第３７卷
２００９年７月分析化学（ＦＥＮＸＩＨＵＡＸＵＥ）研究报告Ｃｈｉｎｅｓｅ第７期１０１９～１０２４ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
差速离心结合蛋白质组学技术研究
受镉盐胁迫后的牙鲆肝差异蛋白质
那宏坤１黄清育１黄河清¨’２’３
（厦门大学生命科学学院生物化学与生物技术学系‘，近海海洋环境科学国家重点实验室２，
化学化工学院固体表面物理化学国家重点实验室和化学生物学福建省重点实验室３，厦门３６１００５）
摘要人工构建镉盐污染源，选用差速离心结合双向凝胶电泳（２Ｄ—ＰＡＧＥ）法，高效提取、分离和筛选牙鲆
（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓｏｌｉｖａｃｅｕｓ，ＰＯ）受镉盐胁迫后的肝脏全蛋白和差异蛋白质。实验结果表明：选用直接裂解法提取
牙鲆肝（ＰＯｌｉｖｅｒＰＯＬ）全蛋白质且用２Ｄ—ＰＡＧＥ分离，可获得约８００个蛋白斑点，其中镉盐诱导了１１个差异蛋
白斑点。以相对离心力为１０００×ｇ、１２０００×ｇ和１０００００×ｇ的差速离心法，分别制备了３种沉淀蛋白和１种
胞浆蛋白，称为ＰＯＬ组分Ｉ、ＰＯＬ组分ＩＩ、ＰＯＬ组分Ⅲ和ＰＯＬ组分Ⅳ（胞浆蛋白），蛋白斑点数目分别为３８０、
５５０、５００和８５０个，总计２２８０个，明显高于直接裂解法。比较分析法发现，差速离心结合２Ｄ．ＰＡＧＥ分离技术
可获得牙鲆肝脏受镉盐胁迫后表达的５４个差异蛋白质，并适合于用肽质量指纹（ｐｅｐｔｉｄｅｍａｓｓｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ，
ＰＭＦ）图谱技术鉴定。本实验所建立的差速离心结合蛋白质组学技术可高效提取、分离和鉴定组织全蛋白或
差异蛋白，并能有效地筛选出蛋白指示物。
关键词牙鲆肝，蛋白质组学，差速离心，镉污染，蛋白指示物
１引言
建立高效提取与分离动植物及微生物组织细胞中的全蛋白，且可鉴定蛋白质的方法，是目前开展蛋白质组学研究所面临的技术难题之一【ｌ＇２Ｊ。双向凝胶电泳（２Ｄ—ＰＡＧＥ）和双向液相色谱分离（２Ｄ—ＬＣ）技术是目前开展蛋白质组学研究的常用分离技术，但前者易受细胞组织内干扰物影响，例如核酸、多糖和脂类物质旧１；而后者在分离过程中，易丢失部分蛋白质，难获取全蛋白【４Ｊ。目前，组织细胞全蛋白的常用破碎技术有丙酮沉淀法、裂解法、冻溶法和酶解法等【ｌ“Ｊ。针对生物材料来源不同，优化提取组织细胞全蛋白和减少内外干扰物是开展蛋白质组学必须克服的难题。至今，相关的研究已有大量且详细的研究报道【５．６Ｊ，但尚未建立一套较为成熟、重复性高和广谱性好的细胞组织全蛋白质提取方法。环境蛋白质组学是目前环境毒理学中最有挑战性和前瞻性的领域之一，相关的研究仅仅处于起步阶段。环境蛋白质组学能同时筛选与鉴定出由各类重金属和有机污染物，在单一和联合胁迫效应环境中所诱导的多种蛋白指示物¨’８Ｊ，为揭示复杂的毒理机理和评价危害性提供实验证据¨，２，９ｊ。
本实验以牙鲆肝脏组织为材料，选用差速离心和双向凝胶电泳非在线联用技术，高效提取和优化分离受镉盐胁迫前后的牙鲆肝脏全蛋白，为后续选用蛋白质组学技术筛选及鉴定监测镉污染程度及危害性的蛋白质标志物提供可信度较高的结果。
２实验部分
２．１仪器、试剂与材料
双向电泳仪（北京六一仪器厂）；ＲＥＦＬＥＸ型ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ质谱仪（德国Ｂｒｕｋｅｒ公司）；各类冷冻离心机（贝克曼公司）－ｂ载体两性电解质（Ａｍｅｒｓｈａｍ公司），ｐＨ３～１０；胰蛋白酶（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；基质ａ一氰一４一羟肉桂酸（美国ＩＣＮ生物医学公司）；碘乙酰胺（Ｓｉｇｍａ公司）；丙稀酰胺、甲叉丙稀酰胺等试剂均购自上海生物工程技术有限公司；匀浆缓冲液：０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖，１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，５０ｒｎｍｏｌ／Ｌ＂Ｉｒｉｓ—ＨＣｌ，１ｍｍｏｌ／ＬＰＭＳＦ（ｐＨ＝７．４）；样品裂解液：７ｍｏｌ／Ｌ尿素，４％ＣＨＡＰＳ，２ｍｏｌ／Ｌ硫脲，６０ｍｍｏＬ／ＬＤＩＴ，２００８．１２—１４收稿；２００９－０３—１３接受
本文系国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．４０７７６０６０）和福建省高校创新研究团队基金资助￥Ｅ・ｍａｉｌ：ｈｑｈｕａｎｇ＠ｘｌｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１０２０分析化学
ｍｍｏＬ／Ｌ第３７卷１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｌＰＭＳＦ，０．５％载体两性电解质，０．０００２％溴酚兰。分装，
一２０℃保存待用；双向电泳和银染方法中所需试剂均参考文献［１，１０］。
实验所需的牙鲆均购于厦门人工养殖场。使用前，牙鲆需在实验室驯养一周。实验前７２ｈ开始停止喂食，防止饲料中微量重金属影响牙鲆的正常代谢。随机选择牙鲆１０只，并随机分为实验组和对照组。实验组牙鲆置于人工模拟构建的ＣｄＣＩ，（１０ｍｇ／Ｌ）的污染环境中，继续饲养７２ｈ。对照组牙鲆置于在人工海水中继续饲养。实验前，选用剪断脊椎处死方式处理牙鲆，并迅速解剖，获取牙鲆肝脏，用预冷的磷酸盐缓冲液直接冲洗，并保存在一８０℃以备使用。
２．２差速离心提取牙鲆肝脏蛋白质
取实验组（受镉盐胁迫）５条牙鲆的肝脏（ＰＯＬ）各２０ｇ，混合后共１００ｇ。对照组的ＰＯＬ取法同上。加入等体积匀浆缓冲液，在冰浴条件下研磨制成匀浆。随后，以４００×ｇ的相对离心力离心１０ｍｉｎ，去除未磨碎的组织和细胞，收集上清液Ｉ，备用。选用下列差速离心技术，分步收集蛋白沉淀物，并选用２Ｄ．ＰＡＧＥ进行有效分离，具体实验步骤（始终维持在４℃环境下）：（１）１０００×ｇ沉淀分离ｉ以１０００×ｇ的相对离心力离心上清液Ｉ１０ｒａｉｎ，收集沉淀蛋白和上清液Ⅱ。该沉淀物主要是细胞核，用匀浆缓冲液洗涤两次，最后收集沉淀样品备用（一２０℃保存，下同）；（２）１２０００×ｇ沉淀的分离：以１２０００×ｇ的相对离心力离心上清液Ⅱ３０ｍｉｎ，收集沉淀蛋白和上清液Ⅲ。选用匀浆缓冲液洗涤该沉淀蛋白两次，最后收集沉淀样品备用；（３）１０００００×ｇ沉淀的分离：以１０００００×ｇ的相对离心力离心上清液Ⅲ３０ｍｉｎ，收集沉淀蛋白质和上清液Ⅳ。上清液Ⅳ中多数蛋白是胞浆蛋白，收集样品，冻干备用；（４）上述所有收集的蛋白组分分别充分溶解于裂解液中，并选用１０００００×ｇ的相对离心力离心蛋白样品１０ｍｉｎ，分别收集上清液，称为ＰＯＬ蛋白组分Ｉ（１０００×ｇ沉淀蛋白）、ＰＯＬ蛋白组分Ⅱ（１２０００×ｇ沉淀蛋白）、ＰＯＬ蛋白组分Ⅲ（１０００００×ｇ沉淀蛋白）和ＰＯＬ蛋白组分Ⅳ（胞浆蛋白），并用于双向电泳分离。
２．３双向凝胶电泳分离条件
２．３．１等电聚焦电泳在上样之前，参考文献［１０］先进行预电泳。预电泳结束后，换上样品液，在用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定样品液的总蛋白浓度后，以１５０峭总蛋白上样，然后进行等电聚焦电泳。
２．３．２凝胶电泳按照ＳＤＳ均一胶的配方配置１１％胶浓度的凝胶。将平衡后的胶条转移到ＳＤＳ凝胶上，并在胶条上覆盖一层含有溴酚兰的０．５％琼脂糖，在１４０Ｖ的恒定电压下进行电泳。待溴酚兰前沿到达凝胶底端时，停止电泳。
２．４银染、图像分析及蛋白鉴定
参照文献［１０］的银染方法进行蛋白质染色。染色后，利用扫描仪对ＳＤＳ凝胶板进行透射扫描。选用Ｍｅｌａｎｉｅ４Ｔｒｉａｌ软件进行凝胶电泳图谱中的蛋白质总数和差异斑点分析与统计。用ＲＥＦＬＥＹ型ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ质谱仪获得各蛋白的肽质量指纹图，采用反射模式、正离子谱测定。激光波长为３３７ｎｍ，质谱信号单次扫描累加２００次，用ＢＲＵＫＥＲ肽混合物作外标。选用常规ＰＭＦ和数据库比对技术直接鉴定差异蛋白质…Ｊ。数据库选择ＭＳＤＢ，检索基本
条件参照文献［１０］。
３结果与讨论
３．１直接裂解法ＰｏＬ全蛋臼分离
图１是牙鲆受金属镉胁迫后，采取直接裂解
法提取ＰＯＬ全蛋白质的２Ｄ—ＰＡＧＥ图谱。从图ｌ
可看出，实验组和对照组的蛋白质斑点分布趋势
采用Ｍｅｌａｎｉｅ图１直接裂解法提取的牙鲆肝脏全蛋白双向电泳图基本：警，具有较好竺戮；一礓ｈ晤觑匕黼：嘉－富‘：：ｏ～ｎａｌｐｏｌ咖ｙａｃｒｙ。ｌａ，胁ｍｉｄｅ琊ｇ。ｅ嵩ｔｒｏ眦ｐｈｏｒ。ｅ眦ｓｉｓ４嘶ａｌ软件进行蛋白质斑点数…一…ｉ一．７．‘－＿７。ｊ‘＿………………”～７………
ｍｓ／ＬＣｄＣＩ：）；Ｂ．对照组（。。ｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）。
目统计与分析，对照组和实验组２Ｄ－ＰＡＧＥ图谱中的蛋白质斑点数目约为８００个，其中多数蛋白质
斑点的ｐＩ范围集中在４。５—９．０之间，蛋白质亚Ａ．实验组（唧。ｒｉ。。ｔａｊ刚ｐ）：ｌｏｍｇ／Ｌ镉盐处理（嘞ｔｅｄ１０ｗｉｔｈ
第７期那宏坤等：差速离心结合蛋白质组学技术研究受镉盐胁迫后的牙鲆肝差异蛋白质１０２１基的分子量在２５—１００ｋＤ之间，具有较高的分辨率，适合于后续蛋白质鉴定。
通过比对分析，可获得１１个差异蛋白质斑点，其中高表达蛋白２个（Ａ６和Ａ１１）；上调蛋白６个（Ａ１、Ａ４、Ａ７、Ａ８、Ａ９和Ａ１０）；下调蛋白３个（Ａ２、Ａ３和Ａ５）。这些差异蛋白斑点均与受镉盐诱导有关，推测是牙鲆肝脏产生的应激蛋白质。
３．２优化建立差速离心法分离ＰＯＬ全蛋白质技术
肝脏是动物代谢的重要场所之一，具有各类复杂代谢途径和含有丰富的蛋白质。借鉴文献［１２］，选用２Ｄ．ＰＡＧＥ分离法可获得约近千个鼠肝脏全蛋白斑点数的实验结果。
本实验选用直接裂解法提取ＰＯＬ全蛋白，但只获取约８００个蛋白斑点的２Ｄ—ＰＡＧＥ图谱。显然，图１中的全蛋白质斑点数偏少，不太适合进一步深入开展ＰＯＬ蛋白质组学研究，尤其不适合研究镉盐毒理学和筛选连续监测流动水体镉污染程度的蛋白指示物。在系列比对实验基础上，建立了差速离心法高效提取牙鲆肝脏全蛋白技术，具体实验步骤见图２。图２显示了选用差速离心法使牙鲆肝脏中不同沉降系数的蛋白质得到粗分离，减少高丰度蛋白的干扰和提高低丰度蛋白富集的效果，有助于开展牙鲆肝脏全蛋白组学研究和筛选差异蛋白质。
Ｃｅｎ舢ｔｒｉｆｕｇｅⅡ
离心
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ１０００。ｇ，１０ｍｉｎ≮｝离心Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ收集沉淀样品Ｂ月．溶解ＣｏｌｌｅｃｔｔｈｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅＢａｎｄｔｈｅｎｄｉｓｓｏｌｖｅｉｔ．
收集卜清液Ⅳ（胞浆蛋向）
ＣｏｌｌｅｃｔｓａｍｐｌｅＩＶｉｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
（ｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｃｅｌｌｐｌａｓｍａ）胁１０００离心Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｐ，－。ｇ１０ｍｉｎ一圆
４图２差速离心法分离牙鲆肝全蛋白主要实验步骤示意图Ｆｉｇ．２ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍａｐｏｆｐｒｏｔｅｏｍｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｉｎＰＯＬ目前，常用于动物肝脏全蛋白质提取技术且适合于开展蛋白质组学研究方法有ＴＣＡ／丙酮酸沉淀法、缓冲液法、裂解法及“鸟枪”蛋白质组分析法【１３’１４３等。但这些方法获取肝脏全蛋白种类大都低于１５００种，明显少于本实验建立的差速离心提取技术。３．３在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ｉ的差异蛋白图３是在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ｉ全蛋白和差异蛋白图谱。采用ＭｅｌａｎｉｅＴｒｉａｌ软件对图解中
的蛋白质斑点数目进行统计与分析，可在亚细胞组分Ｉ中获得约３８０个蛋白质斑点。比较图３Ａ（实验组）和图３Ｂ（对照组），可获得１１个差异蛋白斑点。其中Ａｌ、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ６、Ａ７和Ａ８为上调蛋白，而Ａ５、Ａ９、Ａ１０和Ａ１１为下调蛋白。
３．４在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅱ的差异蛋白
图４是在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅱ全蛋白和差异蛋白的２Ｄ．ＰＡＧＥ图谱。经统计与分析后，发现亚细胞组分Ⅱ中获得约５５０个蛋白斑点。
比较图４Ａ（实验组）和图４Ｂ（对照组）蛋白斑点分布和差异特性，可获得１３个差异蛋白斑点，其中
１０２２分析化学第３７卷的Ａ１和Ａ４斑点为上调蛋白；Ａ２、Ａ３、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１ｌ和Ａ１２斑点为下调蛋白；ＡＳ、Ａ１０和Ａ１３为高表达蛋白（ｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ）。
图３在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ｉ全蛋白的２Ｄ．图４在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅱ全蛋白的２Ｄ—ＰＡＧＥ图谱ＰＡＧＥ图谱
Ｆｉｇ．３２Ｄ－ＰＡＧＥｍａｐｏｆｐｒｏｔｅｏｍｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔＩｏｆＰＯＬＦｉｇ．４２Ｄ－ＰＡＧＥｍａｐｏｆｐｒｏｔｅｏｍｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔＩＩｏｆＰＯＬｕｎｄｅｒｓｔｒｅｓｓｏｆｃａｄｍｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｕｎｄｅｒｇ，ｔｒｅｆｌ．ｓｏｆｃａｄｍｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ
Ａ．实验组（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ）：１０ｍｇ／Ｌ镉盐处理（ｔｒｅａｔｅｄＡ．实验组（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ）：１０ｍｇ／Ｌ镉盐处理（ｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ１０ｍｇ／ＬＣｄＣｌ２）；Ｂ．对照组（ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）。ｗｉｔｈ１０ｎｃ／ＬＣｄＣｌ２）；Ｂ．对照组（ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）。
３．５在镉盐胁迫下。牙鲆肝脏组分Ⅲ的差异蛋白
图５是在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅲ的全蛋白和差异蛋白质的２Ｄ—ＰＡＧＥ图谱。经分析与统计，可获悉图５显示出约５００个蛋白斑点。比对图５Ａ和图５Ｂ结果，可进一步获悉两图之间约有１４个差异蛋白斑点。其中的ＡＩＯ、Ａ１ｌ和Ａ１４斑点为上调蛋白；Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１２和Ａ１３斑点为下调蛋白。
３．６在镉盐胁迫下。牙鲆肝脏组分Ⅳ的差异蛋白
通常认为，细胞破碎液经１０００００×ｇ的相对离心力离心后所获得的蛋白上清液视为细胞的胞浆蛋白。根据３．２节所描述的实验步骤和离心率可获悉，牙鲆肝脏组分Ⅳ属于胞浆蛋白质。在镉盐胁迫下，所获得牙鲆肝脏组分Ⅳ的差异蛋白质，视为金属镉胁迫牙鲆肝脏表达的差异胞浆蛋白。从图６中可看出牙鲆肝脏组分Ⅳ含有约８５０个蛋白斑点，其胞浆蛋白质种类明显高于其它牙鲆肝脏组分的蛋白质种类，说明了牙鲆肝脏含有丰富的胞浆蛋白质。比较图６Ａ和图６Ｂ中的差异蛋白斑点分布情况和规律可获悉，在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏表达了１６种差异蛋白，其差异蛋白总数目多于其它ＰＯＬ组分。其中高表达的蛋白质为Ａ１、Ａ２、Ａ４和Ａ９；上调蛋白为Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ１０、Ａ１１和Ａ１４；下调蛋白为Ａ３、Ａ８、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１５和Ａ１６。
图５在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅲ全蛋白的２Ｄ—图６在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组Ⅳ全蛋白的２Ｄ．ＰＡＧＥＰＡＧＥ图谱图谱
Ｆｉｇ．５２Ｄ－ＰＡＧＥｍａｐｏｆｐｒｏｔｅｏｍｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔⅢｏｆＰＯＬＦｉｇ．６２Ｄ－ＰＡＧＥｍａｐｏｆｐｒｏｔｅｏｍｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔＩＶｏｆｕｎｄｅｒｓｔｒｅｓｓｏｆｃａｄｍｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅＰＯＬｕｎｄｅｒｓｔｒｅｓｓｏｆｃａｄｍｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ
Ａ．实验组（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ）：１０ｍｇＬ镉盐处理（ｔｒｅａｔｅｄＡ．实验组（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ）：１０ｍｇ／Ｌ镉盐处理（ｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ１０ｍｓ／ＬＣｄＣｌ２）；Ｂ．对照组（ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）。ｗｉｔｈ１０ｍｇ／ＬＣｄＣｌ２）；Ｂ．对照组（ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）。
进一步选用肽质量指纹（ＰＭＦ）图谱和数据库比对技术对上述５４个差异蛋白进行鉴定。结果发现，有３种同类差异蛋白，即共有５１个不同的差异蛋白。在鉴定结果中发现了一些文献［１５，１６］中已报道
的与镉盐胁迫有关的蛋白（见表１）。
第７期
表１那宏坤等：差速离心结合蛋白质组学技术研究受镉盐胁迫后的牙鲆肝差异蛋白质１０２３牙鲆肝脏中表达的与镉盐胁迫有关的差异蛋白的质谱鉴定
ＭＳｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＰＯＬ．．—ｃ—ｏｎｃｅｒｎｅｄｗｉｔｈｓｔｒｅｓｓＴａｂｌｅ１ｏｆｃａｄｍｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ
总结图３—６中所显示的蛋白斑点数目可获悉，选用差速离心法分离牙鲆肝脏的全蛋白种类约２２８０个，明显高于直接裂解法（８００个蛋白斑点）的结果。虽然选用不同离心力分离ＰＯＬ亚细胞蛋白组分之间含有同一类蛋白，但只发现存在少量同类蛋白质，说明了选用差速离心法所获取的ＰＯＬ全蛋白中只含有少量的同类蛋白质，推测所获得的蛋白种类应高于２０００种，适合于开展ＰＯＬ蛋白质组学研究。在镉盐胁迫下，同样也获取５４种差异蛋白，其中只有３种同类差异蛋白，即镉盐胁迫牙鲆肝脏表达了５１种差异蛋白，这也适合于筛选潜在的可用于研究金属镉毒理学和监测流动水体重金属污染的蛋白质指示物。显然，差速离心结合双向电泳技术显著提高了牙鲆肝全蛋白的分离效率和差异蛋白的检出率。
由于动物组织、细胞及卵等中蛋白质种类间存在丰度差异¨７｜，现有的全蛋白提取与分离技术不易通过单一的２Ｄ．ＰＡＧＥ方法同时显示高低丰度不同的蛋白质。而本实验所建立的差速离心技术结合蛋白质组学技术，不仅降低蛋白之间产生沉淀现象，而且还使许多低丰度蛋白得以富集和鉴定，从中获取更多的蛋白种类。在蛋白的分离效率上明显高于现有的全蛋白提取与分离技术，如直接裂解法，适合开展蛋白质组学研究和筛选与鉴定差异蛋白质组学。前人研究已发现，热激蛋白质７０Ｓ（ＨＳＰ７０）和过氧化氢酶均可作为监测金属镉污染或氧化损伤的指示蛋白０１５，１６］。从表１所鉴定的差异蛋白质种类中也含有这两种蛋白。此外，Ｖ型ＡＴＰ酶和细胞骨架相关蛋白（例如：Ｂｅｔｅ微管蛋白和ａｃｔｉｎ）等均与镉代谢和受镉抑制表达有关。这说明，选用蛋白质组学及相关分析技术可筛选并鉴定许多潜在的适合作为蛋白质指示物且可用于开展镉毒理学机理、污染程度的关键指示蛋白质¨ｎ驯。
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
１ＢａｏＸｉａｏ—Ｄｏｎｇ（包晓东），ＨｕａｎｇＬｉｎ（黄琳），ＨｕａｎｇＨｅ・Ｑｉｎｇ（黄河清），ＣａｉＺｏｎｇ－Ｗｅｉ（蔡宗苇）．Ｃｈｉｎｅｓｅ上Ａｎａｌ．
Ｃｈｅｍ．（分析化学），２∞８，３６（４）：４３３—４３８
２
３ＺｈｕＦｅｎｇＪＹ，ＨｕａｎｇＨＱ，ＢａｏＸＤ，ＬｉｎＱＭ，ＣａｉＺＷ．Ａｑｕａｔ．Ｔｏｘｉｃ０１．，２晰，７８（２）：１２７～１３５Ｌｉ—Ｊｉａｎ（冯丽剑），ＨｕａｎｇＬｉｎ（黄琳），ＺｈｏｕＨｕｉ—Ｑｉｎ（卓慧钦），ＨｕａｎｇＨｅ—Ｑｉｎｇ（黄河清）．Ｃｈｉｎｅｓｅ上Ａｎａｌ．
Ｃｈｅｍ．（分析化学），２００８，３６（５）：５５７—５８２
４ＺｅｎｇＸＨ，ＨｕａｎｇＨＱ，ＣｈｅｎＤＳ，ＪｉｎＨＷ，ＨｕａｎｇＨＹ．Ｉｎｔｅｒｎ．上ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏ．，２００７，２６１：１０８～１１４
５“Ｎａ（李娜），ＹａｎｇＰｅｎｇ－Ｙｕａｎ（杨苋原）．Ｃｈｉｎｅｓｅ上Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（分析化学），２００８，３６（４）：４４９—４５３
６
７
８
９
ｌＯＧａｚｚａｎａＧ，ＢｏｒｌａｋＪ．上Ｐｒｏ把ｏｍｅＲｅｓ．，２００７，６（８）：３１４３—３１５１Ｗ，ＢａｈｋＪＤ，ＬｅｅＢＨ．￡尼Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，２００７，３３０（ｔｏ）：７３５—７４６ＡｈｓａｎＮ，ＬｅｅＳＨ，ＬｅｅＤＧ，ＬｅｅＨ，ＬｅｅＳＳｉｌｖｅｓｔｒｅＦ，ＤｉｅｆｉｅｋＪＦ，ＤｕｍｏｎｔＶ，ＤｉｅｕＭ，ＲａｅｓＭ，ＤｅｖｏｓＰ．Ａｑｕａｔ．Ｔｏｘｉｃｏｌ，２００６，７６（１）：４６—５８Ｌ．ＭａｒｍｉｍｌｉＮ．Ｅｖｎｉｒｏ．Ｐｏｉｌｕ．，２∞８，１５６（３）：ｌ１２１一】１２７ＲｕｓｔｉｃｈｅｌｌｉＣ．ＶｉｓｉｏｌｊＧ，ＫｏｓｔｅｅｋａＤ，ＶｔｔｒｒｏＥ，ＳａｎｉｔａｄｉＴＮａＨｏｎｇ—Ｋｕｎ（那宏坤），ＨｕａｎｇＱｉｎｇ—Ｙｕ（黄清育），ＣｈｅｎＹｉｎｇ－Ｙｉｎｇ（陈盈盈），ＨｕａｎｇＨｅ—Ｑｉｎｇ（黄河清）．Ｃｈｉｎｅｓｅ
ＪｏｕｒｎａｌＣｈｒｏｍａｗｇｒａｐｈｙ（色谱），２０惦，２６（６）：６６２～６６４
分析化学
１１Ｚｈｕｏ第３７卷Ｈｕｉ－Ｑｉｎ（卓慧钦），ＪｉｎＨｏｎｇ－Ｗｅｉ（金宏伟），ＨｕａｎｇＨｅ．Ｑｉｎｇ（黄河清），ＨｕａｎｇＨｕｉ—Ｙｉｎｇ（黄慧英），Ｃａｉｚｏｎｇ－ｗｄ
Ｊ，ＹａｎｇＰＹ，ＺｈａｎｇＸ（蔡宗苇）．Ｃｈｉｎｅｓｅ上Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（分析化学），２１１０７，３５（６）：７９１—７９６１２
１３
１４ＧａｏＭＸ，ＩＡＮ，ＺｌＩａｎｇＺｈａｎｇＸｕｅＭ．ＳＯ，．Ｐ耐Ｔｅｃｈｎ０１．，２００６，５２：１７０—１７６Ｊ，ＸｕＸＱ，ＧａｏＭＸ，ＹａｎｇＰＹ，ＺｈａｎｇＸＭ．Ｐｒｏｔｅｏｍ／ｃｓ，２００７，７：５００—５１２Ｘｉａｏ・Ｆａｎｇ（薛晓芳），ＷｕＳＯＩｌｇ・Ｆｅｎｇ（吴松峰），ＺｈｕＹｕｎ．Ｐｉｎｇ（朱云平），ＨｅＦｕ－Ｃｈｕ（贺福初）．Ｃｈｉｎｅｓｅ上Ａｎａｌ．
Ｃｈｅｍ．（分析化学），２００７。３５（１）：１９—２４
１５
１６
１７ＲａｄｌｏｗｓｋａＭ，ＰｅｍｐｋｏｗｉａｋＦｒａｎｋＶ，ＥｖａＨｕａｎｇＪ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｉｎｔｅ舰，２００２，２７：６０５—６０８Ｖ，ＪａｍｅｓＦＤ，ＤｉｒｋＩ．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００１，１６１：４０５—４１４Ｈｕｉ—ＹｉｎｇＨｅ－Ｑｉｎｇ（黄河清），ＬｕＹｏｎｇ－Ｊｉｎ（陆永进），ＬｉｎＱｉｎｇ－Ｍｅｉ（林庆梅），ＺｈｕｏＨｕｉ—Ｑｉｎ（卓慧钦），Ｈｕａｎｇ
（黄慧英）．Ｃｈｉｎｅｓｅ上Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（分析化学），２，００７，３５（８）：１１０５—１１１０
ＨｕａｎｇＬｉｎ（黄琳），ＣｈｅｎＤｏｎｇ—ｓｈｉ（陈东仕），ＹａｈＬｉ（颜利），ＦａｎｇＣａｉ－Ｗａｎｇ（方财王），ＨｕａｎｇＨｅ－Ｑｉｎｇ（黄河清）．
ＪＹ，ＨｕａｎｇＬ，ＨｕａｎｇＨＱ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｔｏｘｉｃ０１．Ｐｈａｒｍａｃ０１．，２００９，２７：２１２—２１８Ｃｈｅｍ．上ＣｈｉｎｅｓｅＵｎｉｖｅｒｓｔｉｅｓ（高等学校化学学报），２００９，３０：３１４～３１９１９
２０“１１９ＸＰ，ＺｈｕＣｈｅｎＨａｉ—Ｂｉｎ（陈海滨），ＨｕａｎｇＬｉｎ（黄琳），ＨｕａｎｇＱｉｎｇ－Ｙｕ（黄清育），ＺｈｕＦｅｎｇ（朱峰），ＬｉｎｇＸｕｅ－Ｐｉｎｇ（凌雪萍），
Ｈｅ—Ｑｉｎｇ（黄河清）．Ｃｈｉｎｅｓｅ工Ａｎｄ．Ｃｈｅｍ．（分析化学），２１１０９，３７（６）：８０１～８０５Ｈｕａｎｇ
ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＬｉｖｅｒＲｅｖｅａｌｅｄｗｉｔｈａＣｏｍｂｉｎｅｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆ
ｂｏｔｈＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎａｎｄＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓｉｎＰａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ
ＯｌｉｖａｃｅｕｓＵｎｄｅｒＳｔｒｅｓｓｏｆＣａｄｍｉｕｍＳａｌｔ
ＮＡＨｏｎｇ－Ｋｕｎｌ，ＨＵＡＮＧＱｉｎｇ．Ｙｕｌ，ＨＵＡＮＧＨｅ—Ｑｉｎｇ＋１’２’３
１（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２（Ｓｔａｔｅ
１ａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭａｒｉｎｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＸｉａｍｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ３６１００５）ＥｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｘｉａｍｅｎ３６１００５）ａｎｄＳｔａｔｅ０ＴｈｅＸ呵ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ研Ｆｕｊｉａｎ
ＳｕｒｆａｃｅＣｏｌｌａｇｅＰｒｏｖｉｎｃｅＫｑＬａｂｏｒａｔｏｒｙ《ＰｈｙｓｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ《ＳｏｌｉｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＸｉａｍｅｎｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｘｉａｍｅｎ３６１００５）
ＡｂｓｔｒａｃｔＢｏｔｈｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｏｍｅａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｅｘｔｒａｃｔｅｄ，ｓｅｐａｒａｔｅｄａｎｄｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙａｃｏｍｂｉｎｅｄａｐｐｒｏａｃｈｏｆｂｏｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ
ｕｎｄｅｒｔｈｅｓｔｒｅｓｓｏｆｃａｄｍｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅａｓａｎｄ２Ｄ—ＰＡＧＥｉｎｌｉｖｅｒｏｆＰａｒａｌｉｃｈｔｙｓｏｌｉｖａｃｅｕｓ（ＰＯＬ）ｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆａｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌｐｏｌｌｕｔｉｏｎｓｏｕｒｃｅ．Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ８００ｓｐｏｔｓ
ｗｈｏｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｐａｒａｔｅｄｗｉｔｈ２Ｄ—ＰＡＧＥｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｄｉｒｅｃｔｌｙｓｉｓｉｎｔｈｅＰＯＬ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ１１ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＰＯＬｗｅｒｅａｌｓｏｏｂｔａｉｎｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅ
ａｓｔｒｅｓｓｏｆｃａｄｍｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｐｒｅｐａｒｅ
ＰＯＬｔｈｒｅｅｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｐｌａｓｍｏｌｙｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｃａｌｌｅｄＰＯＬｃｏｍｐｏｎｅｎｔＩ，ｃｏｍｐｏｎｅｎｔＩＩ，ＰＯＬ
ｓｐｏｔｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔＩｌｌ，ａｎｄＰＯＬｃｏｍｐｏｎｅｎｔ１Ｖ（ｐｌａｓｍｏｌｙｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｅａｃｈｇｅｌｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄｔｏｈａｖｅ３８０，５５０，５００，ａｎｄ８５０，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ２２８０
ａｒｅｓｐｏｔｓ
ｅｎｔｉａｌｉｎｓｕｍ，ｗｈｉｌｅｔｏｔａｌｓｐｏｔｓｍｕｃｈｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｂｙｄｉｒｅｃｔｌｙｓｉｓａｐｐｒｏａｃｈ．Ｕｓｉｎｇｔｈｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎａｍｅｔｈｏｄ，ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ５４ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＰＯＬｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｃｏｍｂｉｎｅｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｂｏｔｈｄｉｆｆｅｒ－ａｎｄｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｐｏｌｙａｃｙｌａｍｉｎｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２Ｄ－・ＰＡＧＥ）ｍｅｔｈｏｄｓ
ｃａｒｌｕｎｄｅｒｔｈｅｓｔｒｅｓｓｏｆｃａｄｍｉ・－ｐｅｐｔｉｄｅｍａｓｓｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ
ｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｗｈｏｌｅａｍｃｈｌｏｒｉｄｅ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｓｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｂｅｆｕｒｔｈｅｒｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙ（ＰＭＦ）．Ｈｅｒｅ，ｔｈｅｓｅｃｏｍｂｉｎｅｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｃａｌｌｂｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔ，ｓｅｐａｒａｔｅａｎｄ
ｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒｓｉｎｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｔｉｓｓｕｅ．
ＫｅｙｗｏｒｄｓＰａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓｏｌｉｖａｃｅｕｓｌｉｖｅｒ，ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ．ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ，ｃａｄｍｉｕｍｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ，
（Ｒｅｃｅｉｖｅｄ１４Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００８；ａｃｃｅｐｔｅｄ１３Ｍａｒｃｈ２００９）
差速离心结合蛋白质组学技术研究受镉盐胁迫后的牙鲆肝差
异蛋白质
作者：
作者单位：
刊名：
英文刊名：
年，卷(期)：
被引用次数：那宏坤， 黄清育， 黄河清， NA Hong-Kun， HUANG Qing-Yu， HUANG HE-Qing厦门大学生命科学学院生物化学与生物技术学系,近海海洋环境科学国家重点实验室,厦门,361005分析化学CHINESE JOURNAL OF ANALYTICAL CHEMISTRY2009,37(7)1次
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引证文献(1条)
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_fxhx200907016.aspx
第３７卷
２００９年７月分析化学（ＦＥＮＸＩＨＵＡＸＵＥ）研究报告Ｃｈｉｎｅｓｅ第７期１０１９～１０２４ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
差速离心结合蛋白质组学技术研究
受镉盐胁迫后的牙鲆肝差异蛋白质
那宏坤１黄清育１黄河清¨’２’３
（厦门大学生命科学学院生物化学与生物技术学系‘，近海海洋环境科学国家重点实验室２，
化学化工学院固体表面物理化学国家重点实验室和化学生物学福建省重点实验室３，厦门３６１００５）
摘要人工构建镉盐污染源，选用差速离心结合双向凝胶电泳（２Ｄ—ＰＡＧＥ）法，高效提取、分离和筛选牙鲆
（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓｏｌｉｖａｃｅｕｓ，ＰＯ）受镉盐胁迫后的肝脏全蛋白和差异蛋白质。实验结果表明：选用直接裂解法提取
牙鲆肝（ＰＯｌｉｖｅｒＰＯＬ）全蛋白质且用２Ｄ—ＰＡＧＥ分离，可获得约８００个蛋白斑点，其中镉盐诱导了１１个差异蛋
白斑点。以相对离心力为１０００×ｇ、１２０００×ｇ和１０００００×ｇ的差速离心法，分别制备了３种沉淀蛋白和１种
胞浆蛋白，称为ＰＯＬ组分Ｉ、ＰＯＬ组分ＩＩ、ＰＯＬ组分Ⅲ和ＰＯＬ组分Ⅳ（胞浆蛋白），蛋白斑点数目分别为３８０、
５５０、５００和８５０个，总计２２８０个，明显高于直接裂解法。比较分析法发现，差速离心结合２Ｄ．ＰＡＧＥ分离技术
可获得牙鲆肝脏受镉盐胁迫后表达的５４个差异蛋白质，并适合于用肽质量指纹（ｐｅｐｔｉｄｅｍａｓｓｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ，
ＰＭＦ）图谱技术鉴定。本实验所建立的差速离心结合蛋白质组学技术可高效提取、分离和鉴定组织全蛋白或
差异蛋白，并能有效地筛选出蛋白指示物。
关键词牙鲆肝，蛋白质组学，差速离心，镉污染，蛋白指示物
１引言
建立高效提取与分离动植物及微生物组织细胞中的全蛋白，且可鉴定蛋白质的方法，是目前开展蛋白质组学研究所面临的技术难题之一【ｌ＇２Ｊ。双向凝胶电泳（２Ｄ—ＰＡＧＥ）和双向液相色谱分离（２Ｄ—ＬＣ）技术是目前开展蛋白质组学研究的常用分离技术，但前者易受细胞组织内干扰物影响，例如核酸、多糖和脂类物质旧１；而后者在分离过程中，易丢失部分蛋白质，难获取全蛋白【４Ｊ。目前，组织细胞全蛋白的常用破碎技术有丙酮沉淀法、裂解法、冻溶法和酶解法等【ｌ“Ｊ。针对生物材料来源不同，优化提取组织细胞全蛋白和减少内外干扰物是开展蛋白质组学必须克服的难题。至今，相关的研究已有大量且详细的研究报道【５．６Ｊ，但尚未建立一套较为成熟、重复性高和广谱性好的细胞组织全蛋白质提取方法。环境蛋白质组学是目前环境毒理学中最有挑战性和前瞻性的领域之一，相关的研究仅仅处于起步阶段。环境蛋白质组学能同时筛选与鉴定出由各类重金属和有机污染物，在单一和联合胁迫效应环境中所诱导的多种蛋白指示物¨’８Ｊ，为揭示复杂的毒理机理和评价危害性提供实验证据¨，２，９ｊ。
本实验以牙鲆肝脏组织为材料，选用差速离心和双向凝胶电泳非在线联用技术，高效提取和优化分离受镉盐胁迫前后的牙鲆肝脏全蛋白，为后续选用蛋白质组学技术筛选及鉴定监测镉污染程度及危害性的蛋白质标志物提供可信度较高的结果。
２实验部分
２．１仪器、试剂与材料
双向电泳仪（北京六一仪器厂）；ＲＥＦＬＥＸ型ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ质谱仪（德国Ｂｒｕｋｅｒ公司）；各类冷冻离心机（贝克曼公司）－ｂ载体两性电解质（Ａｍｅｒｓｈａｍ公司），ｐＨ３～１０；胰蛋白酶（Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；基质ａ一氰一４一羟肉桂酸（美国ＩＣＮ生物医学公司）；碘乙酰胺（Ｓｉｇｍａ公司）；丙稀酰胺、甲叉丙稀酰胺等试剂均购自上海生物工程技术有限公司；匀浆缓冲液：０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖，１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，５０ｒｎｍｏｌ／Ｌ＂Ｉｒｉｓ—ＨＣｌ，１ｍｍｏｌ／ＬＰＭＳＦ（ｐＨ＝７．４）；样品裂解液：７ｍｏｌ／Ｌ尿素，４％ＣＨＡＰＳ，２ｍｏｌ／Ｌ硫脲，６０ｍｍｏＬ／ＬＤＩＴ，２００８．１２—１４收稿；２００９－０３—１３接受
本文系国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．４０７７６０６０）和福建省高校创新研究团队基金资助￥Ｅ・ｍａｉｌ：ｈｑｈｕａｎｇ＠ｘｌｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
１０２０分析化学
ｍｍｏＬ／Ｌ第３７卷１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ，１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｌＰＭＳＦ，０．５％载体两性电解质，０．０００２％溴酚兰。分装，
一２０℃保存待用；双向电泳和银染方法中所需试剂均参考文献［１，１０］。
实验所需的牙鲆均购于厦门人工养殖场。使用前，牙鲆需在实验室驯养一周。实验前７２ｈ开始停止喂食，防止饲料中微量重金属影响牙鲆的正常代谢。随机选择牙鲆１０只，并随机分为实验组和对照组。实验组牙鲆置于人工模拟构建的ＣｄＣＩ，（１０ｍｇ／Ｌ）的污染环境中，继续饲养７２ｈ。对照组牙鲆置于在人工海水中继续饲养。实验前，选用剪断脊椎处死方式处理牙鲆，并迅速解剖，获取牙鲆肝脏，用预冷的磷酸盐缓冲液直接冲洗，并保存在一８０℃以备使用。
２．２差速离心提取牙鲆肝脏蛋白质
取实验组（受镉盐胁迫）５条牙鲆的肝脏（ＰＯＬ）各２０ｇ，混合后共１００ｇ。对照组的ＰＯＬ取法同上。加入等体积匀浆缓冲液，在冰浴条件下研磨制成匀浆。随后，以４００×ｇ的相对离心力离心１０ｍｉｎ，去除未磨碎的组织和细胞，收集上清液Ｉ，备用。选用下列差速离心技术，分步收集蛋白沉淀物，并选用２Ｄ．ＰＡＧＥ进行有效分离，具体实验步骤（始终维持在４℃环境下）：（１）１０００×ｇ沉淀分离ｉ以１０００×ｇ的相对离心力离心上清液Ｉ１０ｒａｉｎ，收集沉淀蛋白和上清液Ⅱ。该沉淀物主要是细胞核，用匀浆缓冲液洗涤两次，最后收集沉淀样品备用（一２０℃保存，下同）；（２）１２０００×ｇ沉淀的分离：以１２０００×ｇ的相对离心力离心上清液Ⅱ３０ｍｉｎ，收集沉淀蛋白和上清液Ⅲ。选用匀浆缓冲液洗涤该沉淀蛋白两次，最后收集沉淀样品备用；（３）１０００００×ｇ沉淀的分离：以１０００００×ｇ的相对离心力离心上清液Ⅲ３０ｍｉｎ，收集沉淀蛋白质和上清液Ⅳ。上清液Ⅳ中多数蛋白是胞浆蛋白，收集样品，冻干备用；（４）上述所有收集的蛋白组分分别充分溶解于裂解液中，并选用１０００００×ｇ的相对离心力离心蛋白样品１０ｍｉｎ，分别收集上清液，称为ＰＯＬ蛋白组分Ｉ（１０００×ｇ沉淀蛋白）、ＰＯＬ蛋白组分Ⅱ（１２０００×ｇ沉淀蛋白）、ＰＯＬ蛋白组分Ⅲ（１０００００×ｇ沉淀蛋白）和ＰＯＬ蛋白组分Ⅳ（胞浆蛋白），并用于双向电泳分离。
２．３双向凝胶电泳分离条件
２．３．１等电聚焦电泳在上样之前，参考文献［１０］先进行预电泳。预电泳结束后，换上样品液，在用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定样品液的总蛋白浓度后，以１５０峭总蛋白上样，然后进行等电聚焦电泳。
２．３．２凝胶电泳按照ＳＤＳ均一胶的配方配置１１％胶浓度的凝胶。将平衡后的胶条转移到ＳＤＳ凝胶上，并在胶条上覆盖一层含有溴酚兰的０．５％琼脂糖，在１４０Ｖ的恒定电压下进行电泳。待溴酚兰前沿到达凝胶底端时，停止电泳。
２．４银染、图像分析及蛋白鉴定
参照文献［１０］的银染方法进行蛋白质染色。染色后，利用扫描仪对ＳＤＳ凝胶板进行透射扫描。选用Ｍｅｌａｎｉｅ４Ｔｒｉａｌ软件进行凝胶电泳图谱中的蛋白质总数和差异斑点分析与统计。用ＲＥＦＬＥＹ型ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ质谱仪获得各蛋白的肽质量指纹图，采用反射模式、正离子谱测定。激光波长为３３７ｎｍ，质谱信号单次扫描累加２００次，用ＢＲＵＫＥＲ肽混合物作外标。选用常规ＰＭＦ和数据库比对技术直接鉴定差异蛋白质…Ｊ。数据库选择ＭＳＤＢ，检索基本
条件参照文献［１０］。
３结果与讨论
３．１直接裂解法ＰｏＬ全蛋臼分离
图１是牙鲆受金属镉胁迫后，采取直接裂解
法提取ＰＯＬ全蛋白质的２Ｄ—ＰＡＧＥ图谱。从图ｌ
可看出，实验组和对照组的蛋白质斑点分布趋势
采用Ｍｅｌａｎｉｅ图１直接裂解法提取的牙鲆肝脏全蛋白双向电泳图基本：警，具有较好竺戮；一礓ｈ晤觑匕黼：嘉－富‘：：ｏ～ｎａｌｐｏｌ咖ｙａｃｒｙ。ｌａ，胁ｍｉｄｅ琊ｇ。ｅ嵩ｔｒｏ眦ｐｈｏｒ。ｅ眦ｓｉｓ４嘶ａｌ软件进行蛋白质斑点数…一…ｉ一．７．‘－＿７。ｊ‘＿………………”～７………
ｍｓ／ＬＣｄＣＩ：）；Ｂ．对照组（。。ｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）。
目统计与分析，对照组和实验组２Ｄ－ＰＡＧＥ图谱中的蛋白质斑点数目约为８００个，其中多数蛋白质
斑点的ｐＩ范围集中在４。５—９．０之间，蛋白质亚Ａ．实验组（唧。ｒｉ。。ｔａｊ刚ｐ）：ｌｏｍｇ／Ｌ镉盐处理（嘞ｔｅｄ１０ｗｉｔｈ
第７期那宏坤等：差速离心结合蛋白质组学技术研究受镉盐胁迫后的牙鲆肝差异蛋白质１０２１基的分子量在２５—１００ｋＤ之间，具有较高的分辨率，适合于后续蛋白质鉴定。
通过比对分析，可获得１１个差异蛋白质斑点，其中高表达蛋白２个（Ａ６和Ａ１１）；上调蛋白６个（Ａ１、Ａ４、Ａ７、Ａ８、Ａ９和Ａ１０）；下调蛋白３个（Ａ２、Ａ３和Ａ５）。这些差异蛋白斑点均与受镉盐诱导有关，推测是牙鲆肝脏产生的应激蛋白质。
３．２优化建立差速离心法分离ＰＯＬ全蛋白质技术
肝脏是动物代谢的重要场所之一，具有各类复杂代谢途径和含有丰富的蛋白质。借鉴文献［１２］，选用２Ｄ．ＰＡＧＥ分离法可获得约近千个鼠肝脏全蛋白斑点数的实验结果。
本实验选用直接裂解法提取ＰＯＬ全蛋白，但只获取约８００个蛋白斑点的２Ｄ—ＰＡＧＥ图谱。显然，图１中的全蛋白质斑点数偏少，不太适合进一步深入开展ＰＯＬ蛋白质组学研究，尤其不适合研究镉盐毒理学和筛选连续监测流动水体镉污染程度的蛋白指示物。在系列比对实验基础上，建立了差速离心法高效提取牙鲆肝脏全蛋白技术，具体实验步骤见图２。图２显示了选用差速离心法使牙鲆肝脏中不同沉降系数的蛋白质得到粗分离，减少高丰度蛋白的干扰和提高低丰度蛋白富集的效果，有助于开展牙鲆肝脏全蛋白组学研究和筛选差异蛋白质。
Ｃｅｎ舢ｔｒｉｆｕｇｅⅡ
离心
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ１０００。ｇ，１０ｍｉｎ≮｝离心Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ收集沉淀样品Ｂ月．溶解ＣｏｌｌｅｃｔｔｈｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅＢａｎｄｔｈｅｎｄｉｓｓｏｌｖｅｉｔ．
收集卜清液Ⅳ（胞浆蛋向）
ＣｏｌｌｅｃｔｓａｍｐｌｅＩＶｉｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ
（ｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｃｅｌｌｐｌａｓｍａ）胁１０００离心Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｐ，－。ｇ１０ｍｉｎ一圆
４图２差速离心法分离牙鲆肝全蛋白主要实验步骤示意图Ｆｉｇ．２ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍａｐｏｆｐｒｏｔｅｏｍｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎｉｎＰＯＬ目前，常用于动物肝脏全蛋白质提取技术且适合于开展蛋白质组学研究方法有ＴＣＡ／丙酮酸沉淀法、缓冲液法、裂解法及“鸟枪”蛋白质组分析法【１３’１４３等。但这些方法获取肝脏全蛋白种类大都低于１５００种，明显少于本实验建立的差速离心提取技术。３．３在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ｉ的差异蛋白图３是在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ｉ全蛋白和差异蛋白图谱。采用ＭｅｌａｎｉｅＴｒｉａｌ软件对图解中
的蛋白质斑点数目进行统计与分析，可在亚细胞组分Ｉ中获得约３８０个蛋白质斑点。比较图３Ａ（实验组）和图３Ｂ（对照组），可获得１１个差异蛋白斑点。其中Ａｌ、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ６、Ａ７和Ａ８为上调蛋白，而Ａ５、Ａ９、Ａ１０和Ａ１１为下调蛋白。
３．４在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅱ的差异蛋白
图４是在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅱ全蛋白和差异蛋白的２Ｄ．ＰＡＧＥ图谱。经统计与分析后，发现亚细胞组分Ⅱ中获得约５５０个蛋白斑点。
比较图４Ａ（实验组）和图４Ｂ（对照组）蛋白斑点分布和差异特性，可获得１３个差异蛋白斑点，其中
１０２２分析化学第３７卷的Ａ１和Ａ４斑点为上调蛋白；Ａ２、Ａ３、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１ｌ和Ａ１２斑点为下调蛋白；ＡＳ、Ａ１０和Ａ１３为高表达蛋白（ｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ）。
图３在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ｉ全蛋白的２Ｄ．图４在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅱ全蛋白的２Ｄ—ＰＡＧＥ图谱ＰＡＧＥ图谱
Ｆｉｇ．３２Ｄ－ＰＡＧＥｍａｐｏｆｐｒｏｔｅｏｍｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔＩｏｆＰＯＬＦｉｇ．４２Ｄ－ＰＡＧＥｍａｐｏｆｐｒｏｔｅｏｍｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔＩＩｏｆＰＯＬｕｎｄｅｒｓｔｒｅｓｓｏｆｃａｄｍｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｕｎｄｅｒｇ，ｔｒｅｆｌ．ｓｏｆｃａｄｍｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ
Ａ．实验组（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ）：１０ｍｇ／Ｌ镉盐处理（ｔｒｅａｔｅｄＡ．实验组（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ）：１０ｍｇ／Ｌ镉盐处理（ｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ１０ｍｇ／ＬＣｄＣｌ２）；Ｂ．对照组（ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）。ｗｉｔｈ１０ｎｃ／ＬＣｄＣｌ２）；Ｂ．对照组（ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）。
３．５在镉盐胁迫下。牙鲆肝脏组分Ⅲ的差异蛋白
图５是在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅲ的全蛋白和差异蛋白质的２Ｄ—ＰＡＧＥ图谱。经分析与统计，可获悉图５显示出约５００个蛋白斑点。比对图５Ａ和图５Ｂ结果，可进一步获悉两图之间约有１４个差异蛋白斑点。其中的ＡＩＯ、Ａ１ｌ和Ａ１４斑点为上调蛋白；Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１２和Ａ１３斑点为下调蛋白。
３．６在镉盐胁迫下。牙鲆肝脏组分Ⅳ的差异蛋白
通常认为，细胞破碎液经１０００００×ｇ的相对离心力离心后所获得的蛋白上清液视为细胞的胞浆蛋白。根据３．２节所描述的实验步骤和离心率可获悉，牙鲆肝脏组分Ⅳ属于胞浆蛋白质。在镉盐胁迫下，所获得牙鲆肝脏组分Ⅳ的差异蛋白质，视为金属镉胁迫牙鲆肝脏表达的差异胞浆蛋白。从图６中可看出牙鲆肝脏组分Ⅳ含有约８５０个蛋白斑点，其胞浆蛋白质种类明显高于其它牙鲆肝脏组分的蛋白质种类，说明了牙鲆肝脏含有丰富的胞浆蛋白质。比较图６Ａ和图６Ｂ中的差异蛋白斑点分布情况和规律可获悉，在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏表达了１６种差异蛋白，其差异蛋白总数目多于其它ＰＯＬ组分。其中高表达的蛋白质为Ａ１、Ａ２、Ａ４和Ａ９；上调蛋白为Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ１０、Ａ１１和Ａ１４；下调蛋白为Ａ３、Ａ８、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１５和Ａ１６。
图５在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组分Ⅲ全蛋白的２Ｄ—图６在镉盐胁迫下，牙鲆肝脏组Ⅳ全蛋白的２Ｄ．ＰＡＧＥＰＡＧＥ图谱图谱
Ｆｉｇ．５２Ｄ－ＰＡＧＥｍａｐｏｆｐｒｏｔｅｏｍｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔⅢｏｆＰＯＬＦｉｇ．６２Ｄ－ＰＡＧＥｍａｐｏｆｐｒｏｔｅｏｍｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔＩＶｏｆｕｎｄｅｒｓｔｒｅｓｓｏｆｃａｄｍｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅＰＯＬｕｎｄｅｒｓｔｒｅｓｓｏｆｃａｄｍｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ
Ａ．实验组（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ）：１０ｍｇＬ镉盐处理（ｔｒｅａｔｅｄＡ．实验组（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ）：１０ｍｇ／Ｌ镉盐处理（ｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ１０ｍｓ／ＬＣｄＣｌ２）；Ｂ．对照组（ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）。ｗｉｔｈ１０ｍｇ／ＬＣｄＣｌ２）；Ｂ．对照组（ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ）。
进一步选用肽质量指纹（ＰＭＦ）图谱和数据库比对技术对上述５４个差异蛋白进行鉴定。结果发现，有３种同类差异蛋白，即共有５１个不同的差异蛋白。在鉴定结果中发现了一些文献［１５，１６］中已报道
的与镉盐胁迫有关的蛋白（见表１）。
第７期
表１那宏坤等：差速离心结合蛋白质组学技术研究受镉盐胁迫后的牙鲆肝差异蛋白质１０２３牙鲆肝脏中表达的与镉盐胁迫有关的差异蛋白的质谱鉴定
ＭＳｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＰＯＬ．．—ｃ—ｏｎｃｅｒｎｅｄｗｉｔｈｓｔｒｅｓｓＴａｂｌｅ１ｏｆｃａｄｍｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ
总结图３—６中所显示的蛋白斑点数目可获悉，选用差速离心法分离牙鲆肝脏的全蛋白种类约２２８０个，明显高于直接裂解法（８００个蛋白斑点）的结果。虽然选用不同离心力分离ＰＯＬ亚细胞蛋白组分之间含有同一类蛋白，但只发现存在少量同类蛋白质，说明了选用差速离心法所获取的ＰＯＬ全蛋白中只含有少量的同类蛋白质，推测所获得的蛋白种类应高于２０００种，适合于开展ＰＯＬ蛋白质组学研究。在镉盐胁迫下，同样也获取５４种差异蛋白，其中只有３种同类差异蛋白，即镉盐胁迫牙鲆肝脏表达了５１种差异蛋白，这也适合于筛选潜在的可用于研究金属镉毒理学和监测流动水体重金属污染的蛋白质指示物。显然，差速离心结合双向电泳技术显著提高了牙鲆肝全蛋白的分离效率和差异蛋白的检出率。
由于动物组织、细胞及卵等中蛋白质种类间存在丰度差异¨７｜，现有的全蛋白提取与分离技术不易通过单一的２Ｄ．ＰＡＧＥ方法同时显示高低丰度不同的蛋白质。而本实验所建立的差速离心技术结合蛋白质组学技术，不仅降低蛋白之间产生沉淀现象，而且还使许多低丰度蛋白得以富集和鉴定，从中获取更多的蛋白种类。在蛋白的分离效率上明显高于现有的全蛋白提取与分离技术，如直接裂解法，适合开展蛋白质组学研究和筛选与鉴定差异蛋白质组学。前人研究已发现，热激蛋白质７０Ｓ（ＨＳＰ７０）和过氧化氢酶均可作为监测金属镉污染或氧化损伤的指示蛋白０１５，１６］。从表１所鉴定的差异蛋白质种类中也含有这两种蛋白。此外，Ｖ型ＡＴＰ酶和细胞骨架相关蛋白（例如：Ｂｅｔｅ微管蛋白和ａｃｔｉｎ）等均与镉代谢和受镉抑制表达有关。这说明，选用蛋白质组学及相关分析技术可筛选并鉴定许多潜在的适合作为蛋白质指示物且可用于开展镉毒理学机理、污染程度的关键指示蛋白质¨ｎ驯。
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ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＬｉｖｅｒＲｅｖｅａｌｅｄｗｉｔｈａＣｏｍｂｉｎｅｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆ
ｂｏｔｈＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎａｎｄＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓｉｎＰａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ
ＯｌｉｖａｃｅｕｓＵｎｄｅｒＳｔｒｅｓｓｏｆＣａｄｍｉｕｍＳａｌｔ
ＮＡＨｏｎｇ－Ｋｕｎｌ，ＨＵＡＮＧＱｉｎｇ．Ｙｕｌ，ＨＵＡＮＧＨｅ—Ｑｉｎｇ＋１’２’３
１（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２（Ｓｔａｔｅ
１ａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭａｒｉｎｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＸｉａｍｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ３６１００５）ＥｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｘｉａｍｅｎ３６１００５）ａｎｄＳｔａｔｅ０ＴｈｅＸ呵ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ研Ｆｕｊｉａｎ
ＳｕｒｆａｃｅＣｏｌｌａｇｅＰｒｏｖｉｎｃｅＫｑＬａｂｏｒａｔｏｒｙ《ＰｈｙｓｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ《ＳｏｌｉｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＸｉａｍｅｎｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｘｉａｍｅｎ３６１００５）
ＡｂｓｔｒａｃｔＢｏｔｈｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｏｍｅａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｅｘｔｒａｃｔｅｄ，ｓｅｐａｒａｔｅｄａｎｄｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙａｃｏｍｂｉｎｅｄａｐｐｒｏａｃｈｏｆｂｏｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ
ｕｎｄｅｒｔｈｅｓｔｒｅｓｓｏｆｃａｄｍｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅａｓａｎｄ２Ｄ—ＰＡＧＥｉｎｌｉｖｅｒｏｆＰａｒａｌｉｃｈｔｙｓｏｌｉｖａｃｅｕｓ（ＰＯＬ）ｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆａｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌｐｏｌｌｕｔｉｏｎｓｏｕｒｃｅ．Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ８００ｓｐｏｔｓ
ｗｈｏｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｐａｒａｔｅｄｗｉｔｈ２Ｄ—ＰＡＧＥｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｄｉｒｅｃｔｌｙｓｉｓｉｎｔｈｅＰＯＬ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ１１ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＰＯＬｗｅｒｅａｌｓｏｏｂｔａｉｎｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅ
ａｓｔｒｅｓｓｏｆｃａｄｍｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｐｒｅｐａｒｅ
ＰＯＬｔｈｒｅｅｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｐｌａｓｍｏｌｙｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｃａｌｌｅｄＰＯＬｃｏｍｐｏｎｅｎｔＩ，ｃｏｍｐｏｎｅｎｔＩＩ，ＰＯＬ
ｓｐｏｔｓｃｏｍｐｏｎｅｎｔＩｌｌ，ａｎｄＰＯＬｃｏｍｐｏｎｅｎｔ１Ｖ（ｐｌａｓｍｏｌｙｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｅａｃｈｇｅｌｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄｔｏｈａｖｅ３８０，５５０，５００，ａｎｄ８５０，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ２２８０
ａｒｅｓｐｏｔｓ
ｅｎｔｉａｌｉｎｓｕｍ，ｗｈｉｌｅｔｏｔａｌｓｐｏｔｓｍｕｃｈｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｂｙｄｉｒｅｃｔｌｙｓｉｓａｐｐｒｏａｃｈ．Ｕｓｉｎｇｔｈｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎａｍｅｔｈｏｄ，ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ５４ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＰＯＬｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｃｏｍｂｉｎｅｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｂｏｔｈｄｉｆｆｅｒ－ａｎｄｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｐｏｌｙａｃｙｌａｍｉｎｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２Ｄ－・ＰＡＧＥ）ｍｅｔｈｏｄｓ
ｃａｒｌｕｎｄｅｒｔｈｅｓｔｒｅｓｓｏｆｃａｄｍｉ・－ｐｅｐｔｉｄｅｍａｓｓｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ
ｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｗｈｏｌｅａｍｃｈｌｏｒｉｄｅ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｓｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｂｅｆｕｒｔｈｅｒｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙ（ＰＭＦ）．Ｈｅｒｅ，ｔｈｅｓｅｃｏｍｂｉｎｅｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｃａｌｌｂｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｕｓｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔ，ｓｅｐａｒａｔｅａｎｄ
ｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒｓｉｎｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｔｉｓｓｕｅ．
ＫｅｙｗｏｒｄｓＰａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓｏｌｉｖａｃｅｕｓｌｉｖｅｒ，ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ
ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ．ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ，ｃａｄｍｉｕｍｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ，
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差速离心结合蛋白质组学技术研究受镉盐胁迫后的牙鲆肝差
异蛋白质
作者：
作者单位：
刊名：
英文刊名：
年，卷(期)：
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_fxhx200907016.aspx