实验四
酵母菌的形态观察, 死活细胞鉴别, 微生物测量技术,显微镜直接计数法
日期 11月10号 星期三90节
一、实验目的
1．观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。
2．了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造及使用原理，掌握测定微生物细胞大小的方法 . 3. 了解血球计数板的构造和使用方法,学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。 二、实验原理
染色：美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。
测量：微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体微小，只能在显微镜下测量。用于测量微主物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把 10 mm长度刻成 100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间物像重叠)用于测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测 微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
计数：每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。
在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。
下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数 因1ml=1cm3=1000mm3， 三、实验仪器
1 菌种: 培养48h的酵母菌．
２ 染色液和试剂：0.05%、0.1%吕氏碱性美蓝．
3 器材：显微镜、血球计数板、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、吸水纸、计数器、移液器、擦镜纸。 四、实验方法 １目微尺的校正：
把Olympus目镜的下部罗圈旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，
再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长10μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的实际长度。
用同法分别校正在低倍镜下和高倍镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 ２ 酵母菌形态观察及死活细胞鉴别
１）制片：在一个载玻片上分别滴0.05%、0.1%吕氏碱性美蓝各1滴，无菌操作取酵母菌，在染液中分别混匀，盖上盖玻片，静置5分钟。
２）镜检：在显微镜高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽生殖方式。
３）计数死活细胞：死细胞为染为兰色的细胞，活细胞为无色细胞，分别计数，并隔5-15分钟检测一下死活细胞数，比较其死活细胞的比例变化。 ３ 细胞大小的测定：
移去镜台测微尺，换上酵母菌染色片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测徽尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10～20个菌体，才能代表该菌的大小。待测微生物需用培养至对数生长期的菌体进行测定。
４ 显微镜直接计数酵母菌液浓度：
１）酵母菌液的制备：无菌操作用接种环从斜面中取一环酵母菌，置于无菌水中振荡制成菌悬液．
２）加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的吸头将酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。
３）显微镜计数：静置5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。 五、实验结果
１ 绘图说明酵母菌形态及出芽方式。
２ 目镜测微尺校正结果（填表）．
３ 酵母菌大小测定结果（填表）．
六 思考题
１为什么目测尺使用前必须校正？
答：目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把 10 mm长度刻成 100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间物像重叠)用于测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测 微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 ２不同美蓝浓度和作用时间对酵母菌死活细胞的比例有何影响？ 答：0.05%的美蓝溶液中酵母菌死活细胞的比例大约为1：4
0.1%的美蓝溶液中酵母菌死活细胞的比例大约为2：3
由数据可知，高浓度美兰溶液（0.1%）第一组死活比例，死细胞占总体的33.7%
第二组死活比例，死细胞占总体的45.1% 第三组死活比例，死细胞占总体的71.1% 0.05%的美兰溶液（低浓度） 第一组死活比例，死细胞占总体的9.6% 第二组死活比例，死细胞占总体的21.1% 第三组死活比例，死细胞占总体的31.3%
３根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量少误差，力求准确？
答：1、向计数室中加菌悬液时产生气泡 避免方法：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的吸头将酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室。
2、显微镜光线的强弱
调整光强，转动反光镜或调整旋钮 3、血球技术板上有污物
避免方法：先对计数板进行镜检，若有污物，则先清洗，吹干后才能计数 4、取样时菌液不均匀
避免方法：取样时先摇匀菌液。最好用振荡器振荡。
实验四
酵母菌的形态观察, 死活细胞鉴别, 微生物测量技术,显微镜直接计数法
日期 11月10号 星期三90节
一、实验目的
1．观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。
2．了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造及使用原理，掌握测定微生物细胞大小的方法 . 3. 了解血球计数板的构造和使用方法,学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。 二、实验原理
染色：美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。
测量：微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体微小，只能在显微镜下测量。用于测量微主物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把 10 mm长度刻成 100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间物像重叠)用于测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测 微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
计数：每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。
在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。
下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数 因1ml=1cm3=1000mm3， 三、实验仪器
1 菌种: 培养48h的酵母菌．
２ 染色液和试剂：0.05%、0.1%吕氏碱性美蓝．
3 器材：显微镜、血球计数板、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、吸水纸、计数器、移液器、擦镜纸。 四、实验方法 １目微尺的校正：
把Olympus目镜的下部罗圈旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，
再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长10μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的实际长度。
用同法分别校正在低倍镜下和高倍镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 ２ 酵母菌形态观察及死活细胞鉴别
１）制片：在一个载玻片上分别滴0.05%、0.1%吕氏碱性美蓝各1滴，无菌操作取酵母菌，在染液中分别混匀，盖上盖玻片，静置5分钟。
２）镜检：在显微镜高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽生殖方式。
３）计数死活细胞：死细胞为染为兰色的细胞，活细胞为无色细胞，分别计数，并隔5-15分钟检测一下死活细胞数，比较其死活细胞的比例变化。 ３ 细胞大小的测定：
移去镜台测微尺，换上酵母菌染色片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测徽尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10～20个菌体，才能代表该菌的大小。待测微生物需用培养至对数生长期的菌体进行测定。
４ 显微镜直接计数酵母菌液浓度：
１）酵母菌液的制备：无菌操作用接种环从斜面中取一环酵母菌，置于无菌水中振荡制成菌悬液．
２）加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的吸头将酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。
３）显微镜计数：静置5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。 五、实验结果
１ 绘图说明酵母菌形态及出芽方式。
２ 目镜测微尺校正结果（填表）．
３ 酵母菌大小测定结果（填表）．
六 思考题
１为什么目测尺使用前必须校正？
答：目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把 10 mm长度刻成 100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间物像重叠)用于测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测 微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 ２不同美蓝浓度和作用时间对酵母菌死活细胞的比例有何影响？ 答：0.05%的美蓝溶液中酵母菌死活细胞的比例大约为1：4
0.1%的美蓝溶液中酵母菌死活细胞的比例大约为2：3
由数据可知，高浓度美兰溶液（0.1%）第一组死活比例，死细胞占总体的33.7%
第二组死活比例，死细胞占总体的45.1% 第三组死活比例，死细胞占总体的71.1% 0.05%的美兰溶液（低浓度） 第一组死活比例，死细胞占总体的9.6% 第二组死活比例，死细胞占总体的21.1% 第三组死活比例，死细胞占总体的31.3%
３根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量少误差，力求准确？
答：1、向计数室中加菌悬液时产生气泡 避免方法：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的吸头将酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室。
2、显微镜光线的强弱
调整光强，转动反光镜或调整旋钮 3、血球技术板上有污物
避免方法：先对计数板进行镜检，若有污物，则先清洗，吹干后才能计数 4、取样时菌液不均匀
避免方法：取样时先摇匀菌液。最好用振荡器振荡。