∀544∀中国免疫学杂志2010年第26卷
doi:10. 3969/j. issn. 1000 484X. 2010. 06. 014
人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定
年四季 黄 黎 王 栩 邬于川 袁 青 (四川省泸州医学院基础医学院, 泸州646000)
中国图书分类号 R392. 11 文献标识码 A 文章编号 1000 484X(2010) 06 0544 04
[摘 要] 目的:构建人源性天然噬菌体展示文库并对文库进行鉴定。方法:从未经主动免疫健康志愿者的外周血淋巴细胞中提取总RNA, 反转录合成cDNA, 用直接PCR 及半巢式PCR 扩增人抗体重链(V H ) 及轻链(V 和V ) 可变区基因。采用改进的重叠延伸PCR 法将V H 基因和V L (V 和V ) 基因连接成人单链抗体(scFv) 基因, 并将scFv 文库基因克隆到噬菌体载体pCANTAB 5E 中, 电转化E. coli TG1, 构建单链抗体文库。结果:采用直接PCR 和半巢式PCR 扩增得到42条V H 基因片段, 16条V 基因片段, 18条V 基因片段。混合的V H 和V L 等摩尔比连接后, 产生的单链抗体文库基因大小为750bp 左右; 转化后构建了文库容量为1. 35 108的单链抗体文库。BstN ! 酶切分析文库中的单链抗体基因结果显示, 酶切得到的scFv 指纹图谱均不相同。结论:构建的抗体文库多样性好, 可用于多种人源性单链抗体的筛选。
[关键词] 单链抗体; 噬菌体抗体文库; 重叠延伸PCR
Construction and identification of non immunized human phage display library
NIAN Si Ji, HU ANG Li, WANG Xu , WU Y u Chuan, YU AN Qing. School o f Basic Medical Sciences, Luzhou Medical Col lege, Luzhou 646000, China
[Abstract] Objective:To develop non immunized hu man phage display library. Methods:The total RNA of lymphocyte cells from pe ripheral blood of healthy voluntee was isolated and cDNA was synthesized, and the genes of heavy variable chain (V H ) and light variable chain (V and V ) were amplified by direct PCR and half nested PCR. By overlapping extension PCR, the genes of V H and V L (V and V ) were linked. The linked genes of single chain Fv fragment (scFv) were ligated with the vector pCANTAB 5E and then cloned into TG1for the scFv library construction. Results:By direct PC R and half nested PCR, 42V H fragments, 16V and 18V fragmen ts were obtained. The size of linked scFv library genes was 750bp and the volume of constructed scFv library was 1. 35 10. The results of BstN ! analysis of scFv genes from the phage library showed that fingerprint map of the selected scFvs was different. Conclusion:The developed phage library is diversity and can be used for selecting humanized scFv.
[Key w ords] Sin gle chain Fv fragment; Phage antibod y library; Overlapping extension PCR
8
目前单克隆抗体(mAb) 作为治疗性抗体发展迅速, 主要用于免疫治疗肿瘤、免疫性疾病、器官移植、感染性疾病及心血管疾病等。但单克隆抗体的临床应用仍然受到一定的限制, 主要障碍是诱导产生的人抗鼠抗体(HAHA) 反应、肿瘤渗入量低及半衰期短的问题[1]。随着基因工程技术的发展, 各种形式的基因工程抗体被构建来改善它们的性能和效能, 其中小分子单链抗体(single chain Fv fragment, scFv) 可通过噬菌体展示的方法制备, 从而使完全人
本文为四川省教育厅青年基金项目(07ZB036)、四川省卫生厅科研基金资助项目(80164) 及泸州医学院青年基金项目
作者简介:年四季(1977年-) , 男, 硕士, 讲师, 主要从事分子免疫学
方面的研究工作, E mail:siji nian@hot mail. co m;
通讯作者及指导教师:袁 青(1978年-) , 女, 博士, 副教授, 主要从
事分子免疫学方面的研究工作, E mail:yqyuan nsj@yahoo. com. cn 。
源化的抗体制备成为可能, 并且单链抗体分子量小, 组织穿透力强[2]。
噬菌体抗体文库技术的出现是抗体工程领域的
重大技术突破。文库容量和多样性是衡量抗体文库质量的两个重要参数。文库容量越大, 从中筛选得到抗体的可能性越大, 而且文库容量的大小与所获抗体的亲和力成正比。在抗体文库的构建过程中, 另外一个重要的指标为抗体文库的多样性, 文库的多样性可通过设计能扩增所有抗体基因的PCR 引物加以实现。本研究以未经免疫的健康人外周血为基因来源, 以一套被证明能扩增出所有抗体基因的PCR 引物及自行设计的引物扩增获得全套抗体可变区基因, 从而构建文库容量大、多样性相对良好的人源性天然噬菌体抗体库, 为以后筛选针对各类病毒、毒素、肿瘤特异性抗原及自身免疫疾病相关抗原的特异性人源治疗性单克隆抗体奠定基础。
年四季等 人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定 第6期∀545∀
1 材料与方法
1. 1 实验试剂 大肠杆菌TG1、辅助噬菌体M13K07及pC ANTAB 5E 噬菌体载体均购自Gene 公司。淋巴细胞分离液为天根生物技术有限公司产品。MMLV 反转录酶和RNase inhibitor 等反转录试剂及PCR 试剂购自Promega 公司。
1. 2 引物设计 人抗体可变区引物序列是根据文献[3 5]中的人抗体可变区引物序列重新设计而成(表1) , 重新设计的引物有利于简化抗体基因组装程序, 提高组装效率, 并且可增加抗体文库的多样性。1. 3 实验方法
1. 3. 1 人淋巴细胞cDNA 的合成 抽取60例未经主动免疫健康人的外周血, 用淋巴细胞分离液常规分离淋巴细胞, 按Trizol 说明书提取淋巴细胞总RNA, 以oligo dT 为引物反转录合成第1链cDNA 。1. 3. 2 V H 和V L 基因的扩增 直接PC R 扩增V H 和V L 基因:以第1链cDNA 为模板, 将V H 基因的上游引物和V H 基因的下游端引物两两配对, 共组成42对引物; 将V 和V 基因的上游引物和下游引物两两配对, 分别组成16对引物和18对引物, PCR 扩增V H 、V 和V 。PCR 反应条件为94#1分钟, 55#1分钟, 72#1分钟, 共30个循环, PC R 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收纯化。半巢式PCR 扩增V H 、V 和V 基因:以第一链cDNA 为模板, 将扩增C H 基因的下游引物(C H 1R 、C H 2R 和C H 3R) 等摩尔比混合, 作为1条下游引物使用, 与V H 基因上游引物配对扩增, 将扩增得到的PC R 产物纯化并混合作为模板, 再以V H 的上游引物与下游引物两两配对, 共组成42对引物扩增得到V H 基因片段; 同样, 用V 上游引物与半巢式PCR 下游引物C R 扩增cDNA, PCR 产物纯化并混合后作为模板, 以V 的上游引物与下游引物两两配对, 共组成16对引物进行扩增得到V 基因片段。用V 上游引物与半巢式PCR 下游引物C R 扩增cDNA, PCR 产物纯化并混合后作为模板, 以V 的上游引物与下游引物两两配对, 共组成18对引物进行扩增得到V 基因片段。第1轮半巢式PCR 条件为:94#1分钟, 50#1分钟, 72#1分钟, 共30个循环。第2轮PCR 的条件为:94#1分钟, 55#1分钟, 72#1分钟, 共30个循环。PCR 产物经琼脂糖凝胶鉴定后回收纯化。
1. 3. 3 scFv 基因的拼接 将所有回收的V H 基因片段混合即得到V H 基因文库; 同样将回收的V 基因片段混合得到V 基因文库; 将回收的V 基因片段
上游引物, 以linkerR 为下游引物, 进行PC R 扩增, 获得V H linker 基因片段; 将V 基因文库以上游引物linkerF 和下游引物V scFvR 为引物, 进行PC R 扩增, 获得linker V 基因片段; 将V 基因文库以linkerF 和V sc FvR 为引物, 分别进行PC R 扩增, 获得linker V 基因片段。PC R 反应条件为94#1分钟, 55#1分钟, 72#1分钟, 共30个循环。PCR 产物均经琼脂糖凝胶电泳, 切胶回收目的片段。
表1 构建天然人源scFv 文库的引物
Tab. 1 Oligonucleotide primers for construction of non immu
nized human scFv library
V H forward pri mers:
5∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGG TGCAGCTGCA GGAG TCSG3∃ 5∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGG TACAGCTGCA GCAG TCA 3∃ 5∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGG TGCAGCTACA GCAG TGGG 3∃ 5∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGG TGCAGCTGKTGGAG WCY 3∃ 5∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGG TCCAGCTKG TRCAG TCTGG 3∃ 5∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGR TCACCTTGAAG GAGTCTG 3∃ 5∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGG TGCAGCTGGTGSARTCTG G3∃V H reverse pri mers: 5∃TCCGCCGAGACCG CCTCCACCTGAGG AGACRGTGACCAG GGTG 3∃ 5∃TCCGCCGAGACCG CCTCCACCTGAGG AGACGGTGACCAG GGTT 3∃ 5∃TCCGCCGAGACCG CCTCCACCTGAAG AGACGGTGACCA TTG T 3∃ 5∃TCCGCCGAGACCG CCTCCACCTGAGG AGACGGTGACCG TG GTCC3∃ 5∃TCCGCCGAGACCG CCTCCACCGG TTGG GGCG GATGCACTCC3∃ 5∃TCCGCCGAGACCG CCTCCACCSG ATGGGCCCTTGG TGG ARGC3∃V forward pri mers: 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGG ACA TCCRGD TG ACCCA G TC TCC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGG AAA TTG TRW TG ACRCA GTCTCC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGG A T A TTG TG M TGACBCAG WC TCC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGG AAA CG ACAC TCA CG CAG TCTC 3∃V backward pri mers: 5∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTTG GTCC3∃ 5∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCASCTTGG TCC3∃ 5∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATA TCCACTTTGG TCC 3∃ 5∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCC3∃V forward pri mers: 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGCAG TCTG TSBTG ACGCAG CCGCC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGTCCT A TG WGCTG ACWCAGCCAC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGTCCT A TG AG CTGA YRCAG CYACC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGCAG CCTG TGCTG ACTCAR YC 3∃ 5∃G G TGG CTCA GG CGG TG GA GG CTCGCA GD CTG TG GTG ACY CAG G AGCC 3∃ 5∃G G TGG CTCA GG CGG TG GA GG CTCGCA GCCWG KG CTG AC TC AGCC MCC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGTCCTCTGA GCTG ASTCAGG ASCC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGCAG TCTGY YCTG AY TCA GCCT 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGA A TT TT A TGC TG ACTCAG CCCC 3∃V backward pri mers: 5∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACCTAGG ACGG TSASCTTGG TCC3∃ 5∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACCGAG GACG GTCAGCTGGG TGC3∃C H 1R:5∃G GATCCTCTAGATTTACCCGGAG ACAGG 3∃C H 2R:5∃TCTA TCCACGAGG GTCC3∃C H 3R:5∃CTCTCTTG TCCACCTTGT3∃C R:5∃GG ATCCTCTA GAACACTCTCCCCTGTTG 3∃C R:5∃CATTCATGAGACACACCT 3∃V H sc FvF:5∃A TCGACGCTACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGG T 3∃V sFvR:ACG GCTGCG TCAGAG TGCGGCCGCACGTTT3∃V sFvR:ACG GCTGCG TCAGAG TGCGGCCGCACC 3∃. L inke rF:5∃TC A G G TG G A G G CG G T TC TG G C G G A G G T G GC TC A G G CG G TG G A G G C TCG3∃
∀546∀中国免疫学杂志2010年第26卷
混合linker V 和linker V 得到linker V L 基因片段。将等摩尔的V H linker 基因片段与linker V L 基因片段混合后, 进行PCR 连接。反应条件为:94#1分钟, 65#1分钟, 共25个循环。然后取前一轮PCR 产物1 l 再进行第二次PCR 扩增, 凝胶回收PCR 产物, 得到连接好的sc Fv 基因片段V H linker V L 。1. 3. 4 噬菌体抗体文库的构建 用Sfi ! 、Not ! 酶切scFv 基因片段, 与经同样双酶切的pC ANTAB 5E 载体在T4连接酶作用下进行连接(连接反应体积共20 l) 。取连接产物1 l 电转100 l 感受态细胞TG1, 转化产物立即加入37#预热的3ml 2 YTG (含2%葡萄糖) 培养基中, 180r/min 振荡1小时后, 转化产物稀释10倍后取1 l 涂于2 YTAG(含2%葡萄糖, 100 g/ml 氨苄青霉素) 平板上, 37#培养过夜。次日, 计数菌落数, 并挑取10个菌落, 进行菌落PC R 检测, 计算插入有全长scFv 基因的菌落比例, 从而得到噬菌体文库的容量。如果文库容量达到10, 则将剩余连接产物经乙醇沉淀纯化后用6 l TE 溶解, 每次取1 l 纯化后的连接产物电转化感受态E. coli TG1, 重复6次。转化产物180r/min 振荡培养1小时, 将转化产物涂于2 YT AG 大平板上, 37#培养过夜。次日, 收集所有平板中的菌落并加入终浓度为15%的甘油, 分装后液氮速冻保存于-80#。1. 3. 5 噬菌体抗体文库多样性分析 从scFv 抗体文库中随机挑取单菌落, PC R 鉴定是否插入有全长scFv 基因, 随机取10个阳性PCR 产物并纯化后, 用BstN ! 进行酶切, 3%琼脂糖凝胶电泳分析酶切指纹图谱。
8
接采用3个片段重叠延伸PCR(SOE PCR) , 该方法需要合成大量不同的引物, 而且操作繁琐, 费事费力, 连接效率低。本研究采用2个片段SOE PCR 法将V H 和V L 基因组装成scFv 基因, V H 和V L 之间以linker (Gly4Ser) 3基因序列连接。SOE PC R 组装法操作简单, 节省时间, 并且组装成功率高, 同时也能使体V H 和V L 基因组装后产生的scFv 基因多样性最大化。用PC R 法分别在V H 基因的3∃端和V L 基因的5∃端加上linker 序列, 形成V H linker 基因片段和V L linker 基因片段。再将两个基因文库抗等摩尔比混合, 互为引物及模板, 在新的PC R 系统中进行重叠延伸, 即得到完整的scFv 基因片段。然后以完整的scFv 片段为模板, 进行PCR 大量扩增, 最终得到scFv 基因文库, 其基因大小为750bp 左右(图2、3) 。2. 4 噬菌体展示抗体文库的构建 scFv 基因片段经sfi ! 和Not ! 双酶切后, 与经同样双酶切的pC ANTAB 5E 载体连接。将连接产物取1 l 电转感受态TG1, 取复苏的电转化菌液稀释10倍后取1 l 涂板, 结果平板上长出250个菌落, 取10个菌落进行菌落PCR 鉴定显示, 有9个菌落插入有全长sc Fv 基因(图4) , 即构建的单链抗体文库的重组率为
2 结果
2. 1 总RNA 的提取 用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞, 镜检并计数后按10细胞/ml Trizol 的比例, 提取人外周血淋巴细胞总RNA 。经1%琼脂糖凝胶电泳后清晰可见28、18和5S 3条带, 说明提取的总RNA 质量较好。
2. 2 人V H 和V L 基因的扩增 本研究采用了60个不同健康志愿者的外周血淋巴细胞, 其包含了足够多样性的人抗体基因, 并且选用的抗体基因引物也几乎覆盖了人抗体基因的各个家族, 在直接PCR 扩增V H 和V L 基因的基础上, 同时采用了半巢式PCR, 以保证所有的抗体基因都能得到扩增。直接PCR 的结果显示, 只有部分V H 和V L 基因能被扩增出来。以半巢式PCR 加以辅助, 最终有效扩增到所有的V H 、V 及V 基因(图1) 。2.
图2 凝胶回收扩增的V H linker, linker V 和linker V
Fig. 2 The recovered DNA of V H linker, linker V and linker
V by gel extraction kit
Note:M. 100bp DNA marker; Lane 1. V H linker; Lane 2. li nker V ; Lane 3.
.
8
图1 PC R 扩增V H , V 及V
Fig. 1 Amplification of V H , V 及V by PCR
Note:DNA marker VII:300, 500, 1000, 1500, 2000, 2500bp.
年四季等 人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定 第6期∀547∀
合成抗体可变区基因构建全合成或半合成抗体文库。人工合成的抗体文库可通过人工随机设计抗体可变区中的关键区域从而增加抗体文库的多样性。但人工合成的抗体基因, 由于其中有的序列是随机化学合成的, 可导致抗体文库中相当部分克隆不具备抗体的生物学活性, 从而产生无效克隆而在文库容量和多样性方面影响抗体文库的质量。天然抗体文库的优点在于抗体基因都经过了体内的V D J
图3 重叠延伸法(SOE PCR) 组装和扩增的scFv Fig. 3 The assem bled scFv by splice overlap extension PCR
Note:M. 100bp DN A marker; Lane 1 3.
scFv.
[6]
重排和克隆选择, 所生成的抗体100%具有活性, 并且抗体基因来源于人, 制备的抗体免疫原性弱。抗体文库不仅需要足够的文库容量, 也要具有
良好的多样性。对于天然抗体文库, 抗体基因的来源直接影响到抗体文库的多样性[7]。为了保证抗体文库的多样性, 本研究采用了60名健康志愿者的外周血淋巴细胞, 以使扩增到的人抗体基因能够保证具有广泛的代表性。另外在引物设计方面, 能扩增到所有基因家族的引物是文库多样性的另一保证。本研究综合考虑了前人设计的人抗体基因引物序列, 并在抗体基因扩增时, 同时采用直接PCR 和半巢式PCR, 以保证所有的抗体基因序列都能得到有效的扩增, 从而确保文库的多样性。
另外, 在抗体文库构建时, 大部分学者将载体 scFv 文库基因电转化入TG1后, 直接将电转化后的菌液保存于-80#或经M13K07辅助噬菌体超感染后, 以噬菌体形式保存。但重组噬菌体不稳定, 长时间保存容易造成重组基因的丢失。本研究将电转化后复苏的所有菌液涂板, 过夜生长后回收平板上所有的菌落, 加入15%甘油分装后保存于-80#。此种方法保存文库稳定, 进行文库亲和筛选时, 只需要拿出部分分装的菌液用于M13K07辅助噬菌体超感然即可。
图4 PCR 鉴定单链抗体文库的重组率
Fig. 4 Identification of the rate of recom binant clones from
scFv library
Note:M. 100bp DN A marker; Lane 1 10. Clones 1
10.
图5 BstN I 酶切后单链抗体指纹图谱
Fig. 5 The fingerprint map of scFv digested by BstNI
Note:M. 100bp DN A marker; Lane 1 10. sc Fv 1 10from scFv library.
90%, 经计算插入有全长scFv 基因的单链抗体文库容量达到1. 35 108。将剩余菌液经乙醇沉淀纯化去盐后, 分6次电转化TG1, 涂板并将所有菌落回收后, 加15%甘油分装保存于-80#。
2. 5 噬菌体展示抗体文库多样性分析 从抗体文库中随机选取10个sc Fv 基因, BstN ! 酶切, 3%琼脂糖凝胶电泳分析酶切指纹图谱, 结果显示10个单链抗体基因的酶切图谱均不同, 说明抗体文库中抗体分子的多样性良好(图5) , 可用于针对多种抗原的抗体筛选。
4 参考文献
1 Stas P, Lasters I. Immunogenici ty of therapeutic anti bodies[J ]. M ed Sci, 2009; 25(12) :1070 1077.
2 Sha mes P, Baty D. The future of antibody fragments made of a single im munoglobuli n domain[J]. Med Sci, 2009; 25(12) :1159 1162.
3 Marks J D, Hoogenboom H R, Bonnert T P et al . By passing i mmuni za tion, human antibodies from V gene libraries dis played on phage[J].J Mol Biol, 1991; 222(3):581 597.
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7 Pansri P, Jaruseranee N, Rangnoi K e t al . A co mpact phage display human scFv library for selec tion of antibodies to a wide variety of antigens[J ]. B MC Biotechnol, 2009; 9:6.
3 讨论
目前人源性抗体文库基因主要来源于两种途
径:一种是用PCR 法直接扩增多样性的人抗体基因[收稿2010 01 22 修回2010 02 20]
(编辑 许四平)
∀544∀中国免疫学杂志2010年第26卷
doi:10. 3969/j. issn. 1000 484X. 2010. 06. 014
人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定
年四季 黄 黎 王 栩 邬于川 袁 青 (四川省泸州医学院基础医学院, 泸州646000)
中国图书分类号 R392. 11 文献标识码 A 文章编号 1000 484X(2010) 06 0544 04
[摘 要] 目的:构建人源性天然噬菌体展示文库并对文库进行鉴定。方法:从未经主动免疫健康志愿者的外周血淋巴细胞中提取总RNA, 反转录合成cDNA, 用直接PCR 及半巢式PCR 扩增人抗体重链(V H ) 及轻链(V 和V ) 可变区基因。采用改进的重叠延伸PCR 法将V H 基因和V L (V 和V ) 基因连接成人单链抗体(scFv) 基因, 并将scFv 文库基因克隆到噬菌体载体pCANTAB 5E 中, 电转化E. coli TG1, 构建单链抗体文库。结果:采用直接PCR 和半巢式PCR 扩增得到42条V H 基因片段, 16条V 基因片段, 18条V 基因片段。混合的V H 和V L 等摩尔比连接后, 产生的单链抗体文库基因大小为750bp 左右; 转化后构建了文库容量为1. 35 108的单链抗体文库。BstN ! 酶切分析文库中的单链抗体基因结果显示, 酶切得到的scFv 指纹图谱均不相同。结论:构建的抗体文库多样性好, 可用于多种人源性单链抗体的筛选。
[关键词] 单链抗体; 噬菌体抗体文库; 重叠延伸PCR
Construction and identification of non immunized human phage display library
NIAN Si Ji, HU ANG Li, WANG Xu , WU Y u Chuan, YU AN Qing. School o f Basic Medical Sciences, Luzhou Medical Col lege, Luzhou 646000, China
[Abstract] Objective:To develop non immunized hu man phage display library. Methods:The total RNA of lymphocyte cells from pe ripheral blood of healthy voluntee was isolated and cDNA was synthesized, and the genes of heavy variable chain (V H ) and light variable chain (V and V ) were amplified by direct PCR and half nested PCR. By overlapping extension PCR, the genes of V H and V L (V and V ) were linked. The linked genes of single chain Fv fragment (scFv) were ligated with the vector pCANTAB 5E and then cloned into TG1for the scFv library construction. Results:By direct PC R and half nested PCR, 42V H fragments, 16V and 18V fragmen ts were obtained. The size of linked scFv library genes was 750bp and the volume of constructed scFv library was 1. 35 10. The results of BstN ! analysis of scFv genes from the phage library showed that fingerprint map of the selected scFvs was different. Conclusion:The developed phage library is diversity and can be used for selecting humanized scFv.
[Key w ords] Sin gle chain Fv fragment; Phage antibod y library; Overlapping extension PCR
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目前单克隆抗体(mAb) 作为治疗性抗体发展迅速, 主要用于免疫治疗肿瘤、免疫性疾病、器官移植、感染性疾病及心血管疾病等。但单克隆抗体的临床应用仍然受到一定的限制, 主要障碍是诱导产生的人抗鼠抗体(HAHA) 反应、肿瘤渗入量低及半衰期短的问题[1]。随着基因工程技术的发展, 各种形式的基因工程抗体被构建来改善它们的性能和效能, 其中小分子单链抗体(single chain Fv fragment, scFv) 可通过噬菌体展示的方法制备, 从而使完全人
本文为四川省教育厅青年基金项目(07ZB036)、四川省卫生厅科研基金资助项目(80164) 及泸州医学院青年基金项目
作者简介:年四季(1977年-) , 男, 硕士, 讲师, 主要从事分子免疫学
方面的研究工作, E mail:siji nian@hot mail. co m;
通讯作者及指导教师:袁 青(1978年-) , 女, 博士, 副教授, 主要从
事分子免疫学方面的研究工作, E mail:yqyuan nsj@yahoo. com. cn 。
源化的抗体制备成为可能, 并且单链抗体分子量小, 组织穿透力强[2]。
噬菌体抗体文库技术的出现是抗体工程领域的
重大技术突破。文库容量和多样性是衡量抗体文库质量的两个重要参数。文库容量越大, 从中筛选得到抗体的可能性越大, 而且文库容量的大小与所获抗体的亲和力成正比。在抗体文库的构建过程中, 另外一个重要的指标为抗体文库的多样性, 文库的多样性可通过设计能扩增所有抗体基因的PCR 引物加以实现。本研究以未经免疫的健康人外周血为基因来源, 以一套被证明能扩增出所有抗体基因的PCR 引物及自行设计的引物扩增获得全套抗体可变区基因, 从而构建文库容量大、多样性相对良好的人源性天然噬菌体抗体库, 为以后筛选针对各类病毒、毒素、肿瘤特异性抗原及自身免疫疾病相关抗原的特异性人源治疗性单克隆抗体奠定基础。
年四季等 人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定 第6期∀545∀
1 材料与方法
1. 1 实验试剂 大肠杆菌TG1、辅助噬菌体M13K07及pC ANTAB 5E 噬菌体载体均购自Gene 公司。淋巴细胞分离液为天根生物技术有限公司产品。MMLV 反转录酶和RNase inhibitor 等反转录试剂及PCR 试剂购自Promega 公司。
1. 2 引物设计 人抗体可变区引物序列是根据文献[3 5]中的人抗体可变区引物序列重新设计而成(表1) , 重新设计的引物有利于简化抗体基因组装程序, 提高组装效率, 并且可增加抗体文库的多样性。1. 3 实验方法
1. 3. 1 人淋巴细胞cDNA 的合成 抽取60例未经主动免疫健康人的外周血, 用淋巴细胞分离液常规分离淋巴细胞, 按Trizol 说明书提取淋巴细胞总RNA, 以oligo dT 为引物反转录合成第1链cDNA 。1. 3. 2 V H 和V L 基因的扩增 直接PC R 扩增V H 和V L 基因:以第1链cDNA 为模板, 将V H 基因的上游引物和V H 基因的下游端引物两两配对, 共组成42对引物; 将V 和V 基因的上游引物和下游引物两两配对, 分别组成16对引物和18对引物, PCR 扩增V H 、V 和V 。PCR 反应条件为94#1分钟, 55#1分钟, 72#1分钟, 共30个循环, PC R 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后回收纯化。半巢式PCR 扩增V H 、V 和V 基因:以第一链cDNA 为模板, 将扩增C H 基因的下游引物(C H 1R 、C H 2R 和C H 3R) 等摩尔比混合, 作为1条下游引物使用, 与V H 基因上游引物配对扩增, 将扩增得到的PC R 产物纯化并混合作为模板, 再以V H 的上游引物与下游引物两两配对, 共组成42对引物扩增得到V H 基因片段; 同样, 用V 上游引物与半巢式PCR 下游引物C R 扩增cDNA, PCR 产物纯化并混合后作为模板, 以V 的上游引物与下游引物两两配对, 共组成16对引物进行扩增得到V 基因片段。用V 上游引物与半巢式PCR 下游引物C R 扩增cDNA, PCR 产物纯化并混合后作为模板, 以V 的上游引物与下游引物两两配对, 共组成18对引物进行扩增得到V 基因片段。第1轮半巢式PCR 条件为:94#1分钟, 50#1分钟, 72#1分钟, 共30个循环。第2轮PCR 的条件为:94#1分钟, 55#1分钟, 72#1分钟, 共30个循环。PCR 产物经琼脂糖凝胶鉴定后回收纯化。
1. 3. 3 scFv 基因的拼接 将所有回收的V H 基因片段混合即得到V H 基因文库; 同样将回收的V 基因片段混合得到V 基因文库; 将回收的V 基因片段
上游引物, 以linkerR 为下游引物, 进行PC R 扩增, 获得V H linker 基因片段; 将V 基因文库以上游引物linkerF 和下游引物V scFvR 为引物, 进行PC R 扩增, 获得linker V 基因片段; 将V 基因文库以linkerF 和V sc FvR 为引物, 分别进行PC R 扩增, 获得linker V 基因片段。PC R 反应条件为94#1分钟, 55#1分钟, 72#1分钟, 共30个循环。PCR 产物均经琼脂糖凝胶电泳, 切胶回收目的片段。
表1 构建天然人源scFv 文库的引物
Tab. 1 Oligonucleotide primers for construction of non immu
nized human scFv library
V H forward pri mers:
5∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGG TGCAGCTGCA GGAG TCSG3∃ 5∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGG TACAGCTGCA GCAG TCA 3∃ 5∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGG TGCAGCTACA GCAG TGGG 3∃ 5∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGG TGCAGCTGKTGGAG WCY 3∃ 5∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGG TCCAGCTKG TRCAG TCTGG 3∃ 5∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGR TCACCTTGAAG GAGTCTG 3∃ 5∃ACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGG TGCAGCTGGTGSARTCTG G3∃V H reverse pri mers: 5∃TCCGCCGAGACCG CCTCCACCTGAGG AGACRGTGACCAG GGTG 3∃ 5∃TCCGCCGAGACCG CCTCCACCTGAGG AGACGGTGACCAG GGTT 3∃ 5∃TCCGCCGAGACCG CCTCCACCTGAAG AGACGGTGACCA TTG T 3∃ 5∃TCCGCCGAGACCG CCTCCACCTGAGG AGACGGTGACCG TG GTCC3∃ 5∃TCCGCCGAGACCG CCTCCACCGG TTGG GGCG GATGCACTCC3∃ 5∃TCCGCCGAGACCG CCTCCACCSG ATGGGCCCTTGG TGG ARGC3∃V forward pri mers: 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGG ACA TCCRGD TG ACCCA G TC TCC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGG AAA TTG TRW TG ACRCA GTCTCC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGG A T A TTG TG M TGACBCAG WC TCC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGG AAA CG ACAC TCA CG CAG TCTC 3∃V backward pri mers: 5∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTTG GTCC3∃ 5∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCASCTTGG TCC3∃ 5∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTGATA TCCACTTTGG TCC 3∃ 5∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCC3∃V forward pri mers: 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGCAG TCTG TSBTG ACGCAG CCGCC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGTCCT A TG WGCTG ACWCAGCCAC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGTCCT A TG AG CTGA YRCAG CYACC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGCAG CCTG TGCTG ACTCAR YC 3∃ 5∃G G TGG CTCA GG CGG TG GA GG CTCGCA GD CTG TG GTG ACY CAG G AGCC 3∃ 5∃G G TGG CTCA GG CGG TG GA GG CTCGCA GCCWG KG CTG AC TC AGCC MCC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGTCCTCTGA GCTG ASTCAGG ASCC 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGCAG TCTGY YCTG AY TCA GCCT 3∃ 5∃GG TGG CTCAGG CGG TGG AGG CTCGA A TT TT A TGC TG ACTCAG CCCC 3∃V backward pri mers: 5∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACCTAGG ACGG TSASCTTGG TCC3∃ 5∃GCGTCAGAGTGCGGCCGCACCGAG GACG GTCAGCTGGG TGC3∃C H 1R:5∃G GATCCTCTAGATTTACCCGGAG ACAGG 3∃C H 2R:5∃TCTA TCCACGAGG GTCC3∃C H 3R:5∃CTCTCTTG TCCACCTTGT3∃C R:5∃GG ATCCTCTA GAACACTCTCCCCTGTTG 3∃C R:5∃CATTCATGAGACACACCT 3∃V H sc FvF:5∃A TCGACGCTACTGCGGCCCAGCCGGCCCAGG T 3∃V sFvR:ACG GCTGCG TCAGAG TGCGGCCGCACGTTT3∃V sFvR:ACG GCTGCG TCAGAG TGCGGCCGCACC 3∃. L inke rF:5∃TC A G G TG G A G G CG G T TC TG G C G G A G G T G GC TC A G G CG G TG G A G G C TCG3∃
∀546∀中国免疫学杂志2010年第26卷
混合linker V 和linker V 得到linker V L 基因片段。将等摩尔的V H linker 基因片段与linker V L 基因片段混合后, 进行PCR 连接。反应条件为:94#1分钟, 65#1分钟, 共25个循环。然后取前一轮PCR 产物1 l 再进行第二次PCR 扩增, 凝胶回收PCR 产物, 得到连接好的sc Fv 基因片段V H linker V L 。1. 3. 4 噬菌体抗体文库的构建 用Sfi ! 、Not ! 酶切scFv 基因片段, 与经同样双酶切的pC ANTAB 5E 载体在T4连接酶作用下进行连接(连接反应体积共20 l) 。取连接产物1 l 电转100 l 感受态细胞TG1, 转化产物立即加入37#预热的3ml 2 YTG (含2%葡萄糖) 培养基中, 180r/min 振荡1小时后, 转化产物稀释10倍后取1 l 涂于2 YTAG(含2%葡萄糖, 100 g/ml 氨苄青霉素) 平板上, 37#培养过夜。次日, 计数菌落数, 并挑取10个菌落, 进行菌落PC R 检测, 计算插入有全长scFv 基因的菌落比例, 从而得到噬菌体文库的容量。如果文库容量达到10, 则将剩余连接产物经乙醇沉淀纯化后用6 l TE 溶解, 每次取1 l 纯化后的连接产物电转化感受态E. coli TG1, 重复6次。转化产物180r/min 振荡培养1小时, 将转化产物涂于2 YT AG 大平板上, 37#培养过夜。次日, 收集所有平板中的菌落并加入终浓度为15%的甘油, 分装后液氮速冻保存于-80#。1. 3. 5 噬菌体抗体文库多样性分析 从scFv 抗体文库中随机挑取单菌落, PC R 鉴定是否插入有全长scFv 基因, 随机取10个阳性PCR 产物并纯化后, 用BstN ! 进行酶切, 3%琼脂糖凝胶电泳分析酶切指纹图谱。
8
接采用3个片段重叠延伸PCR(SOE PCR) , 该方法需要合成大量不同的引物, 而且操作繁琐, 费事费力, 连接效率低。本研究采用2个片段SOE PCR 法将V H 和V L 基因组装成scFv 基因, V H 和V L 之间以linker (Gly4Ser) 3基因序列连接。SOE PC R 组装法操作简单, 节省时间, 并且组装成功率高, 同时也能使体V H 和V L 基因组装后产生的scFv 基因多样性最大化。用PC R 法分别在V H 基因的3∃端和V L 基因的5∃端加上linker 序列, 形成V H linker 基因片段和V L linker 基因片段。再将两个基因文库抗等摩尔比混合, 互为引物及模板, 在新的PC R 系统中进行重叠延伸, 即得到完整的scFv 基因片段。然后以完整的scFv 片段为模板, 进行PCR 大量扩增, 最终得到scFv 基因文库, 其基因大小为750bp 左右(图2、3) 。2. 4 噬菌体展示抗体文库的构建 scFv 基因片段经sfi ! 和Not ! 双酶切后, 与经同样双酶切的pC ANTAB 5E 载体连接。将连接产物取1 l 电转感受态TG1, 取复苏的电转化菌液稀释10倍后取1 l 涂板, 结果平板上长出250个菌落, 取10个菌落进行菌落PCR 鉴定显示, 有9个菌落插入有全长sc Fv 基因(图4) , 即构建的单链抗体文库的重组率为
2 结果
2. 1 总RNA 的提取 用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞, 镜检并计数后按10细胞/ml Trizol 的比例, 提取人外周血淋巴细胞总RNA 。经1%琼脂糖凝胶电泳后清晰可见28、18和5S 3条带, 说明提取的总RNA 质量较好。
2. 2 人V H 和V L 基因的扩增 本研究采用了60个不同健康志愿者的外周血淋巴细胞, 其包含了足够多样性的人抗体基因, 并且选用的抗体基因引物也几乎覆盖了人抗体基因的各个家族, 在直接PCR 扩增V H 和V L 基因的基础上, 同时采用了半巢式PCR, 以保证所有的抗体基因都能得到扩增。直接PCR 的结果显示, 只有部分V H 和V L 基因能被扩增出来。以半巢式PCR 加以辅助, 最终有效扩增到所有的V H 、V 及V 基因(图1) 。2.
图2 凝胶回收扩增的V H linker, linker V 和linker V
Fig. 2 The recovered DNA of V H linker, linker V and linker
V by gel extraction kit
Note:M. 100bp DNA marker; Lane 1. V H linker; Lane 2. li nker V ; Lane 3.
.
8
图1 PC R 扩增V H , V 及V
Fig. 1 Amplification of V H , V 及V by PCR
Note:DNA marker VII:300, 500, 1000, 1500, 2000, 2500bp.
年四季等 人源性天然噬菌体展示文库的构建及鉴定 第6期∀547∀
合成抗体可变区基因构建全合成或半合成抗体文库。人工合成的抗体文库可通过人工随机设计抗体可变区中的关键区域从而增加抗体文库的多样性。但人工合成的抗体基因, 由于其中有的序列是随机化学合成的, 可导致抗体文库中相当部分克隆不具备抗体的生物学活性, 从而产生无效克隆而在文库容量和多样性方面影响抗体文库的质量。天然抗体文库的优点在于抗体基因都经过了体内的V D J
图3 重叠延伸法(SOE PCR) 组装和扩增的scFv Fig. 3 The assem bled scFv by splice overlap extension PCR
Note:M. 100bp DN A marker; Lane 1 3.
scFv.
[6]
重排和克隆选择, 所生成的抗体100%具有活性, 并且抗体基因来源于人, 制备的抗体免疫原性弱。抗体文库不仅需要足够的文库容量, 也要具有
良好的多样性。对于天然抗体文库, 抗体基因的来源直接影响到抗体文库的多样性[7]。为了保证抗体文库的多样性, 本研究采用了60名健康志愿者的外周血淋巴细胞, 以使扩增到的人抗体基因能够保证具有广泛的代表性。另外在引物设计方面, 能扩增到所有基因家族的引物是文库多样性的另一保证。本研究综合考虑了前人设计的人抗体基因引物序列, 并在抗体基因扩增时, 同时采用直接PCR 和半巢式PCR, 以保证所有的抗体基因序列都能得到有效的扩增, 从而确保文库的多样性。
另外, 在抗体文库构建时, 大部分学者将载体 scFv 文库基因电转化入TG1后, 直接将电转化后的菌液保存于-80#或经M13K07辅助噬菌体超感染后, 以噬菌体形式保存。但重组噬菌体不稳定, 长时间保存容易造成重组基因的丢失。本研究将电转化后复苏的所有菌液涂板, 过夜生长后回收平板上所有的菌落, 加入15%甘油分装后保存于-80#。此种方法保存文库稳定, 进行文库亲和筛选时, 只需要拿出部分分装的菌液用于M13K07辅助噬菌体超感然即可。
图4 PCR 鉴定单链抗体文库的重组率
Fig. 4 Identification of the rate of recom binant clones from
scFv library
Note:M. 100bp DN A marker; Lane 1 10. Clones 1
10.
图5 BstN I 酶切后单链抗体指纹图谱
Fig. 5 The fingerprint map of scFv digested by BstNI
Note:M. 100bp DN A marker; Lane 1 10. sc Fv 1 10from scFv library.
90%, 经计算插入有全长scFv 基因的单链抗体文库容量达到1. 35 108。将剩余菌液经乙醇沉淀纯化去盐后, 分6次电转化TG1, 涂板并将所有菌落回收后, 加15%甘油分装保存于-80#。
2. 5 噬菌体展示抗体文库多样性分析 从抗体文库中随机选取10个sc Fv 基因, BstN ! 酶切, 3%琼脂糖凝胶电泳分析酶切指纹图谱, 结果显示10个单链抗体基因的酶切图谱均不同, 说明抗体文库中抗体分子的多样性良好(图5) , 可用于针对多种抗原的抗体筛选。
4 参考文献
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3 讨论
目前人源性抗体文库基因主要来源于两种途
径:一种是用PCR 法直接扩增多样性的人抗体基因[收稿2010 01 22 修回2010 02 20]
(编辑 许四平)