NLRP12减轻结肠炎症和肿瘤的发生
摘要
NLRP12是细胞内NLRP 家族中的一员，可以减少炎症因子的产生，但是它减轻炎症反应的病理生理机制尚不明确。为了了解NLRP12在结肠炎和结直肠肿瘤的发生上的作用，我们对Nlrp 基因缺陷的小鼠进行了研究。我们发现Nlrp 基因缺陷的小鼠对结肠炎和结直肠肿瘤高度敏感，这种现象联合了炎症因子、化学因子和肿瘤发生因子的增殖。在Nlrp 基因缺陷的小鼠中，增强的炎症反应和结直肠肿瘤的发生是因为巨噬细胞无法减弱NF-kB 和ERK 的激活。这些结果提示NLRP12在维持肠道内稳态和防止结直肠肿瘤的发生的中具有重要作用。
介绍
炎症一般被认为是机体对感染和损伤的保护机制。然而，失控的炎症却是肿瘤发生的一个主要的风险因子。在发达国家，结直肠癌的普遍性在癌症中位列第三，是导致癌症相关死亡的第二大因素。特别是，患有炎性肠病比如克罗恩病、溃疡性结肠炎的病人发生结直肠癌的风险更高。虽然IBD 相关的结直肠癌的分子机制尚未完全明确，但是普遍认为，IBD 病人中因慢性炎症产生的细胞因子、化学因子、基质退化酶和生长因子导致了结肠表皮细胞突变成赘生性细胞。
内脏慢性炎症是由机体免疫系统和共生菌群的异常作用刺激产生的。表皮细胞和免疫细胞表面的非特异性免疫受体，如Toll 样受体，通过激活转录因子NF-kB 的下调，来刺激炎症的进程，NF-KB 是促炎因子和趋化因子产生的中心环节。然而NF-KB 信号的精密调控对使肠道菌群的相互作用维持在一个生理水平是必不可少的。因此，解除NF-KB 信号的管制可能是肠道炎症、结肠炎和结直肠癌发生的重要机制。最近的研究在分子水平证明了下调NF-KB 在维持肠道内稳态中的重要作用。例如，删除特定肠上皮细胞的NF-KB 调节器A20可导致小鼠易发结肠炎和结直肠癌，这可能是NF-KB 的产生失控的结果。相似的，TIR8/SIGGIR缺陷小鼠发生结肠炎和结直肠癌的敏感性激增，TIR8/SIGGIR是一个可以下调Toll 样受体和IL-1受体介导的NF-KB 信号的分子。 为了应对肠道菌群的作用，除了TLRs 之外，免疫系统还利用有限的、能编码模式识别受体（PRPPs ）的胚系减少炎性因子的产生。这些PRPPs 包括c 型凝集素受体（CLRs ），RIG-I 样受体（RLRs ），HIN-200蛋白和核酸结合域和低聚域受体
（NLRs ），NLTR 蛋白就是一些平台蛋白，这些平台蛋白就是以处在核苷酸捆绑和寡聚域为特点，位于细胞内的间隔内。NLRs 涉及大量的非特异性免疫信号通路，从通过NOD1和NOD2来调节MAP 激酶和NF-KB 信号通路，通过CIITA 过调制MHC Ⅱ基因，到通过NLRP1,NLRP3和NLRC4对名为炎症小体细胞的凋亡蛋白酶激活蛋白复合物的组装。不像以上所提的NLRs ，活体内NLR 蛋白NLRP12的作用还不清楚。特别是，编
码NLRP12的基因多态性还和周期性发热和过敏性皮炎的高度易感性联系在一起。起初发现NLRP12可以调节NF-KB 和细胞凋亡蛋白酶1的激活。此外，在离体组织中，NLRP12可以通过使靶向激酶IRAK1和NIK 蛋白酶体退化下调经典和非经典的NF-KB 信号。然而，最新发现，在周期性发热病人中，NLRP12的错义突变可以增加细胞凋亡蛋白酶的激活而不是抑制NF-KB 信号。因此， NLRP12介导的NF-KB 的调控通路的病理生理学关系仍未明确。在这项研究中，我们利用结肠炎和发生结直肠肿瘤的小鼠模型，来证明NLRP12调节炎症的病理生理机制。
结果
NLRP12基因缺陷小鼠建模
小鼠NLRP12和其他的NLRPs 有着同样的结构，即：氨基酸末端有一个Prin 模体，然后紧跟着一个中央核苷酸绑定结构域（NBD ），C 端存在富亮氨酸重复序列。NLRP12产物由小鼠7号染色体编码，并存在7个外显子，大约有28.3kb 的区域。我们最初研究了在大量的主要免疫细胞群中小鼠的Nlrp12基因的转录表现。Nlrp12的 mRNA表达水平最高的是中性粒细胞、T 细胞，然后是树突状细胞和巨噬细胞（图1A ）。据最近报道，NLRP12可在结肠组织表达。我们进一步证明了Nlrp2在胃肠道各部分和淋巴器官间的表达差异。Nlrp12在小肠、盲肠、结肠、脾、肝和肠系膜淋巴结中均有表达（图1B ）。为了研究NLRP12在调节内脏炎症反应的作用，通过同源重组制备Nlrp12基因缺陷的小鼠。为了达到这一目的，在目标重组时，用新霉素选择性盒子取代编码Nlrp12的Pyrin 结构域，下游效应器和蛋白功能所需的结构域（图S1B 、S1C ）。用阳性的胚胎干细胞生产嵌合子小鼠，而Nlrp2敲除的小鼠与C57BL/6进行10代回交。Nlrp2敲除小鼠在特定的无菌环境中看起来生殖能力旺盛、健康。
Nlrp12缺陷的小鼠对DSS 引起的结肠炎都是非常敏感的
为了验证NLRP12在结肠炎引起的炎症中的作用，3%的DSS 喂养Nlrp12敲除的小鼠5天，在疾病的急性期和恢复期测量体重、评估大便的硬度、直肠的出血和测量直肠的长度来监控对结肠炎的易感性。尤其是，疾病级数和临床存在大量野生型和Nlrp12缺陷的小鼠在疾病急性期没有统计学差异。然而，一旦停止DSS 水源的摄入，野生型小鼠便开始恢复，而Nlrp12缺陷的小鼠却持续存在的体重丢失、腹泻和直肠出血。大量的结肠外观病变也支持这种炎症表型。在急性期（第五天），野生型和Nlrp12缺陷小鼠的结肠表现相似（数据没有显示）。而在第9天，Nlrp12缺陷小鼠的结肠明显短于野生型小鼠（Figures 1E and1F ）。为了证明Nlrp12敲除小鼠的恢复是否真的延迟，还是Nlrp12缺陷小鼠阻止了对治疗反应而使反应在稍微后一点的时间呈现出来，在DSS 引起结肠炎的20天后再次检测Nlrp12敲除小鼠的结肠长度和重量。Nlrp12缺陷小鼠的结肠明显比野生型小鼠的短、并且重，这个结果意味着Nlrp12敲除小鼠在DSS
干预停止2周后仍存在结肠炎症(Figures S1D and S1E) 。另一个炎症表型也与此一致，它就是在20天的时候Nlrp12敲除小鼠的肠系膜淋巴结和脾在重量和体积上明显大于野生型的小鼠(Figures S1F and S1G)。
为了观察在Nlrp12缺陷小鼠中炎症持续存在的证据，在DSS 干预的第5、9、20天后对结肠组织进行免疫组化检测，和以上所述的临床参数一致的是，在疾病的恢复阶段（第9和20天）Nlrp12缺陷小鼠的结肠中的炎性细胞、溃疡和增生明显更多，而在早期阶段却没有。相似的，在第9天的时候Nlrp12缺陷小鼠结肠组织的促炎因子明显高于野生型的，但是在DSS 干预的第5天却不是。总之，这些结果说明了在肠上皮中，NLRP12在清除DSS 损伤引起的炎症反应时起着重要的作用。
NLRP12抑制结肠炎相关的肿瘤发生
对Nlrp12缺陷小鼠接触DSS 处理后持续存在内脏炎症反应的观察，提示了我们去研究Nlrp2基因在结肠炎相关肿瘤中的作用。为了这一目的，我们通过注射诱导结肠癌的发生，单剂量的氧化偶氮甲烷就可以导致DNA 甲基化，并且随后给予3个周期的
3%DSS进行干预。在实验期每日监测体重的变化，给予AOM/DSS治疗12周后观察结肠的肿瘤负荷。Nlrp12缺陷小鼠相比野生型小鼠体重明显减轻，直肠流血量也明显增多。同样，虽然肿瘤大小没有显著的差异，而Nlrp12缺陷小鼠结肠荷瘤量明显更高。野生型小鼠的肿瘤常常发生在远端结肠和结直肠，而Nlrp12缺陷小鼠的肿瘤则整个结肠区域。在Nlrp12缺陷小鼠中，与增加的荷瘤量相关的有更多的炎症反应和增生以及更多的异性增生。肿瘤和腺瘤性息肉的组织学检查发现，在实验中的所有Nlrp12缺陷小鼠均发展成高级别异性增生，其中30%可归类成腺癌。相反，在野生型小鼠中，只有20%的小鼠结肠存在高级别异性增生，并且本组腺癌的发生也不明显。总的来说，这些结果说明了在防止结肠炎相关肿瘤的发生中，NLRP12起了重要的作用。 NLRP12抑制结肠炎感应后的炎症反应
经过AOM/DSS干预后的Nlrp12基因缺陷小鼠脾脏明显肿大。因此，我们做出假设，在进行DSS 治疗时，NLRP12是通过抑制免疫细胞的激活和炎症反应避免发生结肠炎相关的肿瘤发生。为了探究这种假设的进一步细节，我们仔细检测了结肠肿瘤感应早期（注射AOM15天后）的组织病理学变化。与我们的假设相一致的是，Nlrp12基因缺陷小鼠结肠的组织损毁，黏膜水肿，炎症和增生明显多于野生型小鼠。Nlrp12基因缺陷小鼠中结肠炎症，溃疡和增生的半定量分数均明显更高。并且Nlrp12基因缺陷小鼠的结肠浸润的巨噬细胞、中性粒细胞和T 细胞都更多。通过F4/80染色显示，
NLRP12基因敲除小鼠的免疫细胞高度浸润并不局限于发生炎症的结肠，而是扩展到整个结肠。
为了进一步探究NLRP12基因敲除小鼠结肠超级炎症反应相关的免疫细胞的分型，用流式细胞学分离并检测结肠炎不同阶段时结肠固有层中的骨髓细胞。在结肠炎的早期（第五天），NLRP12基因敲除小鼠和野生型小鼠的结肠固有层中浸润最多的均为免疫细胞为中性粒细胞，而NLRP12基因敲除小鼠中的数量确实野生型的两倍。不仅如此，在晚期阶段（第9至20天），Nlrp12基因缺陷小鼠结肠中所检测的细胞(CD11b+, F4/80+, CD11c+, Gr-1+)数量明显高于野生型小鼠。在20天的时候，NLRP12基因敲除小鼠中，肠系膜淋巴和脾脏结渗出物中的骨髓细胞群存在同样具有戏剧性的增长，虽然在更早的时候这些组织的细胞数量和野生型小鼠的一致。不仅如此，未治疗的野生型和Nlrp12敲除的小鼠中粒细胞系的数量和频率是相似的（此数据未显示）。此外，在20天的时候，在Nlrp12敲除小鼠的脾和肠系膜淋巴结中，可分离出大量CD11b+的粒细胞，它们在LPS 和PMA 阳性的离子通道的刺激下可以产生IL-6和TNF-a 。而且，Nlrp12缺陷的小鼠细胞内的IL-6 和TNF-a 的平均荧光强度明显强于野生型小鼠，说明Nlrp12敲除小鼠的粒细胞可以产生更多的促炎因子。因此，这些所有的结果都说明了，NLRP12在减弱粒细胞炎症反应和DSS 介导的结肠炎中起着重要的作用。
提高Nlrp12缺陷小鼠的细胞因子和趋化因子的产生导致增生和肿瘤的发生。
相对于野生型小鼠，在缺乏NLRP12的情况下，随着提高粒细胞的浸润和超活化，Nlrp2敲除的小鼠结肠产生的促炎因子如IL-1b, IL-6, TNF-a, IL-17,和 IL-15等都明显的提高（图4C ，这数据未显示）。同样的，Nlrp12缺陷的小鼠结肠中G-CSF,
嗜酸细胞活化趋化因子, KC, IP-10, MIP-1a, MIP-1b, 和MIP2等趋化因子水平均更高。（图4C ，数据未展示）。在知道Nlrp12敲除小鼠中高的肿瘤负荷可提高促炎因子和趋化因子的产生这种情况下，我们作出假设，和NLRs 不同，NLRP12在炎症信号通路中是一个负调节因子。这种机制可能也可以解释它抗肿瘤的作用，在Nlrp12敲除的小鼠中，与肿瘤生长因子一起，增加的细胞因子和趋化因子创造了一个可以促失控的进细胞增殖和腺瘤型增生。
为了探究在Nlrp12敲除的小鼠中肿瘤生长信号下调的本质，我们首先对AOM/DSS治疗的小鼠结肠的诱导凋亡进行研究。然而，野生型和Nlrp12敲除小鼠结肠中的mRNA 和抗凋亡蛋白Bcl-XL 以及TUNEL 阳性细胞的数量都相一致。（图S4）。我们接着检测了结肠中的多种细胞因子和肿瘤生长因子，比如COX2和诱导一氧化氮合成酶，因为这些他们经常导致肿瘤的发生。相对与野生型小鼠，Nlrp12敲除小鼠街行中的促炎因子如IL-6,TNF-a 和趋化因子MIP2都有明显的升高（图5A ）。不像IL-6和TNF-a ，肿瘤抑制因子IFN-g 和它的效应器 IFN-g依赖的NOS2 转录水平都没有明显的变化
（图5A ）。相反的，我们检测到多于平常3倍水平的前列腺素合成酶COX2的mRNA ，这些mRNA 是致结肠癌的先兆。不仅如此，Nlrp12缺陷小鼠的结肠肿瘤中也存在COX2和MIP2的高表达（图5B ）。
肿瘤生长因子和粗盐因子的基因表达由经NF-kB, MAPK,STAT, 和 AKT蛋白调节的信号转导通路调控。为了验证在缺失Nlrp12基因时，这些通路和分子调控是否被解除，我们用western blotting的方法检测NF-kB, MAPK,STAT信号通路的激活。事实上，相对于野生型小鼠，在注射AOM15天后的Nlrp12缺陷小鼠结肠中的NF-KB,ERK,STAT3的激活水平明显更高。（图5C 和5D ）。用AOM/DSS治疗的Nlrp12基因缺陷小鼠的结肠增生区域中，这些炎症通道的超活性常常和肠上皮细胞的增殖相关（图5E 和5F ）。相反，和BradU 染色法检测的一样，Nlrp12基因敲除的小鼠和野生型小鼠为转化和未感染结肠增殖情况相似（数据未显示）。不仅如此，Nlrp12基因缺陷的小鼠高度增生的结肠组织周围浸润着大量的巨噬细胞（图5G ），提示在缺失NLRP12的情况下，粒细胞可以提供促进肿瘤生长的的信号。
在造血系统中，NLRP12信号对防止结肠炎和结肠炎相关的肿瘤发生非常重要。 为了确定调节NLRP12防止肿瘤发生的细胞群，我们制成4群Nlrp12的骨髓嵌合体（图6A ）。骨髓再造的8周之后，用AOM 加DSS 对小鼠进行肿瘤诱导。相对于野生型小鼠，Nlrp12缺陷小鼠体重丢失更多，提示NLRP12可能在炎性细胞和非炎性细胞中都有防止结肠炎的作用。然而，有野生型骨髓细胞的Nlrp12基因缺陷小鼠体重在后来增长到和野生型小鼠相似的水平，而骨髓中缺乏NLRP12的小鼠体重却不能增长（图6A ）。这提示着在免疫细胞中，NLRP12信号在控制结肠炎中非常重要，然而它在上皮细胞中的作用可能是多余的。与此相似的，在造血系统中缺乏Nlrp12的细胞群的肿瘤负荷明显增高，结肠明显短缩（图6B 、6C ）。另一方面，野生型小鼠和拥有野生型骨髓的Nlrp12缺陷小鼠中，肿瘤负荷和结肠长度没有明显差别（图6B 、6C ）。与此一致的是，在注射AOM15天（注射DSS10天）之后，Nlrp12缺陷小鼠的嵌合免疫细胞NF-KB 和ERK 激活增加（图6D 和6E ）。总的来说，这些结果说明Nlrp12缺陷的粒细胞，特别是巨噬细胞不能使NF-KB 和ERK 信号通道沉默，这些信号通道在结肠炎中提高细胞椅子水平，炎症反应和结肠肿瘤的发生。
NLRP12负调巨噬细胞的NF-KB 和ERK 信号。
为了收集下调Nlrp12基因缺陷巨噬细胞的NF-KB 和ERK 信号通道的证据，在不同时间用western blotting分析以LPS 刺激骨髓衍生的巨噬细胞和激活的NF-KB ，MAPK 和STST3。与前期认为Nlrp12缺陷小鼠中NF-KB 的活性增高一致的是，在LPS 暴露之后的一系列时间点，包括10min 到2h ，IKBa 的降解和磷酸化都提高了（图7A 、7B ）。不仅如此，LPS 刺激的Nlrp12缺陷的巨噬细胞有更高水平的ERP 磷酸化（图7A ）。相反， STAT3、MAP 激酶p38和JNK 的激活水平和野生型巨噬细胞的相似（图7A ，数据未显示），这证明了这些结果的特异性。Nlrp12缺陷巨噬细胞NF-KB 和ERK 活性的提高，并不是因为炎症的抑制，而是因为CasePase1的活性没有受到影响，而
casepase-1是应对炎症激活物LPS+ATP和沙门菌和李斯特菌的感染而激活的。（补图5A ）。
我们接下来回答了在Nlrp12缺陷小鼠中，NF-KB 和ERK 活性增高是局限于TLRT4的配体LPS 还是对其他类型的TLR 配体的一般反应。用TLR2配体Panm3-CSK4和TLR3配体polyI:C刺激的野生型和Nlrp12敲除的巨噬细胞显示：在Nlrp12缺陷的巨噬细胞中，两种受体的配体可诱导NF-KB 和ERK 激活的增加（图7C-7F ），这提示NLRP12在下调NF-KB 和ERK 信号通道下游的多种TLRs 中有着重要作用。和之前活体数据一样的是，在LPS 刺激的Nlrp12缺陷的巨噬细胞中，mRNA 水平（图7G ）和蛋白水平（图S5B ）的IL-6,KC,TNF-a,COX-2和MIP2的表达都有明显的提高。
之前的研究提示，NLRP12可以通过抑制IRAK1的磷酸化抑制经典NF-KB 和激活，通过诱导蛋白酶体NIK 的降解下调非经典NF-KB 的激活。为了证明在LPS 刺激的Nlrp12缺陷巨噬细胞中经典和非经典的NF-KB 信号通道是否发生改变，我们分析了非经典的NF-KB 信号中的效应器P100和经典的NF-KB 信号中的效应器P105。有趣的是，在LPS 刺激后的Nlrp12缺陷巨噬细胞中P105的磷酸化水平明显的提高（图8A ）。相反，在LPS 刺激的野生型和NLRP12敲除的巨噬细胞中，P100的磷酸化水平大致相同（图8A ）。为了弄清在LPS 刺激中，NLRP12是否抑制了经典的NF-KB 通道，我们用western blot 分析了巨噬细胞细胞质裂解物中的磷酸化P105和磷酸化P100的水平和细胞核裂解物中RelA （p65）、RelB 的水平。和图8B 显示的一样，Nlrp12敲除巨噬细胞的磷酸化的P105水平比野生型巨噬细胞明显更高。不仅如此，在LPS 刺激过的Nlrp12缺陷的巨噬细胞细胞核中，RelA 数量明显更高（图8C ）。最后，我们坚持了LPS 刺激的巨噬细胞细胞核中p56DNA 结合活性（图8D ）。LPS 刺激的Nlrp12缺陷的巨噬细胞细胞核中P56DNA 结合活性明显更高（图8D ）。虽然我们的结果不能排除NLRP12下调由TNF-a 受体超家族的CD40L 等配体引起的非经典NF-KB 信号通道的可能性，但是证实了之前研究中NLRP12强效下调TLR 介导的经典的NF-KB 信号的激活。总之，NLRP12可以通过减弱粒细胞中NF-KB 和ERK 信号抑制炎症和结肠肿瘤的发生。缺失NLRP12时，提高炎症因子和肿瘤生长的产生可导致上皮细胞的转化并促进结肠炎相关的肿瘤的发生。
讨论
我们的研究证明，通过控制微生物组成和结肠炎和结直肠肿瘤导致的NF-KB 和ERK 信号通道的激活，NLRP12在抑制促炎因子和趋化因子中起着重要的作用。结直肠肿瘤发生是导致癌症相关死亡的一个因素。炎性肠病是导致结直肠癌的一个易感因素。慢性结肠炎是由于基因易感宿主的免疫细胞透过结肠上皮细胞屏障导致免疫细胞超活化产生的。炎症进程的发起是由于NLRs 和其他PRRs 对共生菌群的反应，这些反应原本是为控制感染和修复上皮细胞的损伤而产生的。并且，紧密的炎症信号通道调节在维持免疫反应在生理水平是非常重要的。过度的炎症反应是有害的，它能启动适应性免疫，并最终发展成自身免疫。因此，对NF-KB 和其他炎症信号通道的抑制同等重要，因为它们
可以导致炎症反应。事实上，去除NF-KB 的调节因子如A20,TIR8和DUBA 可显著提高DSS 介导的结肠炎的敏感性。相似的，我们发现，因为无法下调炎症反应信号通路， Nlrp12缺陷可跳高小鼠患结肠炎和结肠炎相关型肿瘤的敏感性。
在这项研究中，我们提出在巨噬细胞中NLRP12的活性对减弱结肠炎症反应和肿瘤发生起着重要的作用。我们的观点有以下几个证据。首先，我们证明了在小鼠粒细胞间隔中NLRP12的活性对防止结肠炎相关性结肠肿瘤的发生有着重要的作用。第二，Nlrp12缺陷的巨噬细胞对TLRs 的配体高度敏感，说明NF-KB 和ERK 的激活增加。肿瘤组织中巨噬细胞密度的增加和人类癌症预后不良明显相关。越来越多的人体证据显示，人类结直肠肿瘤的活性巨噬细胞可产生肿瘤促进因子，比如IL-6, 和TNF-a ，趋化因子KC 和MIP2，基质金属蛋白酶，COX2和NOS2，和生长因子。不仅如此，NLRP12在人类和小鼠单核细胞中均有表达。研究发现，NLRP12有突变的人类巨噬细胞具有高炎症反应性，并且和有周期性发热症状的炎性疾病相关。其他TLR 如NOD2和NLR3的基因突变与自身免疫性疾病和IBD 相关。因此，在我们的结直肠肿瘤的的小鼠模型中，Nlrp12缺陷巨噬细胞的高炎症反应说明NLRP12在防止人结肠炎症反应和结直肠癌中起着重要作用。 肿瘤相关巨噬细胞产生的几种致瘤因子由NF-KB 和STAT3和ERK 信号通路调控。我们知道小鼠模型和人类结直肠肿瘤中NF-KB 的重要作用。最近关于小鼠结直肠肿瘤模型的研究证明，ERK 和STAT3的激活是肿瘤进展必不可少的部分。ERK 通过激活原癌基因cMyc 的转录调节一系列的致瘤因子，如COX2。STAT3可调节促炎生长因子IL-17和IL-23，抗凋亡蛋白Bcl-xl 和一些其他生长因子。因此，在Nlrp12缺陷的结肠组织中,NF-KB,ERK 和STAT3的高度激活强烈支持我们的表型观察，同时也揭示了Nlrp12缺陷小鼠高肿瘤发生风险的机制。
总的来说，我们的研究证明，活体内NLRP12可以通过下调NF-KB 和ERK 信号，起到抗炎和抗肿瘤发生的作用。考虑到抗炎信号在维持结肠稳态的重要作用，我们的研究在发现结肠炎和结肠肿瘤中NLRP12的抗炎功能这一领域有着巨大作用。这一研究证明了肠道炎症和肿瘤在PRRs 中的调节机制，并为今后进一步理解NLR 在防止胃肠道功能失调的作用铺平道路。这可能发现新方法来治疗这种日益严重的健康问题。
实验进程
小鼠
诱导DSS 诱导的结肠炎
诱导结直肠癌
病理学分析
原位肠道扩散实验
体外新号实验
骨髓嵌合体
固有层细胞的增殖
NF-KB 活性分析
统计分析
NLRP12减轻结肠炎症和肿瘤的发生
摘要
NLRP12是细胞内NLRP 家族中的一员，可以减少炎症因子的产生，但是它减轻炎症反应的病理生理机制尚不明确。为了了解NLRP12在结肠炎和结直肠肿瘤的发生上的作用，我们对Nlrp 基因缺陷的小鼠进行了研究。我们发现Nlrp 基因缺陷的小鼠对结肠炎和结直肠肿瘤高度敏感，这种现象联合了炎症因子、化学因子和肿瘤发生因子的增殖。在Nlrp 基因缺陷的小鼠中，增强的炎症反应和结直肠肿瘤的发生是因为巨噬细胞无法减弱NF-kB 和ERK 的激活。这些结果提示NLRP12在维持肠道内稳态和防止结直肠肿瘤的发生的中具有重要作用。
介绍
炎症一般被认为是机体对感染和损伤的保护机制。然而，失控的炎症却是肿瘤发生的一个主要的风险因子。在发达国家，结直肠癌的普遍性在癌症中位列第三，是导致癌症相关死亡的第二大因素。特别是，患有炎性肠病比如克罗恩病、溃疡性结肠炎的病人发生结直肠癌的风险更高。虽然IBD 相关的结直肠癌的分子机制尚未完全明确，但是普遍认为，IBD 病人中因慢性炎症产生的细胞因子、化学因子、基质退化酶和生长因子导致了结肠表皮细胞突变成赘生性细胞。
内脏慢性炎症是由机体免疫系统和共生菌群的异常作用刺激产生的。表皮细胞和免疫细胞表面的非特异性免疫受体，如Toll 样受体，通过激活转录因子NF-kB 的下调，来刺激炎症的进程，NF-KB 是促炎因子和趋化因子产生的中心环节。然而NF-KB 信号的精密调控对使肠道菌群的相互作用维持在一个生理水平是必不可少的。因此，解除NF-KB 信号的管制可能是肠道炎症、结肠炎和结直肠癌发生的重要机制。最近的研究在分子水平证明了下调NF-KB 在维持肠道内稳态中的重要作用。例如，删除特定肠上皮细胞的NF-KB 调节器A20可导致小鼠易发结肠炎和结直肠癌，这可能是NF-KB 的产生失控的结果。相似的，TIR8/SIGGIR缺陷小鼠发生结肠炎和结直肠癌的敏感性激增，TIR8/SIGGIR是一个可以下调Toll 样受体和IL-1受体介导的NF-KB 信号的分子。 为了应对肠道菌群的作用，除了TLRs 之外，免疫系统还利用有限的、能编码模式识别受体（PRPPs ）的胚系减少炎性因子的产生。这些PRPPs 包括c 型凝集素受体（CLRs ），RIG-I 样受体（RLRs ），HIN-200蛋白和核酸结合域和低聚域受体
（NLRs ），NLTR 蛋白就是一些平台蛋白，这些平台蛋白就是以处在核苷酸捆绑和寡聚域为特点，位于细胞内的间隔内。NLRs 涉及大量的非特异性免疫信号通路，从通过NOD1和NOD2来调节MAP 激酶和NF-KB 信号通路，通过CIITA 过调制MHC Ⅱ基因，到通过NLRP1,NLRP3和NLRC4对名为炎症小体细胞的凋亡蛋白酶激活蛋白复合物的组装。不像以上所提的NLRs ，活体内NLR 蛋白NLRP12的作用还不清楚。特别是，编
码NLRP12的基因多态性还和周期性发热和过敏性皮炎的高度易感性联系在一起。起初发现NLRP12可以调节NF-KB 和细胞凋亡蛋白酶1的激活。此外，在离体组织中，NLRP12可以通过使靶向激酶IRAK1和NIK 蛋白酶体退化下调经典和非经典的NF-KB 信号。然而，最新发现，在周期性发热病人中，NLRP12的错义突变可以增加细胞凋亡蛋白酶的激活而不是抑制NF-KB 信号。因此， NLRP12介导的NF-KB 的调控通路的病理生理学关系仍未明确。在这项研究中，我们利用结肠炎和发生结直肠肿瘤的小鼠模型，来证明NLRP12调节炎症的病理生理机制。
结果
NLRP12基因缺陷小鼠建模
小鼠NLRP12和其他的NLRPs 有着同样的结构，即：氨基酸末端有一个Prin 模体，然后紧跟着一个中央核苷酸绑定结构域（NBD ），C 端存在富亮氨酸重复序列。NLRP12产物由小鼠7号染色体编码，并存在7个外显子，大约有28.3kb 的区域。我们最初研究了在大量的主要免疫细胞群中小鼠的Nlrp12基因的转录表现。Nlrp12的 mRNA表达水平最高的是中性粒细胞、T 细胞，然后是树突状细胞和巨噬细胞（图1A ）。据最近报道，NLRP12可在结肠组织表达。我们进一步证明了Nlrp2在胃肠道各部分和淋巴器官间的表达差异。Nlrp12在小肠、盲肠、结肠、脾、肝和肠系膜淋巴结中均有表达（图1B ）。为了研究NLRP12在调节内脏炎症反应的作用，通过同源重组制备Nlrp12基因缺陷的小鼠。为了达到这一目的，在目标重组时，用新霉素选择性盒子取代编码Nlrp12的Pyrin 结构域，下游效应器和蛋白功能所需的结构域（图S1B 、S1C ）。用阳性的胚胎干细胞生产嵌合子小鼠，而Nlrp2敲除的小鼠与C57BL/6进行10代回交。Nlrp2敲除小鼠在特定的无菌环境中看起来生殖能力旺盛、健康。
Nlrp12缺陷的小鼠对DSS 引起的结肠炎都是非常敏感的
为了验证NLRP12在结肠炎引起的炎症中的作用，3%的DSS 喂养Nlrp12敲除的小鼠5天，在疾病的急性期和恢复期测量体重、评估大便的硬度、直肠的出血和测量直肠的长度来监控对结肠炎的易感性。尤其是，疾病级数和临床存在大量野生型和Nlrp12缺陷的小鼠在疾病急性期没有统计学差异。然而，一旦停止DSS 水源的摄入，野生型小鼠便开始恢复，而Nlrp12缺陷的小鼠却持续存在的体重丢失、腹泻和直肠出血。大量的结肠外观病变也支持这种炎症表型。在急性期（第五天），野生型和Nlrp12缺陷小鼠的结肠表现相似（数据没有显示）。而在第9天，Nlrp12缺陷小鼠的结肠明显短于野生型小鼠（Figures 1E and1F ）。为了证明Nlrp12敲除小鼠的恢复是否真的延迟，还是Nlrp12缺陷小鼠阻止了对治疗反应而使反应在稍微后一点的时间呈现出来，在DSS 引起结肠炎的20天后再次检测Nlrp12敲除小鼠的结肠长度和重量。Nlrp12缺陷小鼠的结肠明显比野生型小鼠的短、并且重，这个结果意味着Nlrp12敲除小鼠在DSS
干预停止2周后仍存在结肠炎症(Figures S1D and S1E) 。另一个炎症表型也与此一致，它就是在20天的时候Nlrp12敲除小鼠的肠系膜淋巴结和脾在重量和体积上明显大于野生型的小鼠(Figures S1F and S1G)。
为了观察在Nlrp12缺陷小鼠中炎症持续存在的证据，在DSS 干预的第5、9、20天后对结肠组织进行免疫组化检测，和以上所述的临床参数一致的是，在疾病的恢复阶段（第9和20天）Nlrp12缺陷小鼠的结肠中的炎性细胞、溃疡和增生明显更多，而在早期阶段却没有。相似的，在第9天的时候Nlrp12缺陷小鼠结肠组织的促炎因子明显高于野生型的，但是在DSS 干预的第5天却不是。总之，这些结果说明了在肠上皮中，NLRP12在清除DSS 损伤引起的炎症反应时起着重要的作用。
NLRP12抑制结肠炎相关的肿瘤发生
对Nlrp12缺陷小鼠接触DSS 处理后持续存在内脏炎症反应的观察，提示了我们去研究Nlrp2基因在结肠炎相关肿瘤中的作用。为了这一目的，我们通过注射诱导结肠癌的发生，单剂量的氧化偶氮甲烷就可以导致DNA 甲基化，并且随后给予3个周期的
3%DSS进行干预。在实验期每日监测体重的变化，给予AOM/DSS治疗12周后观察结肠的肿瘤负荷。Nlrp12缺陷小鼠相比野生型小鼠体重明显减轻，直肠流血量也明显增多。同样，虽然肿瘤大小没有显著的差异，而Nlrp12缺陷小鼠结肠荷瘤量明显更高。野生型小鼠的肿瘤常常发生在远端结肠和结直肠，而Nlrp12缺陷小鼠的肿瘤则整个结肠区域。在Nlrp12缺陷小鼠中，与增加的荷瘤量相关的有更多的炎症反应和增生以及更多的异性增生。肿瘤和腺瘤性息肉的组织学检查发现，在实验中的所有Nlrp12缺陷小鼠均发展成高级别异性增生，其中30%可归类成腺癌。相反，在野生型小鼠中，只有20%的小鼠结肠存在高级别异性增生，并且本组腺癌的发生也不明显。总的来说，这些结果说明了在防止结肠炎相关肿瘤的发生中，NLRP12起了重要的作用。 NLRP12抑制结肠炎感应后的炎症反应
经过AOM/DSS干预后的Nlrp12基因缺陷小鼠脾脏明显肿大。因此，我们做出假设，在进行DSS 治疗时，NLRP12是通过抑制免疫细胞的激活和炎症反应避免发生结肠炎相关的肿瘤发生。为了探究这种假设的进一步细节，我们仔细检测了结肠肿瘤感应早期（注射AOM15天后）的组织病理学变化。与我们的假设相一致的是，Nlrp12基因缺陷小鼠结肠的组织损毁，黏膜水肿，炎症和增生明显多于野生型小鼠。Nlrp12基因缺陷小鼠中结肠炎症，溃疡和增生的半定量分数均明显更高。并且Nlrp12基因缺陷小鼠的结肠浸润的巨噬细胞、中性粒细胞和T 细胞都更多。通过F4/80染色显示，
NLRP12基因敲除小鼠的免疫细胞高度浸润并不局限于发生炎症的结肠，而是扩展到整个结肠。
为了进一步探究NLRP12基因敲除小鼠结肠超级炎症反应相关的免疫细胞的分型，用流式细胞学分离并检测结肠炎不同阶段时结肠固有层中的骨髓细胞。在结肠炎的早期（第五天），NLRP12基因敲除小鼠和野生型小鼠的结肠固有层中浸润最多的均为免疫细胞为中性粒细胞，而NLRP12基因敲除小鼠中的数量确实野生型的两倍。不仅如此，在晚期阶段（第9至20天），Nlrp12基因缺陷小鼠结肠中所检测的细胞(CD11b+, F4/80+, CD11c+, Gr-1+)数量明显高于野生型小鼠。在20天的时候，NLRP12基因敲除小鼠中，肠系膜淋巴和脾脏结渗出物中的骨髓细胞群存在同样具有戏剧性的增长，虽然在更早的时候这些组织的细胞数量和野生型小鼠的一致。不仅如此，未治疗的野生型和Nlrp12敲除的小鼠中粒细胞系的数量和频率是相似的（此数据未显示）。此外，在20天的时候，在Nlrp12敲除小鼠的脾和肠系膜淋巴结中，可分离出大量CD11b+的粒细胞，它们在LPS 和PMA 阳性的离子通道的刺激下可以产生IL-6和TNF-a 。而且，Nlrp12缺陷的小鼠细胞内的IL-6 和TNF-a 的平均荧光强度明显强于野生型小鼠，说明Nlrp12敲除小鼠的粒细胞可以产生更多的促炎因子。因此，这些所有的结果都说明了，NLRP12在减弱粒细胞炎症反应和DSS 介导的结肠炎中起着重要的作用。
提高Nlrp12缺陷小鼠的细胞因子和趋化因子的产生导致增生和肿瘤的发生。
相对于野生型小鼠，在缺乏NLRP12的情况下，随着提高粒细胞的浸润和超活化，Nlrp2敲除的小鼠结肠产生的促炎因子如IL-1b, IL-6, TNF-a, IL-17,和 IL-15等都明显的提高（图4C ，这数据未显示）。同样的，Nlrp12缺陷的小鼠结肠中G-CSF,
嗜酸细胞活化趋化因子, KC, IP-10, MIP-1a, MIP-1b, 和MIP2等趋化因子水平均更高。（图4C ，数据未展示）。在知道Nlrp12敲除小鼠中高的肿瘤负荷可提高促炎因子和趋化因子的产生这种情况下，我们作出假设，和NLRs 不同，NLRP12在炎症信号通路中是一个负调节因子。这种机制可能也可以解释它抗肿瘤的作用，在Nlrp12敲除的小鼠中，与肿瘤生长因子一起，增加的细胞因子和趋化因子创造了一个可以促失控的进细胞增殖和腺瘤型增生。
为了探究在Nlrp12敲除的小鼠中肿瘤生长信号下调的本质，我们首先对AOM/DSS治疗的小鼠结肠的诱导凋亡进行研究。然而，野生型和Nlrp12敲除小鼠结肠中的mRNA 和抗凋亡蛋白Bcl-XL 以及TUNEL 阳性细胞的数量都相一致。（图S4）。我们接着检测了结肠中的多种细胞因子和肿瘤生长因子，比如COX2和诱导一氧化氮合成酶，因为这些他们经常导致肿瘤的发生。相对与野生型小鼠，Nlrp12敲除小鼠街行中的促炎因子如IL-6,TNF-a 和趋化因子MIP2都有明显的升高（图5A ）。不像IL-6和TNF-a ，肿瘤抑制因子IFN-g 和它的效应器 IFN-g依赖的NOS2 转录水平都没有明显的变化
（图5A ）。相反的，我们检测到多于平常3倍水平的前列腺素合成酶COX2的mRNA ，这些mRNA 是致结肠癌的先兆。不仅如此，Nlrp12缺陷小鼠的结肠肿瘤中也存在COX2和MIP2的高表达（图5B ）。
肿瘤生长因子和粗盐因子的基因表达由经NF-kB, MAPK,STAT, 和 AKT蛋白调节的信号转导通路调控。为了验证在缺失Nlrp12基因时，这些通路和分子调控是否被解除，我们用western blotting的方法检测NF-kB, MAPK,STAT信号通路的激活。事实上，相对于野生型小鼠，在注射AOM15天后的Nlrp12缺陷小鼠结肠中的NF-KB,ERK,STAT3的激活水平明显更高。（图5C 和5D ）。用AOM/DSS治疗的Nlrp12基因缺陷小鼠的结肠增生区域中，这些炎症通道的超活性常常和肠上皮细胞的增殖相关（图5E 和5F ）。相反，和BradU 染色法检测的一样，Nlrp12基因敲除的小鼠和野生型小鼠为转化和未感染结肠增殖情况相似（数据未显示）。不仅如此，Nlrp12基因缺陷的小鼠高度增生的结肠组织周围浸润着大量的巨噬细胞（图5G ），提示在缺失NLRP12的情况下，粒细胞可以提供促进肿瘤生长的的信号。
在造血系统中，NLRP12信号对防止结肠炎和结肠炎相关的肿瘤发生非常重要。 为了确定调节NLRP12防止肿瘤发生的细胞群，我们制成4群Nlrp12的骨髓嵌合体（图6A ）。骨髓再造的8周之后，用AOM 加DSS 对小鼠进行肿瘤诱导。相对于野生型小鼠，Nlrp12缺陷小鼠体重丢失更多，提示NLRP12可能在炎性细胞和非炎性细胞中都有防止结肠炎的作用。然而，有野生型骨髓细胞的Nlrp12基因缺陷小鼠体重在后来增长到和野生型小鼠相似的水平，而骨髓中缺乏NLRP12的小鼠体重却不能增长（图6A ）。这提示着在免疫细胞中，NLRP12信号在控制结肠炎中非常重要，然而它在上皮细胞中的作用可能是多余的。与此相似的，在造血系统中缺乏Nlrp12的细胞群的肿瘤负荷明显增高，结肠明显短缩（图6B 、6C ）。另一方面，野生型小鼠和拥有野生型骨髓的Nlrp12缺陷小鼠中，肿瘤负荷和结肠长度没有明显差别（图6B 、6C ）。与此一致的是，在注射AOM15天（注射DSS10天）之后，Nlrp12缺陷小鼠的嵌合免疫细胞NF-KB 和ERK 激活增加（图6D 和6E ）。总的来说，这些结果说明Nlrp12缺陷的粒细胞，特别是巨噬细胞不能使NF-KB 和ERK 信号通道沉默，这些信号通道在结肠炎中提高细胞椅子水平，炎症反应和结肠肿瘤的发生。
NLRP12负调巨噬细胞的NF-KB 和ERK 信号。
为了收集下调Nlrp12基因缺陷巨噬细胞的NF-KB 和ERK 信号通道的证据，在不同时间用western blotting分析以LPS 刺激骨髓衍生的巨噬细胞和激活的NF-KB ，MAPK 和STST3。与前期认为Nlrp12缺陷小鼠中NF-KB 的活性增高一致的是，在LPS 暴露之后的一系列时间点，包括10min 到2h ，IKBa 的降解和磷酸化都提高了（图7A 、7B ）。不仅如此，LPS 刺激的Nlrp12缺陷的巨噬细胞有更高水平的ERP 磷酸化（图7A ）。相反， STAT3、MAP 激酶p38和JNK 的激活水平和野生型巨噬细胞的相似（图7A ，数据未显示），这证明了这些结果的特异性。Nlrp12缺陷巨噬细胞NF-KB 和ERK 活性的提高，并不是因为炎症的抑制，而是因为CasePase1的活性没有受到影响，而
casepase-1是应对炎症激活物LPS+ATP和沙门菌和李斯特菌的感染而激活的。（补图5A ）。
我们接下来回答了在Nlrp12缺陷小鼠中，NF-KB 和ERK 活性增高是局限于TLRT4的配体LPS 还是对其他类型的TLR 配体的一般反应。用TLR2配体Panm3-CSK4和TLR3配体polyI:C刺激的野生型和Nlrp12敲除的巨噬细胞显示：在Nlrp12缺陷的巨噬细胞中，两种受体的配体可诱导NF-KB 和ERK 激活的增加（图7C-7F ），这提示NLRP12在下调NF-KB 和ERK 信号通道下游的多种TLRs 中有着重要作用。和之前活体数据一样的是，在LPS 刺激的Nlrp12缺陷的巨噬细胞中，mRNA 水平（图7G ）和蛋白水平（图S5B ）的IL-6,KC,TNF-a,COX-2和MIP2的表达都有明显的提高。
之前的研究提示，NLRP12可以通过抑制IRAK1的磷酸化抑制经典NF-KB 和激活，通过诱导蛋白酶体NIK 的降解下调非经典NF-KB 的激活。为了证明在LPS 刺激的Nlrp12缺陷巨噬细胞中经典和非经典的NF-KB 信号通道是否发生改变，我们分析了非经典的NF-KB 信号中的效应器P100和经典的NF-KB 信号中的效应器P105。有趣的是，在LPS 刺激后的Nlrp12缺陷巨噬细胞中P105的磷酸化水平明显的提高（图8A ）。相反，在LPS 刺激的野生型和NLRP12敲除的巨噬细胞中，P100的磷酸化水平大致相同（图8A ）。为了弄清在LPS 刺激中，NLRP12是否抑制了经典的NF-KB 通道，我们用western blot 分析了巨噬细胞细胞质裂解物中的磷酸化P105和磷酸化P100的水平和细胞核裂解物中RelA （p65）、RelB 的水平。和图8B 显示的一样，Nlrp12敲除巨噬细胞的磷酸化的P105水平比野生型巨噬细胞明显更高。不仅如此，在LPS 刺激过的Nlrp12缺陷的巨噬细胞细胞核中，RelA 数量明显更高（图8C ）。最后，我们坚持了LPS 刺激的巨噬细胞细胞核中p56DNA 结合活性（图8D ）。LPS 刺激的Nlrp12缺陷的巨噬细胞细胞核中P56DNA 结合活性明显更高（图8D ）。虽然我们的结果不能排除NLRP12下调由TNF-a 受体超家族的CD40L 等配体引起的非经典NF-KB 信号通道的可能性，但是证实了之前研究中NLRP12强效下调TLR 介导的经典的NF-KB 信号的激活。总之，NLRP12可以通过减弱粒细胞中NF-KB 和ERK 信号抑制炎症和结肠肿瘤的发生。缺失NLRP12时，提高炎症因子和肿瘤生长的产生可导致上皮细胞的转化并促进结肠炎相关的肿瘤的发生。
讨论
我们的研究证明，通过控制微生物组成和结肠炎和结直肠肿瘤导致的NF-KB 和ERK 信号通道的激活，NLRP12在抑制促炎因子和趋化因子中起着重要的作用。结直肠肿瘤发生是导致癌症相关死亡的一个因素。炎性肠病是导致结直肠癌的一个易感因素。慢性结肠炎是由于基因易感宿主的免疫细胞透过结肠上皮细胞屏障导致免疫细胞超活化产生的。炎症进程的发起是由于NLRs 和其他PRRs 对共生菌群的反应，这些反应原本是为控制感染和修复上皮细胞的损伤而产生的。并且，紧密的炎症信号通道调节在维持免疫反应在生理水平是非常重要的。过度的炎症反应是有害的，它能启动适应性免疫，并最终发展成自身免疫。因此，对NF-KB 和其他炎症信号通道的抑制同等重要，因为它们
可以导致炎症反应。事实上，去除NF-KB 的调节因子如A20,TIR8和DUBA 可显著提高DSS 介导的结肠炎的敏感性。相似的，我们发现，因为无法下调炎症反应信号通路， Nlrp12缺陷可跳高小鼠患结肠炎和结肠炎相关型肿瘤的敏感性。
在这项研究中，我们提出在巨噬细胞中NLRP12的活性对减弱结肠炎症反应和肿瘤发生起着重要的作用。我们的观点有以下几个证据。首先，我们证明了在小鼠粒细胞间隔中NLRP12的活性对防止结肠炎相关性结肠肿瘤的发生有着重要的作用。第二，Nlrp12缺陷的巨噬细胞对TLRs 的配体高度敏感，说明NF-KB 和ERK 的激活增加。肿瘤组织中巨噬细胞密度的增加和人类癌症预后不良明显相关。越来越多的人体证据显示，人类结直肠肿瘤的活性巨噬细胞可产生肿瘤促进因子，比如IL-6, 和TNF-a ，趋化因子KC 和MIP2，基质金属蛋白酶，COX2和NOS2，和生长因子。不仅如此，NLRP12在人类和小鼠单核细胞中均有表达。研究发现，NLRP12有突变的人类巨噬细胞具有高炎症反应性，并且和有周期性发热症状的炎性疾病相关。其他TLR 如NOD2和NLR3的基因突变与自身免疫性疾病和IBD 相关。因此，在我们的结直肠肿瘤的的小鼠模型中，Nlrp12缺陷巨噬细胞的高炎症反应说明NLRP12在防止人结肠炎症反应和结直肠癌中起着重要作用。 肿瘤相关巨噬细胞产生的几种致瘤因子由NF-KB 和STAT3和ERK 信号通路调控。我们知道小鼠模型和人类结直肠肿瘤中NF-KB 的重要作用。最近关于小鼠结直肠肿瘤模型的研究证明，ERK 和STAT3的激活是肿瘤进展必不可少的部分。ERK 通过激活原癌基因cMyc 的转录调节一系列的致瘤因子，如COX2。STAT3可调节促炎生长因子IL-17和IL-23，抗凋亡蛋白Bcl-xl 和一些其他生长因子。因此，在Nlrp12缺陷的结肠组织中,NF-KB,ERK 和STAT3的高度激活强烈支持我们的表型观察，同时也揭示了Nlrp12缺陷小鼠高肿瘤发生风险的机制。
总的来说，我们的研究证明，活体内NLRP12可以通过下调NF-KB 和ERK 信号，起到抗炎和抗肿瘤发生的作用。考虑到抗炎信号在维持结肠稳态的重要作用，我们的研究在发现结肠炎和结肠肿瘤中NLRP12的抗炎功能这一领域有着巨大作用。这一研究证明了肠道炎症和肿瘤在PRRs 中的调节机制，并为今后进一步理解NLR 在防止胃肠道功能失调的作用铺平道路。这可能发现新方法来治疗这种日益严重的健康问题。
实验进程
小鼠
诱导DSS 诱导的结肠炎
诱导结直肠癌
病理学分析
原位肠道扩散实验
体外新号实验
骨髓嵌合体
固有层细胞的增殖
NF-KB 活性分析
统计分析