HEREDITAS (Beijing)
2008年6月, 30(6): 771―775 ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn
研究报告
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2008.00771
红莲型水稻杂种F 1花药噬菌体展示文库的构建
胡朝凤, 彭晓珏, 周杨永, 谭艳平, 李绍清, 朱英国
武汉大学生命科学学院, 武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 武汉 430072
摘要: 噬菌体展示是研究蛋白质相互作用的重要手段, 为深入研究红莲型水稻不育和育性恢复的分子机理, 以红莲型水稻杂种F 1花药为材料, 分离纯化mRNA, 经反转录合成双链cDNA, 在双链cDNA 末端加上定向Eco R Ⅰ/Hin d Ⅲ接头, 再用Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ消化接头, 形成两端分别带有Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ粘性末端的双链cDNA 。经Mini Column 纯化后, 收集300 bp 以上的双链cDNA 片段, 将其连接到带有Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ末端的T7 Select 10-3b 载体上, 经体外包装后, 以BL T5403 为受体菌构建了红莲水稻杂种F 1花药的噬菌体展示文库。经测定显示, 该噬菌体展示文库容量为1.03×106 pfu/mL, 重组率为100%, 扩增后文库滴度为2.14×1012 pfu/mL。对随机挑取的100 个噬菌斑进行PCR 鉴定, 97%的插入片段大于300 bp。 关键词: 水稻; 花药; 噬菌体展示; 文库构建
Construction of T7 phage display library from the anther of Honglian hybrid line of rice
HU Chao-Feng, PENG Xiao-Jue, ZHOU Yang-Yong, TAN Yan-Ping, LI Shao-Qing, ZHU Ying-Guo
Key Laboratory of MOE for Plant Development Biology, College of Life Science, Wuhan University, Wuhan 430072, China
Abstract: Phage display is a powerful method to study protein-protein interactions. In order to study the molecular mecha-nism of cytoplasmic male sterility and fertility restoration in Honglian rice, the mRNA was isolated with PolyA Tract mRNA Isolation Kit from the anther of F1 hybrid rice and the double strand (ds) cDNA was synthesized by reverse tran-scription. Then the directional Eco R Ⅰ/Hin d Ⅲlinkers were ligated into the ends of ds cDNA and the ds cDNA was further digested with Eco R Ⅰand Hin d Ⅲ, which resulted in ds cDNA with Eco R Ⅰand Hin d Ⅲends. The digested ds cDNA frag-ments longer than 300 bp in length were fractionated with Mini Column, then ligated into the T7 Select 10-3b vertor with Eco R Ⅰand Hin d Ⅲends. After packaging in vitro, the T7 Select 10-3b vertor was tansformed into BL T5403 to construct the T7 phage display library. Analysis showed that the library contained 1.03×106 clones per microliter, and approximately 100% of the clones in library was recombinant. The titer of the amplied library was 2.14×1012 pfu/mL, and the insert length of the recombinants over 300 bp was about 97%.
Keywords: rice (Oryza sativa L.); anther; T7 phage display; library construction
收稿日期:2007−11−23; 修回日期: 2008−01−26
基金项目: 国家自然科学基金(编号: 30571144)和国家高技术研究发展计划项目(863计划)(编号: 2006AA10A103)资助[Supported by the National Natu-
ral Science Foundation (No.30571144) and Hi-Tech Research and Development Program of China (863 Program) of China (No.2006AA10A103)]
作者简介: 胡朝凤(1981−), 女, 在读博士生, 研究方向：植物发育遗传。E-mail: [email protected] 通讯作者: 李绍清(1966−), 男, 副教授, 研究方向：植物发育遗传。E-mail: [email protected]
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第30卷
在高等植物中, 雄性不育是一个普遍的自然现 象[1~3], 它不仅是农作物杂种优势利用的基础, 具有重要的生产利用价值, 另一方面, 它又是研究细胞质遗因此, 近年来传、核质互作和花药发育的极好材料[4]。成为植物遗传育种和分子生物学研究的一大热点。 虽然我国水稻杂种优势利用一直保持世界领先水平, 但是关于水稻细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility CMS)及其育性恢复的机理研究还相对滞后, 许多问题仍有待深入探索。在包台型、红莲型和野败型3种CMS 水稻分子机理的研究中, 包台型的研究相对较为深入。Wang 等[5]认为包台的两个恢复基因Rf1a 、Rf1b 含有多个重复的PPR 结构域, 它们通过未知的方式剪切或者降解线粒体atp6-orf79共转录本[6, 7], 阻止毒性蛋白ORF79的产生, 从而恢复不育系的育性。虽然从花药败育类型看, 包台为染败, 红莲为圆败, 败育类型不同。但是, Yi等[8]发现HL-CMS 水稻和包台型一样存在一个与atp6共转录但只有5个碱基差异的嵌合线粒体基因orfH79, 而orfH79与atp6共转录本之间的连接序列以及表达水平和包台又有一些不 同[9, 10]。那么红莲型水稻的不育及育性恢复的分子机制和包台存在哪些异同, 又有哪些分子通过什么样的信号途径参与其中, 就需要我们采用新的技术和方法进行进一步的研究和验证。
噬菌体展示技术是近年来建立和发展起来的利用噬菌体表达外源基因的一项新技术[11], 在动物、微生物学研究中使用比较广泛, 在植物雄性不育研究中还未涉及。该技术可以用来筛选针对几乎任何靶标(蛋白、DNA 、RNA) 的亲和性多肽, 它主要应用于研究蛋白相互作用(例如激素、抗体、受体) [12, 13] 、酶分析、DNA-蛋白相互作用、RNA-蛋白相互作用、抗原决定簇作图和突变分析等方面[14~17]。因此, 本实验希望通过构建红莲杂种F 1花药的噬菌体展示文库, 为以后利用不育候选基因orfH79以及恢复候选基因为靶标, 筛选与不育及育性恢复相关的分子, 深入了解不育以及恢复的分子机理, 进一步研究恢复基因对不育基因的调控机理、作用方式等提供可靠的技术支持。
天左右, 当幼穗分化进入单核早期, 选取长势较好的红莲优6号的幼穗, 在4℃剥取花药, 称4 g花药, 在液氮中充分研磨, −80℃冻存或者直接用于下一步总RNA 的提取。 1.1.2 主要试剂
Trizol Reagent为Invitrogen 公司产品, PolyATract mRNA Isolation Kit 为Promega 公司产品, Orient Express Random Primer cDNA Synthesis Kit 和T7 Select 10-3b Cloning Kit 为Novagen 公司产品。 1.2 方法
1.2.1 总RNA 的提取
取研磨好的花药, 加入40 mL Trizol, 迅速震荡, 混合均匀, 室温放置5 min, 4℃, 12 000 r/min离心10 min, 取上清。加入4 mL氯仿, 剧烈震荡15 s, 静置3 min, 4℃ 12 000 r/min离心15 min。将水相转移到一新管中, 加入10 mL异丙醇, 混匀后室温静置 5 min, 4℃ 12 000 r/min离心10 min。弃上清, 加入1 mL 75%乙醇, 4℃ 7 500 r/min 离心5 min。弃上清, 空气干燥5 min, 溶于100 µL 无RNA 酶的水中。用紫外分光光度法测定总RNA 浓度, 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 质量。 1.2.2 mRNA 的分离纯化
按照PolyA Tract mRNA Isolation Kit 说明书分离纯化mRNA, 用紫外分光光度法测定mRNA 浓度, 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测mRNA 的质量。 1.2.3 cDNA 的合成及末端平端化
按照Orient Express Random Primer cDNA Syn-thesis Kit说明书合成双链cDNA 。cDNA 第1链的合成: 取4 µg mRNA 作为模板, 加入1 µg 随机引物, 在MMLV 反转录酶作用下利用甲基化的dNTP 完成第1链的合成。cDNA 第2 链的合成: 在第1 链反应体系中加入1.6 U Rnase H, 使cDNA 和mRNA 杂合体上的mRNA 链产生缺口, 再加入50 U DNA聚合酶Ⅰ和甲基化的dNTP, 合成cDNA 第2链。12 000 r/min离心15 min沉淀双链DNA, 吹干后溶于20 µL ddH2O 中, 加入1.5 U T4 DNA 聚合酶, 利用T4 DNA聚合酶补平双链cDNA 的末端。 1.2.4 cDNA 与Eco R Ⅰ/Hin d Ⅲ接头的连接及接头
的消化
取末端补平的双链cDNA 10 µL, 加入2 µL
1 材料和方法
1.1 材料和试剂 1.1.1 材料种植
2006年夏, 红莲型杂交水稻红莲优6号种植在武汉大学校内试验基地, 一般栽培管理。生长约90
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胡朝凤等: 红莲型水稻杂种F 1花药噬菌体展示文库的构建
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Eco R Ⅰ/Hin d Ⅲ接头在T4 DNA连接酶作用下在cDNA 末端连接上定向Eco R Ⅰ/Hin d Ⅲ接头。然后分别加入Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ各100 U消化接头, 得到两端分别带有Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ粘性末端的双链cDNA 。 1.2.5 cDNA 片段的分离
将上述消化产物全部上样于Mini Column, 按Mini Column Fractionation Kit说明书对cDNA 片段进行分离, 除去已消化的接头碎片和小片段的双链cDNA 以及大于3 kb的不易与噬菌体包装的大片段, 收集300 bp以上3 kb以下的双链cDNA 。 1.2.6 cDNA 的重组与体外包装
上述分离的双链cDNA 定量后与T7 Select 10-3b Vector Arms 按照摩尔浓度比3︰1、1︰1、 1︰3的比例作3个不同的连接体系如表1。T7 Select 10-3b Vector Arms 为两端分别带有Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ切割位点的噬菌体DNA, 可与经Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ消化的双链cDNA 两端互补, 在T4 DNA 连接酶作用下, 16℃连接过夜, 形成重组T7 Select 10-3b 载体。取连接产物1 µL 与5 µL 包装蛋白( T7 select packaging extract ) 混合, 22℃包装2 h, 得到具有感染性的T7噬菌体颗粒。然后再选取滴度最高的比例做5 µL 的连接体系, 取连接产物5 µL 与25 µL 包装蛋白混合, 22℃包装2 h, 得到大量具有感染性的T7噬菌体颗粒。
表1 不同比例cDNA: vector arms的连接体系
Table 1 Ligase reaction of the different ratio of insert cDNA : vector arms
组分 Component
cDNA 与载体的浓度比
Ratio of insert cDNA: vector arms Insert cDNA(µL)
T7 select vector arms(µL) 10×ligase buffer(µL) 10 mmol/L ATP(µL) 100 mmol/L dTT(µL) T4 DNA ligase(µL) ddH 2O(µL) 总体积 Total volume(µL)
100 µL, 加入250 µL OD 值为1的BL T5403 菌液以及1 mL Top固体培养基, 混合均匀, 铺于LB 平板上。37℃倒置培养3~4 h 后, 计数各平板上噬菌斑数目, 计算文库的容量。滴度计算公式如下: 滴度=噬菌体数目×稀释倍数×10 pfu/mL。 1.2.7.2 文库重组率测定
从原始包装物滴度测定平板上挑取100 个噬菌斑, 分别加入含有试剂盒中提供的T7up 和T7down 引物进行PCR 扩增。扩增条件为: 94℃预变性5 min; 94℃ 50 s, 50℃ 1 min, 72℃ 1 min, 35个循环; 72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测插入片段大小, 并计算文库重组率。 1.2.7.3 文库的扩增
将全部包装产物与BL T5403 菌液混合, 按5×104个噬菌斑/板, 铺15 cm LB平板, 37℃倒置培养3~4 h。待平板上噬菌斑长到直径为1~2 mm 时, 每块板加10 mL 噬菌体提取缓冲液(20 mmol/L
Tris-HCl, pH 8.0, 100 mmol/L NaCl, 6 mmol/L
次日收集噬菌体提取MgSO 4) 覆盖平板, 4℃存贮过夜。
缓冲液, 加0.15 mL 氯仿, 3 000 r/min离心5 min, 收集上清。取10 µL 上清进行10倍的梯度稀释、铺板, 测定扩增后噬菌体展示文库的滴度。在扩增产物中加入1/10 体积80%的灭菌甘油, 分装后−70℃保存。
2 结果与分析
2.1 总RNA 提取结果
用Trizol 试剂提取花药总RNA, 经紫外分光光度法测定, 产量为550 µg, OD 260/OD 280=2.023, 说明
编号 No.
1 2 3 3︰1 1︰1 1︰3
0.45 0.15 0.05 0.20 0.20 0.20 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.05 0.05 0.05 0.00 0.30 0.40 1.00 1.00 1.00
RNA 的纯度较高, 电泳结果如图1所示, 28S和18S rRNA 条带均清晰, 说明提取的总RNA 质量很好, 未发生降解。
1.2.7 T7噬菌体展示文库的鉴定 1.2.7.1 文库容量测定
将宿主菌BL T5403 接种于M9 TB 培养液, 5 µL 用TB 培养液做10倍梯度稀释, 每个梯度取
37℃ 180 r/min 培养至OD 值为1。取包装产物 图1 红莲杂种F 1花药总RNA 电泳
Fig. 1 Total RNA extracted from the anfer of Honglian F1 hybrid rice
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2.2 mRNA 分离
分离纯化的mRNA 见图2, 产量为6.5 µg, 收率为1.18%, OD 260/OD 280 = 1.96, 并且电泳图上弥散的mRNA 清晰可见, 分布均匀, 且看不到对应的28S rRNA 和18S rRNA 条带无rRNA 的污染, 表明分离的mRNA 纯度高, 质量好可以用于cDNA 合成。
图3 随机挑取克隆的PCR 检测
Fig. 3 PCR assay of clones picked at random from the T7 phage display library
3 讨 论
噬菌体展示文库对于研究与生物大分子相互作用的小肽或蛋白有着广泛的应用, 它实现了基因型和表型的结合, 提供了高效率的筛选系统, 其技术
要点是将外源基因插入改建过的噬菌体外壳蛋白基图2 mRNA 电泳图谱 因以表达外源短肽。对于构建高质量的文库噬菌体M: 总RNA; 1、2: 纯化后的mRNA 。
展示文库而言, 其关键是要保证文库的滴度和重组Fig. 2 The result of mRNA electrogenesis
M: Total RNA ; 1, 2 : mRNA isolated from the total RNA. 率。一般cDNA 文库构建的关键在于获得高质量的
mRNA, RNA易被RNA 酶降解, 而RNA 酶广泛存在,
2.3 不同连接体系滴度的测定 且不容易失活, 所以建立一个无RNA 酶的环境对于
双链cDNA 与T7 Select 10-3b vector arms 按制备优质的RNA 非常重要, 尤其是对于花药这样的照物质的量比3︰1、1︰1、1︰3的比例作3个不同材料。因此, 本实验的操作一般都在冰上进行, 并且的连接体系, 与包装蛋白包装后, 结果如表2, 3︰1在尽可能短的时间内完成, 确保RNA 的质量。最后
4
的比例所得到的噬菌体文库滴度较高为5.72×10 我们通过几个不同的小的连接体系寻找到了双链pfu/mL, 故选取insert: vector arms为3︰1的比例做cDNA 与噬菌体载体二者之间连接的最佳比例, 从5 µL 的连接体系。 而有效地提高了重组率和滴度, 使本实验构建的噬 菌体展示文库滴度达到1.03×106 pfu/mL, 重组率为表2 不同比例cDNA: vector arms的连接体系滴度
100%, 为以后的高效筛选提供了基础。 Table 2 The titer of different ratio of cDNA: vector arms
目前, 红莲型杂交稻在生产上得到了大面积推广, 编号 No.
但是对于红莲型不育和育性恢复分子机理研究还是不
1 2 3
够清楚[18, 19], 基础研究明显滞后于生产应用。因此, 需
cDNA 与载体摩尔浓度比 3︰1 1︰1 1︰3
要加强对红莲型不育和育性恢复分子机理的进一步研Ratio of insert cDNA:
vector arms 究。噬菌体展示文库的构建为今后的基础研究提供了
433 2.03×101.03×105.72×10滴度Titer (pfu/mL)
适用的技术支持。与其他技术相比, 噬菌体展示技术
的主要优点是容易对库容量较大的文库进行筛选, 标2.4 T7噬菌体展示文库的鉴定 准的cDNA 文库筛选受噬菌斑数目或能通过杂交筛选
的克隆数目的限制, 通常只能达到104数量级。而用噬红莲杂交水稻F 1花药未扩增文库的库容量为
菌体展示技术, 可以很容易地对多样性大于109 的文1.03 ×106 pfu/mL。对随机挑取的100 个噬菌斑进行
库进行筛选。同时由于筛选出的噬菌体还可以在大肠PCR 鉴定(图3), 文库重组率为100%, 97%的插入
杆菌中进行再扩增, 从而可以进行连续多轮的筛选, 片段大于300 bp, 测序结果显示无任何rRNA 以及
得到高亲和力的噬菌体, 并且获得其核酸序列相对比基因组DNA 的污染, 符合文库构建要求。扩增后文
较容易。本研究应用的是一种新的噬菌体展示技术T7 库滴度为2.14×1012 pfu/mL, 在扩增后的文库中随机
噬菌体展示系统, 与其他噬菌体相比, T7 噬菌体复制挑取100个克隆进行PCR, 仍然具有很好的多态性。
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胡朝凤等: 红莲型水稻杂种F 1花药噬菌体展示文库的构建
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周期短, 细胞质蛋白组装操作和储存方便, 克隆效率高, 更适用于高效文库构建和亲和淘洗。并且T7 噬菌体展示系统能构建和筛查更大的文库, 能使我们在对不育及育性恢复分子机理知之甚少的情况下, 开展广泛而有效的筛选, 通过“点面结合”寻找与育性相关的分子, 形成分子间相互作用的网络信号通路, 深化我们对于雄性不育的系统认识。
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772 HEREDITAS (Beijing) 2008
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在高等植物中, 雄性不育是一个普遍的自然现 象[1~3], 它不仅是农作物杂种优势利用的基础, 具有重要的生产利用价值, 另一方面, 它又是研究细胞质遗因此, 近年来传、核质互作和花药发育的极好材料[4]。成为植物遗传育种和分子生物学研究的一大热点。 虽然我国水稻杂种优势利用一直保持世界领先水平, 但是关于水稻细胞质雄性不育(Cytoplasmic male sterility CMS)及其育性恢复的机理研究还相对滞后, 许多问题仍有待深入探索。在包台型、红莲型和野败型3种CMS 水稻分子机理的研究中, 包台型的研究相对较为深入。Wang 等[5]认为包台的两个恢复基因Rf1a 、Rf1b 含有多个重复的PPR 结构域, 它们通过未知的方式剪切或者降解线粒体atp6-orf79共转录本[6, 7], 阻止毒性蛋白ORF79的产生, 从而恢复不育系的育性。虽然从花药败育类型看, 包台为染败, 红莲为圆败, 败育类型不同。但是, Yi等[8]发现HL-CMS 水稻和包台型一样存在一个与atp6共转录但只有5个碱基差异的嵌合线粒体基因orfH79, 而orfH79与atp6共转录本之间的连接序列以及表达水平和包台又有一些不 同[9, 10]。那么红莲型水稻的不育及育性恢复的分子机制和包台存在哪些异同, 又有哪些分子通过什么样的信号途径参与其中, 就需要我们采用新的技术和方法进行进一步的研究和验证。
噬菌体展示技术是近年来建立和发展起来的利用噬菌体表达外源基因的一项新技术[11], 在动物、微生物学研究中使用比较广泛, 在植物雄性不育研究中还未涉及。该技术可以用来筛选针对几乎任何靶标(蛋白、DNA 、RNA) 的亲和性多肽, 它主要应用于研究蛋白相互作用(例如激素、抗体、受体) [12, 13] 、酶分析、DNA-蛋白相互作用、RNA-蛋白相互作用、抗原决定簇作图和突变分析等方面[14~17]。因此, 本实验希望通过构建红莲杂种F 1花药的噬菌体展示文库, 为以后利用不育候选基因orfH79以及恢复候选基因为靶标, 筛选与不育及育性恢复相关的分子, 深入了解不育以及恢复的分子机理, 进一步研究恢复基因对不育基因的调控机理、作用方式等提供可靠的技术支持。
天左右, 当幼穗分化进入单核早期, 选取长势较好的红莲优6号的幼穗, 在4℃剥取花药, 称4 g花药, 在液氮中充分研磨, −80℃冻存或者直接用于下一步总RNA 的提取。 1.1.2 主要试剂
Trizol Reagent为Invitrogen 公司产品, PolyATract mRNA Isolation Kit 为Promega 公司产品, Orient Express Random Primer cDNA Synthesis Kit 和T7 Select 10-3b Cloning Kit 为Novagen 公司产品。 1.2 方法
1.2.1 总RNA 的提取
取研磨好的花药, 加入40 mL Trizol, 迅速震荡, 混合均匀, 室温放置5 min, 4℃, 12 000 r/min离心10 min, 取上清。加入4 mL氯仿, 剧烈震荡15 s, 静置3 min, 4℃ 12 000 r/min离心15 min。将水相转移到一新管中, 加入10 mL异丙醇, 混匀后室温静置 5 min, 4℃ 12 000 r/min离心10 min。弃上清, 加入1 mL 75%乙醇, 4℃ 7 500 r/min 离心5 min。弃上清, 空气干燥5 min, 溶于100 µL 无RNA 酶的水中。用紫外分光光度法测定总RNA 浓度, 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 质量。 1.2.2 mRNA 的分离纯化
按照PolyA Tract mRNA Isolation Kit 说明书分离纯化mRNA, 用紫外分光光度法测定mRNA 浓度, 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测mRNA 的质量。 1.2.3 cDNA 的合成及末端平端化
按照Orient Express Random Primer cDNA Syn-thesis Kit说明书合成双链cDNA 。cDNA 第1链的合成: 取4 µg mRNA 作为模板, 加入1 µg 随机引物, 在MMLV 反转录酶作用下利用甲基化的dNTP 完成第1链的合成。cDNA 第2 链的合成: 在第1 链反应体系中加入1.6 U Rnase H, 使cDNA 和mRNA 杂合体上的mRNA 链产生缺口, 再加入50 U DNA聚合酶Ⅰ和甲基化的dNTP, 合成cDNA 第2链。12 000 r/min离心15 min沉淀双链DNA, 吹干后溶于20 µL ddH2O 中, 加入1.5 U T4 DNA 聚合酶, 利用T4 DNA聚合酶补平双链cDNA 的末端。 1.2.4 cDNA 与Eco R Ⅰ/Hin d Ⅲ接头的连接及接头
的消化
取末端补平的双链cDNA 10 µL, 加入2 µL
1 材料和方法
1.1 材料和试剂 1.1.1 材料种植
2006年夏, 红莲型杂交水稻红莲优6号种植在武汉大学校内试验基地, 一般栽培管理。生长约90
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胡朝凤等: 红莲型水稻杂种F 1花药噬菌体展示文库的构建
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Eco R Ⅰ/Hin d Ⅲ接头在T4 DNA连接酶作用下在cDNA 末端连接上定向Eco R Ⅰ/Hin d Ⅲ接头。然后分别加入Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ各100 U消化接头, 得到两端分别带有Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ粘性末端的双链cDNA 。 1.2.5 cDNA 片段的分离
将上述消化产物全部上样于Mini Column, 按Mini Column Fractionation Kit说明书对cDNA 片段进行分离, 除去已消化的接头碎片和小片段的双链cDNA 以及大于3 kb的不易与噬菌体包装的大片段, 收集300 bp以上3 kb以下的双链cDNA 。 1.2.6 cDNA 的重组与体外包装
上述分离的双链cDNA 定量后与T7 Select 10-3b Vector Arms 按照摩尔浓度比3︰1、1︰1、 1︰3的比例作3个不同的连接体系如表1。T7 Select 10-3b Vector Arms 为两端分别带有Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ切割位点的噬菌体DNA, 可与经Eco R Ⅰ和Hin d Ⅲ消化的双链cDNA 两端互补, 在T4 DNA 连接酶作用下, 16℃连接过夜, 形成重组T7 Select 10-3b 载体。取连接产物1 µL 与5 µL 包装蛋白( T7 select packaging extract ) 混合, 22℃包装2 h, 得到具有感染性的T7噬菌体颗粒。然后再选取滴度最高的比例做5 µL 的连接体系, 取连接产物5 µL 与25 µL 包装蛋白混合, 22℃包装2 h, 得到大量具有感染性的T7噬菌体颗粒。
表1 不同比例cDNA: vector arms的连接体系
Table 1 Ligase reaction of the different ratio of insert cDNA : vector arms
组分 Component
cDNA 与载体的浓度比
Ratio of insert cDNA: vector arms Insert cDNA(µL)
T7 select vector arms(µL) 10×ligase buffer(µL) 10 mmol/L ATP(µL) 100 mmol/L dTT(µL) T4 DNA ligase(µL) ddH 2O(µL) 总体积 Total volume(µL)
100 µL, 加入250 µL OD 值为1的BL T5403 菌液以及1 mL Top固体培养基, 混合均匀, 铺于LB 平板上。37℃倒置培养3~4 h 后, 计数各平板上噬菌斑数目, 计算文库的容量。滴度计算公式如下: 滴度=噬菌体数目×稀释倍数×10 pfu/mL。 1.2.7.2 文库重组率测定
从原始包装物滴度测定平板上挑取100 个噬菌斑, 分别加入含有试剂盒中提供的T7up 和T7down 引物进行PCR 扩增。扩增条件为: 94℃预变性5 min; 94℃ 50 s, 50℃ 1 min, 72℃ 1 min, 35个循环; 72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测插入片段大小, 并计算文库重组率。 1.2.7.3 文库的扩增
将全部包装产物与BL T5403 菌液混合, 按5×104个噬菌斑/板, 铺15 cm LB平板, 37℃倒置培养3~4 h。待平板上噬菌斑长到直径为1~2 mm 时, 每块板加10 mL 噬菌体提取缓冲液(20 mmol/L
Tris-HCl, pH 8.0, 100 mmol/L NaCl, 6 mmol/L
次日收集噬菌体提取MgSO 4) 覆盖平板, 4℃存贮过夜。
缓冲液, 加0.15 mL 氯仿, 3 000 r/min离心5 min, 收集上清。取10 µL 上清进行10倍的梯度稀释、铺板, 测定扩增后噬菌体展示文库的滴度。在扩增产物中加入1/10 体积80%的灭菌甘油, 分装后−70℃保存。
2 结果与分析
2.1 总RNA 提取结果
用Trizol 试剂提取花药总RNA, 经紫外分光光度法测定, 产量为550 µg, OD 260/OD 280=2.023, 说明
编号 No.
1 2 3 3︰1 1︰1 1︰3
0.45 0.15 0.05 0.20 0.20 0.20 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.05 0.05 0.05 0.00 0.30 0.40 1.00 1.00 1.00
RNA 的纯度较高, 电泳结果如图1所示, 28S和18S rRNA 条带均清晰, 说明提取的总RNA 质量很好, 未发生降解。
1.2.7 T7噬菌体展示文库的鉴定 1.2.7.1 文库容量测定
将宿主菌BL T5403 接种于M9 TB 培养液, 5 µL 用TB 培养液做10倍梯度稀释, 每个梯度取
37℃ 180 r/min 培养至OD 值为1。取包装产物 图1 红莲杂种F 1花药总RNA 电泳
Fig. 1 Total RNA extracted from the anfer of Honglian F1 hybrid rice
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2.2 mRNA 分离
分离纯化的mRNA 见图2, 产量为6.5 µg, 收率为1.18%, OD 260/OD 280 = 1.96, 并且电泳图上弥散的mRNA 清晰可见, 分布均匀, 且看不到对应的28S rRNA 和18S rRNA 条带无rRNA 的污染, 表明分离的mRNA 纯度高, 质量好可以用于cDNA 合成。
图3 随机挑取克隆的PCR 检测
Fig. 3 PCR assay of clones picked at random from the T7 phage display library
3 讨 论
噬菌体展示文库对于研究与生物大分子相互作用的小肽或蛋白有着广泛的应用, 它实现了基因型和表型的结合, 提供了高效率的筛选系统, 其技术
要点是将外源基因插入改建过的噬菌体外壳蛋白基图2 mRNA 电泳图谱 因以表达外源短肽。对于构建高质量的文库噬菌体M: 总RNA; 1、2: 纯化后的mRNA 。
展示文库而言, 其关键是要保证文库的滴度和重组Fig. 2 The result of mRNA electrogenesis
M: Total RNA ; 1, 2 : mRNA isolated from the total RNA. 率。一般cDNA 文库构建的关键在于获得高质量的
mRNA, RNA易被RNA 酶降解, 而RNA 酶广泛存在,
2.3 不同连接体系滴度的测定 且不容易失活, 所以建立一个无RNA 酶的环境对于
双链cDNA 与T7 Select 10-3b vector arms 按制备优质的RNA 非常重要, 尤其是对于花药这样的照物质的量比3︰1、1︰1、1︰3的比例作3个不同材料。因此, 本实验的操作一般都在冰上进行, 并且的连接体系, 与包装蛋白包装后, 结果如表2, 3︰1在尽可能短的时间内完成, 确保RNA 的质量。最后
4
的比例所得到的噬菌体文库滴度较高为5.72×10 我们通过几个不同的小的连接体系寻找到了双链pfu/mL, 故选取insert: vector arms为3︰1的比例做cDNA 与噬菌体载体二者之间连接的最佳比例, 从5 µL 的连接体系。 而有效地提高了重组率和滴度, 使本实验构建的噬 菌体展示文库滴度达到1.03×106 pfu/mL, 重组率为表2 不同比例cDNA: vector arms的连接体系滴度
100%, 为以后的高效筛选提供了基础。 Table 2 The titer of different ratio of cDNA: vector arms
目前, 红莲型杂交稻在生产上得到了大面积推广, 编号 No.
但是对于红莲型不育和育性恢复分子机理研究还是不
1 2 3
够清楚[18, 19], 基础研究明显滞后于生产应用。因此, 需
cDNA 与载体摩尔浓度比 3︰1 1︰1 1︰3
要加强对红莲型不育和育性恢复分子机理的进一步研Ratio of insert cDNA:
vector arms 究。噬菌体展示文库的构建为今后的基础研究提供了
433 2.03×101.03×105.72×10滴度Titer (pfu/mL)
适用的技术支持。与其他技术相比, 噬菌体展示技术
的主要优点是容易对库容量较大的文库进行筛选, 标2.4 T7噬菌体展示文库的鉴定 准的cDNA 文库筛选受噬菌斑数目或能通过杂交筛选
的克隆数目的限制, 通常只能达到104数量级。而用噬红莲杂交水稻F 1花药未扩增文库的库容量为
菌体展示技术, 可以很容易地对多样性大于109 的文1.03 ×106 pfu/mL。对随机挑取的100 个噬菌斑进行
库进行筛选。同时由于筛选出的噬菌体还可以在大肠PCR 鉴定(图3), 文库重组率为100%, 97%的插入
杆菌中进行再扩增, 从而可以进行连续多轮的筛选, 片段大于300 bp, 测序结果显示无任何rRNA 以及
得到高亲和力的噬菌体, 并且获得其核酸序列相对比基因组DNA 的污染, 符合文库构建要求。扩增后文
较容易。本研究应用的是一种新的噬菌体展示技术T7 库滴度为2.14×1012 pfu/mL, 在扩增后的文库中随机
噬菌体展示系统, 与其他噬菌体相比, T7 噬菌体复制挑取100个克隆进行PCR, 仍然具有很好的多态性。
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胡朝凤等: 红莲型水稻杂种F 1花药噬菌体展示文库的构建
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周期短, 细胞质蛋白组装操作和储存方便, 克隆效率高, 更适用于高效文库构建和亲和淘洗。并且T7 噬菌体展示系统能构建和筛查更大的文库, 能使我们在对不育及育性恢复分子机理知之甚少的情况下, 开展广泛而有效的筛选, 通过“点面结合”寻找与育性相关的分子, 形成分子间相互作用的网络信号通路, 深化我们对于雄性不育的系统认识。
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