浅谈基因工程的技术
姓名：唐小惠学号：1401420107
摘要：本文主要围绕基因工程的几大技术主要包括DNA 序列分析、分子杂交（Southern 杂交、Northern 杂交、Western 杂交、原位杂交技术），DNA 的提取与纯化，DNA 的凝胶电泳，PCR 扩增技术开展论述。
关键词：Southern 杂交、Northern 杂交、Western 杂交、PCR 扩增、原位杂交技术。
1、 基因工程的介绍
基因工程是在体外将目的DNA （来源可以是动植物和微生物）和某一载体（DNA ）系统进行重组，再将重组的DNA 导入宿主细胞内，最后实现目的基因稳定复制和表达的过程。基因工程研究步骤是：第一，从生物体中分离得到目的基因（或DNA 片段；第二，在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到重组DNA 分子；第三，将重组DNA 分子导入受体细胞中，并进行繁殖；第四，选择得到含有重组DNA 分子的细胞克隆，并进行大量繁殖，从而使得目的基因得到扩增；最后，进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如，序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究和利用等。
2、 DNA的提取与纯化
2.1质粒DNA 的提取原理
在碱性条件下线状DNA 发生变性，质粒DNA 维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA 会形成沉淀，从而将质粒DNA 与染色体DNA 分开。
2.1.1质粒DNA 提取的溶液配制
溶液Ⅰ的配制：50mM 葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶，RNase A。
溶液Ⅱ的配制：0.2N NaOH，1.0%SDS。
溶液Ⅲ的配制：3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH 至4.8）。
2.1.2质粒DNA 提取的操作步骤
第一步，溶菌，使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁；第二步，破膜，蛋白质和DNA 变性溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA 变性；第三步，中和，溶液III 使DNA 复性、并促使蛋白质-SDS 复合物和染色体DNA 、RNA 沉淀。
2.1.3影响质粒DNA 产量的因素
菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数，质粒的大小。
2.2基因组DNA 的提取原理及过程
细胞裂解，DNA 纯化和沉淀。
3、DNA 的定量和纯度测定
3.1紫外光谱法的原理
DNA （或 RNA ）在260nm 波长处有特异的紫外吸收峰。而蛋白质在280nm 处有吸收峰。
3.1.2紫外光谱法的使用仪器
用微量比色杯（10 ）l 在紫外分光光度计直接测定。
3.2琼脂糖凝胶电泳估计的原理
溴化乙锭（EB ）能插入DNA 分子中，紫外光照射下能发橙红色荧光。EB 在300nm 紫外光照射下能发橙红色荧光，即可显示DNA 泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA 含量及大小成正比。与已知浓度的DNA 电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA 含量。
3、 DNA的凝胶电泳
3.1电泳的基本原理
带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。
3.2琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。
4、 分子杂交
4.1Southern 杂交
4.1.2 Southern杂交基本原理
具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA 片段，将胶上的DNA 变性并在原位将单链DNA 片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA 分子的含量。
4.1.3Southern 杂交基本步骤
Southern 印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜) 上，即印迹；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
第一，待测核酸样品的制备（制备待测DNA 、DNA 限制酶消化）；第二，琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA 样品。原理是Southern 印迹杂交是先将DNA 样品(含不同大小的DNA 片段) 先按片段长短进行分离，然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。因此，制备DNA 样品后需要进行电泳分离。在恒定电压下，将DNA 样品放在0.8~1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨70-80000bp 的DNA 片段，故可对DNA 片段进行分离。但需要用不同的胶浓度来分辨这个范围内的不同的DNA 片段。原则是分辨大片段的DNA 需要用浓度较低的胶，分辨小片段的DNA 则需要浓度较高的胶。经过一段时间电泳后，DNA 按分子量大小在凝胶中形成许多条带，大小相同的分子处于同一条带位置。另外为了便于测定待测DNA 分子量的大小或是所处的分子大小范围，往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA 样品即标准分子量DNA (DNA marker)进行电泳。DNA marker可以用放射性核素进行末端标记，通过这种方式，杂交后的标准分子量DNA 也能显影出条带。步骤，制备琼脂糖凝胶，尽可能薄。DNA 样品与上样缓冲液混匀，上样。推荐使用的靶基因的上样量见不同条件下上样本的使用指针比较表。一般而言，对地高辛杂交系统，所需DNA 样品的浓度较低，每道加2.5-5μg 人类基因组DNA; 如果基因组比人类DNA 更复杂(如植物DNA) 则上样量可达10μg; 每道上质粒DNA
泳，使DNA 条带很好的分离。在电泳结束后，0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min ，紫外灯下观察凝胶。第三，转膜。将凝胶中的单链DNA 片段转移到固相支持物上。而此过程最重要的是保持各DNA 片段的相对位置不变。DNA 是沿与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA 片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA 片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印迹。用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜、尼龙膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。其中常用的是NC 膜和Nylon 膜。第五，杂交。
4.2Northern 杂交
4.2.1Northern 杂交的原理
整合到植物染色体上的外源基因如果能正常表达，则转化植株细胞内有其转录产物--特异mRNA 的生成。将提取的植物总RNA 或mRNA 用变性凝胶电泳分离，则不同的RNA 分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上; 将他们原位转移到固定膜上; 在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交; 然后通过探针的标记性质检测出杂交体。若经杂交，样品无杂交带出现，表明外源基因已经整合到植物细胞染色体上，但在该取材部位及生理状态下该基因并未有效表达。
4.3 Western杂交
4.3.1 Western 杂交的原理
Western 杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE 电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜(硝酸纤维素膜或尼龙膜) 上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体(一抗) ，膜上的目的蛋白(抗原) 与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗(通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体) ，最后通过二抗上带标记化合物(一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶) 的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物(植物) 细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
5、 PCR技术
5.1PCR 技术的原理
该技术是在模板DNA 、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA 聚合酶的酶促合成反应。DNA 聚合酶以单链DNA 为模板，借助一小段双链DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH 末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA 互补链。
参考文献
[1] 楼士林，杨盛昌，龙敏南，等. 基因工程[M].北京：科学出版社，2002.
[2] 李庆军，董艳桐，施冰. 植物抗虫基因的研究进展[J].林业科技，2002，27(2)：22 26.
[3] 陈渝军, 林晶. 基因工程技术在医药卫生领域的应用及发展. 药品评价,2005, 2( 2) : 144- 145.
[4] 童克中. 基因及其表达. 北京: 科学出版社, 2001.
[5] 朱宝泉. 基因工程技术在医学工业中的应用及进展
[6] 方鹏. 基因工程应用简述[ J] .辽宁师专学报.2004.6(2): 29- 30.
[7] 王俊杰21 世纪基因工程在肿瘤防治中的应用[ J] 2000.6(6):62- 67.
浅谈基因工程的技术
姓名：唐小惠学号：1401420107
摘要：本文主要围绕基因工程的几大技术主要包括DNA 序列分析、分子杂交（Southern 杂交、Northern 杂交、Western 杂交、原位杂交技术），DNA 的提取与纯化，DNA 的凝胶电泳，PCR 扩增技术开展论述。
关键词：Southern 杂交、Northern 杂交、Western 杂交、PCR 扩增、原位杂交技术。
1、 基因工程的介绍
基因工程是在体外将目的DNA （来源可以是动植物和微生物）和某一载体（DNA ）系统进行重组，再将重组的DNA 导入宿主细胞内，最后实现目的基因稳定复制和表达的过程。基因工程研究步骤是：第一，从生物体中分离得到目的基因（或DNA 片段；第二，在体外，将目的基因插入能自我复制的载体中得到重组DNA 分子；第三，将重组DNA 分子导入受体细胞中，并进行繁殖；第四，选择得到含有重组DNA 分子的细胞克隆，并进行大量繁殖，从而使得目的基因得到扩增；最后，进一步对获得的目的基因进行研究和利用。比如，序列分析、表达载体构建、原核表达以及转基因研究和利用等。
2、 DNA的提取与纯化
2.1质粒DNA 的提取原理
在碱性条件下线状DNA 发生变性，质粒DNA 维持环状。在高盐条件下作复性处理，变性的染色体DNA 会形成沉淀，从而将质粒DNA 与染色体DNA 分开。
2.1.1质粒DNA 提取的溶液配制
溶液Ⅰ的配制：50mM 葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶，RNase A。
溶液Ⅱ的配制：0.2N NaOH，1.0%SDS。
溶液Ⅲ的配制：3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH 至4.8）。
2.1.2质粒DNA 提取的操作步骤
第一步，溶菌，使用“溶液Ⅰ”溶解细菌细胞壁；第二步，破膜，蛋白质和DNA 变性溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA 变性；第三步，中和，溶液III 使DNA 复性、并促使蛋白质-SDS 复合物和染色体DNA 、RNA 沉淀。
2.1.3影响质粒DNA 产量的因素
菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数，质粒的大小。
2.2基因组DNA 的提取原理及过程
细胞裂解，DNA 纯化和沉淀。
3、DNA 的定量和纯度测定
3.1紫外光谱法的原理
DNA （或 RNA ）在260nm 波长处有特异的紫外吸收峰。而蛋白质在280nm 处有吸收峰。
3.1.2紫外光谱法的使用仪器
用微量比色杯（10 ）l 在紫外分光光度计直接测定。
3.2琼脂糖凝胶电泳估计的原理
溴化乙锭（EB ）能插入DNA 分子中，紫外光照射下能发橙红色荧光。EB 在300nm 紫外光照射下能发橙红色荧光，即可显示DNA 泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA 含量及大小成正比。与已知浓度的DNA 电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA 含量。
3、 DNA的凝胶电泳
3.1电泳的基本原理
带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。
3.2琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖凝胶琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。
4、 分子杂交
4.1Southern 杂交
4.1.2 Southern杂交基本原理
具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA 片段，将胶上的DNA 变性并在原位将单链DNA 片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA 分子的含量。
4.1.3Southern 杂交基本步骤
Southern 印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜) 上，即印迹；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
第一，待测核酸样品的制备（制备待测DNA 、DNA 限制酶消化）；第二，琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA 样品。原理是Southern 印迹杂交是先将DNA 样品(含不同大小的DNA 片段) 先按片段长短进行分离，然后进行杂交。这样可确定杂交靶分子的大小。因此，制备DNA 样品后需要进行电泳分离。在恒定电压下，将DNA 样品放在0.8~1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨70-80000bp 的DNA 片段，故可对DNA 片段进行分离。但需要用不同的胶浓度来分辨这个范围内的不同的DNA 片段。原则是分辨大片段的DNA 需要用浓度较低的胶，分辨小片段的DNA 则需要浓度较高的胶。经过一段时间电泳后，DNA 按分子量大小在凝胶中形成许多条带，大小相同的分子处于同一条带位置。另外为了便于测定待测DNA 分子量的大小或是所处的分子大小范围，往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA 样品即标准分子量DNA (DNA marker)进行电泳。DNA marker可以用放射性核素进行末端标记，通过这种方式，杂交后的标准分子量DNA 也能显影出条带。步骤，制备琼脂糖凝胶，尽可能薄。DNA 样品与上样缓冲液混匀，上样。推荐使用的靶基因的上样量见不同条件下上样本的使用指针比较表。一般而言，对地高辛杂交系统，所需DNA 样品的浓度较低，每道加2.5-5μg 人类基因组DNA; 如果基因组比人类DNA 更复杂(如植物DNA) 则上样量可达10μg; 每道上质粒DNA
泳，使DNA 条带很好的分离。在电泳结束后，0.25-0.50μg/mlEB染色15-30min ，紫外灯下观察凝胶。第三，转膜。将凝胶中的单链DNA 片段转移到固相支持物上。而此过程最重要的是保持各DNA 片段的相对位置不变。DNA 是沿与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA 片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA 片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印迹。用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜、尼龙膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。其中常用的是NC 膜和Nylon 膜。第五，杂交。
4.2Northern 杂交
4.2.1Northern 杂交的原理
整合到植物染色体上的外源基因如果能正常表达，则转化植株细胞内有其转录产物--特异mRNA 的生成。将提取的植物总RNA 或mRNA 用变性凝胶电泳分离，则不同的RNA 分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上; 将他们原位转移到固定膜上; 在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交; 然后通过探针的标记性质检测出杂交体。若经杂交，样品无杂交带出现，表明外源基因已经整合到植物细胞染色体上，但在该取材部位及生理状态下该基因并未有效表达。
4.3 Western杂交
4.3.1 Western 杂交的原理
Western 杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE 电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜(硝酸纤维素膜或尼龙膜) 上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体(一抗) ，膜上的目的蛋白(抗原) 与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗(通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体) ，最后通过二抗上带标记化合物(一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶) 的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物(植物) 细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
5、 PCR技术
5.1PCR 技术的原理
该技术是在模板DNA 、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA 聚合酶的酶促合成反应。DNA 聚合酶以单链DNA 为模板，借助一小段双链DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH 末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA 互补链。
参考文献
[1] 楼士林，杨盛昌，龙敏南，等. 基因工程[M].北京：科学出版社，2002.
[2] 李庆军，董艳桐，施冰. 植物抗虫基因的研究进展[J].林业科技，2002，27(2)：22 26.
[3] 陈渝军, 林晶. 基因工程技术在医药卫生领域的应用及发展. 药品评价,2005, 2( 2) : 144- 145.
[4] 童克中. 基因及其表达. 北京: 科学出版社, 2001.
[5] 朱宝泉. 基因工程技术在医学工业中的应用及进展
[6] 方鹏. 基因工程应用简述[ J] .辽宁师专学报.2004.6(2): 29- 30.
[7] 王俊杰21 世纪基因工程在肿瘤防治中的应用[ J] 2000.6(6):62- 67.