细胞凋亡原理

流式细胞仪技术概述

适当染色后其成分所发出的散射光和荧光,经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点,当每个细胞经过焦点时,发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置) ,光检测器把散射光定量转化成电信号,经数字转换器进行数字化后而成整数,然后进行电子存储,以后数据可以调出显示和进行分析。其优点如下:

1、具有操作简便,只要将染色的单个细胞推入仪器中,就会得出数据。

2、具有较高的灵敏度及测定速度,而且每次可测出许多数据,一般情况下,每秒可测5000个细胞,能迅速分析和记数大量细胞,并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。

3、应用广泛,即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析,也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群,既可测定DNA 和RNA 、测凋亡峰,又可测蛋白含量,特别是胞浆蛋白。

一、样品的制备

流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号,因此,细胞必须做成单个细胞悬浮状态,不能聚集,也不允许有细胞碎片存在。所用染料必须特异(如特异单抗),而且不允许渗透至载液中。

标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系,要经F icoll 分离,作单细胞分离处理,但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞,需采用酶消化法(胰蛋白酶、胶原酶等) ,化学法(EDTA 、EGTA 和柠檬酸盐)消化分散液或洗液最好用无钙、镁PBS ,柠檬酸盐的浓度为40μmol/L,并同时采用机械分散法,将经消化处理的膨松组织,用玻璃珠悬摇或用吸管吹打分散均可,用PBS 洗2~3次后重悬,最好过一下尼龙或不锈钢网筛100μm和20μm。细胞浓度要保证在1-2×106/mL

若标本用于测定单个细胞,需加入1~5

mg/L的DNAase ,将有助于阻止破碎细胞释放的DNA 造成细胞再聚集,但是若分离的细胞要作DNA 含量测定之用时,则切勿加DNAase 。

二、悬浮细胞的固定

上述制备的活细胞即可用于流式细胞仪分析,如果染色和流式分析要拖后进行,或为了提高染色效果,则要将细胞预固定。乙醇固定是常用的方法。

1、固定方法:

(1)甲醛法:在细胞悬液中加入等量的8%甲醛(用Hank’S液配)4℃下固定12-18小时。

(2)乙醇法:细胞悬于PBS 中,缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇,使终浓度为70%,冰浴30分钟。

(3)丙酮法:于细胞悬液中,缓慢加入冷丙酮,使终浓度为85%。

2、实例:

(1)用预冷的无钙、镁含0.5mmol/L EDTA 的磷酸盐缓冲液,将细胞制成1×106细胞的悬液。

(2)在4℃下逐滴加入3倍体积的95%乙醇,连续搅拌使乙醇终浓度达70%。

(3)该细胞可在4℃下保存数日。

(4)分析前先用1000r/min离心10分钟,弃去乙醇,再将细胞悬于PBS 中或要求的试剂中。

三、流式细胞仪分析的应用

(一) 非染色细胞的光散射

一个粒子(如细胞) 出现在一束光线中,立即会干扰该光束,造成该光束入射光的重分布,该细胞所获能量则以衍散、折射、反射等复杂的参数形式重新发射出来,这些参数与细胞体积、表面构象、内部结构形成函数关系,可测低角前面约10°的光散射及90°的光散射。

一般认为,90°位置的光散射值主要受细胞内部结构所致的光反射和折射影响,而低角前面10°位置的光散射则主要代表细胞大小。光散射测量方法如下:

(1)将细胞悬浮于HBSS 中,浓度介于1×106~2×106/mL浓度之间。

(2)以悬浮细胞平衡盐溶液(HBSS)充满含鞘液的细胞贮藏池。

(3)设定细胞流量为500个/S(秒) ,以获得最佳测定结果。

(二) 染色法

1 细胞的碘化丙锭(propiolium iodide PI) 染色

PI 和EB(溴化乙锭) 为同类物质,与EB 一样,PI 嵌入DNA 双螺旋中,可使荧光强度增加约20倍,PI 的荧光强度约为EB 染色的1.8倍,以488nm 波长激发,DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm 。

1.1 小鼠Lewis 肺癌细胞(3LL)DNA含量测定方法

(1)从C57BL/6小鼠上切除肿块,在培养皿内用PBS 冲洗;

(2)去除结缔组织及脂肪,剪碎肿块;

(3)小碎片移入1.20×38mm 注射针, 加压使其通过, 于4℃条件下重悬细胞于HBSS 中。

(4)将200~300μL细胞悬液(5×105细胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL),染色3LL 细胞,于4℃存放20~30分钟。

(5)测定580~750nm 之间的发射荧光,以去除末结合PI 产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。

注:PI 染色液:0.1%柠檬酸钠1000mL+PI5mg+1%Nonide P40水。

1.2 培养细胞DNA 的流式细胞仪分析

(1)从培养皿中吸去培养基,以HBSS 冲洗二次;

(2)加入PI5mL 于培养皿中,在4℃放10分钟;

(3)用吸管反复次打细胞,使细胞破坏,胞核释放出来,再行流式细胞仪分析。

1.3 完整细胞DNA 的PI 染色

(1)70%乙醇固定的细胞悬液,离心,去固定液;

(2)室温条件下加入PI 染色一批细胞(105~106细胞/mL),时间为30分钟,然后行流式细胞仪分析。

1.4 光辉霉素和PI 的DNA 染色

在荧光抗生素光辉霉素和PI 联合染色过程中,光辉霉素的供体分子被PI 的受体分子接受产生能量转移,该染色技术主要用于实体肿瘤组织,精子细胞及妇科标本,同时也适用于体外培养的细胞。

(1)分离制备的细胞悬液即可使用,若用70%乙醇固定可保存一周。

(2)以PI/光辉霉素染色,4℃1小时(PI 为10 mg/L、光辉霉素为10 mg/L)。

(3)染色后进样,以100W 汞灯作为激光光源,使用BG123nm 阻断滤片,叠加K590型高通滤法(one seep filter) 。

2、DNA 和RNA 的鉴别染色

利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA 和RNA 。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定,非固定细胞核酸,或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA 和RNA 含量时较难获得好的重复性结果,但该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下:

(1)试剂:

溶液A :低温保存,稳定期约2周。

Triton X-100(0.1%) 0.1mL ,1mol/L HCL 8mL

1mol/L NacL 15ml 蒸馏水76mL ,PH1.5(100mL )

溶液B :稳定期数月,最好除菌以后(高压或过滤) 贮存。

0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L Nacl15mL

0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L柠檬酸18.5mL

蒸馏水24mL ,总体积为99mL pH6.0

吖啶橙母液:

用吖啶橙/蒸馏水配成1mg/mL(致癌物,应小心) ,吖啶橙应用液0.1mL 母液加9.9mL 溶液B 稀释。

注意:仪器鞘流系统应保持4℃。

氩激光激发波488nm ,红色荧光为DNA(F>600nm),绿色荧光为RNA 或单链DNA(F>530nm)

(2)方法

①用含15%血清的PBS 配制细胞悬液,取0.2mL(8×106细胞/mL),加入0.4mL 溶液A ,4℃放置45~60秒。

②加1.2mL 含吖啶橙的溶液B ,室温2分钟。

③应在加入溶液B 后10分钟内进流式细胞仪分析。

注意:①细胞数保持恒定;②核酸与吖啶橙的比例;③染色时间及温度。

(三) 染色法的应用

1、变性及双链DNA 的鉴别染色

(1)试剂:

HBSS 内含1000u/mL RNA 酶A ,0.2mol/L KCl pH1.35

吖啶橙用0.1mol/L柠檬酸配成5 mg/L(16.7μm),0.2mol/L Na2HPO4 缓冲液,pH2.6。 ①2×106细胞悬于1mL HBSS/RNase液中。

②37℃温育1小时。

③将0.2mL 细胞悬液(含4×105细胞始终悬浮于HBSS/RNase)与0.5mL 0.2mol/L K Cl(pH1.35)混匀,20℃ 30分钟。

④加2mL 吖啶橙染色2分钟。

⑤绿色荧光(530nm)和红色荧光(600nm)分别代表细胞中单链及双链DNA 含量。

2、DNA 与癌基因探针双标记测定

这种测定是先用癌基因探针按间接免疫荧光染色法标记癌基因表达产物,然后用PI 标记DNA ,现以研究白血病细胞增殖与癌基因的关系说明操作步骤:

(1)制备白血病细胞悬液,用100%甲醇在-20℃固定10分钟。

(2)取50μl50mg/L的癌基因探针Y13-25(它是一种广谱单克隆抗体,可特异性地直接与N-ras ,Ki-ras 和Ha-ras 三种癌基因编码的21Kd 蛋白相结合) ,4℃作用30~45分钟。

(3)用PB 离心洗涤2次,重悬浮于50μL HBSS 中(含0.1%叠氮钠和2%小牛血清) 。

(4)加入50μL 1:200兔抗鼠IgG ,4℃放置30~45分钟。

(5)同(3)洗涤后加入50μL 1:40的FITC 标记的羊抗兔IgG ,4℃反应30~45分钟。

(6)同(3)洗涤后,细胞用RNA 酶消化,室温20~30分钟。

(7)同(3)洗涤后,用PI 染液染20分钟。

(8)同(3)洗涤后,用488nm 激发波长测定。FITC 染色显示ras 癌基因表达产物,PI 染色显示DNA 含量。

注意事项:

①制备样品时,离心次数不宜过多,防止细胞丢失和凝集;

②细胞固定时间不宜过长,不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定剂;

③为了降低本底,应将细胞表面未结合的荧光染料洗净;

④进行双标记沉淀时,应尽量选用激发光谱不接近的荧光色素。

3、以溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料进行细胞周期分析。

(1)试剂:

用培养基配制33 mg/L Brdu 及脱氧细胞苷26.4g/mL。

染色液:Hoechst33258溶于PBS ,细胞染色24小时后进行分析,据报道染色的稳定时间在30分钟至24小时之间。

(2)方法:

①将Brdu 溶液按1:10加入细胞培养液中。

②根据细胞周期时间不同,选择不同时间培养的细胞。

③孵育后,摇散细胞以传代培养。

④直接用染液重悬细胞,进入流式细胞仪分析。

Hoechst33258荧光值在410~580nm 之间,需用330~360nm 紫外光激发。应特异性结合腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对。因此,不仅特异性标记DNA ,亦可标记胸腺嘧啶。在细胞周期分析时,在与细胞孵育过程加入Brdu,Brdu 可替代DNA 中的胸腺嘧啶,因此,处于合成期内的细胞表面上仍保持二倍体状态,并在分裂后G1峰的半峰处产生一新峰,此项技术可用于直接测定细胞G2期及分裂时间。

4、Hoechst33342染色活细胞DNA

(1)试剂:Hoechst 33342, 用蒸馏水配成0.25mol/L。

(2)方法:

①制备106/m细胞悬液,以Hoechst33342染色,浓度为5~10 mg/L ,室温下20分钟。

②分析前切勿洗涤细胞。

Hoechst33342可用作细胞DNA 的活体染料,据信可在保持细胞活性的同时,呈现出相当好的DNA 化学计量关系,激发波在紫外范围350~363nm 之间,发射波则在450nm 处。

5、以异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyante FIFC )染色蛋白质。

(1)试剂:异硫氰酸荧光素(FIFC)用含40 mg/L RNase 的PBS 配成0.1~1.0 mg/L浓度。

(2)方法:

①染色前用终浓度70%乙醇固定细胞,至少18小时。

②离心固定细胞,弃去固定液。

③室温下用FIFC 染色细胞蛋白,30分钟。

④流式细胞仪分析,使用氩激光,激发波长488nm ,荧光发射波长515~535nm 。 也可于固定细胞中,以18 mg/L (0.1%柠檬酸盐配制) 和0.05 mg/L FIFC(含40 mg/LRNase ,PBS 配制) 染色20分钟以上可对DNA 和蛋白质双重染色,分别呈现红色荧光(D NA )和绿色荧光(蛋白质)。

6、荧光素抗体的应用

该技术既可用于检测带有特异性膜抗原的细胞,可用荧光素或若丹明标记单克隆抗体处理上述细胞;也可用于测定胞浆中的蛋白质(如凋亡BCL-2蛋白,抗病毒蛋白MXA 等) ,后者在细胞凋亡章节中已介绍从略。

用磷酸盐缓冲液Eagle’sMEM稀释FIFC 连接的抗体内含0.1%叠氮钠、2%牛血清。为判定FIFC 抗体的最适度的稀释浓度,向微量滴定板的细胞中加入50μL不同浓度的稀释液,再以荧光显微镜确认最佳染色浓度。使用抗人LEU-I 抗体分析时,应稀释成5mg/L或 0.25 mg/L。无论鼠或人细胞在2×107浓度时其存活率应在90%以上。

方法:

(1)于微量滴定板加入50μL抗体稀释度,再加入50μL细胞悬液,混匀。

(2)冰浴45分钟,离心滴定板(1500r/min 10分钟)。

(3)弃上清,以培养基100μL洗涤细胞沉淀2次,每次洗涤后用1500r/min 10分钟,弃上清。

(4)以1ml 预冷的培养基配成1×106细胞/mL的已染色细胞悬液,进样前持续保持冷环境(4℃) 。

目前流式细胞仪(FCM)已在各学科中获得应用。

①细胞生物学:定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞;分析生物大分子如DNA 、RNA 、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系,进行染色体核型分析,并可纯化X 或Y 染色体。

②肿瘤学:DNA 倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA 倍体测定技术,对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。

③免疫学:研究细胞周期或DNA 倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系;进行免疫活性细胞的分型与纯化;分析淋巴细胞亚群与疾病的关系;免疫缺陷病如艾滋病的诊断;器官移植后的免疫学监测等。

④血液学:血液细胞的分类、分型,造血细胞分化的研究,血细胞中各种酶的定量分析,如过氧化物酶、非特异性酯酶等;用NBT 及DNA 双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系,检测母体血液中Rh(+)或抗D 抗原阳性细胞,以了解胎儿是否可能因Rh 血型不合而发生严重溶血;检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病,如红斑狼疮等。

⑤药物学:检测药物在细胞中的分布,研究药的作用机制,亦可用于筛选新药,如化疗药物对肿瘤的凋亡机制,可通过测DNA 凋亡峰,Bcl-2凋亡调节蛋白等。

流式细胞仪检测细胞凋亡

——PI 单染色法

基本原理

其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等,其中细胞核的改变最具特征性,主要包括以下几个方面:

1. 细胞核的改变:由于凋亡细胞核的改变,造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA 可染性发生改变。研究表明,用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色,其DNA 可染性降低。许多学者把这种DNA 可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

2. 光散射特性:凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上,前散射光与细胞的大小有关,而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用,与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时,细胞固缩,体积变小,故前散射光降低,这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解,核破裂形成,细胞内颗粒往往增多,故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时,由于细胞肿胀,其前散射光增大;侧散射光在细胞坏死时也增大,因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是,根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中,用光散射特性检测凋亡的可靠性较好,而在肿瘤细胞凋亡中,其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来,用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。

试剂与仪器

? PBS溶液;

? PI 染液:将PI 溶于PBS (pH7.4)中,终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。

? 70%乙醇

? 400目筛网

? 流式细胞仪

实验步骤

1. 收集细胞{数目约(1~ 5)×106个/mL},500 ~ 1000 r/min离心5min ,弃去培养液。

2. 3ml PBS 洗涤1次。

3. 离心去PBS ,加入冰预冷的70%的乙醇固定,4℃,1—2小时。

4. 离心弃去固定液,3mlPBS 重悬5min 。

5. 400目的筛网过滤1次,500—1000r/min离心5min ,弃去PBS 。

6. 用1ml PI 染液染色,4℃避光30min 。

7. 流式细胞仪检测:PI 用氩离子激发荧光,激光光波波长为488nm ,发射光波波长大于630nm ,产生红色荧光分析PI 荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。

8. 结果判断:在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上,凋亡细胞与正常细胞相比,前散射光降低,而侧散射光可高可低,与细胞的类型有关;在分析PI 荧光的直方图时,先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片,在PI 荧光的直方图上,凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0,则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45,可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI 荧光强度做参照标准,两者分别为0.35和0.7,可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。

注意事项

细胞凋亡时,其DNA 可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA 可染性降低也可能是因为DNA 含量的降低,或者是因为DNA 结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。

流式细胞仪技术概述

适当染色后其成分所发出的散射光和荧光,经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点,当每个细胞经过焦点时,发出一束散射光/或荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置) ,光检测器把散射光定量转化成电信号,经数字转换器进行数字化后而成整数,然后进行电子存储,以后数据可以调出显示和进行分析。其优点如下:

1、具有操作简便,只要将染色的单个细胞推入仪器中,就会得出数据。

2、具有较高的灵敏度及测定速度,而且每次可测出许多数据,一般情况下,每秒可测5000个细胞,能迅速分析和记数大量细胞,并能准确统计群体中荧光标记细胞的比例。

3、应用广泛,即可用于测定细胞活力、繁殖周期和细胞定型分析,也可区别死亡细胞、分裂细胞和静止细胞群,既可测定DNA 和RNA 、测凋亡峰,又可测蛋白含量,特别是胞浆蛋白。

一、样品的制备

流式细胞仪是测定一个或重复的每个颗粒经光路的信号,因此,细胞必须做成单个细胞悬浮状态,不能聚集,也不允许有细胞碎片存在。所用染料必须特异(如特异单抗),而且不允许渗透至载液中。

标本如果是属于淋巴细胞等血细胞、骨髓细胞或白血病细胞系或类淋巴细胞系,要经F icoll 分离,作单细胞分离处理,但若为实体组织或贴壁生长的上皮成纤维样细胞,需采用酶消化法(胰蛋白酶、胶原酶等) ,化学法(EDTA 、EGTA 和柠檬酸盐)消化分散液或洗液最好用无钙、镁PBS ,柠檬酸盐的浓度为40μmol/L,并同时采用机械分散法,将经消化处理的膨松组织,用玻璃珠悬摇或用吸管吹打分散均可,用PBS 洗2~3次后重悬,最好过一下尼龙或不锈钢网筛100μm和20μm。细胞浓度要保证在1-2×106/mL

若标本用于测定单个细胞,需加入1~5

mg/L的DNAase ,将有助于阻止破碎细胞释放的DNA 造成细胞再聚集,但是若分离的细胞要作DNA 含量测定之用时,则切勿加DNAase 。

二、悬浮细胞的固定

上述制备的活细胞即可用于流式细胞仪分析,如果染色和流式分析要拖后进行,或为了提高染色效果,则要将细胞预固定。乙醇固定是常用的方法。

1、固定方法:

(1)甲醛法:在细胞悬液中加入等量的8%甲醛(用Hank’S液配)4℃下固定12-18小时。

(2)乙醇法:细胞悬于PBS 中,缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇,使终浓度为70%,冰浴30分钟。

(3)丙酮法:于细胞悬液中,缓慢加入冷丙酮,使终浓度为85%。

2、实例:

(1)用预冷的无钙、镁含0.5mmol/L EDTA 的磷酸盐缓冲液,将细胞制成1×106细胞的悬液。

(2)在4℃下逐滴加入3倍体积的95%乙醇,连续搅拌使乙醇终浓度达70%。

(3)该细胞可在4℃下保存数日。

(4)分析前先用1000r/min离心10分钟,弃去乙醇,再将细胞悬于PBS 中或要求的试剂中。

三、流式细胞仪分析的应用

(一) 非染色细胞的光散射

一个粒子(如细胞) 出现在一束光线中,立即会干扰该光束,造成该光束入射光的重分布,该细胞所获能量则以衍散、折射、反射等复杂的参数形式重新发射出来,这些参数与细胞体积、表面构象、内部结构形成函数关系,可测低角前面约10°的光散射及90°的光散射。

一般认为,90°位置的光散射值主要受细胞内部结构所致的光反射和折射影响,而低角前面10°位置的光散射则主要代表细胞大小。光散射测量方法如下:

(1)将细胞悬浮于HBSS 中,浓度介于1×106~2×106/mL浓度之间。

(2)以悬浮细胞平衡盐溶液(HBSS)充满含鞘液的细胞贮藏池。

(3)设定细胞流量为500个/S(秒) ,以获得最佳测定结果。

(二) 染色法

1 细胞的碘化丙锭(propiolium iodide PI) 染色

PI 和EB(溴化乙锭) 为同类物质,与EB 一样,PI 嵌入DNA 双螺旋中,可使荧光强度增加约20倍,PI 的荧光强度约为EB 染色的1.8倍,以488nm 波长激发,DNA/PI复合物最大的发射波长约为615nm 。

1.1 小鼠Lewis 肺癌细胞(3LL)DNA含量测定方法

(1)从C57BL/6小鼠上切除肿块,在培养皿内用PBS 冲洗;

(2)去除结缔组织及脂肪,剪碎肿块;

(3)小碎片移入1.20×38mm 注射针, 加压使其通过, 于4℃条件下重悬细胞于HBSS 中。

(4)将200~300μL细胞悬液(5×105细胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL),染色3LL 细胞,于4℃存放20~30分钟。

(5)测定580~750nm 之间的发射荧光,以去除末结合PI 产生的激发光与发射光谱线之间的重叠部分。

注:PI 染色液:0.1%柠檬酸钠1000mL+PI5mg+1%Nonide P40水。

1.2 培养细胞DNA 的流式细胞仪分析

(1)从培养皿中吸去培养基,以HBSS 冲洗二次;

(2)加入PI5mL 于培养皿中,在4℃放10分钟;

(3)用吸管反复次打细胞,使细胞破坏,胞核释放出来,再行流式细胞仪分析。

1.3 完整细胞DNA 的PI 染色

(1)70%乙醇固定的细胞悬液,离心,去固定液;

(2)室温条件下加入PI 染色一批细胞(105~106细胞/mL),时间为30分钟,然后行流式细胞仪分析。

1.4 光辉霉素和PI 的DNA 染色

在荧光抗生素光辉霉素和PI 联合染色过程中,光辉霉素的供体分子被PI 的受体分子接受产生能量转移,该染色技术主要用于实体肿瘤组织,精子细胞及妇科标本,同时也适用于体外培养的细胞。

(1)分离制备的细胞悬液即可使用,若用70%乙醇固定可保存一周。

(2)以PI/光辉霉素染色,4℃1小时(PI 为10 mg/L、光辉霉素为10 mg/L)。

(3)染色后进样,以100W 汞灯作为激光光源,使用BG123nm 阻断滤片,叠加K590型高通滤法(one seep filter) 。

2、DNA 和RNA 的鉴别染色

利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA 和RNA 。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定,非固定细胞核酸,或作溶酶体的一种标记。观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定DNA 和RNA 含量时较难获得好的重复性结果,但该方法已被许多实验室广泛采用。方法如下:

(1)试剂:

溶液A :低温保存,稳定期约2周。

Triton X-100(0.1%) 0.1mL ,1mol/L HCL 8mL

1mol/L NacL 15ml 蒸馏水76mL ,PH1.5(100mL )

溶液B :稳定期数月,最好除菌以后(高压或过滤) 贮存。

0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L Nacl15mL

0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L柠檬酸18.5mL

蒸馏水24mL ,总体积为99mL pH6.0

吖啶橙母液:

用吖啶橙/蒸馏水配成1mg/mL(致癌物,应小心) ,吖啶橙应用液0.1mL 母液加9.9mL 溶液B 稀释。

注意:仪器鞘流系统应保持4℃。

氩激光激发波488nm ,红色荧光为DNA(F>600nm),绿色荧光为RNA 或单链DNA(F>530nm)

(2)方法

①用含15%血清的PBS 配制细胞悬液,取0.2mL(8×106细胞/mL),加入0.4mL 溶液A ,4℃放置45~60秒。

②加1.2mL 含吖啶橙的溶液B ,室温2分钟。

③应在加入溶液B 后10分钟内进流式细胞仪分析。

注意:①细胞数保持恒定;②核酸与吖啶橙的比例;③染色时间及温度。

(三) 染色法的应用

1、变性及双链DNA 的鉴别染色

(1)试剂:

HBSS 内含1000u/mL RNA 酶A ,0.2mol/L KCl pH1.35

吖啶橙用0.1mol/L柠檬酸配成5 mg/L(16.7μm),0.2mol/L Na2HPO4 缓冲液,pH2.6。 ①2×106细胞悬于1mL HBSS/RNase液中。

②37℃温育1小时。

③将0.2mL 细胞悬液(含4×105细胞始终悬浮于HBSS/RNase)与0.5mL 0.2mol/L K Cl(pH1.35)混匀,20℃ 30分钟。

④加2mL 吖啶橙染色2分钟。

⑤绿色荧光(530nm)和红色荧光(600nm)分别代表细胞中单链及双链DNA 含量。

2、DNA 与癌基因探针双标记测定

这种测定是先用癌基因探针按间接免疫荧光染色法标记癌基因表达产物,然后用PI 标记DNA ,现以研究白血病细胞增殖与癌基因的关系说明操作步骤:

(1)制备白血病细胞悬液,用100%甲醇在-20℃固定10分钟。

(2)取50μl50mg/L的癌基因探针Y13-25(它是一种广谱单克隆抗体,可特异性地直接与N-ras ,Ki-ras 和Ha-ras 三种癌基因编码的21Kd 蛋白相结合) ,4℃作用30~45分钟。

(3)用PB 离心洗涤2次,重悬浮于50μL HBSS 中(含0.1%叠氮钠和2%小牛血清) 。

(4)加入50μL 1:200兔抗鼠IgG ,4℃放置30~45分钟。

(5)同(3)洗涤后加入50μL 1:40的FITC 标记的羊抗兔IgG ,4℃反应30~45分钟。

(6)同(3)洗涤后,细胞用RNA 酶消化,室温20~30分钟。

(7)同(3)洗涤后,用PI 染液染20分钟。

(8)同(3)洗涤后,用488nm 激发波长测定。FITC 染色显示ras 癌基因表达产物,PI 染色显示DNA 含量。

注意事项:

①制备样品时,离心次数不宜过多,防止细胞丢失和凝集;

②细胞固定时间不宜过长,不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定剂;

③为了降低本底,应将细胞表面未结合的荧光染料洗净;

④进行双标记沉淀时,应尽量选用激发光谱不接近的荧光色素。

3、以溴化脱氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料进行细胞周期分析。

(1)试剂:

用培养基配制33 mg/L Brdu 及脱氧细胞苷26.4g/mL。

染色液:Hoechst33258溶于PBS ,细胞染色24小时后进行分析,据报道染色的稳定时间在30分钟至24小时之间。

(2)方法:

①将Brdu 溶液按1:10加入细胞培养液中。

②根据细胞周期时间不同,选择不同时间培养的细胞。

③孵育后,摇散细胞以传代培养。

④直接用染液重悬细胞,进入流式细胞仪分析。

Hoechst33258荧光值在410~580nm 之间,需用330~360nm 紫外光激发。应特异性结合腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对。因此,不仅特异性标记DNA ,亦可标记胸腺嘧啶。在细胞周期分析时,在与细胞孵育过程加入Brdu,Brdu 可替代DNA 中的胸腺嘧啶,因此,处于合成期内的细胞表面上仍保持二倍体状态,并在分裂后G1峰的半峰处产生一新峰,此项技术可用于直接测定细胞G2期及分裂时间。

4、Hoechst33342染色活细胞DNA

(1)试剂:Hoechst 33342, 用蒸馏水配成0.25mol/L。

(2)方法:

①制备106/m细胞悬液,以Hoechst33342染色,浓度为5~10 mg/L ,室温下20分钟。

②分析前切勿洗涤细胞。

Hoechst33342可用作细胞DNA 的活体染料,据信可在保持细胞活性的同时,呈现出相当好的DNA 化学计量关系,激发波在紫外范围350~363nm 之间,发射波则在450nm 处。

5、以异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyante FIFC )染色蛋白质。

(1)试剂:异硫氰酸荧光素(FIFC)用含40 mg/L RNase 的PBS 配成0.1~1.0 mg/L浓度。

(2)方法:

①染色前用终浓度70%乙醇固定细胞,至少18小时。

②离心固定细胞,弃去固定液。

③室温下用FIFC 染色细胞蛋白,30分钟。

④流式细胞仪分析,使用氩激光,激发波长488nm ,荧光发射波长515~535nm 。 也可于固定细胞中,以18 mg/L (0.1%柠檬酸盐配制) 和0.05 mg/L FIFC(含40 mg/LRNase ,PBS 配制) 染色20分钟以上可对DNA 和蛋白质双重染色,分别呈现红色荧光(D NA )和绿色荧光(蛋白质)。

6、荧光素抗体的应用

该技术既可用于检测带有特异性膜抗原的细胞,可用荧光素或若丹明标记单克隆抗体处理上述细胞;也可用于测定胞浆中的蛋白质(如凋亡BCL-2蛋白,抗病毒蛋白MXA 等) ,后者在细胞凋亡章节中已介绍从略。

用磷酸盐缓冲液Eagle’sMEM稀释FIFC 连接的抗体内含0.1%叠氮钠、2%牛血清。为判定FIFC 抗体的最适度的稀释浓度,向微量滴定板的细胞中加入50μL不同浓度的稀释液,再以荧光显微镜确认最佳染色浓度。使用抗人LEU-I 抗体分析时,应稀释成5mg/L或 0.25 mg/L。无论鼠或人细胞在2×107浓度时其存活率应在90%以上。

方法:

(1)于微量滴定板加入50μL抗体稀释度,再加入50μL细胞悬液,混匀。

(2)冰浴45分钟,离心滴定板(1500r/min 10分钟)。

(3)弃上清,以培养基100μL洗涤细胞沉淀2次,每次洗涤后用1500r/min 10分钟,弃上清。

(4)以1ml 预冷的培养基配成1×106细胞/mL的已染色细胞悬液,进样前持续保持冷环境(4℃) 。

目前流式细胞仪(FCM)已在各学科中获得应用。

①细胞生物学:定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞;分析生物大分子如DNA 、RNA 、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系,进行染色体核型分析,并可纯化X 或Y 染色体。

②肿瘤学:DNA 倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA 倍体测定技术,对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。

③免疫学:研究细胞周期或DNA 倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系;进行免疫活性细胞的分型与纯化;分析淋巴细胞亚群与疾病的关系;免疫缺陷病如艾滋病的诊断;器官移植后的免疫学监测等。

④血液学:血液细胞的分类、分型,造血细胞分化的研究,血细胞中各种酶的定量分析,如过氧化物酶、非特异性酯酶等;用NBT 及DNA 双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系,检测母体血液中Rh(+)或抗D 抗原阳性细胞,以了解胎儿是否可能因Rh 血型不合而发生严重溶血;检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病,如红斑狼疮等。

⑤药物学:检测药物在细胞中的分布,研究药的作用机制,亦可用于筛选新药,如化疗药物对肿瘤的凋亡机制,可通过测DNA 凋亡峰,Bcl-2凋亡调节蛋白等。

流式细胞仪检测细胞凋亡

——PI 单染色法

基本原理

其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等,其中细胞核的改变最具特征性,主要包括以下几个方面:

1. 细胞核的改变:由于凋亡细胞核的改变,造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA 可染性发生改变。研究表明,用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色,其DNA 可染性降低。许多学者把这种DNA 可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

2. 光散射特性:凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上,前散射光与细胞的大小有关,而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用,与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时,细胞固缩,体积变小,故前散射光降低,这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解,核破裂形成,细胞内颗粒往往增多,故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时,由于细胞肿胀,其前散射光增大;侧散射光在细胞坏死时也增大,因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是,根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中,用光散射特性检测凋亡的可靠性较好,而在肿瘤细胞凋亡中,其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来,用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。

试剂与仪器

? PBS溶液;

? PI 染液:将PI 溶于PBS (pH7.4)中,终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。

? 70%乙醇

? 400目筛网

? 流式细胞仪

实验步骤

1. 收集细胞{数目约(1~ 5)×106个/mL},500 ~ 1000 r/min离心5min ,弃去培养液。

2. 3ml PBS 洗涤1次。

3. 离心去PBS ,加入冰预冷的70%的乙醇固定,4℃,1—2小时。

4. 离心弃去固定液,3mlPBS 重悬5min 。

5. 400目的筛网过滤1次,500—1000r/min离心5min ,弃去PBS 。

6. 用1ml PI 染液染色,4℃避光30min 。

7. 流式细胞仪检测:PI 用氩离子激发荧光,激光光波波长为488nm ,发射光波波长大于630nm ,产生红色荧光分析PI 荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。

8. 结果判断:在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上,凋亡细胞与正常细胞相比,前散射光降低,而侧散射光可高可低,与细胞的类型有关;在分析PI 荧光的直方图时,先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片,在PI 荧光的直方图上,凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0,则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45,可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI 荧光强度做参照标准,两者分别为0.35和0.7,可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。

注意事项

细胞凋亡时,其DNA 可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA 可染性降低也可能是因为DNA 含量的降低,或者是因为DNA 结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。


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