基因组DNA 提取原理及方法
Time ：2009-12-26 AM 10:54 Author:bioer Hits: 5617 times
一、原理
DNA 、RNA 和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA 钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA 在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。
在酸性溶液中，DNA 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP 抽提出来，再把P 除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。 DNP 和RNP 在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP 在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP 在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。 苯酚/氯仿作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase 的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此法的特点是使提取的DNA 保持天然状态，真核细胞DNA 的分离通常是在EDTA 及SDS 一类去污剂存在下， 用蛋白酶K 消化细胞获得。诸多生物试剂公司现已有各种类型DNA 提取试剂盒出售。
二、材料及试剂
1. GENTRO DNA提取试剂盒
2. 异丙醇
3. 70％酒精
三、操作步骤
（一）、从全血中提取DNA
1. 溶血：加300ul 的肝素或EDTA 二钠抗凝的全血到含RBC Lysis Solution 900ul 的1.5ml EP管, 室温静置1min, 期间，轻轻颠倒混匀10次。13000 ~16000 g离心20s 。
2. 弃上清液，将管底的白色沉淀用枪头吹散，使白细胞在残留的液体中悬浮。
3. 加300ul 的Cell Lysis Solution于EP 管中, 充分混匀。
4. 加100ul 的Protein Precipitation Solution于EP 管中, 充分混匀,13000 ~16000g离心3min.
5. 取上清液，加300ul 的异丙醇，充分混匀颠倒50次，可见白色絮状沉淀，13000 ~16000 g离心1min 。
6. 弃上清液，加入70%的酒精500ul ，13000~16000 g离心1min 。
7. 弃上清液，加入DNA Hydration Solution 50ul, 充分混匀，65℃5min 使DNA 完全溶解。
8. 紫外分光光度计测定OD260/280，比值大于1.8即可。
（二）、从组织中提取DNA
9. 取液氮冷冻的叶片2-3片， 在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。
10. 将粉末放入到1.5 ml离心管中，然后加入缓冲液“S”750ul, 充分混匀。
11. 将离心管置于65℃水浴中1-2小时，水浴过程中温和混匀几次。
12. 取出离心管, 每管加入等体积的酚－氯仿(V/V=1:1)溶液600-700ul ，混匀后离心，10000rpm, 10分钟。
13. 上清液移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀后，10000rpm, 6分钟。
14. 将上清液移入另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间，然后用枪头勾出DNA, 并用70％乙醇冲洗2次。
15. 勾出的DNA ，真空干燥后将其溶于500ul 1×TE 中。
16. 加入3ul RNA 酶溶液，37℃保温1 小时。
17. 加入等体积的酚-氯仿溶液, 轻轻混匀后, 10000rpm离心6分钟。
18. 取上清液，加入等体积的氯仿，轻轻混匀后，10000rpm 离心6分钟。
19. 取上清液，入1/10体积3M 醋酸钠，混匀后，加入2倍体积冷的无水乙醇（或95％乙醇）。
20. 轻轻混匀静置一会儿后，用枪头勾出DNA, 用70％乙醇冲洗2次后，真空干燥。
21. 依所提DNA 量加入20-50ul 的1×TE 溶解DNA 。
22. 测定DNA 的浓度，取少量样品跑电泳, Agarose 胶的浓度为0.8%。
23. 样品在4℃下保存备用。
附: 提DNA 所用试剂配方：
1. 1. 1M Tris-Cl (1L：800ml H2O 中加121.1g Tris, 用HCl 调pH 至8.5后定容至1升， 灭菌)
2. 0.5M EDTA pH8 (1L: 800ml H2O 中加186.1g EDTANa2 2H2O ，用NaOH 调 pH 至8.0，定容至 1 升)
3. 20% SDS (2L: 在2L 热水中缓慢加 400g SDS， 边加边搅拌，溶解后放置热地方保存)
4. 5M NaCl (1L: 750ml H2O中加292.2g NaCl，溶解后定容至1升， 灭菌)
5. 缓冲液“S” ：配1L 缓冲液“S”
1) 100mM Tris.Cl pH8.5 1M Tris.Cl 100ml
2) 100mM NaCl 5M NaCl 20ml
3) 50mM EDTA pH8.0 0.5M EDTA 100ml
4) 2% SDS 20% SDS 100ml
5) H 2O 680ml
6. 100x TE (1L: 800ml H2O 中加121.1g Tris, 37.2 EDTA Na2 2H2O, 用HCl 调 pH 至8.0, 定容， 灭菌)
7. 50x TAE(1L: 500ml H2O 中加242g Tris，溶解后加100ml 0.5M EDTA pH8.0和57.1ml 冰醋酸，定容)
8. 蛋白酶K 溶液的配制(用20mMTris.Cl, pH8, 2mMCaCl2的缓冲液配制浓度为10ug/ul 的蛋白酶K 溶液； 或用超纯水配制成相同的浓度)
9. RNase (用水溶解RNase, 终浓度10mg/ml, 煮沸20分钟，缓慢冷却， 分装，-20℃下保存)
10. 10. 3M NaAc pH5.2 (1L: 600ml H2O 中加入408.24gNaAc 3H2O , 溶解后，用冰醋酸调pH 至
5.2， 然后定容1L ，灭菌)
四、注意事项
不同要求时可选择不同抽提方法提取DNA
基因组DNA 提取原理及方法
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一、原理
DNA 、RNA 和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA 钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA 在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。
在酸性溶液中，DNA 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP 抽提出来，再把P 除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。 DNP 和RNP 在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP 在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP 在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。 苯酚/氯仿作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase 的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此法的特点是使提取的DNA 保持天然状态，真核细胞DNA 的分离通常是在EDTA 及SDS 一类去污剂存在下， 用蛋白酶K 消化细胞获得。诸多生物试剂公司现已有各种类型DNA 提取试剂盒出售。
二、材料及试剂
1. GENTRO DNA提取试剂盒
2. 异丙醇
3. 70％酒精
三、操作步骤
（一）、从全血中提取DNA
1. 溶血：加300ul 的肝素或EDTA 二钠抗凝的全血到含RBC Lysis Solution 900ul 的1.5ml EP管, 室温静置1min, 期间，轻轻颠倒混匀10次。13000 ~16000 g离心20s 。
2. 弃上清液，将管底的白色沉淀用枪头吹散，使白细胞在残留的液体中悬浮。
3. 加300ul 的Cell Lysis Solution于EP 管中, 充分混匀。
4. 加100ul 的Protein Precipitation Solution于EP 管中, 充分混匀,13000 ~16000g离心3min.
5. 取上清液，加300ul 的异丙醇，充分混匀颠倒50次，可见白色絮状沉淀，13000 ~16000 g离心1min 。
6. 弃上清液，加入70%的酒精500ul ，13000~16000 g离心1min 。
7. 弃上清液，加入DNA Hydration Solution 50ul, 充分混匀，65℃5min 使DNA 完全溶解。
8. 紫外分光光度计测定OD260/280，比值大于1.8即可。
（二）、从组织中提取DNA
9. 取液氮冷冻的叶片2-3片， 在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。
10. 将粉末放入到1.5 ml离心管中，然后加入缓冲液“S”750ul, 充分混匀。
11. 将离心管置于65℃水浴中1-2小时，水浴过程中温和混匀几次。
12. 取出离心管, 每管加入等体积的酚－氯仿(V/V=1:1)溶液600-700ul ，混匀后离心，10000rpm, 10分钟。
13. 上清液移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀后，10000rpm, 6分钟。
14. 将上清液移入另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间，然后用枪头勾出DNA, 并用70％乙醇冲洗2次。
15. 勾出的DNA ，真空干燥后将其溶于500ul 1×TE 中。
16. 加入3ul RNA 酶溶液，37℃保温1 小时。
17. 加入等体积的酚-氯仿溶液, 轻轻混匀后, 10000rpm离心6分钟。
18. 取上清液，加入等体积的氯仿，轻轻混匀后，10000rpm 离心6分钟。
19. 取上清液，入1/10体积3M 醋酸钠，混匀后，加入2倍体积冷的无水乙醇（或95％乙醇）。
20. 轻轻混匀静置一会儿后，用枪头勾出DNA, 用70％乙醇冲洗2次后，真空干燥。
21. 依所提DNA 量加入20-50ul 的1×TE 溶解DNA 。
22. 测定DNA 的浓度，取少量样品跑电泳, Agarose 胶的浓度为0.8%。
23. 样品在4℃下保存备用。
附: 提DNA 所用试剂配方：
1. 1. 1M Tris-Cl (1L：800ml H2O 中加121.1g Tris, 用HCl 调pH 至8.5后定容至1升， 灭菌)
2. 0.5M EDTA pH8 (1L: 800ml H2O 中加186.1g EDTANa2 2H2O ，用NaOH 调 pH 至8.0，定容至 1 升)
3. 20% SDS (2L: 在2L 热水中缓慢加 400g SDS， 边加边搅拌，溶解后放置热地方保存)
4. 5M NaCl (1L: 750ml H2O中加292.2g NaCl，溶解后定容至1升， 灭菌)
5. 缓冲液“S” ：配1L 缓冲液“S”
1) 100mM Tris.Cl pH8.5 1M Tris.Cl 100ml
2) 100mM NaCl 5M NaCl 20ml
3) 50mM EDTA pH8.0 0.5M EDTA 100ml
4) 2% SDS 20% SDS 100ml
5) H 2O 680ml
6. 100x TE (1L: 800ml H2O 中加121.1g Tris, 37.2 EDTA Na2 2H2O, 用HCl 调 pH 至8.0, 定容， 灭菌)
7. 50x TAE(1L: 500ml H2O 中加242g Tris，溶解后加100ml 0.5M EDTA pH8.0和57.1ml 冰醋酸，定容)
8. 蛋白酶K 溶液的配制(用20mMTris.Cl, pH8, 2mMCaCl2的缓冲液配制浓度为10ug/ul 的蛋白酶K 溶液； 或用超纯水配制成相同的浓度)
9. RNase (用水溶解RNase, 终浓度10mg/ml, 煮沸20分钟，缓慢冷却， 分装，-20℃下保存)
10. 10. 3M NaAc pH5.2 (1L: 600ml H2O 中加入408.24gNaAc 3H2O , 溶解后，用冰醋酸调pH 至
5.2， 然后定容1L ，灭菌)
四、注意事项
不同要求时可选择不同抽提方法提取DNA