodMicrobiol,2002,76(122):27238.19vonWintzingerodeF,GobelUB,StackebrandtE.Determinationof
microbialdiversityinenvironmentalsamples:pitfallsofPCR2basedrRNA
感染性腹泻与肠道神经系统
黄祖雄1(综述) 叶礼燕2(审校)
(11福建医科大学福州总医院临床医学院儿科,福州350025;21南京军区福州总医院儿科,福州350025)
【摘要】 肠道液体的分泌和吸收受肠道神经系统(entericnervoussystem,ENS)的调控。近年来研究表明
ENS参与感染性腹泻的病理生理过程。ENS可能通过肠壁内的神经反射或外来初级感觉神经的轴突反射,促
进肠道液体分泌。通过作用于肠道神经的某一位点来减少肠道液体分泌, 【关键词】 腹泻; 肠神经系统; 止泻药
【中图分类号】 R44212 【文献标识码】 A2(2 ,毒。口服补液盐的问世大大降低了腹泻的病死率,口服补液盐仍是目前的主要治疗手段,但这种方法并不能减轻腹泻的病程和粪便量。因此,学者们一直致力于研究抑制肠道分泌、促进水钠吸收的止泻药物。近年来发现肠道神经系统(entericnervoussystem,ENS)参与感染性腹泻的发生,通过作用于肠道神经某一位点来减少肠道液体分泌,可能为止泻药物的研究指出新方向。
1 ENS的调节作用 肠道液体的吸收和分泌受交感神经、副交感神经和ENS的多重调控。ENS是位于胃肠壁内的自主神经系统,呈网状结构,大约含108个神经元,由肌间神经丛和黏膜下神经丛组成,前者控制胃肠运动,后者调节胃肠的分泌和吸收。ENS独立于大脑而行使其功能,但同时受脑的调节,每300个神经元由一来自中枢神经系统的交感、副交感传出纤维调控[1]。ENS含有20多种神经递质,其中乙酰胆碱、血管活性肠肽(VIP)和神经降压素等,可直接作用于肠细胞或间接作用于其它黏膜下神经元,促进肠液体分泌;而脑啡肽、生长抑素和神经肽Y等递质则可能通过抑制神经元活性,起到抗分泌或促进肠的水钠吸收作用。这些递质间构成相互协同、相互拮抗的复杂网络,使肠道的水、电解质吸收代谢处于相对平衡状态[2]。另外,ENS还可与邻近的免疫细胞相互作用,通过释放一些神经递质(如VIP、生长抑素等),影响炎症反应的发生;而免疫
细胞也可通过旁分泌形式释放介质,影响ENS对肠道
液体分泌的调节[3]。交感神经则可通过释放去甲肾上腺素,作用于ENS,抑制VIP能和胆碱能分泌运动神经元,减少肠腔液体分泌;副交感神经在肠液体分泌吸收中的作用尚不清楚。2 感染性腹泻与ENS
传统观点认为霍乱毒素(CT)通过环磷酸腺苷途径直接作用于隐窝细胞,刺激Cl-的分泌,并抑制肠绒毛上皮对Na+、Cl-的吸收,导致液体在肠腔累积过多超过结肠的吸收能力。但这主要是来自体外实验(如离体肠段试验)的结果,不能完全解释CT所致的大量水样便。Lundgren等[4]在研究CT致腹泻作用时,最早发现ENS参与腹泻的发生。他认为肠绒毛突向肠腔,与内容物密切接触,而隐窝细胞则位于深处,并不易直接与肠腔内容物接触,因此局部的微环境可直接影响绒毛对Na+、Cl-的吸收过程,但隐窝细胞的局部控制更可能有赖于间接的作用机制(如ENS作用)。利用经标记的CT研究发现,CT并不与肠腔的隐窝细胞直接接触,提示确实存在另外一种机制刺激隐窝细胞的Cl-分泌。
大量体内试验[4,5]证实,CT除了直接作用于肠细胞,还可能激活ENS后继发隐窝细胞的过度分泌。研究发现神经毒素、河豚毒素、六季双铵和利多卡因等神经阻滞剂可抑制CT所诱导的小肠液体分泌;利用苯扎氯铵破坏肠肌间神经丛后,CT便无法引起此段小肠的分泌反应;CT引发的腹泻还常伴有52羟色胺(52HT)、VIP和神经降压素等胃肠神经肽的增加;CT作用于肠黏膜后,可使肌间和黏膜下神经丛fos原癌产物表达增加,后者是神经活动的可靠标志。毫无疑问,ENS参与了霍乱的发生。Lundgren等的前驱工作使人
作者简介:黄祖雄(1978-),男,福建莆田人,在读硕士研究生,儿科感染消化专业