第十四章 病毒和病毒成份的提纯
一、病毒的提纯
(一) 沉淀法
(二) 层析法
(三) 两相溶剂间分配系数法
(四) 红细胞吸附法
(五) 电泳法
(六) 超速离心法
(七) 超滤法
二、病毒蛋白亚单位的分离
三、病毒脂质的抽提
四、病毒糖类的抽提
一、病毒的提纯
所谓病毒提纯, 就是应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质——DNA 或RNA 的详细研究都需要高纯度的病毒样品。
病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定标准。
1. 物理均一性
测定病毒样品的物理均一性, 是证明其纯度的常用方法, 包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。
2. 病毒滴度与蛋白含量的比例
测定病毒材料的感染力或其血清学反应滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高, 说明病毒的纯度越高。
3. 免疫学反应
免疫反应单一而无非特异反应，则说明病毒材料比较纯净。
4. 结晶形成
病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。
病毒提纯的主要依据和条件有:
(1)病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖, 要在病毒不失活的前提下，使之从细胞中释放出来，去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒, 病毒粒子被释放到细胞外，可以从培养液或尿囊液中提纯； 而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA 病毒，在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外，大量提纯时必须首先裂解细胞，使病毒大量释放。实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、 蛋白酶解等物理和化学的方法。 通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液，其中常含有大量的细胞碎片，一个有效的方法是以2000～ 6000r/min离心30～40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质。
(2)病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒，可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。
(3)对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子, 可以采用分级分离的技术。当然不同的病毒，其生长特性及理化学性质不同，因此提纯方法也不尽一致。
(一) 沉淀法
主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。
1. 中性盐沉淀法
病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀， 且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。
2. 聚乙二醇沉淀法
聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量， 用于病毒沉的主要是分子量为2000～6000的PEG 。将PEG 配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG 加于
毒悬液中, 使其达到所需浓度, 通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年) 成功地用PEG 浓缩了禽脑脊髓炎病毒。
3. 有机溶剂沉淀法
甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。
4. 等电点沉淀法
病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。多数病毒的等电点在pH4.5～5.5之间，因此在pH3～6范围内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀，此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时，必须注意pH 对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。
5. 皂土法
Girin(1989年) 应用皂土在酸性条件下(pH4～4.5) 吸附轮状病毒SA-11，再在碱性条件下（pH 8.5），又使其洗脱下来, 从而达到纯化目的。
6. 鱼精蛋白沉淀法
鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于50nm 的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/L NaCl时, 病毒又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm 的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm 的异种蛋白质。
(二) 层析法
病毒粒子表面携带特定的电荷群，因此病毒对离子交换树脂及类似的其它吸附剂具有亲和性。利用吸附剂的层析法分为两种，一种是正吸附法，即依据病毒粒子表面所携带的电荷进行特异性吸附，然后用适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收；另一种是负吸附法，即只吸附组织或宿主细胞成份等非病毒蛋白，而让病毒粒子通过。收集滤液后经差速离心沉淀法回收病毒。由于各种病毒的大小和表面结构等理化性质不同，因此对吸附剂的亲和性也有显著的差异。
1. 萄聚糖柱层析法
将初步浓缩的材料，通过葡聚糖G-150或G-200柱层析，然后用0.02～0.15mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.6)洗脱，分部收集，测定280nm 波长处的OD 值，将含病毒的各部分相混合，再浓缩，透析之后，即可得到比较纯净的病毒，Nagano(1989年) 用Sephacryls-1000 柱层析纯化了鸡传染性支气管炎病毒。
2. 凝胶层析法
①磷酸钙凝胶:这是病毒吸附层析法中较为常用的凝胶，由0. 5mol/L CaCl2和0.5mol/L Na2HPO4溶液混合制备凝胶状沉淀物。在中性条件下生成的凝胶称为“brushite ”， 在碱性条件下生成的凝胶称为羟基磷灰石(hydroxypatite)。两者均用0.001mol/L磷酸盐缓冲液悬浮，置于4℃4～5天，使它充分沉淀后应用。
②氢氧化锌凝胶:是由7mol/L氨水与0.1mol/L醋酸锌溶液滴加混合(pH8.5) 而制备的，在制备后数小时内较稳定，可作为吸附剂。Newton 和Beris 等将水泡性口炎病毒悬液与氢氧化锌凝胶混合，使其形成复合体后沉淀，然后用0.08mol/L EDTA(pH8.5) 解离病毒，获得较好的回收量。
③焦磷酸镁凝胶:是由0.1mol/L焦磷酸钠和0.1mol/L mol/MgCl2，以2：10(体积) 比例在室温中缓慢滴加混合而获得的较稳定的焦磷酸镁凝胶。西村等将牛痘病毒悬液同此凝胶混合，使病毒吸附于凝胶，然后用0.1mol/L盐水洗2次，最后用0.3mol/L枸橼酸钠溶液解离病毒，将病毒较好地回收于水相中。
3. 离子交换纤维素柱层析法
离子交换层析适于分离几乎所有带电荷的分子。通常有阴离子交换剂和阳离子交换剂两种。
某些病毒可以被离子交换剂经离子键作用而吸附，通过改变平衡液的离子强度, 使其再洗脱下来而达到纯化目的。腺病毒和口蹄疫病毒被DEAE 纤维素吸附， 可分别再用0.5mol/L和0.15mol/L NaCl溶液洗脱下来，从而得以纯化。
4. 亲和层析法
亲和层析是一种特殊的吸附层析, 基质与待分离物具有特异的生物亲和力。 通常是将特异的抗体经共价偶联作用结合在配基上组成一种不溶性配基。当相应的抗原物质通过固定配基装成的层析柱时，即被吸附。随后再改变实验条件，将其洗脱下来，达到纯化的目的。该法是于80年代初期开始用于病毒的分离提纯，不仅纯度好，敏感，而且回收率高。
Njayou(1991年) 应用此法成功地提纯了麻疹病毒。 他们应用猴抗麻疹病毒的IgG 进行共价偶联，获得了高纯度而有活性的病毒，回收率可达总回收成份的30％。 Rimmelzwaan (1987年) 应用犬细小病毒的中和性单克隆抗体亲和层析，纯化了细小病毒，经SDS —PAGE 和 ELISA鉴定，99％以上的杂蛋白被洗除，收获了70～90％的病毒抗原成份。
(三) 两相溶剂间分配系数法
该法主要原理就是高分子物质以溶质形式存在于两相溶剂中，根据其分配系数的不同而选择性地分配于其中的一方，从而达到纯化的目的。所采用的溶剂主要有: 葡聚糖硫酸盐(Dextran Sulphate,DS)和聚乙二醇(PEG)或甲基纤维素(MC)和聚乙烯醇(PVA)，形成 Ds —PEG 系、Ds —PVA 系和Ds —MC 系。利用病毒在有机溶剂中的分配原理，在适当的溶剂系统和葡聚糖层之间进行多次反复转换，不仅能够浓缩病毒，而且还可以纯化病毒。
通常是将两相溶剂如Ds —PEG 以适当的重量百分比混合，然后加入病毒液， 数次激烈振荡混合，置于4℃ 24～36小时，即可分离为两层，病毒将特异地分布于其中一方(如Ds 层中) 。适当改变溶剂的混合比例时，分配于Ds 层中的病毒可由Ds 层转入 PEG中，而得以浓缩。若调节适当，一步就可浓缩100倍，两步浓缩就可以达到10000倍。
非病毒物质通常以不同的方式进行分配，从而达到浓缩纯化的目的。Nammar(1991年) 应用Ds —PVA 系纯化了反转录病毒。两相溶剂间分配系数法简单、温和，并能使病毒得到较高的浓缩和纯化。但是为了获得高度纯化的病毒，还需配合应用其它方法。
(四) 红细胞吸附法
所谓病毒的红细胞凝集反应，就是指病毒被红细胞表面粘蛋白吸附的现象。自Hirst 发现流感病毒的红细胞凝集性质以来，随后相继发现其它一些动物病毒也有红细胞凝集性。Stanley 证明，流感病毒在0℃时被红细胞吸附，而在37℃时却从红细胞上脱离下来的性质，从而将此方法应用于病毒提纯。
我们实验室应用醛化鸡红细胞吸附马流感病毒，取得较好效果。具体方法是:
采取鸡血，以无菌生理盐水洗涤3次后制成压积红细胞。 另取福尔马林和生理盐水等量混合，制成福尔马林盐水。在2份福尔马林盐水中加入1份压积红细胞，充分振荡15min ，置2～8℃冰箱内48h ，每天振荡2～3次。届时取出，再振荡1次，后用700r/min 离心 5 ～10min ，弃上清，再加20倍量生理盐水，振荡混合后置2～8℃ 冰箱过夜。弃上清，加入20倍量生理盐水，如上洗涤3次。取沉淀红细胞， 加入相当于初次压积红细胞量的生理盐水，混匀后即可应用。
将马流感病毒感染的鸡胚尿囊液，作2500r/min离心10min ，吸取上清液。 取保存于2～8℃的病毒液100ml ，加入2～8℃的醛化红细胞悬液6ml ，充分振荡15min ，立即放入冰箱内每2h 振荡1次，共2～3次，随后置冰箱中过夜，待其自然沉淀。次日吸出上清，
如其血凝价在1:15以下，则证明已经充分吸附，此时即可进行释放，否则需再补加醛化红细胞悬液继续吸附。在已充分吸附病毒的醛化红细胞沉淀中，加入相当于原病毒液1/10量的5mol/L NaCl溶液, 充分振荡，置37℃水浴中4h ，每隔30～60min 振荡1次。取出后立即以700r/min 离心10min 。吸取上清液，即为浓缩病毒液， 必要时可对已释放过病毒的醛化红细胞作第二次释放，方法同前。
上述吸附-释放方法，可将病毒浓度提高10倍左右(以血凝效价表示) 。
(五) 电泳法
先将病毒悬液对缓冲液透析。根据病毒的种类不同，选择适当的缓冲液，但离子强度不能超过0.3mol/L以上。病毒粒子依据其所携带的电荷，在电场中或向正极，或向负极移动，因此电泳结束后，分段收集病毒区带部分，就能达到提纯的目的。
(六) 超速离心法
病毒粒子经过初步浓缩之后，要进一步纯化，通常采用超速离心法， 它是分离提纯不同大小的病毒的有效方法之一。在应用超速离心法沉淀病毒时，必须了解所用离心机的离心力。离心机由于转头的回转产生了强大的离心力, 这种离心力是随转头的大小和离心管至转轴中心的距离而变化的。高速和超速离心机的离心条件，有的以每分钟速度(r/min)表示，有的则以离心力——重力加速度g.(980cm/S2)为单位来表示。离心沉淀时， 沉降速度与离心力有关。
离心机转速在4000r/min左右的称为低速(普通) 离心机；转速至 25000r/min左右的称为高速离心机；转速25000r/min以上的称为超速离心机。高速和超速离心机装有冷冻装置和抽真空装置，以保持离心腔中恒定的低温，并减少转头运转时空气的摩擦力。超速离心机有制备和分析用两类，最近又生产出制备、分析及区带连续离心三用装置在一起的离心机，有的还带扫描装置。
使用超速离心机的分离提纯方法有三种:(1)差速离心法；(2)速度区带离心法；(3)平衡密度梯度离心法(或等密度梯度离心法) 。
1. 差速离心法
这是应用较早的简单方法，建立在不同大小和比重的粒子在沉降速度上存在差别的基础上。具体做法是将被分离的样品交替进行低速离心与高速(或超速) 离心。沉降速度差别在一个或几个数量级的粒子，可用本法分离提取。粒子大小、转速与离心沉淀时间的关系，差速离心适用于从组织培养液、 鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附-释放的病毒悬液中提纯病毒。在由感染细胞或组织匀浆中提取病毒时，由于与病毒大小相近的细胞亚单位及碎片的存在，提纯效果不理想。差速离心法的优点是能迅速处理大量样品，故常作为病毒精
制的第一个阶段，或者用于病毒样品的浓缩和粗提。
以差速离心法分离提纯病毒时，经常以低速(2000～3000r/min，20～30min) 及中速(10000r/min，20～30min) 去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其他较大的杂质。然后，选择在60min 内能够沉淀80%以上的病毒粒子的较高速度，离心1～2h ， 使病毒沉淀。对中、大型病毒如流行性感冒病毒，在经红细胞吸附-释放后，于 25000r/min离心60min ，即可达到目的。小型病毒如脊髓灰质炎病毒、披膜病毒，则需以35000～ 45000r/min离心1～2h 。高速或超速离心沉淀物， 可用研磨和超声波振荡等方法打碎后悬浮于缓冲液中。对于非病毒杂质较多的样品进行差速离心，由于病毒对沉淀物的非特异性吸附而有较多损失。
2. 速度区带离心法
是根据被分离物质在强大离心力中沉降速度不同而进行的分离方法。该法使用的介质密度应该小于被分离物质的密度。介质可以为均一密度，也可以为梯度密度。当被分离的物质沉降到与介质密度相等的区域时就不再沉降。不同分子形成不同的区带，而称为速度区带。该法要求样品浓度为顶端浓度梯度的1/10，样品体积为离心管体积的5%。常用的介质有蔗糖、甘油、聚蔗糖等。在病毒纯化时，将病毒样品溶液层加于密度梯度层的顶部，借助病毒粒子或其亚单位成分本身的浮密度差别，在离心力作用下降到密度相等的介质层内，最后排列成带状停留不动。密度较小的粒子或成分停留在上面的几层内，密度较大的粒子或成分沉降于下面几层内。应用密度梯度法，可以获得相当纯净的病毒样品。病毒粒子或成分的沉降速度取决于其大小、形状及比重，也取决于离心力及悬液介质的密度和粘度。蔗糖是生物大分子粒子密度梯度分离时最常应用的材料，因其易溶于水，且对核酸及蛋白质呈化学惰性。常用的梯度范围从5～20%或10～60%。
除蔗糖浓度连续梯度离心外，近来有人在两层浓度梯度上层加病毒浓缩样品，经超速离心后将病毒收集于两层界面处；也有人在单层蔗糖浓度溶液上层加病毒浓缩样品，经超速离心，使病毒沉淀于蔗糖溶液底部。这两种方法比较简单，但浓缩提纯的效果远远不如多层连续梯度法。
3. 平衡密度梯度离心法
平衡密度梯度离心法是根据粒子的浮密度不同而加以分离。所谓浮密度就是物质的质量减去在一定介质中所受的浮力, 亦称有效密度。
制备梯度的方法有两种：一种是在饱和的CsCl 溶液上面层加病毒样品(容量比1:
4) ；另一种是将病毒样品与CsCl 浓溶液均匀地混合。一般用水平转头，经较长时间的超速离心，在离心管中形成CsCl 的浓度梯度，并由于离心力的作用，样品中的病毒粒子分布于相应密度的区域内。这种方法在分析离心中是最常用的。应用本法时，离心转头的回转数越高，离心时间越长，越能接近平衡状态。
平衡密度梯度离心法广泛应用于病毒和核酸的提纯上。用平衡密度梯度离心法提纯的动物病毒有多型瘤病毒、牛痘病毒、乙型脑炎病毒、狂犬病病毒和马传贫病毒等。有的病毒在这些无机盐类溶液中被破坏，可加入0.2～0.5%牛血清白蛋白，或用0.5～3.0%甲醛先将病毒粒子固定，然后进行平衡密度梯度离心，常能较好地回收病毒。大多数病毒的浮密度在1.10～1.40范围内。所以制备密度范围为1.0～1.7的悬浮介质，便可满足大多数病毒密度梯度离心的需要。
4. 密度梯度离心法的操作程序
(1)密度梯度的制备:制备密度梯度的方法有不连续的(即人工操作) 和连续的( 即机械操作) 密度梯度两种。
不连续的或分层的密度梯度的制备 不连续的密度梯度是以人工操作法制备的，在一定温度下(一般在20℃或在25℃) 配制一系列浓度差为5%的梯度溶液, 例如蔗糖可配制成5、10、15、20、25、30、 35、40%(W/V)等溶液(用蒸馏水或适宜的缓冲液配制) ，用皮下注射器或微量吸管，小心地先吸取浓度最大的溶液注入离心管底，然后依次加入较低的各个浓度(40%→5%)，一层覆盖着一层地层加于离心管中，注意避免产生气泡。假如各层界面被冲动破坏，则应重新制备。也可以将长针头插入管底，依次从浓度低到高加入各溶液。
连续的密度梯度的制备 为了产生一个连续的密度梯度，常用梯度混合装置来制备梯度。
梯度混合装置由A 和B 管组成。两管之间用双通活塞联结。在活塞关闭的状态下，向A 管中加入低浓度蔗糖溶液，向B 管中加入高浓度的蔗糖溶液，两管中容量要相等。在B 管出口处用一根聚乙烯小管连接到离心管。在给B 管充液时，可将聚乙烯小管的流出口向上转动，使之超过液体的水平面，从而阻止液体流出。充液后可将小管接到离心管中使之贴着管壁，然后开动小搅拌器，使搅拌棒转动，同时打开两管间活塞。这三个操作要同时进行，以保证梯度的连续性。 当梯度液体自B 管流出时不允许移动离心管，待离心管中所盛的梯度溶液的体积达到需要量之后，将离心管小心地静止于4℃ 1～2h ，以平衡之。
现在不少“制备用超速离心机”携带有“密度梯度制备自动装置”。按照这个方法制备的蔗糖浓度梯度，理论上按公式计算。
这些浓度梯度是根据样品和实验目的而专门选用的。一般使用的浓度梯度范围为20%→5% ，40%→10%，或60%→10%等。
(2)加入样品:用如上所述注射器或微量吸管吸取悬浮于适宜缓冲液中的病毒或核酸样品( 约梯度介质体积的1/10容量) ，从液面上方1mm 处，紧贴着离心管壁轻轻层加于梯度介质面上。
(3)高速或超速离心:将加入样品的离心管装入套管内，也可将离心管置于转头的套管内，以免在装进套管时震动液体。拧紧套管螺帽，将套管吊在水平转头上，置于离心机
内。梯度离心一般用高速或超速离心机。离心速度和时间，根据所分离的样品选定。离心开始，样品中各种粒子逐渐分离，分布于相应的密度梯度层中成为带状( 如为透明的聚碳酸酯离心管，则可以清楚地见到带状分离，并拍照) 。离心时间到时，使离心机自然停止，不许制动，以免破坏梯度。
(4)梯度的分段收集(取样):在离心完了以后，为了把已分离物质的各条带分开，必须取出梯度溶液。梯度溶液的分段收集方法有如下几种。
①取代法：从离心管底部穿刺或将带长针头的注射器插入离心管底，使一种稠密的介质，如60～70%(W/V)蔗糖溶液，缓慢地注入于离心管底部。然后用一个注射器或移液管，从上面逐一移出各部分。或者在离心管的颈部加上一个塞子，这个塞子附着一根收集导管，通向一个部分收集器，收取各部分。
②穿刺法：将离心管固定于特制的固定架上，在其底部装上一个垂直向上的空心针穿刺，使梯度溶液自由滴出，可用部分收集器或用小试管分段收集。超速离心机一般都带有此装置。此装置的缺点是离心管在用一次后即废弃。
③虹吸法：此法的优点是不必穿刺离心管，离心管可反复使用。经我们多次试验，此法简便易行，对梯度密度无破坏。用一根大穿刺针截两段做虹吸管，以接上 50 ～100ml 玻璃注射器进行送气的方法，分段收集梯度溶液。
④注射器吸取法：用弯曲的针头(J状) 接在注射器上， 从梯度最上层开始向下逐层小心吸取液体。
5. 梯度各层液体的密度测定
(1)称重量法：用10ul 微量注射器吸取样品，加入于已知重量的毛细管中，在 1/10万分析天秤上称重，计算重量(g/ml)，即为梯度溶液的密度。
(2)测定折射率法：用阿贝氏折光仪测定各梯度层溶液的折射率(25℃) 。
(3)浮漂法：向已制备好的各种密度溶液中滴入一滴样品， 找出相应的样品浮密度溶液，即为该梯度层的密度。
6. 各梯度分层液中病毒分布的鉴定
(1)以紫外分光光度计测定蛋白质和核酸吸收峰。吸取各层梯度溶液， 用蒸馏水或缓冲液适当稀释后，测定波长280和260nm 的OD 值。然后以各梯度层管号为横坐标，其OD 值为纵坐标画曲线，即为各梯度层中蛋白质-病毒含量图，有些病毒260nm OD 值较高。
(2)以各种血清学方法测定各梯度层中病毒的抗原效价或用组织培养法测定病毒滴度，证实病毒分布区域。
(3)用电子显微镜负染法观察病毒粒子及其纯度。将各梯度层样品装入透析袋中，置于适宜的溶液中透析去盐，然后取一滴样品用蒸馏水稀释，滴附于铜网膜上，用磷钨酸负染后电镜下观察病毒粒子。
(七) 超滤法
超滤法是利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小的大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩的一种方法。超滤膜的孔径有多种，可根据被截留的分子大小而选择。超滤法是浓缩大容量的病毒样品的一种非常有效的方法，其优点是可以在室温或低温下操作；对被浓缩的产物损害很小；浓缩的同时可达到部分纯化；如选择合适的膜和操作参数，可达到很高的回收率；此外，超滤系统可密封以防止外来污染。超滤系统目前主要有三种，即搅拌池式，浅道流动系统和中空纤维系统。搅拌池式是一种最简单的超滤系统，由超滤室及磁力搅拌器组成，通过正压而使液体通过滤膜。此方法简单，但浓缩样品量有限，一般在2000ml 以内，而且滤膜孔易于堵塞。浅道流动系统的特点是液体在膜表面的螺旋形浅道中流动，液体与膜的接触面积也大于搅拌池系统，因而滤过速度大为提高。中空纤维系统是由很多根空心纤维成束装配而成，每根纤维即为一个微细管型膜，因此，其有效的膜面积远远大于前二个系统，滤过速度很快，适用于大体积的浓缩。
二、病毒蛋白亚单位的分离
病毒具有几种以上的蛋白质, 每一种蛋白质通常都由分子量较小的许多相同的亚单位组成。病毒的结构蛋白决定着病毒粒子的结构及其与细胞受体部位结合的特异性。病毒的血清学特异性和酶活性也决定于蛋白质。结构蛋白还有保护病毒核酸的作用——核酸处于蛋白外壳的内部，或与蛋白质互相缠绕而成核蛋白。因此病毒基因组受到有关蛋白质的保护，从而可以抵抗理化学因素的降解作用。
蛋白质构成病毒质量的大部分，病毒粒子内的蛋白质可以单独地或与糖、脂类结合在一起，成为糖蛋白或脂蛋白。病毒结构蛋白可以从提纯的病毒制品中通过与核酸和其它蛋白分离, 而又不打断肽键的处理方法得到。分离时须用中性去污剂、极性试剂或阻止蛋白聚合的保护剂如尿素、盐酸胍、去氧胆酸钠和SDS 等, 或改变pH 值等方法加以处理。
三、 病毒脂质的抽提
病毒中有许多种脂类化合物，包括磷脂、中性脂肪、脂肪酸、脂肪醛及胆固醇等。病毒脂质的主要成分是磷脂，它在许多病毒中具有结构上的功能。病毒的磷脂就在囊膜中，它对病毒颗粒的结构完整性是很重要的。这是因为当这类病毒用脂溶剂或某些磷脂酶处理后就显著地丧失了感染性。
病毒脂质大部分来源于感染前就存在于宿主细胞的脂质。病毒的有些脂质与糖结合形成糖脂，有些脂质与蛋白结合形成脂蛋白。
抽提病毒脂类时最常用的溶剂系统是氯仿－甲醇。有人应用此溶剂系统抽提SV5的病毒脂质, 其方法是:
(1)取冻干的病毒样品, 用氯仿：甲醇：水=65：25：5的溶剂, 在室温下抽提二次, 每次20 min,接着在氮气下用沸腾的溶剂抽提一次20min 。
(2)合并抽提物, 加入其1/6体积的水 ,混合后分为水相和有机相。如存在神经节甙脂, 则进入到水相中, 而其它全部脂质仍留在有机相中。
(3)将这一部分溶剂移到旋转器或蒸发器中, 在氮气下驱除有机溶剂, 即获得总的脂质。
四、 病毒糖类的提取
糖是所有病毒核酸的组成成份之一, 有些病毒还含有葡萄糖基嘧啶, 另一些病毒则含有糖蛋白。病毒囊膜的主要成份是糖蛋白, 通常位于病毒粒子的表面, 使它们具有血清学活性。
下面是Lai 提纯禽肿瘤病毒糖类的方法：
(1) 用1%SDS(内含0.05mol/L 2-巯基乙醇 )在37℃裂解提纯病毒30min, 在此裂解物中加入5倍体积的乙醇, 沉淀病毒的糖蛋白, 将此沉淀物溶于0.1%SDS,0.1mol/L Tris(pH8.0)中;
(2) 用饱和酚抽提病毒糖蛋白, 取水相加入5倍体积的乙醇(内含2mol/L NH4Ac) 沉淀回收病毒糖蛋白, 再用75%的乙醇洗一次, 溶于0.1%SDS,0.1mol/L Tris中；
(3) 用灰色链丝菌酶1mg/ml处理48h, 再用0.05mg/ml的浓度处理 48h,以水解糖蛋白;
(4) 水解的糖蛋白通过Sephadex-G50凝胶层析过滤法
,
蛋白酶K ，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和
芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA 酶和DNA 酶活性。由
于蛋白酶K 在尿素和SDS 中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它
应用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA ，蛋白质印迹以及去除DNA
和RNA 制备中的核酸酶。蛋白酶K 的一般工作浓度是50—100μg/ml。在较
广的pH 范围内(pH 4-12.5)均有活性。
推荐反应缓冲液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。
蛋白酶k 配制标准：20mg/ml蛋白酶K 配制标准(proteinase K)：将200mg
的蛋白酶K 加入到9.5ml 水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K 完全溶解。不要涡
旋混合。加水定容到10ml ，然后分装成小份贮存于-20℃。
蛋白酶K 的保存：保存在-20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。
孵育温度为55至65℃，理想孵育温度为58℃，孵育时间为15分钟至48
244
小时; 理想孵育时间为2小时。
作用：蛋白酶K 在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理，它具有消化包围靶DNA 蛋白质的作用，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号. 但蛋白酶K 的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时，都会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织切片的脱落，细胞核的消失，从而影响杂交结果。EDTA 缓冲液可以替代蛋白酶K 的作用，解决上述出现的问题，并能达到理想的染色效果。
蛋白酶K 的应用比较广泛，它可以消化包围靶DNA 蛋白，因此使用蛋白酶K 能够增加探针与靶核酸结合的机会增强杂交信号，但在使用蛋白酶K 时要主要使用的浓度，过高或者过低都会破坏细胞的结构、核消失等影响试验结果。
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第十四章 病毒和病毒成份的提纯
一、病毒的提纯
(一) 沉淀法
(二) 层析法
(三) 两相溶剂间分配系数法
(四) 红细胞吸附法
(五) 电泳法
(六) 超速离心法
(七) 超滤法
二、病毒蛋白亚单位的分离
三、病毒脂质的抽提
四、病毒糖类的抽提
一、病毒的提纯
所谓病毒提纯, 就是应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质——DNA 或RNA 的详细研究都需要高纯度的病毒样品。
病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定标准。
1. 物理均一性
测定病毒样品的物理均一性, 是证明其纯度的常用方法, 包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。
2. 病毒滴度与蛋白含量的比例
测定病毒材料的感染力或其血清学反应滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高, 说明病毒的纯度越高。
3. 免疫学反应
免疫反应单一而无非特异反应，则说明病毒材料比较纯净。
4. 结晶形成
病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。
病毒提纯的主要依据和条件有:
(1)病毒只在活的细胞内寄生、复制和增殖, 要在病毒不失活的前提下，使之从细胞中释放出来，去除细胞成份。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒, 病毒粒子被释放到细胞外，可以从培养液或尿囊液中提纯； 而另一些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA 病毒，在毒粒成熟后只有少数病毒释放到细胞外，大量提纯时必须首先裂解细胞，使病毒大量释放。实验室常用冻融、研磨、高速捣碎、超声波处理或高压冲击、中性去污剂裂解、 蛋白酶解等物理和化学的方法。 通过这些方法处理获得的粗制的病毒悬液，其中常含有大量的细胞碎片，一个有效的方法是以2000～ 6000r/min离心30～40分钟，可除去90％以上的细胞碎片和杂质。
(2)病毒粒子实际上是大的蛋白颗粒，可以应用提纯蛋白质的一些技术方法。
(3)对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子, 可以采用分级分离的技术。当然不同的病毒，其生长特性及理化学性质不同，因此提纯方法也不尽一致。
(一) 沉淀法
主要是从稀的悬浮液中浓缩病毒，有中性盐沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、皂土法和鱼精蛋白沉淀法等。
1. 中性盐沉淀法
病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀， 且保持其感染性。在含有病毒的组织培养液中加入等体积的饱和硫酸铵，可以很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、鸡新城疫病毒等。
2. 聚乙二醇沉淀法
聚乙二醇(PEG)为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量， 用于病毒沉的主要是分子量为2000～6000的PEG 。将PEG 配成50%左右的溶液，或直接将固体PEG 加于
毒悬液中, 使其达到所需浓度, 通常在4℃搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。Tanncock(1985年) 成功地用PEG 浓缩了禽脑脊髓炎病毒。
3. 有机溶剂沉淀法
甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提纯病毒，但乙醚、氯仿等脂溶剂对于具有脂质囊膜的病毒具有破坏和灭活作用，故不适于这类病毒的浓缩提纯。
4. 等电点沉淀法
病毒粒子在等电点时，所携带的正电荷与负电荷相互中和，因而失去相互排斥的作用而发生沉淀。多数病毒的等电点在pH4.5～5.5之间，因此在pH3～6范围内均可沉淀，由于一部分细胞成份在等电点时亦发生沉淀，此法效果不太理想，但从感染的组织培养液中浓缩病毒，可以获得较好结果。应用酸性范围的等电点沉淀或分级沉淀病毒时，必须注意pH 对病毒活性的影响及病毒粒子电荷与组织蛋白电荷的差异。
5. 皂土法
Girin(1989年) 应用皂土在酸性条件下(pH4～4.5) 吸附轮状病毒SA-11，再在碱性条件下（pH 8.5），又使其洗脱下来, 从而达到纯化目的。
6. 鱼精蛋白沉淀法
鱼精蛋白为碱性蛋白，具有携带其它蛋白质共沉淀的作用，能和直径大于50nm 的病毒共同沉淀而不影响病毒的感染力。当向这种沉淀物加入1mol/L NaCl时, 病毒又重新释放到悬液中，而鱼精蛋白仍然沉淀。直径小于50nm 的小型病毒则不与鱼精蛋白共同沉淀。因此，可利用鱼精蛋白去除病毒材料中直径大于50nm 的异种蛋白质。
(二) 层析法
病毒粒子表面携带特定的电荷群，因此病毒对离子交换树脂及类似的其它吸附剂具有亲和性。利用吸附剂的层析法分为两种，一种是正吸附法，即依据病毒粒子表面所携带的电荷进行特异性吸附，然后用适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收；另一种是负吸附法，即只吸附组织或宿主细胞成份等非病毒蛋白，而让病毒粒子通过。收集滤液后经差速离心沉淀法回收病毒。由于各种病毒的大小和表面结构等理化性质不同，因此对吸附剂的亲和性也有显著的差异。
1. 萄聚糖柱层析法
将初步浓缩的材料，通过葡聚糖G-150或G-200柱层析，然后用0.02～0.15mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.6)洗脱，分部收集，测定280nm 波长处的OD 值，将含病毒的各部分相混合，再浓缩，透析之后，即可得到比较纯净的病毒，Nagano(1989年) 用Sephacryls-1000 柱层析纯化了鸡传染性支气管炎病毒。
2. 凝胶层析法
①磷酸钙凝胶:这是病毒吸附层析法中较为常用的凝胶，由0. 5mol/L CaCl2和0.5mol/L Na2HPO4溶液混合制备凝胶状沉淀物。在中性条件下生成的凝胶称为“brushite ”， 在碱性条件下生成的凝胶称为羟基磷灰石(hydroxypatite)。两者均用0.001mol/L磷酸盐缓冲液悬浮，置于4℃4～5天，使它充分沉淀后应用。
②氢氧化锌凝胶:是由7mol/L氨水与0.1mol/L醋酸锌溶液滴加混合(pH8.5) 而制备的，在制备后数小时内较稳定，可作为吸附剂。Newton 和Beris 等将水泡性口炎病毒悬液与氢氧化锌凝胶混合，使其形成复合体后沉淀，然后用0.08mol/L EDTA(pH8.5) 解离病毒，获得较好的回收量。
③焦磷酸镁凝胶:是由0.1mol/L焦磷酸钠和0.1mol/L mol/MgCl2，以2：10(体积) 比例在室温中缓慢滴加混合而获得的较稳定的焦磷酸镁凝胶。西村等将牛痘病毒悬液同此凝胶混合，使病毒吸附于凝胶，然后用0.1mol/L盐水洗2次，最后用0.3mol/L枸橼酸钠溶液解离病毒，将病毒较好地回收于水相中。
3. 离子交换纤维素柱层析法
离子交换层析适于分离几乎所有带电荷的分子。通常有阴离子交换剂和阳离子交换剂两种。
某些病毒可以被离子交换剂经离子键作用而吸附，通过改变平衡液的离子强度, 使其再洗脱下来而达到纯化目的。腺病毒和口蹄疫病毒被DEAE 纤维素吸附， 可分别再用0.5mol/L和0.15mol/L NaCl溶液洗脱下来，从而得以纯化。
4. 亲和层析法
亲和层析是一种特殊的吸附层析, 基质与待分离物具有特异的生物亲和力。 通常是将特异的抗体经共价偶联作用结合在配基上组成一种不溶性配基。当相应的抗原物质通过固定配基装成的层析柱时，即被吸附。随后再改变实验条件，将其洗脱下来，达到纯化的目的。该法是于80年代初期开始用于病毒的分离提纯，不仅纯度好，敏感，而且回收率高。
Njayou(1991年) 应用此法成功地提纯了麻疹病毒。 他们应用猴抗麻疹病毒的IgG 进行共价偶联，获得了高纯度而有活性的病毒，回收率可达总回收成份的30％。 Rimmelzwaan (1987年) 应用犬细小病毒的中和性单克隆抗体亲和层析，纯化了细小病毒，经SDS —PAGE 和 ELISA鉴定，99％以上的杂蛋白被洗除，收获了70～90％的病毒抗原成份。
(三) 两相溶剂间分配系数法
该法主要原理就是高分子物质以溶质形式存在于两相溶剂中，根据其分配系数的不同而选择性地分配于其中的一方，从而达到纯化的目的。所采用的溶剂主要有: 葡聚糖硫酸盐(Dextran Sulphate,DS)和聚乙二醇(PEG)或甲基纤维素(MC)和聚乙烯醇(PVA)，形成 Ds —PEG 系、Ds —PVA 系和Ds —MC 系。利用病毒在有机溶剂中的分配原理，在适当的溶剂系统和葡聚糖层之间进行多次反复转换，不仅能够浓缩病毒，而且还可以纯化病毒。
通常是将两相溶剂如Ds —PEG 以适当的重量百分比混合，然后加入病毒液， 数次激烈振荡混合，置于4℃ 24～36小时，即可分离为两层，病毒将特异地分布于其中一方(如Ds 层中) 。适当改变溶剂的混合比例时，分配于Ds 层中的病毒可由Ds 层转入 PEG中，而得以浓缩。若调节适当，一步就可浓缩100倍，两步浓缩就可以达到10000倍。
非病毒物质通常以不同的方式进行分配，从而达到浓缩纯化的目的。Nammar(1991年) 应用Ds —PVA 系纯化了反转录病毒。两相溶剂间分配系数法简单、温和，并能使病毒得到较高的浓缩和纯化。但是为了获得高度纯化的病毒，还需配合应用其它方法。
(四) 红细胞吸附法
所谓病毒的红细胞凝集反应，就是指病毒被红细胞表面粘蛋白吸附的现象。自Hirst 发现流感病毒的红细胞凝集性质以来，随后相继发现其它一些动物病毒也有红细胞凝集性。Stanley 证明，流感病毒在0℃时被红细胞吸附，而在37℃时却从红细胞上脱离下来的性质，从而将此方法应用于病毒提纯。
我们实验室应用醛化鸡红细胞吸附马流感病毒，取得较好效果。具体方法是:
采取鸡血，以无菌生理盐水洗涤3次后制成压积红细胞。 另取福尔马林和生理盐水等量混合，制成福尔马林盐水。在2份福尔马林盐水中加入1份压积红细胞，充分振荡15min ，置2～8℃冰箱内48h ，每天振荡2～3次。届时取出，再振荡1次，后用700r/min 离心 5 ～10min ，弃上清，再加20倍量生理盐水，振荡混合后置2～8℃ 冰箱过夜。弃上清，加入20倍量生理盐水，如上洗涤3次。取沉淀红细胞， 加入相当于初次压积红细胞量的生理盐水，混匀后即可应用。
将马流感病毒感染的鸡胚尿囊液，作2500r/min离心10min ，吸取上清液。 取保存于2～8℃的病毒液100ml ，加入2～8℃的醛化红细胞悬液6ml ，充分振荡15min ，立即放入冰箱内每2h 振荡1次，共2～3次，随后置冰箱中过夜，待其自然沉淀。次日吸出上清，
如其血凝价在1:15以下，则证明已经充分吸附，此时即可进行释放，否则需再补加醛化红细胞悬液继续吸附。在已充分吸附病毒的醛化红细胞沉淀中，加入相当于原病毒液1/10量的5mol/L NaCl溶液, 充分振荡，置37℃水浴中4h ，每隔30～60min 振荡1次。取出后立即以700r/min 离心10min 。吸取上清液，即为浓缩病毒液， 必要时可对已释放过病毒的醛化红细胞作第二次释放，方法同前。
上述吸附-释放方法，可将病毒浓度提高10倍左右(以血凝效价表示) 。
(五) 电泳法
先将病毒悬液对缓冲液透析。根据病毒的种类不同，选择适当的缓冲液，但离子强度不能超过0.3mol/L以上。病毒粒子依据其所携带的电荷，在电场中或向正极，或向负极移动，因此电泳结束后，分段收集病毒区带部分，就能达到提纯的目的。
(六) 超速离心法
病毒粒子经过初步浓缩之后，要进一步纯化，通常采用超速离心法， 它是分离提纯不同大小的病毒的有效方法之一。在应用超速离心法沉淀病毒时，必须了解所用离心机的离心力。离心机由于转头的回转产生了强大的离心力, 这种离心力是随转头的大小和离心管至转轴中心的距离而变化的。高速和超速离心机的离心条件，有的以每分钟速度(r/min)表示，有的则以离心力——重力加速度g.(980cm/S2)为单位来表示。离心沉淀时， 沉降速度与离心力有关。
离心机转速在4000r/min左右的称为低速(普通) 离心机；转速至 25000r/min左右的称为高速离心机；转速25000r/min以上的称为超速离心机。高速和超速离心机装有冷冻装置和抽真空装置，以保持离心腔中恒定的低温，并减少转头运转时空气的摩擦力。超速离心机有制备和分析用两类，最近又生产出制备、分析及区带连续离心三用装置在一起的离心机，有的还带扫描装置。
使用超速离心机的分离提纯方法有三种:(1)差速离心法；(2)速度区带离心法；(3)平衡密度梯度离心法(或等密度梯度离心法) 。
1. 差速离心法
这是应用较早的简单方法，建立在不同大小和比重的粒子在沉降速度上存在差别的基础上。具体做法是将被分离的样品交替进行低速离心与高速(或超速) 离心。沉降速度差别在一个或几个数量级的粒子，可用本法分离提取。粒子大小、转速与离心沉淀时间的关系，差速离心适用于从组织培养液、 鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附-释放的病毒悬液中提纯病毒。在由感染细胞或组织匀浆中提取病毒时，由于与病毒大小相近的细胞亚单位及碎片的存在，提纯效果不理想。差速离心法的优点是能迅速处理大量样品，故常作为病毒精
制的第一个阶段，或者用于病毒样品的浓缩和粗提。
以差速离心法分离提纯病毒时，经常以低速(2000～3000r/min，20～30min) 及中速(10000r/min，20～30min) 去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其他较大的杂质。然后，选择在60min 内能够沉淀80%以上的病毒粒子的较高速度，离心1～2h ， 使病毒沉淀。对中、大型病毒如流行性感冒病毒，在经红细胞吸附-释放后，于 25000r/min离心60min ，即可达到目的。小型病毒如脊髓灰质炎病毒、披膜病毒，则需以35000～ 45000r/min离心1～2h 。高速或超速离心沉淀物， 可用研磨和超声波振荡等方法打碎后悬浮于缓冲液中。对于非病毒杂质较多的样品进行差速离心，由于病毒对沉淀物的非特异性吸附而有较多损失。
2. 速度区带离心法
是根据被分离物质在强大离心力中沉降速度不同而进行的分离方法。该法使用的介质密度应该小于被分离物质的密度。介质可以为均一密度，也可以为梯度密度。当被分离的物质沉降到与介质密度相等的区域时就不再沉降。不同分子形成不同的区带，而称为速度区带。该法要求样品浓度为顶端浓度梯度的1/10，样品体积为离心管体积的5%。常用的介质有蔗糖、甘油、聚蔗糖等。在病毒纯化时，将病毒样品溶液层加于密度梯度层的顶部，借助病毒粒子或其亚单位成分本身的浮密度差别，在离心力作用下降到密度相等的介质层内，最后排列成带状停留不动。密度较小的粒子或成分停留在上面的几层内，密度较大的粒子或成分沉降于下面几层内。应用密度梯度法，可以获得相当纯净的病毒样品。病毒粒子或成分的沉降速度取决于其大小、形状及比重，也取决于离心力及悬液介质的密度和粘度。蔗糖是生物大分子粒子密度梯度分离时最常应用的材料，因其易溶于水，且对核酸及蛋白质呈化学惰性。常用的梯度范围从5～20%或10～60%。
除蔗糖浓度连续梯度离心外，近来有人在两层浓度梯度上层加病毒浓缩样品，经超速离心后将病毒收集于两层界面处；也有人在单层蔗糖浓度溶液上层加病毒浓缩样品，经超速离心，使病毒沉淀于蔗糖溶液底部。这两种方法比较简单，但浓缩提纯的效果远远不如多层连续梯度法。
3. 平衡密度梯度离心法
平衡密度梯度离心法是根据粒子的浮密度不同而加以分离。所谓浮密度就是物质的质量减去在一定介质中所受的浮力, 亦称有效密度。
制备梯度的方法有两种：一种是在饱和的CsCl 溶液上面层加病毒样品(容量比1:
4) ；另一种是将病毒样品与CsCl 浓溶液均匀地混合。一般用水平转头，经较长时间的超速离心，在离心管中形成CsCl 的浓度梯度，并由于离心力的作用，样品中的病毒粒子分布于相应密度的区域内。这种方法在分析离心中是最常用的。应用本法时，离心转头的回转数越高，离心时间越长，越能接近平衡状态。
平衡密度梯度离心法广泛应用于病毒和核酸的提纯上。用平衡密度梯度离心法提纯的动物病毒有多型瘤病毒、牛痘病毒、乙型脑炎病毒、狂犬病病毒和马传贫病毒等。有的病毒在这些无机盐类溶液中被破坏，可加入0.2～0.5%牛血清白蛋白，或用0.5～3.0%甲醛先将病毒粒子固定，然后进行平衡密度梯度离心，常能较好地回收病毒。大多数病毒的浮密度在1.10～1.40范围内。所以制备密度范围为1.0～1.7的悬浮介质，便可满足大多数病毒密度梯度离心的需要。
4. 密度梯度离心法的操作程序
(1)密度梯度的制备:制备密度梯度的方法有不连续的(即人工操作) 和连续的( 即机械操作) 密度梯度两种。
不连续的或分层的密度梯度的制备 不连续的密度梯度是以人工操作法制备的，在一定温度下(一般在20℃或在25℃) 配制一系列浓度差为5%的梯度溶液, 例如蔗糖可配制成5、10、15、20、25、30、 35、40%(W/V)等溶液(用蒸馏水或适宜的缓冲液配制) ，用皮下注射器或微量吸管，小心地先吸取浓度最大的溶液注入离心管底，然后依次加入较低的各个浓度(40%→5%)，一层覆盖着一层地层加于离心管中，注意避免产生气泡。假如各层界面被冲动破坏，则应重新制备。也可以将长针头插入管底，依次从浓度低到高加入各溶液。
连续的密度梯度的制备 为了产生一个连续的密度梯度，常用梯度混合装置来制备梯度。
梯度混合装置由A 和B 管组成。两管之间用双通活塞联结。在活塞关闭的状态下，向A 管中加入低浓度蔗糖溶液，向B 管中加入高浓度的蔗糖溶液，两管中容量要相等。在B 管出口处用一根聚乙烯小管连接到离心管。在给B 管充液时，可将聚乙烯小管的流出口向上转动，使之超过液体的水平面，从而阻止液体流出。充液后可将小管接到离心管中使之贴着管壁，然后开动小搅拌器，使搅拌棒转动，同时打开两管间活塞。这三个操作要同时进行，以保证梯度的连续性。 当梯度液体自B 管流出时不允许移动离心管，待离心管中所盛的梯度溶液的体积达到需要量之后，将离心管小心地静止于4℃ 1～2h ，以平衡之。
现在不少“制备用超速离心机”携带有“密度梯度制备自动装置”。按照这个方法制备的蔗糖浓度梯度，理论上按公式计算。
这些浓度梯度是根据样品和实验目的而专门选用的。一般使用的浓度梯度范围为20%→5% ，40%→10%，或60%→10%等。
(2)加入样品:用如上所述注射器或微量吸管吸取悬浮于适宜缓冲液中的病毒或核酸样品( 约梯度介质体积的1/10容量) ，从液面上方1mm 处，紧贴着离心管壁轻轻层加于梯度介质面上。
(3)高速或超速离心:将加入样品的离心管装入套管内，也可将离心管置于转头的套管内，以免在装进套管时震动液体。拧紧套管螺帽，将套管吊在水平转头上，置于离心机
内。梯度离心一般用高速或超速离心机。离心速度和时间，根据所分离的样品选定。离心开始，样品中各种粒子逐渐分离，分布于相应的密度梯度层中成为带状( 如为透明的聚碳酸酯离心管，则可以清楚地见到带状分离，并拍照) 。离心时间到时，使离心机自然停止，不许制动，以免破坏梯度。
(4)梯度的分段收集(取样):在离心完了以后，为了把已分离物质的各条带分开，必须取出梯度溶液。梯度溶液的分段收集方法有如下几种。
①取代法：从离心管底部穿刺或将带长针头的注射器插入离心管底，使一种稠密的介质，如60～70%(W/V)蔗糖溶液，缓慢地注入于离心管底部。然后用一个注射器或移液管，从上面逐一移出各部分。或者在离心管的颈部加上一个塞子，这个塞子附着一根收集导管，通向一个部分收集器，收取各部分。
②穿刺法：将离心管固定于特制的固定架上，在其底部装上一个垂直向上的空心针穿刺，使梯度溶液自由滴出，可用部分收集器或用小试管分段收集。超速离心机一般都带有此装置。此装置的缺点是离心管在用一次后即废弃。
③虹吸法：此法的优点是不必穿刺离心管，离心管可反复使用。经我们多次试验，此法简便易行，对梯度密度无破坏。用一根大穿刺针截两段做虹吸管，以接上 50 ～100ml 玻璃注射器进行送气的方法，分段收集梯度溶液。
④注射器吸取法：用弯曲的针头(J状) 接在注射器上， 从梯度最上层开始向下逐层小心吸取液体。
5. 梯度各层液体的密度测定
(1)称重量法：用10ul 微量注射器吸取样品，加入于已知重量的毛细管中，在 1/10万分析天秤上称重，计算重量(g/ml)，即为梯度溶液的密度。
(2)测定折射率法：用阿贝氏折光仪测定各梯度层溶液的折射率(25℃) 。
(3)浮漂法：向已制备好的各种密度溶液中滴入一滴样品， 找出相应的样品浮密度溶液，即为该梯度层的密度。
6. 各梯度分层液中病毒分布的鉴定
(1)以紫外分光光度计测定蛋白质和核酸吸收峰。吸取各层梯度溶液， 用蒸馏水或缓冲液适当稀释后，测定波长280和260nm 的OD 值。然后以各梯度层管号为横坐标，其OD 值为纵坐标画曲线，即为各梯度层中蛋白质-病毒含量图，有些病毒260nm OD 值较高。
(2)以各种血清学方法测定各梯度层中病毒的抗原效价或用组织培养法测定病毒滴度，证实病毒分布区域。
(3)用电子显微镜负染法观察病毒粒子及其纯度。将各梯度层样品装入透析袋中，置于适宜的溶液中透析去盐，然后取一滴样品用蒸馏水稀释，滴附于铜网膜上，用磷钨酸负染后电镜下观察病毒粒子。
(七) 超滤法
超滤法是利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小的大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩的一种方法。超滤膜的孔径有多种，可根据被截留的分子大小而选择。超滤法是浓缩大容量的病毒样品的一种非常有效的方法，其优点是可以在室温或低温下操作；对被浓缩的产物损害很小；浓缩的同时可达到部分纯化；如选择合适的膜和操作参数，可达到很高的回收率；此外，超滤系统可密封以防止外来污染。超滤系统目前主要有三种，即搅拌池式，浅道流动系统和中空纤维系统。搅拌池式是一种最简单的超滤系统，由超滤室及磁力搅拌器组成，通过正压而使液体通过滤膜。此方法简单，但浓缩样品量有限，一般在2000ml 以内，而且滤膜孔易于堵塞。浅道流动系统的特点是液体在膜表面的螺旋形浅道中流动，液体与膜的接触面积也大于搅拌池系统，因而滤过速度大为提高。中空纤维系统是由很多根空心纤维成束装配而成，每根纤维即为一个微细管型膜，因此，其有效的膜面积远远大于前二个系统，滤过速度很快，适用于大体积的浓缩。
二、病毒蛋白亚单位的分离
病毒具有几种以上的蛋白质, 每一种蛋白质通常都由分子量较小的许多相同的亚单位组成。病毒的结构蛋白决定着病毒粒子的结构及其与细胞受体部位结合的特异性。病毒的血清学特异性和酶活性也决定于蛋白质。结构蛋白还有保护病毒核酸的作用——核酸处于蛋白外壳的内部，或与蛋白质互相缠绕而成核蛋白。因此病毒基因组受到有关蛋白质的保护，从而可以抵抗理化学因素的降解作用。
蛋白质构成病毒质量的大部分，病毒粒子内的蛋白质可以单独地或与糖、脂类结合在一起，成为糖蛋白或脂蛋白。病毒结构蛋白可以从提纯的病毒制品中通过与核酸和其它蛋白分离, 而又不打断肽键的处理方法得到。分离时须用中性去污剂、极性试剂或阻止蛋白聚合的保护剂如尿素、盐酸胍、去氧胆酸钠和SDS 等, 或改变pH 值等方法加以处理。
三、 病毒脂质的抽提
病毒中有许多种脂类化合物，包括磷脂、中性脂肪、脂肪酸、脂肪醛及胆固醇等。病毒脂质的主要成分是磷脂，它在许多病毒中具有结构上的功能。病毒的磷脂就在囊膜中，它对病毒颗粒的结构完整性是很重要的。这是因为当这类病毒用脂溶剂或某些磷脂酶处理后就显著地丧失了感染性。
病毒脂质大部分来源于感染前就存在于宿主细胞的脂质。病毒的有些脂质与糖结合形成糖脂，有些脂质与蛋白结合形成脂蛋白。
抽提病毒脂类时最常用的溶剂系统是氯仿－甲醇。有人应用此溶剂系统抽提SV5的病毒脂质, 其方法是:
(1)取冻干的病毒样品, 用氯仿：甲醇：水=65：25：5的溶剂, 在室温下抽提二次, 每次20 min,接着在氮气下用沸腾的溶剂抽提一次20min 。
(2)合并抽提物, 加入其1/6体积的水 ,混合后分为水相和有机相。如存在神经节甙脂, 则进入到水相中, 而其它全部脂质仍留在有机相中。
(3)将这一部分溶剂移到旋转器或蒸发器中, 在氮气下驱除有机溶剂, 即获得总的脂质。
四、 病毒糖类的提取
糖是所有病毒核酸的组成成份之一, 有些病毒还含有葡萄糖基嘧啶, 另一些病毒则含有糖蛋白。病毒囊膜的主要成份是糖蛋白, 通常位于病毒粒子的表面, 使它们具有血清学活性。
下面是Lai 提纯禽肿瘤病毒糖类的方法：
(1) 用1%SDS(内含0.05mol/L 2-巯基乙醇 )在37℃裂解提纯病毒30min, 在此裂解物中加入5倍体积的乙醇, 沉淀病毒的糖蛋白, 将此沉淀物溶于0.1%SDS,0.1mol/L Tris(pH8.0)中;
(2) 用饱和酚抽提病毒糖蛋白, 取水相加入5倍体积的乙醇(内含2mol/L NH4Ac) 沉淀回收病毒糖蛋白, 再用75%的乙醇洗一次, 溶于0.1%SDS,0.1mol/L Tris中；
(3) 用灰色链丝菌酶1mg/ml处理48h, 再用0.05mg/ml的浓度处理 48h,以水解糖蛋白;
(4) 水解的糖蛋白通过Sephadex-G50凝胶层析过滤法
,
蛋白酶K ，是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和
芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA 酶和DNA 酶活性。由
于蛋白酶K 在尿素和SDS 中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它
应用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA ，蛋白质印迹以及去除DNA
和RNA 制备中的核酸酶。蛋白酶K 的一般工作浓度是50—100μg/ml。在较
广的pH 范围内(pH 4-12.5)均有活性。
推荐反应缓冲液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。
蛋白酶k 配制标准：20mg/ml蛋白酶K 配制标准(proteinase K)：将200mg
的蛋白酶K 加入到9.5ml 水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K 完全溶解。不要涡
旋混合。加水定容到10ml ，然后分装成小份贮存于-20℃。
蛋白酶K 的保存：保存在-20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。
孵育温度为55至65℃，理想孵育温度为58℃，孵育时间为15分钟至48
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小时; 理想孵育时间为2小时。
作用：蛋白酶K 在原位杂交技术中通常用于杂交前的处理，它具有消化包围靶DNA 蛋白质的作用，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号. 但蛋白酶K 的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高时，都会对细胞的结构有一定的破坏，导致组织切片的脱落，细胞核的消失，从而影响杂交结果。EDTA 缓冲液可以替代蛋白酶K 的作用，解决上述出现的问题，并能达到理想的染色效果。
蛋白酶K 的应用比较广泛，它可以消化包围靶DNA 蛋白，因此使用蛋白酶K 能够增加探针与靶核酸结合的机会增强杂交信号，但在使用蛋白酶K 时要主要使用的浓度，过高或者过低都会破坏细胞的结构、核消失等影响试验结果。
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