经验交流
质谱技术在微生物检测和鉴定中的应用
康琳, 李楠, 高宏伟, 王景林
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2
2
1*
(1. 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室, 北京 100071;
2. 军事医学科学院兽医研究所, 长春 130062)
[关键词] 质谱技术; 微生物; 检测和鉴定
[中图分类号] O 657. 63 [文献标识码] C [文章编号] 1004-8685(2010) 10-2613-04 目前常用的微生物鉴定方法都是基于微生物的形态学、细胞生理生化, 以及核酸基础建立的。自20世纪90年代, 微生物鉴定系统不断发展, 自动化程度不断提高, 但仍然是建立在传统的生理生化和核酸基础上。近年来, 基于蛋白质组学的质谱技术凭借其高灵敏度、高通量、快速等特点在微生物检测和鉴定方面得到快速发展。质谱技术主要是利用特定离子源将待测样品转变为高速运动的离子, 这些离子根据质量/电荷比的不同在电场或磁场作用下得到分离, 并用检测器记录各种离子的相对强度, 形成质谱图用于分析, 提供可靠的鉴定结果。目前用于微生物检测鉴定的质谱技术主要是气-质联用技术(GC-M S) 、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(M ALD I -TOF M S) 、电喷雾质谱(ESI-M S) 及热裂解亚稳态原子轰击质谱(P y-MA B-M S) 等。
1 质谱技术原理
1. 1 气相色谱-质谱联用技术(gas chro m atography m ass spec tro m etry , G C-M S)
混合物样品由气相色谱进入后, 在载气携带下流经色谱柱, 由于不同化合物在固定相和流动相的分配系数不同而达到分离, 并先后从色谱柱流出, 经特殊接口进入质谱仪, 从而得到各组分的质谱图。
1. 2 基质辅助激光解吸飞行时间质谱(m atr i x -assi sted l aser desorpti on /i on i zati on ti m e of fli ght m ass spectrom etry , M ALD I -TOF M S)
M ALD I-TOF M S 的原理是样品和基质混合点在金属靶盘上形成共结晶, 脉冲激光照射晶体后, 基质分子吸收能量与样品解吸附并使其电离(通常是基质的质子转移到样品分子上) 。样品离子在加速电场下获得相同动能, 经高压加速、聚焦后进入飞行时间检测器, 离子的质荷比(m /z) 与飞行时间的平方成正比, 从而对样品进行分析[2]。理论上讲, 只要飞行管的长度够, TOF 检测器可检测分子的质量数是没有上限的, 因此MA LD I-TOF M S 很适合研究蛋白质、核酸等生物大分子。1. 3 电喷雾质谱(e lectrospray i on i zati on m ass spectrome try , ESI
[基金项目]艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治
(2009Z X10004-103)
[作者简介] 康琳(1980-), 女, 助理研究员, 主要从事病原微生
物检测研究工作。
*通讯联系人, E-m ai:l w angjl 6481@hot m ai. l co m
[1]
-M S)
电喷雾质谱的基本原理是:从毛细管流出的液态样品在
雾化气流下转变成带电小液滴(s m a ll drop l et) 进入离子化室, 离子化室内干热的气体使液滴蒸发, 液滴表面电荷强度逐渐增大, 最后形成带有单个或多个电荷的分子离子进入检测器[3]。
1. 4 热裂解亚稳态原子轰击质谱(py ro l y si s m etastable ato m bombard m ent m ass spec trom etry , Py-M AB -M S) 其原理主要是样品在高温下快速裂解, 热裂解物离子化后形成特异性的分子离子峰。传统的离子源主要采用电子离子化(EI) 和化学离子化(C I), 但这两种方式离子化的能量不易控制, 能量过高或过低都会产生碎片离子, 增加了图谱的复杂性和分析难度。近年来有报道[4~6]采用氮气、惰性气体受激发后形成的亚稳态原子作为离子源(MAB ), 其优点是使用不连续的量子化能量离子化样品, 可大大提高离子化效率和仪器分辨率, 而又不易产生碎片离子, 便于图谱分析。2 应用微生物检测的特点
质谱检测和鉴定微生物主要是基于质谱图中是否存在生物标志物。所谓生物标志物(bio m arker) 是微生物中含有的一些化学物质, 其含量或结构具有种属特征, 能够标志某一类或某种特定微生物的存在, 主要包括脂肪酸、蛋白、核酸、糖类等生物分子。
2. 1 GC -M S
GC -M S 联用技术主要用于分析微生物中的脂肪酸、糖类等小分子物质。细菌脂肪酸主要来源于细胞膜脂质双层和脂多糖成分, 不同微生物的脂肪酸在组成和含量上有较大差异, 因此可作为细菌鉴定的主要标志物。张国赏[7]等用该技术分析了7个属(气杆菌属、变形杆菌属、芽胞杆菌、醋杆菌、葡萄球菌、短杆菌和假单胞菌属) 中的12个菌种的全细胞酸性水解产物, 检测出初步化学定名的19种脂肪酸及其它5种羧酸, 并发现这些菌属在14-CH3-C15:O 脂肪酸上的差异, 从而区分各类菌属。最新有关弓形菌属(A rcobacter ) 的研究发现[8], 通过检测脂肪酸C20:0, C22:0, C23:0可成功鉴定该菌属的4个不同菌种。O ursel [9]等利用G C-M S 研究大肠杆菌, 确定其细胞膜由6种饱和脂肪酸(C12:0, C14:0, C15:0, C16:0, C17:0, C18:0) 和3种不饱和脂肪酸(C16:1, C18:1的两个异构体) 组成, 并认为环丙基脂肪酸C17和C19是鉴定大肠杆
脂肪酸本身挥发性较小, 为了增加其挥发性以便于GC -M S 检测, 待测样品需进行分离培养、菌落收集、微生物细胞的皂化以释放脂肪酸、脂肪酸甲基化、脂肪酸甲酯的萃取和洗涤一系列处理过程, 样品制备比较繁琐, 此外, 气-质联用技术要求所分析成分要有一定的挥发性和热稳定性, 这对于一些易热裂解的、不易挥发的大分子生物标记物的检测也有一定局限性。
2. 2 MA LD I-TOF M S
M ALD I-TOF M S 技术主要通过微生物蛋白质表达谱中的特征谱峰鉴定和分类细菌的属、种、株, 甚至是不同亚型。蛋白质在微生物体内含量较高, 细胞壁/膜上的蛋白是信号的主要来源, 因此是目前被研究最多的生物标记物。M ALD I -TOF M S 技术最大特点是对样品纯度要求不高, 对盐、缓冲液、去垢剂等杂质有一定耐受力, 因此样品可不经分离纯化, 直接点样。待测样品通常是单菌落和细胞提取液。
对单菌落的分析是该技术的一大特点, 通常是将单菌落直接涂在样品靶上, 再用基质覆盖, 只需几分钟即可得到细菌的全细胞图谱。J . W a l ker 等采用这种方法鉴定出金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药株(MRSA ), 并对其进行进一步的分型[10]。Easterli ng 等利用M ALD I 监测全菌中重组蛋白的表达, 不需纯化, 浓缩和提取, 大大缩短了分析时间[11]。
M ALD I-TOF M S 技术也可分析细胞提取液, 主要是通过溶剂提取的方法将微生物细胞壁或细胞膜破碎, 让被提取物质充分释放出来。研究发现, 乙腈/水可以溶解菌体表面松散结合的蛋白, 在质量数2000~15000的区域最具有鉴别特性, 所有菌株可通过肉眼区分开。目前已成功鉴定了金葡菌甲氧西林耐药株(MRSA ) 和与之紧密相关的非致病菌(M SSA ) [12], 伯纳特立克次体(C ox iella burnetii ) 的不同菌株[13], 病原性奈瑟菌(N eisseria ) 及其亚型[14]等多种微生物。此外, H o ll and [15]从污染的水样, 食品中经振荡, 超声, 纯化等处理, 直接提取细菌的生物标记蛋白, 利用该技术检测到了大肠杆菌, 福氏志贺菌, 嗜水气单胞菌, 这种方法的采用避免了细菌培养过程, 使得快速鉴别未知微生物成为可能。
有学者认为全菌分析和细菌提取液分析得到的谱图基本相似, 如H ettick 等发现, 用M ALD I-TOF M S 对分枝杆菌进行鉴定时, 经ACN /TFA作为溶剂的分析结果与全细胞的分析结果一致。但也有学者认为, 两种分析所得到的图谱有明显区别, 部分报道认为用于鉴定时, 全菌分析优于细菌提取物, 但是对于一些细菌, 全菌分析给出的信号很少或没有, 又难以完成鉴定, 必须找到合适的基质和溶剂才能得到有鉴定意义的图谱[16]。Easterli ng 则认为对于含低分子量蛋白(
ES I-M S 技术主要也是通过分析蛋白质、脂质、核酸等大分子物质来鉴定微生物, 完成对不同属、种、甚至是亚型的区分。1999年G oodacre [17]首次报道应用ESI-M S 直接检测细菌悬浮液, 通过主要成分分析法(pr i nc i pa l component analysis , PC A ) 分别鉴定了大肠杆菌和仙人掌杆菌的不同菌种。但是该技术易受盐、缓冲液的干扰, 这些杂质的存在很容易降低仪器灵敏度, 影响图谱的重现性, 因此通常情况是将ESI -M S 与(res i 多种高效分离手段相结合, 以便很好的分析复杂样品, 这也是M ALD I 技术所不具备的特点[18, 19]。
电喷雾离子化产生多电荷离子, 这一特点使质荷比降低到多种质量分析器都可以检测的范围, 可更准确测定分子量。与ES I 相连的质谱检测器多为四极杆, 离子阱, 虽然它们的质量检测上限并不高, 但具有较高的质量分辨率, 因此可以在质量较低的范围内检测到生物大分子。多电荷分子离子峰能提供各组分更准确的片段信息, 但与单电荷离子峰图谱相比, 却增加了图谱的复杂性和分析难度。
2. 4 Py-M AB -M S
Py-M AB -M S 技术主要分析全细胞的热解产物, 如细胞壁/膜上的肽聚糖, 脂肪酸。W il kes 等[20]用P y-M AB -M S 分析细胞悬浮液的热解产物, 鉴定了霍乱菌属和沙门氏菌属及其不同菌种。该技术的最大优势在于能对尿液、食品等复杂混合物直接分析, 不需冗长的分离步骤, 无需细菌培养, 数分钟即可得到结果。近年来, W il kes 利用P y-M AB -M S 分析尿液、玉米淀粉等多种复杂物, 固体样品要先用70%乙醇溶液制成悬浮液, 随后通过自动取样器将液体送入热裂解质谱仪内, 即可检测到样品中大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌等微生物的特征图谱。基于Py-M AB -M S 技术结合气相色谱, 法国M G P I 公司推出了一款移动式气-质分析仪。该仪器采用多种最现代的技术, 如快速色谱分析、亚稳态原子轰击源、飞行时间检测器等, 不仅使其具有很高的灵敏度, 更显著的特点是方便移动, 可用于现场快速、准确、自动化的探测和识别各种生物战剂、有毒化合物等, 因此可广泛应用于军队和恐怖威胁所使用的战剂评估、环境检测等多个领域。
此外, MA B 离子源可使用几个不连续的能量使样品离子化, 因此对于相同的生物体系, 可以通过选择不同离子化能量获得几十个指纹图谱, 从而增加鉴定结果的可靠性。研究表明, 氪气(K r), 氮气是最佳离子化气体。
3 影响图谱的主要因素
质谱技术凭借其高通量、快速等优点广泛应用于微生物领域, 主要通过分析谱图完成鉴定过程, 因此获得重现性好的质谱图是决定鉴定结果是否可靠、准确的关键因素。
GC -M S 技术主要用来分析脂类, 脂肪酸是一种可随着培养条件变化而发生改变的细胞组分, 因此分析过程中必须对培养基成分、微生物培养条件、微生物纯化、色谱柱选择等实验条件进行标准化, 否则会严重影响方法的准确度和重复性。
对于M ALD I-TO F M S 而言, 微生物培养基的选择, 基质的选择, 蛋白提取方法等诸多方面都会影响图谱的质量。近年来, 很多学者[21-23]对此做了系统研究, 并建立了各种最优化的实验条件, 结果表明如果控制好这些因素, 不同的操作人员通过同一程序可以获得高度一致、准确的图谱, 甚至不同实验室使用不同的质谱仪也能得到重现性极好的质谱图, 同时这些工作也为质谱鉴定微生物程序的标准化和自动化提供了基础。
锥形电场内的电压(cone vo ltage) 是影响ES I-M S 图谱的重要因素, 其作用主要是通过这个电场区将样品离子束(ion bea m ) 聚集并加速离子。Seetharam an 等研究结果表明[24], 图谱形状随电压变化而变化, 以球形芽胞杆菌(B. sphaericus ) 图, 处的特在较压下强度低,
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导致信息丢失, 因此适当增加样品场区电压, 可提高信噪比, 同时为获得重现性好的图谱, 还需摸索最优化的场区电压。4 结果分析
对未知微生物的分析主要通过与已知数据库进行匹配, 匹配率最高的为未知微生物的鉴定结果。目前已有多种软件系统用于数据分析, 比如德国B ruker D altonics 公司研发的B i o T yper 数据库是根据标准菌株的全细胞蛋白质的指纹图谱建立的, 该软件整合了鉴定与分类以及谱图处理的所有功能, 用户可以自定义峰平滑(s m oo thi ng) 和基线扣除(baseli ne sub trac ti on) 等谱图处理参数, 获得相应的峰列表, 也可进行聚类分析和新的数据库的建立; 英国M icrom ass 公司的M ALD I-TOF 线性飞行时间质谱仪配有60多个属, 300多种细菌的指纹谱数据库, 供用户检索使用, 可以说这些数据库的建立, 能够帮助用户更准确的分析未知微生物, 更拓展了质谱技术的应用范围。随着近年来微生物基因组学和蛋白质组学研究的日益深入, 网络上可以共享的海量的蛋白质数据为质谱鉴定细菌开辟了新途径。将未知细菌样品的质谱峰与蛋白质数据库中细菌的蛋白质分子量相匹配, 匹配率最高的即为未知细菌样品的鉴定结果。常用的数据库查询软件有:PeptIdent/M u ltiIdent 、M S-F it 、M OW SE 、P roF ound 、P ep tIdent2、M ascot 等, 常用的蛋白质组数据库有S w i ss-P ro t 、PRO SITE 等。利用软件调取细菌某一范围内全部蛋白质的分子量作为参照, 将得到的质谱峰与其相对照, 通过数理统计软件分析给出鉴定结果。
5 小结
随着新型技术如表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(surface-enhanced l aser ion ization ti m e of fli ght m ass spectrome try , SELD I) 的诞生[25, 26], 使得不经培养、不需处理直接检测临床分离样本中的病原体成为可能。该技术把基质改为以色谱原理设计的蛋白芯片, 从而增强了分离能力, 可直接对血清、脑脊液、尿液、细胞培养液等样品进行高通量、自动化检测, 其检测的灵敏度高达1f m o 。串联质谱技术的出现可以l 对样品靶上的同一样品, 数秒中就分别获得高灵敏度的多肽质量指纹图和多肽序列, 从而提供微生物更多的结构信息, 使得鉴定结果更可靠。
尽管质谱技术在微生物研究的各领域正发挥着独到的作用, 但在应用上仍存在一些限制。首先是昂贵的价格使得一般实验室难以问津; 其次是微生物样品产生的质谱图比纯化学品的质谱图复杂得多, 要用专门的软件进行分析; 诸如蛋白、多肽等生物标志物数据库的建立还应不断完善, 以便于未知样品的匹配鉴定。相信未来几年内软件的开发会使仪器更易于操作, 图谱更易于分析, 各种谱图数据库的建立和完善会使鉴定结果更准确, 更快捷。
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U re l(A ) =U (x i ) /C=3. 7 10-3/0. 1049=3. 5 10-21. 4. 2 B 类不确定度的估算1. 4. 2. 1 称量重铬酸钾质量不确定度
电子天平的M PE=0. 1mg, 按均匀分布U 1(m) =0. 10. 058(mg) 线性 0. 2m g , 按均匀分布3
U 2(m) =0. 20. 115m g
重复性误差0. 1mg , 95%置信概率; U (m) =0. 1/1. 96=0. 05(m g) U rel(m) =U (m) /m=(0. 1152+0. 052+0. 0582) 0. 5=0. 14m g 1. 4. 2. 2 滴定体积引起的不确定度
25m l A 级滴定管的允差0. 04m , l 按均匀分布U 1(v ) =0. 043=0. 023(m l)
U rel(v ) =U 1(v) /v=0. 023/20. 25=1. 1 10-3
1. 4. 2. 3 重铬酸钾的纯度引起的不确定度
供应商标注重铬酸钾的纯度为不小于99. 98%, 按均匀分布U (w) =0. 02%1. 2 10-4
U rel(w ) =1. 2 10-4/1. 000=1. 2 10-4B 类不确定度的合成
U B =(U r e l(m) 2+U r e l(v) 2+U r e l(w) 2) 1/2=[(0. 14) 10-3) 2+(1. 2 10-4) 2]1/2=0. 141. 5 合成标准不确定度 U r e l(C) =(U 2+U 2) 1/2=[(1. 4 10-1) 2+B A
2. 9 10-2m o l/L,U 由合成标准不确定度U rel(C) =1. 4 10-1
及包含因子k=2而得。
2 有效碘浓度测定结果的不确定度评定2. 1 有效碘六次测定结果:单位(%)
0. 520. 520. 500. 520. 500. 52, 均值0. 51%
u(x i ) =s(x i ) =s(x ik ) /i =
(x ik -x i ) 2
i (n i -1) k
=[(1. 5816-9. 4864/6)/(6-1) ]0. 5=0. 01U (m ) =(0. 0352+0. 012) 0. 5=0. 0364
U c (c 1) =c 1 (0. 000122+0. 000492+0. 0232+0. 03642) 1/2
=0. 51 0. 04306=0. 022
扩展不确定度:P =95%K =2
U r e l(C) =K U r e l(C) =2 0. 022=0. 044%
3 有效碘含量测量结果及不确定度报告
测量结果为0. 51%, 测量结果的扩展不确定度0. 04%, U 由合成标准不确定度U re l (C ) =0. 022%及包含因子k=2而得。4 小结
通过对消毒剂中有效碘浓度不确定度的评定, 讨论分析其主要来源、各自在合成标准不确定度中的影响大小以及其计算方法该方法也可应用于其它容量分析, 有利于检测工作人员开展不确定度的评定, 利用不确定度结果判定本实验室的方法条件与规定方法的符合程度。
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(收稿日期:2010-04-12)
2
+(1. 1
(3. 5
10-2) 2]1/2=1. 4 10-11. 6 扩展不确定度 P =95% K =2
U rel(C ) =K U rel(C ) =2 1. 4 10-1=2. 8 10-1
U =U rel(C ) =2. 8 10-1 0. 1049=2. 9 10-2m o l/L1. 7 测量结果及不确定度报告 测定结果为0. 1049mo l/L, 测定结果的扩展不确定度U =
(上接第2615页)
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(收稿日期:2010-06-24)
经验交流
质谱技术在微生物检测和鉴定中的应用
康琳, 李楠, 高宏伟, 王景林
1
2
2
1*
(1. 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室, 北京 100071;
2. 军事医学科学院兽医研究所, 长春 130062)
[关键词] 质谱技术; 微生物; 检测和鉴定
[中图分类号] O 657. 63 [文献标识码] C [文章编号] 1004-8685(2010) 10-2613-04 目前常用的微生物鉴定方法都是基于微生物的形态学、细胞生理生化, 以及核酸基础建立的。自20世纪90年代, 微生物鉴定系统不断发展, 自动化程度不断提高, 但仍然是建立在传统的生理生化和核酸基础上。近年来, 基于蛋白质组学的质谱技术凭借其高灵敏度、高通量、快速等特点在微生物检测和鉴定方面得到快速发展。质谱技术主要是利用特定离子源将待测样品转变为高速运动的离子, 这些离子根据质量/电荷比的不同在电场或磁场作用下得到分离, 并用检测器记录各种离子的相对强度, 形成质谱图用于分析, 提供可靠的鉴定结果。目前用于微生物检测鉴定的质谱技术主要是气-质联用技术(GC-M S) 、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(M ALD I -TOF M S) 、电喷雾质谱(ESI-M S) 及热裂解亚稳态原子轰击质谱(P y-MA B-M S) 等。
1 质谱技术原理
1. 1 气相色谱-质谱联用技术(gas chro m atography m ass spec tro m etry , G C-M S)
混合物样品由气相色谱进入后, 在载气携带下流经色谱柱, 由于不同化合物在固定相和流动相的分配系数不同而达到分离, 并先后从色谱柱流出, 经特殊接口进入质谱仪, 从而得到各组分的质谱图。
1. 2 基质辅助激光解吸飞行时间质谱(m atr i x -assi sted l aser desorpti on /i on i zati on ti m e of fli ght m ass spectrom etry , M ALD I -TOF M S)
M ALD I-TOF M S 的原理是样品和基质混合点在金属靶盘上形成共结晶, 脉冲激光照射晶体后, 基质分子吸收能量与样品解吸附并使其电离(通常是基质的质子转移到样品分子上) 。样品离子在加速电场下获得相同动能, 经高压加速、聚焦后进入飞行时间检测器, 离子的质荷比(m /z) 与飞行时间的平方成正比, 从而对样品进行分析[2]。理论上讲, 只要飞行管的长度够, TOF 检测器可检测分子的质量数是没有上限的, 因此MA LD I-TOF M S 很适合研究蛋白质、核酸等生物大分子。1. 3 电喷雾质谱(e lectrospray i on i zati on m ass spectrome try , ESI
[基金项目]艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治
(2009Z X10004-103)
[作者简介] 康琳(1980-), 女, 助理研究员, 主要从事病原微生
物检测研究工作。
*通讯联系人, E-m ai:l w angjl 6481@hot m ai. l co m
[1]
-M S)
电喷雾质谱的基本原理是:从毛细管流出的液态样品在
雾化气流下转变成带电小液滴(s m a ll drop l et) 进入离子化室, 离子化室内干热的气体使液滴蒸发, 液滴表面电荷强度逐渐增大, 最后形成带有单个或多个电荷的分子离子进入检测器[3]。
1. 4 热裂解亚稳态原子轰击质谱(py ro l y si s m etastable ato m bombard m ent m ass spec trom etry , Py-M AB -M S) 其原理主要是样品在高温下快速裂解, 热裂解物离子化后形成特异性的分子离子峰。传统的离子源主要采用电子离子化(EI) 和化学离子化(C I), 但这两种方式离子化的能量不易控制, 能量过高或过低都会产生碎片离子, 增加了图谱的复杂性和分析难度。近年来有报道[4~6]采用氮气、惰性气体受激发后形成的亚稳态原子作为离子源(MAB ), 其优点是使用不连续的量子化能量离子化样品, 可大大提高离子化效率和仪器分辨率, 而又不易产生碎片离子, 便于图谱分析。2 应用微生物检测的特点
质谱检测和鉴定微生物主要是基于质谱图中是否存在生物标志物。所谓生物标志物(bio m arker) 是微生物中含有的一些化学物质, 其含量或结构具有种属特征, 能够标志某一类或某种特定微生物的存在, 主要包括脂肪酸、蛋白、核酸、糖类等生物分子。
2. 1 GC -M S
GC -M S 联用技术主要用于分析微生物中的脂肪酸、糖类等小分子物质。细菌脂肪酸主要来源于细胞膜脂质双层和脂多糖成分, 不同微生物的脂肪酸在组成和含量上有较大差异, 因此可作为细菌鉴定的主要标志物。张国赏[7]等用该技术分析了7个属(气杆菌属、变形杆菌属、芽胞杆菌、醋杆菌、葡萄球菌、短杆菌和假单胞菌属) 中的12个菌种的全细胞酸性水解产物, 检测出初步化学定名的19种脂肪酸及其它5种羧酸, 并发现这些菌属在14-CH3-C15:O 脂肪酸上的差异, 从而区分各类菌属。最新有关弓形菌属(A rcobacter ) 的研究发现[8], 通过检测脂肪酸C20:0, C22:0, C23:0可成功鉴定该菌属的4个不同菌种。O ursel [9]等利用G C-M S 研究大肠杆菌, 确定其细胞膜由6种饱和脂肪酸(C12:0, C14:0, C15:0, C16:0, C17:0, C18:0) 和3种不饱和脂肪酸(C16:1, C18:1的两个异构体) 组成, 并认为环丙基脂肪酸C17和C19是鉴定大肠杆
脂肪酸本身挥发性较小, 为了增加其挥发性以便于GC -M S 检测, 待测样品需进行分离培养、菌落收集、微生物细胞的皂化以释放脂肪酸、脂肪酸甲基化、脂肪酸甲酯的萃取和洗涤一系列处理过程, 样品制备比较繁琐, 此外, 气-质联用技术要求所分析成分要有一定的挥发性和热稳定性, 这对于一些易热裂解的、不易挥发的大分子生物标记物的检测也有一定局限性。
2. 2 MA LD I-TOF M S
M ALD I-TOF M S 技术主要通过微生物蛋白质表达谱中的特征谱峰鉴定和分类细菌的属、种、株, 甚至是不同亚型。蛋白质在微生物体内含量较高, 细胞壁/膜上的蛋白是信号的主要来源, 因此是目前被研究最多的生物标记物。M ALD I -TOF M S 技术最大特点是对样品纯度要求不高, 对盐、缓冲液、去垢剂等杂质有一定耐受力, 因此样品可不经分离纯化, 直接点样。待测样品通常是单菌落和细胞提取液。
对单菌落的分析是该技术的一大特点, 通常是将单菌落直接涂在样品靶上, 再用基质覆盖, 只需几分钟即可得到细菌的全细胞图谱。J . W a l ker 等采用这种方法鉴定出金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药株(MRSA ), 并对其进行进一步的分型[10]。Easterli ng 等利用M ALD I 监测全菌中重组蛋白的表达, 不需纯化, 浓缩和提取, 大大缩短了分析时间[11]。
M ALD I-TOF M S 技术也可分析细胞提取液, 主要是通过溶剂提取的方法将微生物细胞壁或细胞膜破碎, 让被提取物质充分释放出来。研究发现, 乙腈/水可以溶解菌体表面松散结合的蛋白, 在质量数2000~15000的区域最具有鉴别特性, 所有菌株可通过肉眼区分开。目前已成功鉴定了金葡菌甲氧西林耐药株(MRSA ) 和与之紧密相关的非致病菌(M SSA ) [12], 伯纳特立克次体(C ox iella burnetii ) 的不同菌株[13], 病原性奈瑟菌(N eisseria ) 及其亚型[14]等多种微生物。此外, H o ll and [15]从污染的水样, 食品中经振荡, 超声, 纯化等处理, 直接提取细菌的生物标记蛋白, 利用该技术检测到了大肠杆菌, 福氏志贺菌, 嗜水气单胞菌, 这种方法的采用避免了细菌培养过程, 使得快速鉴别未知微生物成为可能。
有学者认为全菌分析和细菌提取液分析得到的谱图基本相似, 如H ettick 等发现, 用M ALD I-TOF M S 对分枝杆菌进行鉴定时, 经ACN /TFA作为溶剂的分析结果与全细胞的分析结果一致。但也有学者认为, 两种分析所得到的图谱有明显区别, 部分报道认为用于鉴定时, 全菌分析优于细菌提取物, 但是对于一些细菌, 全菌分析给出的信号很少或没有, 又难以完成鉴定, 必须找到合适的基质和溶剂才能得到有鉴定意义的图谱[16]。Easterli ng 则认为对于含低分子量蛋白(
ES I-M S 技术主要也是通过分析蛋白质、脂质、核酸等大分子物质来鉴定微生物, 完成对不同属、种、甚至是亚型的区分。1999年G oodacre [17]首次报道应用ESI-M S 直接检测细菌悬浮液, 通过主要成分分析法(pr i nc i pa l component analysis , PC A ) 分别鉴定了大肠杆菌和仙人掌杆菌的不同菌种。但是该技术易受盐、缓冲液的干扰, 这些杂质的存在很容易降低仪器灵敏度, 影响图谱的重现性, 因此通常情况是将ESI -M S 与(res i 多种高效分离手段相结合, 以便很好的分析复杂样品, 这也是M ALD I 技术所不具备的特点[18, 19]。
电喷雾离子化产生多电荷离子, 这一特点使质荷比降低到多种质量分析器都可以检测的范围, 可更准确测定分子量。与ES I 相连的质谱检测器多为四极杆, 离子阱, 虽然它们的质量检测上限并不高, 但具有较高的质量分辨率, 因此可以在质量较低的范围内检测到生物大分子。多电荷分子离子峰能提供各组分更准确的片段信息, 但与单电荷离子峰图谱相比, 却增加了图谱的复杂性和分析难度。
2. 4 Py-M AB -M S
Py-M AB -M S 技术主要分析全细胞的热解产物, 如细胞壁/膜上的肽聚糖, 脂肪酸。W il kes 等[20]用P y-M AB -M S 分析细胞悬浮液的热解产物, 鉴定了霍乱菌属和沙门氏菌属及其不同菌种。该技术的最大优势在于能对尿液、食品等复杂混合物直接分析, 不需冗长的分离步骤, 无需细菌培养, 数分钟即可得到结果。近年来, W il kes 利用P y-M AB -M S 分析尿液、玉米淀粉等多种复杂物, 固体样品要先用70%乙醇溶液制成悬浮液, 随后通过自动取样器将液体送入热裂解质谱仪内, 即可检测到样品中大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌等微生物的特征图谱。基于Py-M AB -M S 技术结合气相色谱, 法国M G P I 公司推出了一款移动式气-质分析仪。该仪器采用多种最现代的技术, 如快速色谱分析、亚稳态原子轰击源、飞行时间检测器等, 不仅使其具有很高的灵敏度, 更显著的特点是方便移动, 可用于现场快速、准确、自动化的探测和识别各种生物战剂、有毒化合物等, 因此可广泛应用于军队和恐怖威胁所使用的战剂评估、环境检测等多个领域。
此外, MA B 离子源可使用几个不连续的能量使样品离子化, 因此对于相同的生物体系, 可以通过选择不同离子化能量获得几十个指纹图谱, 从而增加鉴定结果的可靠性。研究表明, 氪气(K r), 氮气是最佳离子化气体。
3 影响图谱的主要因素
质谱技术凭借其高通量、快速等优点广泛应用于微生物领域, 主要通过分析谱图完成鉴定过程, 因此获得重现性好的质谱图是决定鉴定结果是否可靠、准确的关键因素。
GC -M S 技术主要用来分析脂类, 脂肪酸是一种可随着培养条件变化而发生改变的细胞组分, 因此分析过程中必须对培养基成分、微生物培养条件、微生物纯化、色谱柱选择等实验条件进行标准化, 否则会严重影响方法的准确度和重复性。
对于M ALD I-TO F M S 而言, 微生物培养基的选择, 基质的选择, 蛋白提取方法等诸多方面都会影响图谱的质量。近年来, 很多学者[21-23]对此做了系统研究, 并建立了各种最优化的实验条件, 结果表明如果控制好这些因素, 不同的操作人员通过同一程序可以获得高度一致、准确的图谱, 甚至不同实验室使用不同的质谱仪也能得到重现性极好的质谱图, 同时这些工作也为质谱鉴定微生物程序的标准化和自动化提供了基础。
锥形电场内的电压(cone vo ltage) 是影响ES I-M S 图谱的重要因素, 其作用主要是通过这个电场区将样品离子束(ion bea m ) 聚集并加速离子。Seetharam an 等研究结果表明[24], 图谱形状随电压变化而变化, 以球形芽胞杆菌(B. sphaericus ) 图, 处的特在较压下强度低,
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导致信息丢失, 因此适当增加样品场区电压, 可提高信噪比, 同时为获得重现性好的图谱, 还需摸索最优化的场区电压。4 结果分析
对未知微生物的分析主要通过与已知数据库进行匹配, 匹配率最高的为未知微生物的鉴定结果。目前已有多种软件系统用于数据分析, 比如德国B ruker D altonics 公司研发的B i o T yper 数据库是根据标准菌株的全细胞蛋白质的指纹图谱建立的, 该软件整合了鉴定与分类以及谱图处理的所有功能, 用户可以自定义峰平滑(s m oo thi ng) 和基线扣除(baseli ne sub trac ti on) 等谱图处理参数, 获得相应的峰列表, 也可进行聚类分析和新的数据库的建立; 英国M icrom ass 公司的M ALD I-TOF 线性飞行时间质谱仪配有60多个属, 300多种细菌的指纹谱数据库, 供用户检索使用, 可以说这些数据库的建立, 能够帮助用户更准确的分析未知微生物, 更拓展了质谱技术的应用范围。随着近年来微生物基因组学和蛋白质组学研究的日益深入, 网络上可以共享的海量的蛋白质数据为质谱鉴定细菌开辟了新途径。将未知细菌样品的质谱峰与蛋白质数据库中细菌的蛋白质分子量相匹配, 匹配率最高的即为未知细菌样品的鉴定结果。常用的数据库查询软件有:PeptIdent/M u ltiIdent 、M S-F it 、M OW SE 、P roF ound 、P ep tIdent2、M ascot 等, 常用的蛋白质组数据库有S w i ss-P ro t 、PRO SITE 等。利用软件调取细菌某一范围内全部蛋白质的分子量作为参照, 将得到的质谱峰与其相对照, 通过数理统计软件分析给出鉴定结果。
5 小结
随着新型技术如表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(surface-enhanced l aser ion ization ti m e of fli ght m ass spectrome try , SELD I) 的诞生[25, 26], 使得不经培养、不需处理直接检测临床分离样本中的病原体成为可能。该技术把基质改为以色谱原理设计的蛋白芯片, 从而增强了分离能力, 可直接对血清、脑脊液、尿液、细胞培养液等样品进行高通量、自动化检测, 其检测的灵敏度高达1f m o 。串联质谱技术的出现可以l 对样品靶上的同一样品, 数秒中就分别获得高灵敏度的多肽质量指纹图和多肽序列, 从而提供微生物更多的结构信息, 使得鉴定结果更可靠。
尽管质谱技术在微生物研究的各领域正发挥着独到的作用, 但在应用上仍存在一些限制。首先是昂贵的价格使得一般实验室难以问津; 其次是微生物样品产生的质谱图比纯化学品的质谱图复杂得多, 要用专门的软件进行分析; 诸如蛋白、多肽等生物标志物数据库的建立还应不断完善, 以便于未知样品的匹配鉴定。相信未来几年内软件的开发会使仪器更易于操作, 图谱更易于分析, 各种谱图数据库的建立和完善会使鉴定结果更准确, 更快捷。
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(下转第2617页)
中国卫生检验杂志2010年10月第20卷第10期 Ch i n ese Jou r n al ofH ealth Laborat ory Tec hno l ogy , Oct 2010; Vol 20 No 102617
U re l(A ) =U (x i ) /C=3. 7 10-3/0. 1049=3. 5 10-21. 4. 2 B 类不确定度的估算1. 4. 2. 1 称量重铬酸钾质量不确定度
电子天平的M PE=0. 1mg, 按均匀分布U 1(m) =0. 10. 058(mg) 线性 0. 2m g , 按均匀分布3
U 2(m) =0. 20. 115m g
重复性误差0. 1mg , 95%置信概率; U (m) =0. 1/1. 96=0. 05(m g) U rel(m) =U (m) /m=(0. 1152+0. 052+0. 0582) 0. 5=0. 14m g 1. 4. 2. 2 滴定体积引起的不确定度
25m l A 级滴定管的允差0. 04m , l 按均匀分布U 1(v ) =0. 043=0. 023(m l)
U rel(v ) =U 1(v) /v=0. 023/20. 25=1. 1 10-3
1. 4. 2. 3 重铬酸钾的纯度引起的不确定度
供应商标注重铬酸钾的纯度为不小于99. 98%, 按均匀分布U (w) =0. 02%1. 2 10-4
U rel(w ) =1. 2 10-4/1. 000=1. 2 10-4B 类不确定度的合成
U B =(U r e l(m) 2+U r e l(v) 2+U r e l(w) 2) 1/2=[(0. 14) 10-3) 2+(1. 2 10-4) 2]1/2=0. 141. 5 合成标准不确定度 U r e l(C) =(U 2+U 2) 1/2=[(1. 4 10-1) 2+B A
2. 9 10-2m o l/L,U 由合成标准不确定度U rel(C) =1. 4 10-1
及包含因子k=2而得。
2 有效碘浓度测定结果的不确定度评定2. 1 有效碘六次测定结果:单位(%)
0. 520. 520. 500. 520. 500. 52, 均值0. 51%
u(x i ) =s(x i ) =s(x ik ) /i =
(x ik -x i ) 2
i (n i -1) k
=[(1. 5816-9. 4864/6)/(6-1) ]0. 5=0. 01U (m ) =(0. 0352+0. 012) 0. 5=0. 0364
U c (c 1) =c 1 (0. 000122+0. 000492+0. 0232+0. 03642) 1/2
=0. 51 0. 04306=0. 022
扩展不确定度:P =95%K =2
U r e l(C) =K U r e l(C) =2 0. 022=0. 044%
3 有效碘含量测量结果及不确定度报告
测量结果为0. 51%, 测量结果的扩展不确定度0. 04%, U 由合成标准不确定度U re l (C ) =0. 022%及包含因子k=2而得。4 小结
通过对消毒剂中有效碘浓度不确定度的评定, 讨论分析其主要来源、各自在合成标准不确定度中的影响大小以及其计算方法该方法也可应用于其它容量分析, 有利于检测工作人员开展不确定度的评定, 利用不确定度结果判定本实验室的方法条件与规定方法的符合程度。
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(收稿日期:2010-04-12)
2
+(1. 1
(3. 5
10-2) 2]1/2=1. 4 10-11. 6 扩展不确定度 P =95% K =2
U rel(C ) =K U rel(C ) =2 1. 4 10-1=2. 8 10-1
U =U rel(C ) =2. 8 10-1 0. 1049=2. 9 10-2m o l/L1. 7 测量结果及不确定度报告 测定结果为0. 1049mo l/L, 测定结果的扩展不确定度U =
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(收稿日期:2010-06-24)