应用飞行时间质谱仪快速鉴定细菌的初步研究

第33卷　第5期552　2004年　9月

文章编号:1000-8020(2004) 05-0552-03

卫　生　研　究

J OURNAL OF HYGIENE RESEARCH Vol . 33　No . 5Sep . 　2004

·论著·

应用飞行时间质谱仪快速鉴定细菌的初步研究

孙宗科　张伟　陈西平

中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所, 北京　100021

摘要:目的　研究基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对细菌快速鉴定的影响因素。方法　应用8种细菌, 比较了不同培养基(哥伦比亚血琼脂、伊红美兰琼脂、普通营养琼脂) 及培养时间对细菌质谱图的影响。

结果　不同的培养基及培养时间会对细菌质谱图产生影响。结论　选择合适的培养基及培养时间可以提高细菌检测的准确率。

关键词:MALDI -TOF -MS 　细菌　鉴定中图分类号:Q -331　Q93-331　　　　　　文献标识码:B

Matrix -assisted laser desorption ionisation time -of -flight

mass spectrometry used to bacteria detection

Sun Zongke , Zhang Wei , C hen Xiping

Institute of Environment Hygiene and Health Related Product Safety , Chinese Center for

Disease Control and Prevention , Beijing 　100021, China

Abstract :To investigate the influence variations , three culture media and different culture time were evaluated us ing matrix -assisted laser desorption ionisation time -of -flight mass spectrometry for the rapid identification of eight strains of bacteria . These culture media are Colombia Blood Agar , Eosin Ethylene Blue Agar and Nutrition Agar . Results 　　demonstrate that different culture media and culture time can in fluence the reproducibility of the bacteria fingerprint . It is suggested that appropriate culture media and culture time can enhance the accuracy of the bacteria detection using matrix -assisted laser des orption ionisation time -of -flight mass spectrometry .

Key words :MALDI -TOF -MS , bacteria , detection

　　基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix -assisted laser

desorption ionisation time -of -flight mass spectrometry , MALDI -TOF -2. 56mg g ; 若按水砷限值0. 01mg L 计算, 除砷材料对三价砷和五价砷的去除容量分别为2. 10mg g 和1. 67mg g 。

3　结论

(1) 初步研究了不同多孔载体材料经不同金属试剂处理后对水中砷的去除效果, 综合除砷容量、价格及其他因素, 活

性炭为理想的载体材料, 硝酸铁为理想的负载金属试剂。(2) 考察了除砷材料的制备条件, 提出了以活性炭为载体材料, 硝酸铁为负载金属试剂制备除砷材料的优化条件。(3) 考察了活性炭经硝酸铁处理后对水中砷的动态去除性能, 确定了除砷材料与水中砷的反应平衡时间; 对三价砷含量为0. 284mg L 、五价砷含量为0. 254mg L 的模拟自来水, 除砷材料的除砷容量分别可达2. 94mg g 和2. 56mg g 。

图3　除砷材料的动态除砷曲线Fig . 3　Curve of dynamic performance of

material on arsenic removal

图3所示。按我国现行饮用水砷浓度限值0. 05mg L 计算, 除砷材料对三价砷和五价砷的去除容量分别为2. 94mg g 和

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No . 30371194) 作者简介:孙宗科, 男, 硕士研究生1责任作者

4　参考文献

1　GB T 8538-1995饮用天然矿泉水检验方法.

(2004-07-07收稿)

第5期孙宗科, 等. 应用飞行时间质谱仪快速鉴定细菌的初步研究553

MS ) 是近几年快速发展起来的应用于细菌全细胞快速检测的一项技术, 其基本原理为:将样品与过量的基质溶液点加在样

品板上, 溶剂挥发后形成样品与基质的共结晶, 利用激光作为能量来源辐射共结晶体, 基质分子吸收能量与样品解吸附并使样品电离, 经过飞行时间检测器, 将不同质荷比(m z ) 的离子分开, 形成细菌特异性的质谱图。用标准菌株或来源分型明确的菌株建立细菌质谱图库, 相关软件将待测细菌质谱图与细菌库进行比较, 可以确定细菌的种属。

在应用MALDI -TOF -MS 的过程中, 很多因素会对质谱图

[1]

产生影响。有些细菌需要特殊的培养基才能正常生长, 选择合适的培养基有助于对细菌进行检测。在本次实验中, 我们选用在卫生学上有重要意义的8种细菌:大肠埃希菌(Es ch erichia . coli ) 、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis ) 、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii ) 、福氏志贺氏菌(S . flexneri ) 、痢疾志贺氏菌(S . dynesenteriae ) 、宋内志贺氏菌(S . s onnei ) , 金黄色葡萄球菌(Staph ylococcus aureus ) 肺炎链球菌(Strep to coccu s p neu moniae ) ; 应用三种培养基:哥伦比亚血琼脂(Colombia Blood Agar , CB A ) 、伊红美兰琼脂(Eosin Ethylene Blue Agar , EMB ) 、普通营养琼脂(Nutrition Agar , NA ) , 进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的检测, 评价和筛选合适的培养基, 同时比较培养时间对细菌质谱图的影响。

研究培养基对质谱图的影响来进行培养基的选择; 在相同的实验环境下将大肠埃希菌、猪霍乱沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌在哥伦比亚血琼脂上培养72h , 分别于16h 、24h 、48h 和72h 对细菌进行质谱检测, 以研究培养时间对细菌质谱图的影响。1. 2. 2　样品处理方法　将基质溶于含有0. 1%(V V ) 甲酸和0. 01mol L 18-crown -6的1∶1∶1水、甲醇、乙腈溶液(基质溶剂) 中, 革兰氏阳性菌用C MBT 基质, 革兰氏阴性菌用CHCA 基质。将基质溶液于混匀器上震荡混匀获得基质的饱和溶液。标准肽与CHCA 饱和溶液等比例混合获得标准肽溶液。挑取细菌菌苔涂布于96孔样品板上, 每一种细菌涂12孔, 占样品板的一行。自然晾干1h 后, 用基质溶液覆盖菌苔, 用标准肽溶液覆盖校准孔, 每孔1μl 。晾干5min 后进样。1. 2. 3　MicrobeLynx 数据分析　MicrobeLynx 是仪器所用的数据分析系统。该系统采用均方根(root mean square , R MS ) 的数学算法, 将每一孔所得数据与其他11孔数据的均值进行比较, 若R MS ≥3认为该数据为离群数据, 系统自动将其舍弃。若12孔中有6孔及以上R MS

用建立细菌库相同的条件对细菌进行检测, MicrobeLynx 数据分析系统将会用相对概率(relative probability ) 的形式给出被测细菌与细菌库中细菌的匹配情况。相对概率≥90%表示好的匹配, 30%≤相对概率

1　材料和方法

1. 1　实验材料

1. 1. 1　仪器　Micromass 公司的MALDI -Liner 飞行时间质谱仪, 采用氮激光源, 波长为337nm , 为阳离子检测模式, 加速电压为15kV , 数据(质荷比, m z ) 采集范围为500～10000Da 。其他所用仪器为:37℃细菌培养箱(上海安亭科学仪器厂) , 混匀器(台湾省UPWARDS 公司) 1μl 、100μl 、1ml 加样枪(德国eppendorf 公司) , 万分之一分析天平(ME TTLER -TOLEDO 公司) 。

1. 1. 2　菌株　菌种分别购自中国微生物菌种保藏中心及中国医学微生物菌种保藏中心。菌名及菌号为:大肠埃希菌1. 90、猪霍乱沙门氏菌1. 1859、金黄色葡萄球菌1. 1861、肺炎链球菌1. 1692, 鲍氏志贺氏菌51219、福氏志贺氏菌51575、痢疾志贺氏菌51057、宋内志贺氏菌51163。其中金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌为革兰氏阳性细菌, 其余为革兰氏阴性细菌。1. 1. 3　试剂　实验所用基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano -4-hydroxycinnamic acid , CHCA ) 及5-氯-2-巯基苯丙噻唑(5-chloro -2-mercaptobenzothiazole , C MBT ) 、标准肽、溶剂乙腈、甲醇、甲酸及18-crown -6均购自Sigma 公司, 分析纯。溶剂用水为三蒸水, 实验其他用水为单蒸水, 自制。

1. 1. 4　培养基　哥伦比亚琼脂购自DIFCO 公司, 脱纤维羊血购于北京市军马厂, 伊红美兰琼脂及普通营养琼脂购自北京市微生物培养基厂。1. 2　实验方法

1. 2. 1　细菌培养方法　细菌用平板接种法分别接种在含5%脱纤维羊血的哥伦比亚琼脂上及伊红美兰琼脂和普通营养琼脂上, 有氧条件下37℃培养24h , 挑取单菌落在相同的培养基上连续培养两次。细菌培养三次后进行质谱检测, 建立细菌质谱图库。再在相同的实验环境下培养细菌24h , 进行质谱, 2　实验结果

2. 1　培养基种类对质谱图的影响2. 1. 1　质谱图分析　将6种革兰氏阴性细菌在3种培养基上培养传代3次后, 进行质谱检测, 建立细菌质谱图库。用哥伦比亚血琼脂、普通营养琼脂培养基建立细菌库的细菌质谱图, 其谱图十分相似, 不易区分。用伊红美兰琼脂培养基建立细菌库的细菌质谱图各不相同, 从而可以将细菌区分开来。大肠埃希菌在3种培养基上形成的质谱图有明显区别, 说明培养基对同一细菌质谱图会产生影响, 选择合适的培养基有助于对细菌进行检测。2. 1. 2　匹配结果　对细菌进行培养检测, 检测结果与建立的细菌库匹配, 以研究培养基对细菌质谱图重现性的影响, 匹配结果如表1, 伊红美兰琼脂、哥伦比亚血琼脂、普通营养琼脂3种培养基检测结果匹配率分别达到94. 4%、72. 2%、55. 6%,显示出伊红美兰琼脂有较高的分辨率。2. 1. 3　离子峰信息　培养基对细菌质谱图的影响体现在离子峰的变化。表2统计了大肠埃希菌、猪霍乱沙门氏菌、福氏志贺氏菌3种细菌在3种培养基上出现的离子峰信息。在伊红美兰琼脂培养的大肠埃希菌质谱图上出现了2411、2442、3863的离子峰, 猪霍乱沙门氏菌质谱图上出现了1486、2507、2886、2925、3150的离子峰, 而在福氏志贺氏菌质谱图上没有出现新的离子峰, 从而将这3种属于不同属的细菌区分开来。2. 2　培养时间对质谱图的影响

、、、

554卫　　生　　研　　究第33卷

链球菌分别在哥伦比亚血琼脂上培养16h 、24h 、48h 和72h , 用24h 培养获得的质谱图与其他进行RMS 比较, 比较结果如表2。由下表可以看出, 培养时间会影响细菌质谱图的重现性, 为了保证细菌检测的准确率, 应当采用标准化的培养时间。

表1　细菌检测结果

EM B 1

大肠埃希菌

猪霍乱沙门氏菌鲍氏志贺氏菌痢疾志贺氏菌福氏志贺氏菌宋内志贺氏菌结果匹配率(%)

(1)

3　讨论

环境中微生物尤其是细菌污染严重威胁着人类的健康,

快速鉴定环境中的致病微生物对于控制传染病的爆发和传染病的监测极为重要。近二十年来, 一些环境中非常见的致病菌(包括条件致病菌) 感染引起腹泻的事件时有发生, 军团菌感染引起的肺炎也引起人们的广泛关注, 许多新的细菌培养、检测、鉴定技术得到了发展。然而, 这些新的技术包括PCR

Table 1　Results of bacteria detection

细菌名称

菌号1. 90

1. [***********]551163

CBA

3√

1√

(2)

3√

(2)

√√√√94. 4

2√

(2)

3√

(2)

√√

√√√√√

√√

技术、显微荧光技术、免疫组化技术往往需要较长的时间和复杂的前处理程序, 鉴定实验要求较高, 不利于细菌的快速检测[2]。现阶段对于环境样品的鉴定主要还是依赖于传统的培养特性、生化反应等技术。因此, 发展一种快速、高效、灵敏、可操作性强细菌鉴定技术势在必行。

MALDI -TOF -MS 是20世纪80年代出现的生物质谱技术。此种技术的应用与其它细菌检测技术相比, 具有明显的优势:所需时间短, 细菌培养18～24h , 检测所需时间少于30min ; 可从菌落选取细菌直接进行检测; 可在细菌的种、株水平上将细菌区分开来; 产生质谱图的生物标记物已被证实来源于细菌表面, 有利于对不同血清型菌株的鉴别[3]。

在应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测细菌的过程中, 很多因素会影响细菌的检测。本次实验应用8种常见细菌, 研究了培养基和培养时间对细菌MALDI -TOF -MS 检测的影响。研究结果表明, 不同的培养基和培养时间会影响细菌质谱图的重现性, 选择合适的培养基和培养时间有助于对细菌进行检测。

这6种革兰氏阴性细菌都是有重要卫生学意义的肠杆菌科代表性菌株, 有类似的生活环境及相互交叉的表面抗原系统, 进行生化反应及血清学检测时不易得到正确的结果。用质谱进行完整细菌检测时, 生物标记物来自于细菌表面成分, 主要是细菌的表面抗原[3], 造成了这几种细菌的质谱图十分相似, 用质谱常用的培养基哥伦比亚血琼脂很难区分开来。

不同的培养基对细菌质谱图产生影响, 影响包括两个方面:细菌特异性的生物标记物离子发生变化和培养基相关离子的变化。培养基相关离子变化的影响可以通过控制实验条件排除掉, 而检测细菌特异性的生物标记物离子的变化就可以达到将细菌进行区分的目的[4]。不同的培养基和培养时间是如何影响细菌生物标记物离子的还需做进一步的研究, 从而有助于选择合适的培养基和培养时间。

√×√√

√×

(4)

√×(√(3)

√×√

√√√

√√

√×√72. 2

√√

5) √5) √(5) √√×(×(×

(6) ((6) √××6) ×

55. 6

　　注:(1) E MB 、CBA 、NA 用不同培养基建立的细菌库, 1、2、3表示重复三次检测, √表示匹配成功(相对概率≥90%) , ×表示匹配失败(相对概率

表2　6种细菌在3种培养基上的离子峰信息

Table 2　The ion peaks of 6bacteria on 3culture media m z 大肠埃希菌CBA 523

540550563

NA 523550

EMB 523

540

550

[1**********]7

712842

11011230

[1**********]2

24112442

[**************]0

3863

表3　细菌培养24h 与培养16h 、48h 、72h 的RMS 比较Table 3　RMS value comparis on of bacteria cultured 24h

with cultured 16h , 48h and 72h

t h 16h 48h 72h

大肠

埃希菌1. 843. 34>33. 97>3

猪霍乱

沙门氏菌1. 953. 56>33. 83>3

金黄色

葡萄球菌1. 611. 822. 23

肺炎

链球菌1. 281. 651. 57

1101

[1**********]8

[***********][1**********]8

[1**********]7

540

550

猪霍乱沙门氏菌CBA

EMB

福氏志贺氏菌CBA

EM B

[**************]6

[***********][***********][1**********]3

4　参考文献

1　Lay J O . MALDI -TOF mass s pectro metry and bacteria taxonomy . Trends Anal Chem , 2000, 19(8) :507-516

2　Weyandt R G . The role of modern biochemical methods in the determination

of hygienically relevant microorganisms in foodst uffs and (drinking ) water . Anal Bioanal Chem , 2002, 372:230-231

3　Edwards -J ones V , Claydon MA , Evason DJ , et al . Rapid discri mination

between methicillin -s ensitive and methicillin -resistant 295-300

4　Holland RD , Duffy CR , Rafii F . Identification of bacterial proteins

obs erved in M ALD I TOF mass s pectra from whole cells . Anal Chem , 1999, 71(15) :3226-3230

(2003-12-16收稿)

Staphylococcus

aureus by intact cell mas s s pectro metry . J Med Microbial , 2000, 49(3) :

第33卷　第5期552　2004年　9月

文章编号:1000-8020(2004) 05-0552-03

卫　生　研　究

J OURNAL OF HYGIENE RESEARCH Vol . 33　No . 5Sep . 　2004

·论著·

应用飞行时间质谱仪快速鉴定细菌的初步研究

孙宗科　张伟　陈西平

中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所, 北京　100021

结果　不同的培养基及培养时间会对细菌质谱图产生影响。结论　选择合适的培养基及培养时间可以提高细菌检测的准确率。

关键词:MALDI -TOF -MS 　细菌　鉴定中图分类号:Q -331　Q93-331　　　　　　文献标识码:B

Matrix -assisted laser desorption ionisation time -of -flight

mass spectrometry used to bacteria detection

Sun Zongke , Zhang Wei , C hen Xiping

Institute of Environment Hygiene and Health Related Product Safety , Chinese Center for

Disease Control and Prevention , Beijing 　100021, China

Key words :MALDI -TOF -MS , bacteria , detection

　　基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix -assisted laser

3　结论

(1) 初步研究了不同多孔载体材料经不同金属试剂处理后对水中砷的去除效果, 综合除砷容量、价格及其他因素, 活

图3　除砷材料的动态除砷曲线Fig . 3　Curve of dynamic performance of

material on arsenic removal

图3所示。按我国现行饮用水砷浓度限值0. 05mg L 计算, 除砷材料对三价砷和五价砷的去除容量分别为2. 94mg g 和

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No . 30371194) 作者简介:孙宗科, 男, 硕士研究生1责任作者

4　参考文献

1　GB T 8538-1995饮用天然矿泉水检验方法.

(2004-07-07收稿)

第5期孙宗科, 等. 应用飞行时间质谱仪快速鉴定细菌的初步研究553

MS ) 是近几年快速发展起来的应用于细菌全细胞快速检测的一项技术, 其基本原理为:将样品与过量的基质溶液点加在样

在应用MALDI -TOF -MS 的过程中, 很多因素会对质谱图

[1]

1　材料和方法

1. 1　实验材料

1. 1. 4　培养基　哥伦比亚琼脂购自DIFCO 公司, 脱纤维羊血购于北京市军马厂, 伊红美兰琼脂及普通营养琼脂购自北京市微生物培养基厂。1. 2　实验方法

、、、

554卫　　生　　研　　究第33卷

表1　细菌检测结果

EM B 1

大肠埃希菌

猪霍乱沙门氏菌鲍氏志贺氏菌痢疾志贺氏菌福氏志贺氏菌宋内志贺氏菌结果匹配率(%)

(1)

3　讨论

环境中微生物尤其是细菌污染严重威胁着人类的健康,

Table 1　Results of bacteria detection

细菌名称

菌号1. 90

1. [***********]551163

CBA

3√

1√

(2)

3√

(2)

√√√√94. 4

2√

(2)

3√

(2)

√√

√√√√√

√√

√×√√

√×

(4)

√×(√(3)

√×√

√√√

√√

√×√72. 2

√√

5) √5) √(5) √√×(×(×

(6) ((6) √××6) ×

55. 6

　　注:(1) E MB 、CBA 、NA 用不同培养基建立的细菌库, 1、2、3表示重复三次检测, √表示匹配成功(相对概率≥90%) , ×表示匹配失败(相对概率

表2　6种细菌在3种培养基上的离子峰信息

Table 2　The ion peaks of 6bacteria on 3culture media m z 大肠埃希菌CBA 523

540550563

NA 523550

EMB 523

540

550

[1**********]7

712842

11011230

[1**********]2

24112442

[**************]0

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表3　细菌培养24h 与培养16h 、48h 、72h 的RMS 比较Table 3　RMS value comparis on of bacteria cultured 24h

with cultured 16h , 48h and 72h

t h 16h 48h 72h

大肠

埃希菌1. 843. 34>33. 97>3

猪霍乱

沙门氏菌1. 953. 56>33. 83>3

金黄色

葡萄球菌1. 611. 822. 23

肺炎

链球菌1. 281. 651. 57

1101

[1**********]8

[***********][1**********]8

[1**********]7

540

550

猪霍乱沙门氏菌CBA

EMB

福氏志贺氏菌CBA

EM B

[**************]6

[***********][***********][1**********]3

4　参考文献

1　Lay J O . MALDI -TOF mass s pectro metry and bacteria taxonomy . Trends Anal Chem , 2000, 19(8) :507-516

2　Weyandt R G . The role of modern biochemical methods in the determination

of hygienically relevant microorganisms in foodst uffs and (drinking ) water . Anal Bioanal Chem , 2002, 372:230-231

3　Edwards -J ones V , Claydon MA , Evason DJ , et al . Rapid discri mination

between methicillin -s ensitive and methicillin -resistant 295-300

4　Holland RD , Duffy CR , Rafii F . Identification of bacterial proteins

obs erved in M ALD I TOF mass s pectra from whole cells . Anal Chem , 1999, 71(15) :3226-3230

(2003-12-16收稿)

Staphylococcus

aureus by intact cell mas s s pectro metry . J Med Microbial , 2000, 49(3) :

应用飞行时间质谱仪快速鉴定细菌的初步研究

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