第二篇细胞的遗传物质

第二篇 细胞的遗传物质

第一章 细胞内核酸的提取

人类基因组计划的完成以及后基因组学研究的不断深入，标志着现代医学的发展已逐步进入“基因组医学”的时代。疾病分子机制的研究也将为包括疾病的分子诊断、分子治疗在内容的“分子医学”的发展提供动力。

核酸是遗传信息以及基因表达的物质基础，是重要的生物信息分子,也是分子生物学研究的主要对象。它与生命的正常活动，如种族遗传、生长等有密切联系；它与生命的异常活动，如肿瘤的发生、放射损伤以及抗癌、抗病毒药物的作用机理等也有密切的关系。因此，核酸是现代生命科学体系中重点研究的课题之一。核酸分为DNA和RNA两大类。核酸的提取是分子生物学实验技术中基本的操作之一，

第一节 真核细胞基因组DNA的分离与纯化

DNA主要在细胞核内，核外也有少量称为核外基因的线粒体DNA等。真核细胞的DNA分子比原核生物的DNA分子大得多，并且以核蛋白体形式存在于细胞中。真核细胞基因组DNA提取的主要步骤包括裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是去除体系中的其它成分，如蛋白质、多糖、脂类及其它不需要的核酸（RNA）等生物大分子的过程。

一、裂解

细胞破碎的手段常为超声波、组织匀浆、液氮破碎以及包埋组织的超薄切片等方法。为了获得大量完整的DNA，一般采用裂解液等温和的方法破碎细胞。

裂解液一般都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。去污剂的作用是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及去除与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。盐的作用，一方面提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，另一方面可抑制核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 。裂解体系中还可以加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。

二、纯化

根据DNA本身的特征使用不同方法进行核酸提纯。

三、DNA提取的实验步骤

（一）材料与设备

1.试剂 消化液（100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）；pH8.0，25mmol/L EDTA；PBS；TES饱和酚；氯仿；异戊醇； 95%乙

醇溶液；70%乙醇溶液；TE；0.1%SDS；1μg/ml RNA酶；

2.仪器 培养皿、培养瓶、微量离心管、滴管；刻度吸管；加样器；枪头；离心机、液氮罐、组织匀浆器、恒温培养箱

（二）主要步骤

1.如果材料为组织块，可将组织块（约200~1000mg）剪碎后，置入液氮中。随后用冰冷的组织捣碎器捣碎，每100mg组织加入1.2ml消化液（100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）。

2.如果材料是悬浮细胞，收集细胞于微量离心管中，500g×5min离心；如果材料是贴壁细胞，弃上清后，胰酶消化收集细胞，500g×5min离心。随后用冰冷的PBS缓冲液洗涤细胞，500g×5min离心，弃上清，重复一次，并用一倍体积的消化液重悬细胞。

3.组织或细胞混悬液移入带盖的离心管中，50℃消化12～18h。

4.冷却至4℃，加等体积15 mo1／L TES饱和酚。

5.轻轻振摇，使水相和酚层充分混匀。

6. 4℃5000rpm～8000rpm离心15min～20min。此时DNA溶液在上层，酚位于下层，中间是变性蛋白层。

7.用吸管小心吸取上层粘稠溶液，移至另一离心管。注意尽量不要带出中间蛋白层。

8. DNA溶液再加等体积15 mo1／L TES饱和酚抽提一次，按6、7离心并吸至另一离心管。

9.加等体积氯仿/异戊醇按步骤（5、6）抽提，离心5min。

10.吸出DNA溶液后，再步骤（9）抽提一次。

11.用吸管将DNA溶液移至Eppendorf中，冰浴至0℃。

12.加2.5倍体积95%冷乙醇震摇，可见DNA白色沉淀析出。

13.用75%冷乙醇清洗3～4次。

14.室温干燥或冷冻干燥DNA。

15.加适量TE溶液溶解DNA。

四、结果鉴定

1．紫外分光光度计检测：可检测DNA的纯度和含量。一般而言核酸在260nm时吸光度最大，而蛋白质在280nm时吸光度最大。取2μl DNA溶解液，适量稀释，紫外分光光度计测定260nm、280nmOD值，计算OD260/OD280比值，比值在1.72.0:1之间，说明DNA纯度可。在260nm处，1OD双链DNA的浓度为50g /ml，据此可计算DNA的浓度（g /ml）=50×(OD260) × 稀释倍数。

2．电泳检测：可检测核酸的完整性和大小。取2μl DNA溶解液与适量上样缓冲液混合后，经1%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后紫外光下观察，拍照；如果观察到一条清晰的电泳带，无明显的拖尾，说明DNA完整性好。

第二节 真核细胞总RNA的分离提取

RNA是基因表达产物，由以下几类分子组成，rRNA（占细胞总RNA的80%～85%）、tRNA

和核内小分子RNA（占10～15%）、mRNA（占1～5%）。其中mRNA是分子生物学的主要研究对象，分离制备mRNA是克隆基因，分析基因表达以及建立cDNA文库的首要步骤。

真核细胞总RNA分离提取的目的是要获得高纯度的具有充分长度的RNA分子，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的关键是尽量减少RNA酶的污染。RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性的RNA酶外，环境中也存在RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和强力的蛋白质变性剂盐酸胍或异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。

一、RNA提取 的关键

真核细胞RNA的提取过程有四个关键点，即①样品（细胞或组织）的有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。提取的RNA可以用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻译等。

二、组织RNA提取的基本步骤

1.仪器：匀浆器、低温离心机、离心管。

2.试剂：氯仿、75%乙醇、异丙醇、DEPC溶液、1%甲醛变性胶、37%甲醛、3%过氧化氢、甲酰胺、RNA上样缓冲液。

3.主要步骤

（1）取组织50~100mg，加0.8ml Trizol冲洗匀浆器，移入同一离心管，冰上静置5min。

（2）加0.2ml氯仿，充分震荡混匀，静置3min，4℃，12000g×15min离心。弃沉淀。

（3）取上清，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀。－20℃静置2h，4℃，12000g×10min离心。

（4）弃上清，取沉淀，加入1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉淀，4℃，7500g×5min离心。

（5）弃上清，沉淀真空干燥10min。

（6）加40μl DEPC溶液，充分溶解RNA。

4.结果鉴定

（1）紫外分光光度计检测：取RNA溶解液，按一定比例稀释后，紫外分光光度计测定260nm、280nmOD值，计算OD260/OD280比值，如果比值在1.72.0：1之间，说明RNA纯度可。

标准样品当OD260＝1时，RNA浓度约为40μg/ml，根据下述公式计算RNA浓度：RNA浓度（μg/ml）＝OD260×稀释倍数×40。

（2）电泳检测：1%甲醛变性胶电泳观察RNA质量，电泳槽及制胶板先用3%过氧化氢浸泡过夜；制1%甲醛变性凝胶板：4.5μl RNA，2ul 5×甲醛胶电泳缓冲液，3.5μl 37%甲醛，10ul甲酰胺，离心混匀，65℃变性15min后，迅速置冰浴中；再加入2μl RNA上样缓冲液，离心混匀后上样，6V/cm电压，电泳1～2h；暗室内紫外光下观察，拍照；如果观察到清晰的18S、28S RNA电泳带，无大量小分子RNA，说明RNA无明显降解，样品－70℃保存备用。

三、注意事项

1、所有玻璃器皿160～180℃高温干烤6h以上，非耐高温器皿经0.1% DEPC液浸泡后，经高温（15磅，20min）处理灭活RNA酶，所用试剂均用DEPC水配制，然后高压处理。

2、实验用水要经DEPC处理，但含Tris的试剂不能用DEPC处理。

3、实验操作过程中要戴一次性手套，以避免RNA酶污染。

第三节 质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

细菌质粒是一类双链共价闭合环状、大小约1kb200kb 的DNA，存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的可自主复制的遗传成份。通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒是目前最常用的基因克隆的载体分子之一，获得大量纯化的质粒DNA是基因克隆的前提条件。

一、碱裂解法提取质粒DNA的原理

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学性质不同。在PH1212.5时,线性DNA会完全变性,而共价闭合环状DNA只是氢键断裂，经酸中和后，共价闭合环状DNA可迅速准确的复性。而线性DNA不能准确复性，只能聚合成网状结构，离心后与变性的蛋白质、RNA一起沉淀下来。上清液中的质粒DNA可用乙醇沉淀出来。

二、基本步骤

1．材料：含质粒的大肠杆菌

2．试剂：溶液Ⅰ（ 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）)、溶液Ⅱ（0.2N NaOH，1% SDS）用时临时配制。pH 4.8的醋酸钾（KAc）缓冲液（5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml）、 TE缓冲液（10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)）、苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）、 5×TBE（Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml）。10mg/ml溴化乙锭（EB）、琼脂糖、10mg/ml RNase A（RNA酶A）、6×上样缓冲液（0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液）。

3．仪器：离心机、电泳仪、水平式电泳槽

4.主要步骤

（1）挑取LB固体培养基上生长的大肠杆菌单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

（2）取1.5ml培养物转移入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

（3）将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。

（4）加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ于离心管中，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜充分裂解。

（5）加入150μl预冷的醋酸钾（KAc）缓冲液，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。

（6）加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，振荡混匀，4℃离心12000g × 10min。

（7）小心移出上清于另一微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。

（8）加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。

（9）沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。

5.结果鉴定：1%琼脂糖凝胶电泳检测。方法同前核酸DNA的鉴定。

第四节 线粒体DNA的提取

线粒体DNA是染色体遗传物质，哺乳类动物的线粒体DNA为共价闭合环状的双链DNA。它变异快、结构相对简单，经母系遗传，对真核生物基因组的结构、复制、转录、调控机理等方面都起着重要作用。近年来被广泛用于近缘种间或种内种群间亲缘关系的研究。

线粒体DNA最早是用氯化铯梯度离心方法获得，该法提取的线粒体DNA纯度高，但所需仪器设备昂贵，实验周期长，限制其在群体遗传研究中的应用。继而出现了Triton法、碱变性法与改进高盐沉淀法等线粒体DNA的提取方法。

一、碱变性法线粒体DNA提取的原理

线粒体DNA的结构与质粒DNA的结构相似，均为共价闭合环状的双链DNA，实验原理与质粒DNA提取相同 。

二、主要实验步骤

1、材料：新鲜小鼠肝组织

2、仪器：玻璃匀浆器、高速离心机、离心管、吸管

3、试剂：50mmol/L葡萄糖、10mmol/L Na2EDTA，25mmol/L Tris-HCl pH8.0、1%SDS、0.2N NaOH、3M NaAc pH4.8、95%乙醇、75%乙醇、TE缓冲液

4、主要步骤

（1）取50mg新鲜小鼠肝组织，加1ml冷匀浆液，用玻璃匀浆器匀浆，随即以1000g×3min， 4℃，离心，弃沉淀。

（2）取上清，12000g×10min，4℃，离心，沉淀即为粗线粒体。

（3）将沉淀溶于100ml（50mmol/L葡萄糖、10mmol/L Na2EDTA，25mmol/L Tris-HCl pH8.0）溶液中，充分混匀。

（4）加200ml新鲜配制的（1%SDS，0.2N NaOH）溶液，轻轻摇匀，冰浴5min。

（5）再加150ml（3M NaAc pH4.8）溶液，轻轻摇匀，冰浴5min。12000g×10min，4℃，离心

（6）取上清加等体积（酚、氯仿、异戊醇之体积比为25:24:1）溶液，抽提2~4次，界

面无白色物质，10000g×5min离心。

（7）取上清加2倍体积95%乙醇，室温静置15min，然后12000g×10min离心。

（8）弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤1次，以12000g×5min离心。

（9）弃上清，取沉淀，真空干燥后即得线粒体DNA。将其溶于适量的TE缓冲液中，－20℃保存。

5.实验结果鉴定

用紫外分光光度仪测定，A260：A280为2.0左右。若纯度较高，能直接用限制性内切酶进行酶切图谱分析。

（上海中医药大学

王晓玲）

第二篇 细胞的遗传物质

第一章 细胞内核酸的提取

人类基因组计划的完成以及后基因组学研究的不断深入，标志着现代医学的发展已逐步进入“基因组医学”的时代。疾病分子机制的研究也将为包括疾病的分子诊断、分子治疗在内容的“分子医学”的发展提供动力。

核酸是遗传信息以及基因表达的物质基础，是重要的生物信息分子,也是分子生物学研究的主要对象。它与生命的正常活动，如种族遗传、生长等有密切联系；它与生命的异常活动，如肿瘤的发生、放射损伤以及抗癌、抗病毒药物的作用机理等也有密切的关系。因此，核酸是现代生命科学体系中重点研究的课题之一。核酸分为DNA和RNA两大类。核酸的提取是分子生物学实验技术中基本的操作之一，

第一节 真核细胞基因组DNA的分离与纯化

DNA主要在细胞核内，核外也有少量称为核外基因的线粒体DNA等。真核细胞的DNA分子比原核生物的DNA分子大得多，并且以核蛋白体形式存在于细胞中。真核细胞基因组DNA提取的主要步骤包括裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是去除体系中的其它成分，如蛋白质、多糖、脂类及其它不需要的核酸（RNA）等生物大分子的过程。

一、裂解

细胞破碎的手段常为超声波、组织匀浆、液氮破碎以及包埋组织的超薄切片等方法。为了获得大量完整的DNA，一般采用裂解液等温和的方法破碎细胞。

裂解液一般都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。去污剂的作用是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及去除与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。盐的作用，一方面提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，另一方面可抑制核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 。裂解体系中还可以加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。

二、纯化

根据DNA本身的特征使用不同方法进行核酸提纯。

三、DNA提取的实验步骤

（一）材料与设备

1.试剂 消化液（100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）；pH8.0，25mmol/L EDTA；PBS；TES饱和酚；氯仿；异戊醇； 95%乙

醇溶液；70%乙醇溶液；TE；0.1%SDS；1μg/ml RNA酶；

2.仪器 培养皿、培养瓶、微量离心管、滴管；刻度吸管；加样器；枪头；离心机、液氮罐、组织匀浆器、恒温培养箱

（二）主要步骤

1.如果材料为组织块，可将组织块（约200~1000mg）剪碎后，置入液氮中。随后用冰冷的组织捣碎器捣碎，每100mg组织加入1.2ml消化液（100mmol/L NaCl,10mmol/L Tris-HCl，pH8.0，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1mg/ml蛋白酶K）。

2.如果材料是悬浮细胞，收集细胞于微量离心管中，500g×5min离心；如果材料是贴壁细胞，弃上清后，胰酶消化收集细胞，500g×5min离心。随后用冰冷的PBS缓冲液洗涤细胞，500g×5min离心，弃上清，重复一次，并用一倍体积的消化液重悬细胞。

3.组织或细胞混悬液移入带盖的离心管中，50℃消化12～18h。

4.冷却至4℃，加等体积15 mo1／L TES饱和酚。

5.轻轻振摇，使水相和酚层充分混匀。

6. 4℃5000rpm～8000rpm离心15min～20min。此时DNA溶液在上层，酚位于下层，中间是变性蛋白层。

7.用吸管小心吸取上层粘稠溶液，移至另一离心管。注意尽量不要带出中间蛋白层。

8. DNA溶液再加等体积15 mo1／L TES饱和酚抽提一次，按6、7离心并吸至另一离心管。

9.加等体积氯仿/异戊醇按步骤（5、6）抽提，离心5min。

10.吸出DNA溶液后，再步骤（9）抽提一次。

11.用吸管将DNA溶液移至Eppendorf中，冰浴至0℃。

12.加2.5倍体积95%冷乙醇震摇，可见DNA白色沉淀析出。

13.用75%冷乙醇清洗3～4次。

14.室温干燥或冷冻干燥DNA。

15.加适量TE溶液溶解DNA。

四、结果鉴定

1．紫外分光光度计检测：可检测DNA的纯度和含量。一般而言核酸在260nm时吸光度最大，而蛋白质在280nm时吸光度最大。取2μl DNA溶解液，适量稀释，紫外分光光度计测定260nm、280nmOD值，计算OD260/OD280比值，比值在1.72.0:1之间，说明DNA纯度可。在260nm处，1OD双链DNA的浓度为50g /ml，据此可计算DNA的浓度（g /ml）=50×(OD260) × 稀释倍数。

2．电泳检测：可检测核酸的完整性和大小。取2μl DNA溶解液与适量上样缓冲液混合后，经1%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后紫外光下观察，拍照；如果观察到一条清晰的电泳带，无明显的拖尾，说明DNA完整性好。

第二节 真核细胞总RNA的分离提取

RNA是基因表达产物，由以下几类分子组成，rRNA（占细胞总RNA的80%～85%）、tRNA

和核内小分子RNA（占10～15%）、mRNA（占1～5%）。其中mRNA是分子生物学的主要研究对象，分离制备mRNA是克隆基因，分析基因表达以及建立cDNA文库的首要步骤。

真核细胞总RNA分离提取的目的是要获得高纯度的具有充分长度的RNA分子，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的关键是尽量减少RNA酶的污染。RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性的RNA酶外，环境中也存在RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶的污染和抑制内源性RNA酶活性。主要是采用RNA酶的阻抑蛋白RNasin和强力的蛋白质变性剂盐酸胍或异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶。

一、RNA提取 的关键

真核细胞RNA的提取过程有四个关键点，即①样品（细胞或组织）的有效破碎；②有效地使核蛋白复合体变性；③对内源RNA酶的有效抑制；④有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。提取的RNA可以用于核酸杂交、cDNA合成以及体外翻译等。

二、组织RNA提取的基本步骤

1.仪器：匀浆器、低温离心机、离心管。

2.试剂：氯仿、75%乙醇、异丙醇、DEPC溶液、1%甲醛变性胶、37%甲醛、3%过氧化氢、甲酰胺、RNA上样缓冲液。

3.主要步骤

（1）取组织50~100mg，加0.8ml Trizol冲洗匀浆器，移入同一离心管，冰上静置5min。

（2）加0.2ml氯仿，充分震荡混匀，静置3min，4℃，12000g×15min离心。弃沉淀。

（3）取上清，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀。－20℃静置2h，4℃，12000g×10min离心。

（4）弃上清，取沉淀，加入1ml 75%乙醇溶液，漂洗沉淀，4℃，7500g×5min离心。

（5）弃上清，沉淀真空干燥10min。

（6）加40μl DEPC溶液，充分溶解RNA。

4.结果鉴定

（1）紫外分光光度计检测：取RNA溶解液，按一定比例稀释后，紫外分光光度计测定260nm、280nmOD值，计算OD260/OD280比值，如果比值在1.72.0：1之间，说明RNA纯度可。

标准样品当OD260＝1时，RNA浓度约为40μg/ml，根据下述公式计算RNA浓度：RNA浓度（μg/ml）＝OD260×稀释倍数×40。

（2）电泳检测：1%甲醛变性胶电泳观察RNA质量，电泳槽及制胶板先用3%过氧化氢浸泡过夜；制1%甲醛变性凝胶板：4.5μl RNA，2ul 5×甲醛胶电泳缓冲液，3.5μl 37%甲醛，10ul甲酰胺，离心混匀，65℃变性15min后，迅速置冰浴中；再加入2μl RNA上样缓冲液，离心混匀后上样，6V/cm电压，电泳1～2h；暗室内紫外光下观察，拍照；如果观察到清晰的18S、28S RNA电泳带，无大量小分子RNA，说明RNA无明显降解，样品－70℃保存备用。

三、注意事项

1、所有玻璃器皿160～180℃高温干烤6h以上，非耐高温器皿经0.1% DEPC液浸泡后，经高温（15磅，20min）处理灭活RNA酶，所用试剂均用DEPC水配制，然后高压处理。

2、实验用水要经DEPC处理，但含Tris的试剂不能用DEPC处理。

3、实验操作过程中要戴一次性手套，以避免RNA酶污染。

第三节 质粒DNA的碱裂解法提取与纯化

细菌质粒是一类双链共价闭合环状、大小约1kb200kb 的DNA，存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的可自主复制的遗传成份。通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒是目前最常用的基因克隆的载体分子之一，获得大量纯化的质粒DNA是基因克隆的前提条件。

一、碱裂解法提取质粒DNA的原理

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学性质不同。在PH1212.5时,线性DNA会完全变性,而共价闭合环状DNA只是氢键断裂，经酸中和后，共价闭合环状DNA可迅速准确的复性。而线性DNA不能准确复性，只能聚合成网状结构，离心后与变性的蛋白质、RNA一起沉淀下来。上清液中的质粒DNA可用乙醇沉淀出来。

二、基本步骤

1．材料：含质粒的大肠杆菌

2．试剂：溶液Ⅰ（ 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）)、溶液Ⅱ（0.2N NaOH，1% SDS）用时临时配制。pH 4.8的醋酸钾（KAc）缓冲液（5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml）、 TE缓冲液（10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)）、苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、乙醇（无水乙醇、70%乙醇）、 5×TBE（Tris 碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml）。10mg/ml溴化乙锭（EB）、琼脂糖、10mg/ml RNase A（RNA酶A）、6×上样缓冲液（0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液）。

3．仪器：离心机、电泳仪、水平式电泳槽

4.主要步骤

（1）挑取LB固体培养基上生长的大肠杆菌单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

（2）取1.5ml培养物转移入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

（3）将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。

（4）加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ于离心管中，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上2-3min，使细胞膜充分裂解。

（5）加入150μl预冷的醋酸钾（KAc）缓冲液，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。

（6）加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇混合液，振荡混匀，4℃离心12000g × 10min。

（7）小心移出上清于另一微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min。

（8）加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀在室温下晾干。

（9）沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。

5.结果鉴定：1%琼脂糖凝胶电泳检测。方法同前核酸DNA的鉴定。

第四节 线粒体DNA的提取

线粒体DNA是染色体遗传物质，哺乳类动物的线粒体DNA为共价闭合环状的双链DNA。它变异快、结构相对简单，经母系遗传，对真核生物基因组的结构、复制、转录、调控机理等方面都起着重要作用。近年来被广泛用于近缘种间或种内种群间亲缘关系的研究。

线粒体DNA最早是用氯化铯梯度离心方法获得，该法提取的线粒体DNA纯度高，但所需仪器设备昂贵，实验周期长，限制其在群体遗传研究中的应用。继而出现了Triton法、碱变性法与改进高盐沉淀法等线粒体DNA的提取方法。

一、碱变性法线粒体DNA提取的原理

线粒体DNA的结构与质粒DNA的结构相似，均为共价闭合环状的双链DNA，实验原理与质粒DNA提取相同 。

二、主要实验步骤

1、材料：新鲜小鼠肝组织

2、仪器：玻璃匀浆器、高速离心机、离心管、吸管

3、试剂：50mmol/L葡萄糖、10mmol/L Na2EDTA，25mmol/L Tris-HCl pH8.0、1%SDS、0.2N NaOH、3M NaAc pH4.8、95%乙醇、75%乙醇、TE缓冲液

4、主要步骤

（1）取50mg新鲜小鼠肝组织，加1ml冷匀浆液，用玻璃匀浆器匀浆，随即以1000g×3min， 4℃，离心，弃沉淀。

（2）取上清，12000g×10min，4℃，离心，沉淀即为粗线粒体。

（3）将沉淀溶于100ml（50mmol/L葡萄糖、10mmol/L Na2EDTA，25mmol/L Tris-HCl pH8.0）溶液中，充分混匀。

（4）加200ml新鲜配制的（1%SDS，0.2N NaOH）溶液，轻轻摇匀，冰浴5min。

（5）再加150ml（3M NaAc pH4.8）溶液，轻轻摇匀，冰浴5min。12000g×10min，4℃，离心

（6）取上清加等体积（酚、氯仿、异戊醇之体积比为25:24:1）溶液，抽提2~4次，界

面无白色物质，10000g×5min离心。

（7）取上清加2倍体积95%乙醇，室温静置15min，然后12000g×10min离心。

（8）弃上清，沉淀用75%乙醇洗涤1次，以12000g×5min离心。

（9）弃上清，取沉淀，真空干燥后即得线粒体DNA。将其溶于适量的TE缓冲液中，－20℃保存。

5.实验结果鉴定

用紫外分光光度仪测定，A260：A280为2.0左右。若纯度较高，能直接用限制性内切酶进行酶切图谱分析。

（上海中医药大学

王晓玲）