猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV） 简介
猪流行性腹泻病毒( porcine epidemic diarrheavirus，PEDV) 属于Ⅰ类冠状病毒，引起猪流行性腹泻病，仔猪感染此病毒后具有很高的死亡率．
PEDV 是一个正向包膜病毒，其基因组是正义单链RNA 5'端有帽结构( cap) ，3' 端有Poly( A) 尾，基因组全长为28 033bp，基因组结构如图所示．5'端的2 /3 部分编码2 个大的复制酶多聚蛋白ppla 和pplab，其余1 /3 基因组序列包括5 个ORF，编码4 个结构蛋白:纤突蛋白( S)、小包膜糖蛋白( E)、膜糖蛋白(M) 和核衣壳蛋白(N) 以及ORF3 编码的1 个非结构蛋白．
复制周期
首先S糖蛋白与受体结合,然后S糖蛋白被组织蛋白酶L剪切后活化一种融合肽,通过融合肽与细胞内成分的融合作用介导病毒侵入宿主细胞。病毒粒子通过膜融合侵入宿主细胞内,然后释放其具有感染性的基因组RNA。融合后紧密结合的病毒RNA与核衣壳蛋白N被释放进细胞质中,随后在胞质中脱衣壳,与核衣壳蛋白N紧密结合的病毒RNA基因组被释放入胞质中。 首先,ORFlab翻译成一个多聚前体蛋白,然后此前体蛋白被两种蛋白酶,木瓜样蛋白酶(PLP)和主要蛋白酶(Mpro),剪切成为对病毒复制必须的单一蛋白,经共转译处理后产生RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)和其它合成病毒RNA所必需的蛋白。RdRp以进入胞质中的基因组RNA为模板,转录产生负链RNA,然后以负链RNA为模板,合成不同长度的亚基因组mRNA(sgmRNA)和基因组RNA,复制酶、结构蛋白和辅助蛋白也在这一时期产生。N蛋白与新合成的病毒基因组RNA在细胞质中形成螺旋的核衣壳,核衣壳与固定在内质网和高尔基体之间空隙的M蛋白结合后再与E蛋白结合,E蛋白和M蛋白相互作用促使病毒粒子出芽,形成包裹的核衣壳。最后,包裹的核衣壳与在高尔基体内经糖基化等修饰的三聚体S蛋白结合,形成成熟的病毒粒子,通过胞吐作用释放到细胞外。
一． 蛋白组成
1.
2.
3.
4.
5.
6. 纤突蛋白（Spike protein，S） 小包膜蛋白（Envelope protein，E） 膜糖蛋白（Membrane protein，M） 核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，N） ORF3编码的多肽 非结构蛋白（nonstructural protein）
Nsp1
Nsp2
Nsp3
Nsp4
Nsp5
Nsp6
Nsp7
Nsp8
Nsp9
Nsp10
Nsp11
Nsp12
Nsp13
Nsp14
Nsp15
7. 依赖于RNA的非结构蛋白pol基因编码（复 制 酶 多 聚 蛋 白lab， pplab）
二． 病毒分离
方法一
病毒粗提
从无PED病史的健康母猪场取生后2 d的新生仔猪,移入人工哺乳室人工喂奶,观察2 d, 4日龄时口服华株病毒,24 h左右发病(水泻、部分猪呕吐)。扑杀病猪,取出小肠,轻轻挤去内容物,将其纵向剪开,刮取小肠粘膜混合之,用pH7. 4的0. 01mol/L PBS(含0. 15mol/LNaCl, 1mmol/L EDTA-Na2)作1∶10稀释,反复冻融3次, 7 000×g离心30m in,取上清,加PEG-6000(40% )和NaCl至终浓度分别为6%和2%, 4℃过夜后, 7 000×g离心30m in,取沉淀,以PBS悬浮12 h以上。将重悬液15 000×g离心30m in,取上清, 140 000×g 4℃超速离心120m in,以PBS重悬沉淀,重复差速离心1～2轮次。将沉淀用少量PBS充分悬浮,即得粗提病毒。
病毒精提
将病毒粗制剂进行蔗糖(15%～55% )密度梯度离心, 100 000×g离心2 h。以长弯针头自下而上吸取各带少许,电镜观察纯度,并用紫外分光光度计测定抗原蛋白浓度,用ELISA测定病毒效价。取纯度高、活性强的样品,对PBS或Tris-HCl-EDTA (TE)透析48 h,即得病毒纯化制剂,作为免疫和检测用抗原
方法二
取病死猪肠系膜淋巴结和己脱落的肠黏膜剪碎，置于无菌的研钵中，滴加5 -10倍体积 的生理盐水，反复研磨20 min，反复冻融3次后转入EP管中加入青霉素(1 000 U/mL)链霉素(300 U/mL)37℃水浴1h;之后经4 000 r/min离心30 min，取上清用0. 22 um的滤膜过滤之后用灭菌的EP管收集或直接取0. 6 mL接种在含有10%血清的MEM培养液中己长成单层的PK-15细胞，每隔6 - l0 h观察细胞病变。
三． 疫苗研发
1. 灭活疫苗（组织灭活疫苗和细胞灭活疫苗）
优点：组织灭活苗效果好，应用最为广泛，细胞灭活苗制备方便，应用也越
来越广泛
缺点：灭活苗产生完全免疫力需要 2周时间，且剂量偏大，安全性
2. 细胞弱毒苗
可应用 PEDV 细胞弱毒苗经口免疫晚期妊娠母猪，从而有效预防 PEDV 感染
3. 乳酸杆菌疫苗（S基因）
绿色环保、可食用的多功能黏膜免疫的微生态制剂疫苗。
目前，有的实验室正在开展乳酸杆菌表达 TGEV、PEDV 主要保护性抗原基因的研究 TGEV、PEDV 的 S 基因的克隆扩增工作亦已结束
4. 转基因植物疫苗（S基因）
将 PEDV的S基因转入烟草中，提取转基因植物蛋白给小鼠注射或给小鼠饲喂这种转基因植物可诱导小鼠产生全身免疫和黏膜免疫
缺点：蛋白在植物中的表达水平低、表达产物在植物中的稳定性差、转基因口服疫苗在产生免疫反应之前在胃肠道内有时被消化
5. 核酸疫苗(基因疫苗、DNA疫苗)
优点：不散毒、不返强，标记性，性质稳定，制备工艺简单和费用低，长期激发机体体液和细胞免疫反应
缺点：核酸疫苗也存在整合到宿主染色体、致突变、产生抗菌素DNA 抗体等危险性
猪流行性腹泻核酸疫苗的研究还处于起步阶段，是今后研究的热点之一。
6. TGEV 与 PEDV 二联疫苗（二联灭活苗和二联活疫苗已完成）
毒价高，后海穴接种 ( 是对常规免疫途径的突破 )，增强了免疫保护力，一次接种即可，省时、省力
7. PEDV、TGEV、RV 三 联灭活苗
海农科院畜牧兽医研究所采用猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) 和猪轮状病毒 (RV) 细胞培养物制备了三联灭活疫苗
PEDV 的基因组为不分节段的单股正链 RNA。其中 Pol 基因在病毒感染早期发挥重要作用，S 基因被认为是发展有效抵抗冠状病毒的主要靶抗原 ORF3 基因与病毒毒力有关，sM 基因在病毒的自我组装和出芽过程中起至关重要的作用，M 基因编码的M 蛋白可以作为 PEDV 基因工程疫苗的候选抗原，又鉴于冠状病毒 N 蛋白保守性强，所以利用 N 基因编码的 N 蛋白来建立 PEDV 分子生物学诊断技术具有很好的应用前景。
猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV） 简介
猪流行性腹泻病毒( porcine epidemic diarrheavirus，PEDV) 属于Ⅰ类冠状病毒，引起猪流行性腹泻病，仔猪感染此病毒后具有很高的死亡率．
PEDV 是一个正向包膜病毒，其基因组是正义单链RNA 5'端有帽结构( cap) ，3' 端有Poly( A) 尾，基因组全长为28 033bp，基因组结构如图所示．5'端的2 /3 部分编码2 个大的复制酶多聚蛋白ppla 和pplab，其余1 /3 基因组序列包括5 个ORF，编码4 个结构蛋白:纤突蛋白( S)、小包膜糖蛋白( E)、膜糖蛋白(M) 和核衣壳蛋白(N) 以及ORF3 编码的1 个非结构蛋白．
复制周期
首先S糖蛋白与受体结合,然后S糖蛋白被组织蛋白酶L剪切后活化一种融合肽,通过融合肽与细胞内成分的融合作用介导病毒侵入宿主细胞。病毒粒子通过膜融合侵入宿主细胞内,然后释放其具有感染性的基因组RNA。融合后紧密结合的病毒RNA与核衣壳蛋白N被释放进细胞质中,随后在胞质中脱衣壳,与核衣壳蛋白N紧密结合的病毒RNA基因组被释放入胞质中。 首先,ORFlab翻译成一个多聚前体蛋白,然后此前体蛋白被两种蛋白酶,木瓜样蛋白酶(PLP)和主要蛋白酶(Mpro),剪切成为对病毒复制必须的单一蛋白,经共转译处理后产生RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)和其它合成病毒RNA所必需的蛋白。RdRp以进入胞质中的基因组RNA为模板,转录产生负链RNA,然后以负链RNA为模板,合成不同长度的亚基因组mRNA(sgmRNA)和基因组RNA,复制酶、结构蛋白和辅助蛋白也在这一时期产生。N蛋白与新合成的病毒基因组RNA在细胞质中形成螺旋的核衣壳,核衣壳与固定在内质网和高尔基体之间空隙的M蛋白结合后再与E蛋白结合,E蛋白和M蛋白相互作用促使病毒粒子出芽,形成包裹的核衣壳。最后,包裹的核衣壳与在高尔基体内经糖基化等修饰的三聚体S蛋白结合,形成成熟的病毒粒子,通过胞吐作用释放到细胞外。
一． 蛋白组成
1.
2.
3.
4.
5.
6. 纤突蛋白（Spike protein，S） 小包膜蛋白（Envelope protein，E） 膜糖蛋白（Membrane protein，M） 核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，N） ORF3编码的多肽 非结构蛋白（nonstructural protein）
Nsp1
Nsp2
Nsp3
Nsp4
Nsp5
Nsp6
Nsp7
Nsp8
Nsp9
Nsp10
Nsp11
Nsp12
Nsp13
Nsp14
Nsp15
7. 依赖于RNA的非结构蛋白pol基因编码（复 制 酶 多 聚 蛋 白lab， pplab）
二． 病毒分离
方法一
病毒粗提
从无PED病史的健康母猪场取生后2 d的新生仔猪,移入人工哺乳室人工喂奶,观察2 d, 4日龄时口服华株病毒,24 h左右发病(水泻、部分猪呕吐)。扑杀病猪,取出小肠,轻轻挤去内容物,将其纵向剪开,刮取小肠粘膜混合之,用pH7. 4的0. 01mol/L PBS(含0. 15mol/LNaCl, 1mmol/L EDTA-Na2)作1∶10稀释,反复冻融3次, 7 000×g离心30m in,取上清,加PEG-6000(40% )和NaCl至终浓度分别为6%和2%, 4℃过夜后, 7 000×g离心30m in,取沉淀,以PBS悬浮12 h以上。将重悬液15 000×g离心30m in,取上清, 140 000×g 4℃超速离心120m in,以PBS重悬沉淀,重复差速离心1～2轮次。将沉淀用少量PBS充分悬浮,即得粗提病毒。
病毒精提
将病毒粗制剂进行蔗糖(15%～55% )密度梯度离心, 100 000×g离心2 h。以长弯针头自下而上吸取各带少许,电镜观察纯度,并用紫外分光光度计测定抗原蛋白浓度,用ELISA测定病毒效价。取纯度高、活性强的样品,对PBS或Tris-HCl-EDTA (TE)透析48 h,即得病毒纯化制剂,作为免疫和检测用抗原
方法二
取病死猪肠系膜淋巴结和己脱落的肠黏膜剪碎，置于无菌的研钵中，滴加5 -10倍体积 的生理盐水，反复研磨20 min，反复冻融3次后转入EP管中加入青霉素(1 000 U/mL)链霉素(300 U/mL)37℃水浴1h;之后经4 000 r/min离心30 min，取上清用0. 22 um的滤膜过滤之后用灭菌的EP管收集或直接取0. 6 mL接种在含有10%血清的MEM培养液中己长成单层的PK-15细胞，每隔6 - l0 h观察细胞病变。
三． 疫苗研发
1. 灭活疫苗（组织灭活疫苗和细胞灭活疫苗）
优点：组织灭活苗效果好，应用最为广泛，细胞灭活苗制备方便，应用也越
来越广泛
缺点：灭活苗产生完全免疫力需要 2周时间，且剂量偏大，安全性
2. 细胞弱毒苗
可应用 PEDV 细胞弱毒苗经口免疫晚期妊娠母猪，从而有效预防 PEDV 感染
3. 乳酸杆菌疫苗（S基因）
绿色环保、可食用的多功能黏膜免疫的微生态制剂疫苗。
目前，有的实验室正在开展乳酸杆菌表达 TGEV、PEDV 主要保护性抗原基因的研究 TGEV、PEDV 的 S 基因的克隆扩增工作亦已结束
4. 转基因植物疫苗（S基因）
将 PEDV的S基因转入烟草中，提取转基因植物蛋白给小鼠注射或给小鼠饲喂这种转基因植物可诱导小鼠产生全身免疫和黏膜免疫
缺点：蛋白在植物中的表达水平低、表达产物在植物中的稳定性差、转基因口服疫苗在产生免疫反应之前在胃肠道内有时被消化
5. 核酸疫苗(基因疫苗、DNA疫苗)
优点：不散毒、不返强，标记性，性质稳定，制备工艺简单和费用低，长期激发机体体液和细胞免疫反应
缺点：核酸疫苗也存在整合到宿主染色体、致突变、产生抗菌素DNA 抗体等危险性
猪流行性腹泻核酸疫苗的研究还处于起步阶段，是今后研究的热点之一。
6. TGEV 与 PEDV 二联疫苗（二联灭活苗和二联活疫苗已完成）
毒价高，后海穴接种 ( 是对常规免疫途径的突破 )，增强了免疫保护力，一次接种即可，省时、省力
7. PEDV、TGEV、RV 三 联灭活苗
海农科院畜牧兽医研究所采用猪流行性腹泻病毒 (PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV) 和猪轮状病毒 (RV) 细胞培养物制备了三联灭活疫苗
PEDV 的基因组为不分节段的单股正链 RNA。其中 Pol 基因在病毒感染早期发挥重要作用，S 基因被认为是发展有效抵抗冠状病毒的主要靶抗原 ORF3 基因与病毒毒力有关，sM 基因在病毒的自我组装和出芽过程中起至关重要的作用，M 基因编码的M 蛋白可以作为 PEDV 基因工程疫苗的候选抗原，又鉴于冠状病毒 N 蛋白保守性强，所以利用 N 基因编码的 N 蛋白来建立 PEDV 分子生物学诊断技术具有很好的应用前景。