肢体滑膜关节和关节软骨的起源与形态发生

肢体滑膜关节和关节软骨的起源与形态发生

1.INTRODUCTION

肢体的滑膜关节——也就是肘关节，髋关节，或是指间关节——是复杂而多样的器官。它们由相互吻合的覆有关节软骨的表面组成，受关节间韧带和关节旁韧带固定，通过一层增厚的周围滑膜囊和滑液内衬，与身体环境隔绝开来（Archer et al.,1999）。关节软骨本身相当复杂，在组织学上和表型上都可以分成不同的区（Hunziker et al.,2007）。表层区域含有拉长而扁平状的细胞，其方向与关节面平行，被很大一块胶原性基质合在一起，并分泌润滑素（lubricin），透明质酸，以及其它抗黏附性大分子物质，这些东西对无摩擦的关节运动至关重要（Jay et al.,2001）。位于中间区域的关节软骨细胞呈圆形，通常形成小竖排，产生并维持着重要的胞外成分——特别是Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖——这使其有关键的生物力学特点：弹性。底部区域的软骨细胞一般较大，在产生和维持基质方面也比较活跃，并且有关键的组织边界——称为软骨线（tidemark）——位于关节软骨及其下面的软骨下骨质之间（Broom and Poole, 1982）。关节软骨的结构在所有滑膜关节中都是相似的，但每个关节的位置和功能决定了其关节软骨截然不同的构造。举例来说，在髋关节，近乎球形而呈凹面的髋臼软骨与近乎球形而呈凸面的股骨头形成关节。在膝关节，两个远端股骨髁突与相对较平的近端胫骨平台形成关节，但不与腓骨直接接触。膝关节也含有唯一的纤维软骨结构，比如半月板和关节间韧带，髋部有位于中央的圆肌，而指间关节有额外的侧韧带。这些解剖学，组织学，以及生物力学特征的非一般变异已经了解得很清楚了，并且其在关节功能，维持，持续，运动，以及机械负荷耗散方面的多种重要作用也了解得很清楚了（Li et al.,2013a）。与之相比，现在还不清楚的是关节是如何形成，并在胚胎生成和出生后早期产生如此千姿百态的结构，组织，以及生物力学特点的，每个关节都精于且适应于特定的解剖学位置和不同的功能（Archer et al.,2003; Pacifici et al.,2005; Pitsillides and Ashhurst, 2008）。目前为止，产生关节及其特定组织的祖细胞是什么？关节软骨是如何产生其分层结构的？关节的两个面是如何按一种相互吻合的“锁和钥匙”方式成型的？这些领域的进展将有着明显的基础研究价值，也可以有重大地生物力学应用，也许有一天能领导对先天性疾病比如髋关节发育不良，以及年龄相关性疾病比如骨质疏松症的治疗。本篇回顾对近些年在关节发育研究方面的重大进展做了一个概括性的描述。

2.间区的起源和细胞谱系的追踪

数十年前在哺乳动物及鸟类胚胎中的经典研究显示早期肢体中软骨性骨骼的形成是连续而不间断的，比如Y形原基相当于柱状成分（肱骨或股骨），两块孤柱成分（zeugopod，桡骨-尺骨，腓骨-胫骨），而独体成分（autopod）发散形成指骨成分（Hinchliffe and Johnson, 1980; Hamrick, 2001）。这些研究以及其它研究引领了这样一种认识，即关节形成中最明显的信号是在将来的两个关节位置上，紧密接触的无血管性间质组织层的形成，将相邻的软骨成分阻断，因此一开始将其命名为“间区”（Holder, 1977; Mitrovic, 1978）。间区由扁平状细胞组成，细胞的方向与肢体的主轴垂直。通过缝隙连接形成紧密地交界，需要缺氧调控因子Hif-1α来行使功能（Archer et al.,2003; Provot et al.,2007）。由于间区细胞出现的位置之前被软骨细胞所占据，这就引起了一个暗示，即间区细胞源自，并且是去分化软骨细胞的直接后代（Craig et al.,1987; Nalin et al.,1995）。当Holder通过显微手术方法在早期鸡胚中卵内移除预期肘关节位置的间区，后期就没有肘关节形成。这些数据第一次揭示出间区对关节形成是必须的，但没有弄清楚间区仅仅是一个生理上的标示出关节位置的指示呢，还是有额外的，更直接的引导作用。

利用初期间区细胞表达生长和分化因子5（Gdf5; Storm and Kingsley. 1996）这一事实，我们和我们的合伙伙伴们做了遗传学细胞谱系追踪和示踪实验，使用的是复合Gdf5-Cre;ROSA R26R (LacZ)报导小鼠（Rountree et al.,2004; Koyama et al.,2008）。我们发现LacZ阳性间区细胞及其前体细胞在发育期阶段内产生了许多关节组织——包括关节软骨，滑膜内衬，以及关节间韧带——这些组织维持到成年期（Fig.1A-B）。因此，这些数据显示间区细胞不是一过性的，它们积极参与关节组织的形成，并形成一个祖细胞群体，该群体有形成关节的能力。在另一项同时进行的研究中，Hyde及其伙伴们在发育阶段的膝关节中做了类似的细胞谱系追踪与示踪实验，使用的是复合matrillin 1-Cre:R26R 小鼠；基质素1（matrillin-1）一般是被除了关节软骨细胞以外的所有软骨细胞所表达（Hyde et al.,2007）。他们发现在E13.5时，LacZ阴性的新生关节软骨细胞出现在早期膝关节位置，而邻近的细长软骨细胞是LacZ阳性的，这种类型随时间而持续。在相关实验中，同样的研究团体用Col2a1-Cre:R26R 小鼠进行发育阶段膝关节的细胞追踪，并发现标志基因呈阳性的细胞最初出现在关节软骨，十字韧带，以及内侧半月板（Hyde et al.,2008）。在E14.5时标志基因呈阴性的细胞出现在发育阶段的关节中（称为中间区细胞），并且在晚期阶段也出现于半月板的外侧部分。作者总结称膝关节的发育涉及到的细胞，存在于那些有Col2a1表达史的原基中，而侵袭性的Col2a1阴性细胞是从周围产生的。同样的，我们研究的Indian hedgehog-null（Ihh-/-）小鼠胚胎，其肢体骨骼成分完全是软骨性的，并且缺乏关节（Fig.1E-F），而在年龄相符的对照组同窝幼仔中可以预见到该处会出现关节（Fig.1C-D; Koyama et al.,2007）。利用复合Ihh-/-; Gdf5-Cre:R26R 胚胎，我们发现突变体中预期关节处形成LacZ阳性细胞（Fig.1E，箭头所示），但位于两侧并包围着未间断的关节位置（Fig.1F，箭头所示）。这些标志物阳性细胞表达间区标志基因，包括Gdf5和Erg（Fig.1J-L，箭头所示），在对照组同窝幼仔中，表型上相似的细胞按指定的类型出现在关节内（Fig.1C-D and G-I）。我们认为这些数据提示预期的关节祖细胞已经出现，在Ihh-null突变体中有特定的位置，但未能穿透融合的关节位置。Mundlos及其伙伴们研究了短肢突变小鼠的关节发育阶段缺陷，提示两侧细胞的补充与迁入（Niedermaier et al.,2005）。

近期的细胞谱系追踪实验使用的是Sox9CreERT2;R26R 小鼠胚胎，在E11.5时接受他莫昔芬，在E17.5进行检验，提示表达Sox9的细胞是关节软骨和生长板软骨的前体细胞，也是韧带和肌腱的祖细胞（Soeda et al.,2010）。在一项实验中，Zhang等人使用内源性双皮质素（Dcx）来驱动小鼠胚胎中LacZ或eGFP的表达，他们发现表达Dcx的细胞最初构成了肢体间质的绝大部分，但后期限制在间区细胞和关节软骨细胞中（Zhang et al.,2010）。与上面用Sox9做的实验结果一致，他们总结称关节软骨细胞和生长板软骨细胞是起源自表达Dcx的一般性间质前体细胞，然后这些细胞分成关节软骨细胞和生长板细胞。TGFβⅡ受体（Tgfbr2）对于关节形成是至关重要的，特别是在独体关节的形成中（Spagnoli et al.,2007）。人们使用了新的报导小鼠，它含有Tgfbr2-βGal-GFP-BAC结构，同时表达β-半乳糖苷酶（β-Gal）和绿色荧光蛋白（GFP）作为标志基因，用于监测表达Tgfbr2的细胞在发育阶段肢体骨中随时间的时间空间分布（Li et al.,2013b）。E13.5时，Tgfbr2-βGal阳性细胞首先出现在关节的背侧和腹侧区域，在间区的中间区域未发现。到E16.5及出生后时，阳性细胞可在滑膜内衬，半月板表面，韧带，以及Ranvier区观察到，BrdU标记显示表达Tgfbr2的细胞也组成了细胞周期较长的干/祖细胞。作者得出一个有趣的结论，即在间区发育过程中，表达Tgfbr2的细胞会充当祖细胞，这种祖细胞在特定的细胞龛内掌控着关节的发育。

总而言之，上述研究带来了对肢体关节发育过程，以及间区细胞发生，命运，所起作用的更好理解。上述数据及所获的了解可以总结并合成为下面这个普遍的模型（Fig.2），而各个肢体关节不同的形态及功能可能与特殊的事件有关。沿着未被打断的，表达Sox9/Col2/Dcx的软骨原基，可以识别并确定预期的关节点所在，而其上游形态生成机制与决定机制尚不清楚。很快，Gdf5的表达会被激活，这就确定了最初的间区间质细胞群，同时伴有细胞的迁

入，并维持Dcx的表达；位于间区背部和腹部两侧的细胞会激活Tgfbr2的表达，而被原基包围的软骨细胞会开始表达基质素1（Sox9/Col2/Matn1阳性细胞；Fig.2B）。Gdf5阳性细胞与其相应的软骨原基相邻——有Sox9/Col2阳性表达史，但不表达基质素1——将会分化成关节软骨细胞，这可能涉及特定基因的活化，包括Erg和PTHrP（Iwamoto et al.,2007；Chen et al.,2008；Fig.2C）。造成韧带生成与其它关节特异性结构（例如半月板）形成的额外的分化过程与机制可能涉及到Gdf5和Tgfbr2阳性细胞和阴性细胞（Fig.2D）。表达Tgfbr2的细胞也会构成一种慢周期的储备性祖细胞群，它可在关节的修复与再生中起作用。

3.间区和关节形成的调控

Gdf5阳性细胞一开始的特点是间质，随后参与软骨和纤维软骨关节组织的发生。因此，它们必然存在某种机制，在特定的时间和发育阶段关节中某个位置控制着它们独特的表型和分化的能力（Pacific et al.,2005）。实际上，关节消融和软骨融合最初是在一般性或条件性小鼠胚胎突变体中观察到的，这些突变体缺乏Noggin，Wnt4/Wnt9a，Tgfbr2，或β-catenin，造成这种情况的原因似乎是预期关节位置上软骨生成细胞异位分化，过量分化，或是过早分化（Brunet et al.,1998; Spater et al.,2006; Spagnoli et al.,2007; Koyama et al.,2008）。在缺乏Tgfβ-活化酶1（TAK1：Gunnell et al.,2010）或硫酸乙酰肝素合酶Ext1（Mundy et al.,2011）的小鼠胚胎中观察到关节缺失和部分/完全融合，也可得出同样的结论和解释。如上文所指出的那样，关节融合也发生在缺乏Ihh表达的小鼠胚胎的肥大前生长板软骨细胞中，该发现最初揭示的是间区的形成和关节的发育受骨干（shaft）和生长板发育的精密协同调控（St-Jacques et al.,1999）。在缺乏主要软骨生成基因Sox5和Sox6的小鼠胚胎突变体中，观察到严重的间区，关节，以及生长板缺失，这再次证实了肢体骨骼生成的这种有趣的方面（Dy et al.,2010）。对间区基因表达与表型的调控，不久前的一些重要研究提供了新的观点。Kan及其同事们发现Sox11在早期肢体软骨生成前骨凝聚过程（condensation）中广泛表达，但后来变为在间区中局限表达，当其过度表达时，刺激Gdf5基因的表达（Kan et al.,2013）。Gao及其同事们显示锌指转录因子Osr1和Osr2对于Gdf5，Wnt4以及Wnt9在初期肢体间区中表达的开启不是必须的，但若没有它们，这些间区基因的表达就无法维持，然后就是肢体关节在胚胎期融合（Gao et al.,2011）。搜索Wnt9a表达的上游调控因子，Kan和Tabin识别出c-Jun是一个关键的调控因子，起增强子作用，当去除该因子时，Wnt信号途径，以及关节形成的起始与进展都被打乱了（Kan and Tabin, 2013）。Wnt信号途径也参与关节表面区域的功能维持，以及厚度调控（Yuasa et al.,2009; Yasuhara et al.,2011）。按同样的方式，Longobardi及其同事们对取自E14.5小鼠胚胎足趾的组织样本做了激光捕获辅助基因阵列（laser capture-assist gene arrays）。他们发现形成关节的间区细胞的特点是与相邻的生长板软骨细胞相比，细胞因子低表达，特别是MCP-5，MPC-5表达程度低对于间区和关节形成是必须的（Longobardi et al.,2012）。在Tgfbr2-缺失小鼠胚胎中，同时阻滞MCP-5受体CCR2，可以缓解足趾关节的融合。与前面列出的研究相一致，作者总结称关节的形成与骨干的发育紧密相关，并受骨干发育的协同调控，而这一过程中TβRⅡ/MCP5轴是关键交叉点。Jenner及其同事们近期完整地描述了关节空化前，小鼠膝部中间层及外层两侧转录产物的分布情况（Jenner et al.,2014）。如上述研究所描述的那样（Longobardi et al.,2012），他们发现与炎症和肌动蛋白细胞骨架组织有关的基因在间区中间的表达情况是不同的。有趣的是，与软骨肥大和骨形成有关的基因在外层两侧中极大地上调，使作者假设这些层中的细胞进行的是软骨内骨化，而那些位于间区中间细胞形成关节软骨。很明显的是，许多不同的效应子和分子调控者在局部水平和远距水平上发挥作用，参与间区基因表达类型，命运，以及功能的调控（Fig.2E）。

在胚胎形成期和早期胎后生活中，发育中的关节将经历空化，以形成一个含有润滑性液

体的滑囊，这对于关节的顺利运动及身体的功能都是必须的（Fig.2D）。虽然已经知道其基础本质，但这一过程仍然吸引着研究者的兴趣，数十年不衰（Pitsillides and Ashhurst, 2008）。人们早就知道，通过实验性神经损伤造成肢体无法活动，可以抑制发育中肢体关节的空化（Fell and Canti, 1934; Osborne et al.,2002）。这一发现及其含义被其它一些研究所强化，这些研究提示运动刺激了关节表面细胞表型的确定，其特征是产生关键的润滑物，包括透明质酸盐和润滑素（lubricin）（Dowthwaite et al.,2003b）。近期的研究重新评估和阐述了运动在关节形成中的重要性，以及由运动调控的特殊径路，使用的是缺乏肌肉的小鼠胚胎突变体（Kahn et al.,2009）。作者发现在缺乏肌肉的情况下，关节祖细胞命运无法维持，关节相关Wnt/β-联蛋白信号途径没有激活，关节无法正确形成。这些缺陷在数个肢体关节中被观察到，包括肘部，但某些关节似乎较少或完全不受影响，包括膝部。这些有意思的发现唤起了这样一种可能性，即不同的肢体关节的发育可能也涉及到对共同线索比如肌肉驱动性运动的不同反应。在一项相关研究中，Pazin及其同事们做出了基于阵列的分子分布描绘图，以识别小鼠胚胎中引导肘关节和膝关节发育的因子（Pazin et al.,2012）。他们识别出在E15到E16期间，肘特异性和膝特异性分子特性可以被识别出来，他们发现肘关节细胞中肌肉特化和发育基因表达丰富，这与前述缺乏肌肉的突变体中肘关节发育受扰乱的情形相一致（Kahn et al.,2009）。与之相比，膝关节细胞中属于TGFβ信号通路的基因表达丰富，这与条件性肢体Tgfbr2突变体中膝关节缺失相一致。作者提出从基础上不同的两种机制参与了间区形成后肘关节和膝关节的形成。

4.展望

这篇简单的概要显示了过去数年间产生的许多进展，这些进展为肢体关节形成带来了更好的理解。很明显关节的形成与多样性是多种因素之间联合相互作用及复杂编排的结果，这些因素包括间区和非间区细胞，生长板软骨细胞，骨骼肌——还有多种生长因子，信号蛋白，以及转录因子。但是，大部分仍然不清楚并且充满挑战。即使是搞的最清楚的“间区”也是很模糊且不清楚的，因为还没有确定在发育过程中定义间区的标准，以及沿三条主轴定义其边界的标准。后者并不是一种无价值的给定问题的研究，比如Li等人做的一项研究识别出了间区内及间区旁的特殊细胞群/龛，以及我们之前的研究显示在初期足趾关节中，Gdf5阳性间区细胞沿背侧-腹侧轴呈不对称分布（Koyama et al.,2007）。一个相关而重要的，却悬而不决的问题是“间区”是由相同来源的细胞构成而可以产生不同组织的呢，还是由已经预先决定好的不同细胞亚群构成的混合体。人们已经发现成年的关节中含有干/祖细胞及慢周期细胞（Dowthwaite et al.,2003a; Candela et al.,2014）。Wu及其同事们近期使用激光捕获切片技术（laser capture dissection）及微阵列分析对人类胚胎关节组织进行了分析，以识别定型到软骨细胞谱系的细胞的表面表型（CD166low/negCD146low/negCD73+CD44lowBMPR1B+）（Wu et al.,2013）。这一表型细胞的一个亚群在成体关节的特定区域中维持，进一步分析表明LIF，TGF-β，以及BMP信号途径是它们分化状态的潜在调控者。除此之外，这些发现的应用使得作者们可以从多能干细胞群中产生功能上不成熟的关节软骨细胞。这些令人激动的发现需要进一步研究以弄清楚成体关节中这些干/祖细胞及慢周期细胞的本质，它们是否跟间区细胞有关——以及是否是间区细胞的后代，它们是否构成一个单一或多元细胞群，在关节修复或炎症过程中有相同/不同的能力及作用，以及它们是如何被动员以强化人尽皆知的孱弱的成体关节修复能力的。已知一些转录因子和信号蛋白范围可以控制间区的特征性基因表达以及功能，将来尚需搞清楚的是这些基因产物中，每一个控制着那种特定的发育特性和过程，它们中间存在怎样的等级体系，每个基因是如何开关的，这些基因是只有发育作用，还是在修复和再生期间会被重新激活和重新作用。但是，目前为止，非常有趣而仍然没有搞清楚的是，不同关节的三维结构是如何产生的，每个正在发育的关节如何能够形成形状上相互吻合

的表面，每个关节是如何获得截然不同而独一无二的成分的，还有，关节软骨是如何保持持久与长期稳定的，以及如何获得其独特的区域。前路漫漫，但近些年的数据与取得的理解毫无疑问，为不久的将来取得有效进展铺平了道路。

肢体滑膜关节和关节软骨的起源与形态发生

1.INTRODUCTION

肢体的滑膜关节——也就是肘关节，髋关节，或是指间关节——是复杂而多样的器官。它们由相互吻合的覆有关节软骨的表面组成，受关节间韧带和关节旁韧带固定，通过一层增厚的周围滑膜囊和滑液内衬，与身体环境隔绝开来（Archer et al.,1999）。关节软骨本身相当复杂，在组织学上和表型上都可以分成不同的区（Hunziker et al.,2007）。表层区域含有拉长而扁平状的细胞，其方向与关节面平行，被很大一块胶原性基质合在一起，并分泌润滑素（lubricin），透明质酸，以及其它抗黏附性大分子物质，这些东西对无摩擦的关节运动至关重要（Jay et al.,2001）。位于中间区域的关节软骨细胞呈圆形，通常形成小竖排，产生并维持着重要的胞外成分——特别是Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖——这使其有关键的生物力学特点：弹性。底部区域的软骨细胞一般较大，在产生和维持基质方面也比较活跃，并且有关键的组织边界——称为软骨线（tidemark）——位于关节软骨及其下面的软骨下骨质之间（Broom and Poole, 1982）。关节软骨的结构在所有滑膜关节中都是相似的，但每个关节的位置和功能决定了其关节软骨截然不同的构造。举例来说，在髋关节，近乎球形而呈凹面的髋臼软骨与近乎球形而呈凸面的股骨头形成关节。在膝关节，两个远端股骨髁突与相对较平的近端胫骨平台形成关节，但不与腓骨直接接触。膝关节也含有唯一的纤维软骨结构，比如半月板和关节间韧带，髋部有位于中央的圆肌，而指间关节有额外的侧韧带。这些解剖学，组织学，以及生物力学特征的非一般变异已经了解得很清楚了，并且其在关节功能，维持，持续，运动，以及机械负荷耗散方面的多种重要作用也了解得很清楚了（Li et al.,2013a）。与之相比，现在还不清楚的是关节是如何形成，并在胚胎生成和出生后早期产生如此千姿百态的结构，组织，以及生物力学特点的，每个关节都精于且适应于特定的解剖学位置和不同的功能（Archer et al.,2003; Pacifici et al.,2005; Pitsillides and Ashhurst, 2008）。目前为止，产生关节及其特定组织的祖细胞是什么？关节软骨是如何产生其分层结构的？关节的两个面是如何按一种相互吻合的“锁和钥匙”方式成型的？这些领域的进展将有着明显的基础研究价值，也可以有重大地生物力学应用，也许有一天能领导对先天性疾病比如髋关节发育不良，以及年龄相关性疾病比如骨质疏松症的治疗。本篇回顾对近些年在关节发育研究方面的重大进展做了一个概括性的描述。

2.间区的起源和细胞谱系的追踪

数十年前在哺乳动物及鸟类胚胎中的经典研究显示早期肢体中软骨性骨骼的形成是连续而不间断的，比如Y形原基相当于柱状成分（肱骨或股骨），两块孤柱成分（zeugopod，桡骨-尺骨，腓骨-胫骨），而独体成分（autopod）发散形成指骨成分（Hinchliffe and Johnson, 1980; Hamrick, 2001）。这些研究以及其它研究引领了这样一种认识，即关节形成中最明显的信号是在将来的两个关节位置上，紧密接触的无血管性间质组织层的形成，将相邻的软骨成分阻断，因此一开始将其命名为“间区”（Holder, 1977; Mitrovic, 1978）。间区由扁平状细胞组成，细胞的方向与肢体的主轴垂直。通过缝隙连接形成紧密地交界，需要缺氧调控因子Hif-1α来行使功能（Archer et al.,2003; Provot et al.,2007）。由于间区细胞出现的位置之前被软骨细胞所占据，这就引起了一个暗示，即间区细胞源自，并且是去分化软骨细胞的直接后代（Craig et al.,1987; Nalin et al.,1995）。当Holder通过显微手术方法在早期鸡胚中卵内移除预期肘关节位置的间区，后期就没有肘关节形成。这些数据第一次揭示出间区对关节形成是必须的，但没有弄清楚间区仅仅是一个生理上的标示出关节位置的指示呢，还是有额外的，更直接的引导作用。

利用初期间区细胞表达生长和分化因子5（Gdf5; Storm and Kingsley. 1996）这一事实，我们和我们的合伙伙伴们做了遗传学细胞谱系追踪和示踪实验，使用的是复合Gdf5-Cre;ROSA R26R (LacZ)报导小鼠（Rountree et al.,2004; Koyama et al.,2008）。我们发现LacZ阳性间区细胞及其前体细胞在发育期阶段内产生了许多关节组织——包括关节软骨，滑膜内衬，以及关节间韧带——这些组织维持到成年期（Fig.1A-B）。因此，这些数据显示间区细胞不是一过性的，它们积极参与关节组织的形成，并形成一个祖细胞群体，该群体有形成关节的能力。在另一项同时进行的研究中，Hyde及其伙伴们在发育阶段的膝关节中做了类似的细胞谱系追踪与示踪实验，使用的是复合matrillin 1-Cre:R26R 小鼠；基质素1（matrillin-1）一般是被除了关节软骨细胞以外的所有软骨细胞所表达（Hyde et al.,2007）。他们发现在E13.5时，LacZ阴性的新生关节软骨细胞出现在早期膝关节位置，而邻近的细长软骨细胞是LacZ阳性的，这种类型随时间而持续。在相关实验中，同样的研究团体用Col2a1-Cre:R26R 小鼠进行发育阶段膝关节的细胞追踪，并发现标志基因呈阳性的细胞最初出现在关节软骨，十字韧带，以及内侧半月板（Hyde et al.,2008）。在E14.5时标志基因呈阴性的细胞出现在发育阶段的关节中（称为中间区细胞），并且在晚期阶段也出现于半月板的外侧部分。作者总结称膝关节的发育涉及到的细胞，存在于那些有Col2a1表达史的原基中，而侵袭性的Col2a1阴性细胞是从周围产生的。同样的，我们研究的Indian hedgehog-null（Ihh-/-）小鼠胚胎，其肢体骨骼成分完全是软骨性的，并且缺乏关节（Fig.1E-F），而在年龄相符的对照组同窝幼仔中可以预见到该处会出现关节（Fig.1C-D; Koyama et al.,2007）。利用复合Ihh-/-; Gdf5-Cre:R26R 胚胎，我们发现突变体中预期关节处形成LacZ阳性细胞（Fig.1E，箭头所示），但位于两侧并包围着未间断的关节位置（Fig.1F，箭头所示）。这些标志物阳性细胞表达间区标志基因，包括Gdf5和Erg（Fig.1J-L，箭头所示），在对照组同窝幼仔中，表型上相似的细胞按指定的类型出现在关节内（Fig.1C-D and G-I）。我们认为这些数据提示预期的关节祖细胞已经出现，在Ihh-null突变体中有特定的位置，但未能穿透融合的关节位置。Mundlos及其伙伴们研究了短肢突变小鼠的关节发育阶段缺陷，提示两侧细胞的补充与迁入（Niedermaier et al.,2005）。

近期的细胞谱系追踪实验使用的是Sox9CreERT2;R26R 小鼠胚胎，在E11.5时接受他莫昔芬，在E17.5进行检验，提示表达Sox9的细胞是关节软骨和生长板软骨的前体细胞，也是韧带和肌腱的祖细胞（Soeda et al.,2010）。在一项实验中，Zhang等人使用内源性双皮质素（Dcx）来驱动小鼠胚胎中LacZ或eGFP的表达，他们发现表达Dcx的细胞最初构成了肢体间质的绝大部分，但后期限制在间区细胞和关节软骨细胞中（Zhang et al.,2010）。与上面用Sox9做的实验结果一致，他们总结称关节软骨细胞和生长板软骨细胞是起源自表达Dcx的一般性间质前体细胞，然后这些细胞分成关节软骨细胞和生长板细胞。TGFβⅡ受体（Tgfbr2）对于关节形成是至关重要的，特别是在独体关节的形成中（Spagnoli et al.,2007）。人们使用了新的报导小鼠，它含有Tgfbr2-βGal-GFP-BAC结构，同时表达β-半乳糖苷酶（β-Gal）和绿色荧光蛋白（GFP）作为标志基因，用于监测表达Tgfbr2的细胞在发育阶段肢体骨中随时间的时间空间分布（Li et al.,2013b）。E13.5时，Tgfbr2-βGal阳性细胞首先出现在关节的背侧和腹侧区域，在间区的中间区域未发现。到E16.5及出生后时，阳性细胞可在滑膜内衬，半月板表面，韧带，以及Ranvier区观察到，BrdU标记显示表达Tgfbr2的细胞也组成了细胞周期较长的干/祖细胞。作者得出一个有趣的结论，即在间区发育过程中，表达Tgfbr2的细胞会充当祖细胞，这种祖细胞在特定的细胞龛内掌控着关节的发育。

总而言之，上述研究带来了对肢体关节发育过程，以及间区细胞发生，命运，所起作用的更好理解。上述数据及所获的了解可以总结并合成为下面这个普遍的模型（Fig.2），而各个肢体关节不同的形态及功能可能与特殊的事件有关。沿着未被打断的，表达Sox9/Col2/Dcx的软骨原基，可以识别并确定预期的关节点所在，而其上游形态生成机制与决定机制尚不清楚。很快，Gdf5的表达会被激活，这就确定了最初的间区间质细胞群，同时伴有细胞的迁

入，并维持Dcx的表达；位于间区背部和腹部两侧的细胞会激活Tgfbr2的表达，而被原基包围的软骨细胞会开始表达基质素1（Sox9/Col2/Matn1阳性细胞；Fig.2B）。Gdf5阳性细胞与其相应的软骨原基相邻——有Sox9/Col2阳性表达史，但不表达基质素1——将会分化成关节软骨细胞，这可能涉及特定基因的活化，包括Erg和PTHrP（Iwamoto et al.,2007；Chen et al.,2008；Fig.2C）。造成韧带生成与其它关节特异性结构（例如半月板）形成的额外的分化过程与机制可能涉及到Gdf5和Tgfbr2阳性细胞和阴性细胞（Fig.2D）。表达Tgfbr2的细胞也会构成一种慢周期的储备性祖细胞群，它可在关节的修复与再生中起作用。

3.间区和关节形成的调控

Gdf5阳性细胞一开始的特点是间质，随后参与软骨和纤维软骨关节组织的发生。因此，它们必然存在某种机制，在特定的时间和发育阶段关节中某个位置控制着它们独特的表型和分化的能力（Pacific et al.,2005）。实际上，关节消融和软骨融合最初是在一般性或条件性小鼠胚胎突变体中观察到的，这些突变体缺乏Noggin，Wnt4/Wnt9a，Tgfbr2，或β-catenin，造成这种情况的原因似乎是预期关节位置上软骨生成细胞异位分化，过量分化，或是过早分化（Brunet et al.,1998; Spater et al.,2006; Spagnoli et al.,2007; Koyama et al.,2008）。在缺乏Tgfβ-活化酶1（TAK1：Gunnell et al.,2010）或硫酸乙酰肝素合酶Ext1（Mundy et al.,2011）的小鼠胚胎中观察到关节缺失和部分/完全融合，也可得出同样的结论和解释。如上文所指出的那样，关节融合也发生在缺乏Ihh表达的小鼠胚胎的肥大前生长板软骨细胞中，该发现最初揭示的是间区的形成和关节的发育受骨干（shaft）和生长板发育的精密协同调控（St-Jacques et al.,1999）。在缺乏主要软骨生成基因Sox5和Sox6的小鼠胚胎突变体中，观察到严重的间区，关节，以及生长板缺失，这再次证实了肢体骨骼生成的这种有趣的方面（Dy et al.,2010）。对间区基因表达与表型的调控，不久前的一些重要研究提供了新的观点。Kan及其同事们发现Sox11在早期肢体软骨生成前骨凝聚过程（condensation）中广泛表达，但后来变为在间区中局限表达，当其过度表达时，刺激Gdf5基因的表达（Kan et al.,2013）。Gao及其同事们显示锌指转录因子Osr1和Osr2对于Gdf5，Wnt4以及Wnt9在初期肢体间区中表达的开启不是必须的，但若没有它们，这些间区基因的表达就无法维持，然后就是肢体关节在胚胎期融合（Gao et al.,2011）。搜索Wnt9a表达的上游调控因子，Kan和Tabin识别出c-Jun是一个关键的调控因子，起增强子作用，当去除该因子时，Wnt信号途径，以及关节形成的起始与进展都被打乱了（Kan and Tabin, 2013）。Wnt信号途径也参与关节表面区域的功能维持，以及厚度调控（Yuasa et al.,2009; Yasuhara et al.,2011）。按同样的方式，Longobardi及其同事们对取自E14.5小鼠胚胎足趾的组织样本做了激光捕获辅助基因阵列（laser capture-assist gene arrays）。他们发现形成关节的间区细胞的特点是与相邻的生长板软骨细胞相比，细胞因子低表达，特别是MCP-5，MPC-5表达程度低对于间区和关节形成是必须的（Longobardi et al.,2012）。在Tgfbr2-缺失小鼠胚胎中，同时阻滞MCP-5受体CCR2，可以缓解足趾关节的融合。与前面列出的研究相一致，作者总结称关节的形成与骨干的发育紧密相关，并受骨干发育的协同调控，而这一过程中TβRⅡ/MCP5轴是关键交叉点。Jenner及其同事们近期完整地描述了关节空化前，小鼠膝部中间层及外层两侧转录产物的分布情况（Jenner et al.,2014）。如上述研究所描述的那样（Longobardi et al.,2012），他们发现与炎症和肌动蛋白细胞骨架组织有关的基因在间区中间的表达情况是不同的。有趣的是，与软骨肥大和骨形成有关的基因在外层两侧中极大地上调，使作者假设这些层中的细胞进行的是软骨内骨化，而那些位于间区中间细胞形成关节软骨。很明显的是，许多不同的效应子和分子调控者在局部水平和远距水平上发挥作用，参与间区基因表达类型，命运，以及功能的调控（Fig.2E）。

在胚胎形成期和早期胎后生活中，发育中的关节将经历空化，以形成一个含有润滑性液

体的滑囊，这对于关节的顺利运动及身体的功能都是必须的（Fig.2D）。虽然已经知道其基础本质，但这一过程仍然吸引着研究者的兴趣，数十年不衰（Pitsillides and Ashhurst, 2008）。人们早就知道，通过实验性神经损伤造成肢体无法活动，可以抑制发育中肢体关节的空化（Fell and Canti, 1934; Osborne et al.,2002）。这一发现及其含义被其它一些研究所强化，这些研究提示运动刺激了关节表面细胞表型的确定，其特征是产生关键的润滑物，包括透明质酸盐和润滑素（lubricin）（Dowthwaite et al.,2003b）。近期的研究重新评估和阐述了运动在关节形成中的重要性，以及由运动调控的特殊径路，使用的是缺乏肌肉的小鼠胚胎突变体（Kahn et al.,2009）。作者发现在缺乏肌肉的情况下，关节祖细胞命运无法维持，关节相关Wnt/β-联蛋白信号途径没有激活，关节无法正确形成。这些缺陷在数个肢体关节中被观察到，包括肘部，但某些关节似乎较少或完全不受影响，包括膝部。这些有意思的发现唤起了这样一种可能性，即不同的肢体关节的发育可能也涉及到对共同线索比如肌肉驱动性运动的不同反应。在一项相关研究中，Pazin及其同事们做出了基于阵列的分子分布描绘图，以识别小鼠胚胎中引导肘关节和膝关节发育的因子（Pazin et al.,2012）。他们识别出在E15到E16期间，肘特异性和膝特异性分子特性可以被识别出来，他们发现肘关节细胞中肌肉特化和发育基因表达丰富，这与前述缺乏肌肉的突变体中肘关节发育受扰乱的情形相一致（Kahn et al.,2009）。与之相比，膝关节细胞中属于TGFβ信号通路的基因表达丰富，这与条件性肢体Tgfbr2突变体中膝关节缺失相一致。作者提出从基础上不同的两种机制参与了间区形成后肘关节和膝关节的形成。

4.展望

这篇简单的概要显示了过去数年间产生的许多进展，这些进展为肢体关节形成带来了更好的理解。很明显关节的形成与多样性是多种因素之间联合相互作用及复杂编排的结果，这些因素包括间区和非间区细胞，生长板软骨细胞，骨骼肌——还有多种生长因子，信号蛋白，以及转录因子。但是，大部分仍然不清楚并且充满挑战。即使是搞的最清楚的“间区”也是很模糊且不清楚的，因为还没有确定在发育过程中定义间区的标准，以及沿三条主轴定义其边界的标准。后者并不是一种无价值的给定问题的研究，比如Li等人做的一项研究识别出了间区内及间区旁的特殊细胞群/龛，以及我们之前的研究显示在初期足趾关节中，Gdf5阳性间区细胞沿背侧-腹侧轴呈不对称分布（Koyama et al.,2007）。一个相关而重要的，却悬而不决的问题是“间区”是由相同来源的细胞构成而可以产生不同组织的呢，还是由已经预先决定好的不同细胞亚群构成的混合体。人们已经发现成年的关节中含有干/祖细胞及慢周期细胞（Dowthwaite et al.,2003a; Candela et al.,2014）。Wu及其同事们近期使用激光捕获切片技术（laser capture dissection）及微阵列分析对人类胚胎关节组织进行了分析，以识别定型到软骨细胞谱系的细胞的表面表型（CD166low/negCD146low/negCD73+CD44lowBMPR1B+）（Wu et al.,2013）。这一表型细胞的一个亚群在成体关节的特定区域中维持，进一步分析表明LIF，TGF-β，以及BMP信号途径是它们分化状态的潜在调控者。除此之外，这些发现的应用使得作者们可以从多能干细胞群中产生功能上不成熟的关节软骨细胞。这些令人激动的发现需要进一步研究以弄清楚成体关节中这些干/祖细胞及慢周期细胞的本质，它们是否跟间区细胞有关——以及是否是间区细胞的后代，它们是否构成一个单一或多元细胞群，在关节修复或炎症过程中有相同/不同的能力及作用，以及它们是如何被动员以强化人尽皆知的孱弱的成体关节修复能力的。已知一些转录因子和信号蛋白范围可以控制间区的特征性基因表达以及功能，将来尚需搞清楚的是这些基因产物中，每一个控制着那种特定的发育特性和过程，它们中间存在怎样的等级体系，每个基因是如何开关的，这些基因是只有发育作用，还是在修复和再生期间会被重新激活和重新作用。但是，目前为止，非常有趣而仍然没有搞清楚的是，不同关节的三维结构是如何产生的，每个正在发育的关节如何能够形成形状上相互吻合

的表面，每个关节是如何获得截然不同而独一无二的成分的，还有，关节软骨是如何保持持久与长期稳定的，以及如何获得其独特的区域。前路漫漫，但近些年的数据与取得的理解毫无疑问，为不久的将来取得有效进展铺平了道路。