植物细胞悬浮发酵产活性物质的研究进展
摘要：本文概述植物细胞悬浮培养技术研究进展，讨论植物细胞悬浮规模培养技术，展望该技术在开发活性物质研究中的应用前景。
关键词：植物细胞；细胞悬浮培养；活性物质
随着人们对“膳食与健康”的认识不断深入，植物生物活性物质的研究与开发一起了全世界的关注。众多科学家基本上已经公认植物生物活性物质对人类的“康乐”状态的维持以及诸多现代慢性疾病的预防具有重要的作用。某些活性成分对人的心脑血管系统、神经系统、免疫系统、代谢系统等具有生理活性，在抗炎、抗病毒、抗衰老、抗肿瘤等方面均有预防和治疗作用[1]。而且人们对化学合成品的忌讳以及对天然化学品的崇尚，也使得全世界把目光投向植物来源的诸多生物活性物质，期望能找到可以代替目前医药中广泛使用的诸多化学合成品的植物天然物质。
由于生态环境的破坏、无计划的采伐和栽培技术等原因而致使珍稀濒危植物种类不断增加，而当前植物活性物质的获得主要从这些植物的皮、茎、叶中通过化学方法提取和分离，不仅造成植物资源的破坏，而且作为新型药剂的临床研究以及保健品等的开发，特别是推广应用的数量受到限制。因此，研究利用植物细胞悬浮培养发酵技术生产活性物质对大规模商业化生产植物活性成分具有重要的现实意义。
一 植物细胞悬浮培养发酵活性物质研究概况
在植物组织培养研究中，发现培养细胞中含有各种特殊的代谢产物和生物碱、色素、甾体、萜类等药用成分及香精等，其中有些是微生物和人工不能合成的活性物质，有些则是在整株植物含量甚微或本身资源就十分匮乏，而在培养的细胞中含量有时却很高[2]。因此，利用植物细胞培养技术生产有用代谢产物，已成为继微生物技术以后当代生物技术重要的发展领域。而以悬浮培养植物细胞直接发酵生产活性物质的研究又成为这一领域的新热点。
植物细胞悬浮培养是在完全人工控制的条什下进行，具有以下优点：不受地区、季节、士壤及有害生物的影响，可以周年生产且生产周期较短：通过改变培养条件和选择优良培养体系得到超过整株植物产量的代 产物，例如通过新疆
紫草的细胞培养获得了比原植株含量高6倍的紫草素，甘草悬浮培养细胞中所含的甘草酸铵含量高于其他材料；可利用基因工程或创新的合成路线，对有效成分的合成进行遗传操作，提高所需次生代谢产物含量；也可进行生物反应器细胞培养，大规模生产有效的次生代谢产物[3-6]。
目前用于细胞培养的植物有200多种，可产生500多种有效成分，如培养人参细胞生产保健药物人参皂甙、紫草植物生产疗伤药物紫草宁、黄连细胞生产抗菌药物小蘖碱、长春花细胞生产阿吗碱、紫松果菊细胞生产免疫活性多糖、红豆杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇等。从细胞培养中得到的药用成分有：喜树碱、莨菪碱、小蘖碱、全宁、地高辛、天仙子胺、胆固醇、利血平、山萆、芥皂疳元、胰岛素等：实现规模化生产的有：中国科学院植物研究所的紫草培养、华中理工大学的红豆杉培养和中国药科大学的人参培养[4]。
二 单细胞悬浮体系的建立
挑选生长力旺盛、表面有颗粒突起、疏松易碎的愈伤组织，并用镊子尽量夹碎后转入液体培养基，液体培养基在摇床(1O0～120 r／min) 上连续振荡培养使细胞分散，得到细胞悬浮液。悬浮培养细胞的生长曲线为S 型，元宝草细胞生长分为延滞期(0～4 d) ，对数生长期（4～10d) 和静止期(10～18 d) ，元宝草在一个培养周期内细胞鲜质量可增加5倍左右[7]。对数生长期后，由于培养基中的营养物质减少，细胞代谢积累了大量有害物质，使细胞生长环境发生变化，导致细胞生长速度减慢。因此，继代培养应选择在对数生长末期或静止期初进行。悬浮细胞培养周期一般为14~20d。黄山药悬浮培养20 d左右生长量达到最大。保持新鲜培养基适当的比例也是必要的，继代过程中如接种量大，若养分不足，致使细胞死亡数增多[8]。油樟细胞悬浮培养过程中，在细胞生长量最高期, 待细胞沉淀后, 倾去上部培养液, 添加新鲜培养液继代, 经2次继代培养后取下三角瓶, 静置30分钟, 待较大块愈伤组织沉淀后, 用无菌移液管吸取5 mL 上层液, 移入新鲜培养基中继续在摇床上进行连续振荡培养, 以获得单细胞或小块愈伤组织悬浮液。通过显微镜观察检测单细胞及细胞团的存在[9]。通过不断选择获得分散性好的细胞悬浮物，经过6代以上的转接，建立稳定的悬浮细胞系。
三 提高植物细胞悬浮发酵过程中活性物质
1 筛选高通量植物细胞株
在不同属植物中均可能发现同种生物活性物质或者其衍生物，但不同种之间，活性物质及其衍生物的含量有显著差异。因此获得一高通量的植物细胞株是是活性物质生产的基础。一般说来，选择活性物质含量高的植物可获得高产细胞系。但不同环境，不同季节，同种不同个体间的植物，其活性物质的含量都不同。产活性物质的植物的针叶、幼茎、形成层、种胚等均可诱导出愈伤组织，其中以幼茎为最好的外植体材料。
2 前体饲喂
在植物细胞悬浮培养中加入活性物质生物合成的前体物是提高活性物质产量的有效途径之一。前体饲喂细胞一方面可通过增加底物量来加快反应速度和提高产率，另一方面还能够反馈抑制分支路径而促进反应顺利进行，有效提高活性物质的产量。但前体物在促进终产物合成时，往往对细胞生长会带来抑制作用。因此要对添加的浓度、时间等参数进行优化，在最佳时间加入适当浓度的前体物，才能获得最佳添加效果，如陈永勤等[10]在云南红豆杉细胞培养的第12天时向培养基中添加苯丙氨酸、丙酮酸钠和牛儿醇，结果可显著提高细胞中紫杉醇的含量，而在其它时间添加效果均不佳。
3 添加抑制剂
一些代谢抑制剂可切断费目的代谢产物的合成路径，使代谢流向目的产物，但一种或者几种抑制剂额的添加有可能抑制细胞的生长或者活性物质的合成，因此需要反复优化，确定抑制剂的添加种类，确保物质和能量向目的代谢物质流动，从而提高活性物质的产量。
4 添加诱导子
诱导子通过激活或诱导特定酶的合成，而引起植物细胞次生代谢途径、代谢通量、反应速率的改变，从而提高某次生代谢物的产量。诱导子可诱导植物细胞的防御反应，启动次生代谢物合成，从而促进活性物质的合成。在应用时，应选择对细胞株敏感的诱导子，许多研究表明诱导子的添加时间一般在细胞培养指数期的中后期较好[11]。
四 优化培养条件和培养环境
植物细胞的悬浮培养及活性物质的合成很易受外条件的影响，如培养基的组成、培养条件如温度、pH 、光照、通气等。培养基组成和培养条件的改变会影
响甚至改变植物活性物质合成的方向。
在植物的组织培养中，MS(1／2 MS)培养基和B5液体培养基是研究人员常使用的基本培养基。基本培养基可以提供细胞生长所需的大量和微量元素以及碳源，能用来培养生长快、易散碎的愈伤组织，一般来说也同样可以用于该物种的悬浮培养。培养基中的无机盐、蔗糖和激素水平等均会影响植物细胞生长和活性物质的合成。在悬浮培养初期，愈伤组织从固体培养转移到液体培养过程中，易出现褐化现象，提高培养基中2，4-D 浓度，可起到抑制褐化的作用[12]。
控制植物细胞培养过程中溶氧浓度对于细胞的生长也具有十分重要的意义，提高摇瓶转速并在一定范围内提高溶氧浓度能加速细胞生长[13]。氧促进某些次生代谢产物的产生，黄连和亚欧唐松草细胞的黄连素含量随溶氧浓度的提高而增加[13]；长春花在溶氧低于15％条件下，阿玛碱合成被抑制，升高溶氧至某一浓度，阿玛碱迅速人量合成[13]。说明溶氧对细胞的生长和代谢有很大的影响。
一定浓度的蔗糖不仅能促进植物细胞的生长，还能刺激次生物质的合成。采用4％(w／v) 蔗糖浓度培养紫草细胞，仍能提高花色素产 量[14]；培养液中可溶性糖浓度在元宝草悬浮细胞生长期间不断下降，应根据细胞培养的需要调整蔗糖的添加量[7]。植物种类及培养产物不同，最佳培养基也不同，如怀牛膝细胞悬浮培养生产多糖时，碳源便是影响怀牛膝细胞中多糖含量的关键因子[15]。
悬浮细胞系的建立过程中，激素是影响细胞状态的重要调控因素。不含2，4一D 的培养液完全不能建立悬浮细胞系。过低浓度的2，4-D 则不利于悬浮细胞系的分散，高浓度2，4一D 虽然能促进悬浮细胞的分裂，但是细胞液泡化，内含物少，不利于体细胞胚胎的发育。激素种类和配比对于培养细胞的生长和次生代谢物含量的增殖都有极大的影响。草莓的悬浮细胞随着生长调节物质浓度的增高细胞生长量加大，颜色为淡黄色或黄色。当生长调节物质浓度增至2.0 mg ／L 2，
4．D 、1.0 mg／L NAA、0.3rng ／L ZT时，悬浮细胞生长受到了明显的抑制，而且培养液浑浊。因此，在2，4一D 0.2 mg／L 、NAA 0.5 mg／L ，ZT 0.1 mg／L 时细胞增殖倍数最大，且细胞生长为淡黄色，颗粒明显，培养液较清。
光照条件也是影响红豆杉细胞生长和紫杉醇合成的重要因素，黑暗条件下有利于红豆杉愈伤组织的诱导、细胞生长和紫杉醇的形成[16]。在黑暗条件下细胞生长速度较快，约为光照条件下细胞生长速度的3倍，紫杉醇的产量也是光照条
件下细胞紫杉醇含量的3倍。表明红豆杉的悬浮细胞适于在较黑暗的条件下生长和合成紫杉醇[17]。
五 培养方式
除细胞悬浮培养外，改善红豆杉细胞合成紫杉醇的重要方法还有：
两相培养：两相培养是指在植物细胞培养液中加入脂溶性的有机相或具有吸附目的产物的固体多聚化学物，这样整个培养系统就形成了上下两相，细胞在水相生长，而分泌到胞外的代谢物被另一相所吸附。所以两相培养技术能够使活性产物及时转入第二相，可以减轻产物本身的反馈抑制作用，或保护产物免受细胞内部的分解酶的降解，从而提高产物的产量。另外，由于产物进入了第二相，简化了下游处理过程，所以可大幅度降低生产成本。Wang 等[18]在紫杉醇培养对数晚期加入10％(V／V) 的邻苯二甲酸二丁酯，不仅非常有效地促进紫杉醇释放，而且对细胞生长影响很少，能有效地促进紫杉醇的合成。
固定化培养：固定化培养具有连续、反应效率高、易于调控、对环境影响抗性高等优点，成为植物细胞培养研究中的一个重要方法。用于植物细胞固定化的材料有：海藻酸钠、角叉胶及其它合成材料。植物细胞被固定化后，与游离细胞相比，细胞密度更大，细胞与细胞间的距离变小，有利于细胞间的信号传递。这些细胞微环境的变化有利次生代谢物的合成。Bentebibel 等用海藻酸钠包埋红豆杉细胞，获得了高达2．71 mg／L·d 的生产力[19]。
两步法培养：细胞生长与活性物质合成并不同步进行，二者是非偶联型关系。活性物质一般在细胞生长对数后期合成，植物细胞对这两过程的培养条件和营养要求也不一样。
六 植物细胞反应器
植物细胞具有大的液泡，对剪切力敏感，因此搅拌釜内搅拌与通气产生的剪切应力对其生长和代谢有显著影响。选择合适的植物细胞反应器类型及操作方法，可提高植物细胞代谢产物活性物质的合成。剪切应力有一定的积极影响，如增加透气、保持良好的混合状态和细胞分散性，能提高细胞产率和增加活性物质的产量，但多数情况 易造成植物细胞损伤，影响细胞形态和代谢。当搅拌转速能够提供必要混合而又小于150 r／min 时，相应的剪切应力有利于细胞的生长和初生代谢；搅拌转速略大于150r ／min 时，搅拌釜内的剪切应力有利于细胞次生
代调产物的生成；当搅拌转速达到200 r／min 时，不适宜南方红豆杉细胞培养[20]。将搅拌速度控制在一定范围内，并有选择地寻求具有剪切力抗性的细胞，将为悬浮细胞培养生物反应器的设计提供指导。适于悬浮植物细胞培养的生物反应器要符合3个要求：合适的氧传递、良好的混合性能及较低的剪切力。
为加速植物细胞悬浮培养技术商业化生产活性物质进程，各国科学家一方面不断改进培养技术，如控制培养的气相环境，加人刺激剂、大孔树脂吸附剂等；一方面发展新的培养方法，如高密度培养、连续培养等。以期得到一种适合于植物细胞工业化生产的培养方式。目前国内外用于药用植物细胞悬浮培养的反应器主要有搅拌式、鼓泡式、气升式、振动混合式。
七 问题与展望
植物细胞悬浮培养发酵产活性物质研究已经取得了很多的成绩，但是这里需要注意一个问题，培养细胞毕竟与植株存在一定差异，如在植株水平上的活性氧可以在病原侵染部分形成局部的高浓度起一定的作用，但在悬浮细胞系统中就不能形成这种局部效应。在培养细胞中得出的结论要在活体细胞中验证，才能具有实用的价值。
尽管细胞悬浮培养的植物种类已达到百余种，但只有少数达到生产规模。原因：一是由于增殖率不高，产物不稳定(含量低于原植物水平) ，导致成本高，不能商品化。所以高产细胞株系的遗传稳定性研究有待进一步加强。二是由于植物细胞本身所具有的一些特殊性，研究适合于植物细胞大规模培养的生物反应器，己成为这一技术实用化转化的重要问题之一。植物细胞培养生物反应器应从实际出发，考虑工业放大的可能性。
另外，植物细胞悬浮培养的研究重点应放在资源匮乏、含量低、化学方法又难以合成，但临床需要量大，效益高的药用活性物质上，将具有巨大的经济效益和社会效益。
总之，植物细胞大规模培养发酵生物活性物质具有广阔的前景。随着对这一技术的深入研究，必将总结出一套通用的植物细胞工厂化生产活性物质的技术线路，以保护野生资源匮乏的珍贵植物，并开发更多有效成分珍贵、临床价值高的生物活性物质，用于研制新药以及功能性食品，更好地造福于人类。
植物细胞悬浮发酵产活性物质的研究进展
摘要：本文概述植物细胞悬浮培养技术研究进展，讨论植物细胞悬浮规模培养技术，展望该技术在开发活性物质研究中的应用前景。
关键词：植物细胞；细胞悬浮培养；活性物质
随着人们对“膳食与健康”的认识不断深入，植物生物活性物质的研究与开发一起了全世界的关注。众多科学家基本上已经公认植物生物活性物质对人类的“康乐”状态的维持以及诸多现代慢性疾病的预防具有重要的作用。某些活性成分对人的心脑血管系统、神经系统、免疫系统、代谢系统等具有生理活性，在抗炎、抗病毒、抗衰老、抗肿瘤等方面均有预防和治疗作用[1]。而且人们对化学合成品的忌讳以及对天然化学品的崇尚，也使得全世界把目光投向植物来源的诸多生物活性物质，期望能找到可以代替目前医药中广泛使用的诸多化学合成品的植物天然物质。
由于生态环境的破坏、无计划的采伐和栽培技术等原因而致使珍稀濒危植物种类不断增加，而当前植物活性物质的获得主要从这些植物的皮、茎、叶中通过化学方法提取和分离，不仅造成植物资源的破坏，而且作为新型药剂的临床研究以及保健品等的开发，特别是推广应用的数量受到限制。因此，研究利用植物细胞悬浮培养发酵技术生产活性物质对大规模商业化生产植物活性成分具有重要的现实意义。
一 植物细胞悬浮培养发酵活性物质研究概况
在植物组织培养研究中，发现培养细胞中含有各种特殊的代谢产物和生物碱、色素、甾体、萜类等药用成分及香精等，其中有些是微生物和人工不能合成的活性物质，有些则是在整株植物含量甚微或本身资源就十分匮乏，而在培养的细胞中含量有时却很高[2]。因此，利用植物细胞培养技术生产有用代谢产物，已成为继微生物技术以后当代生物技术重要的发展领域。而以悬浮培养植物细胞直接发酵生产活性物质的研究又成为这一领域的新热点。
植物细胞悬浮培养是在完全人工控制的条什下进行，具有以下优点：不受地区、季节、士壤及有害生物的影响，可以周年生产且生产周期较短：通过改变培养条件和选择优良培养体系得到超过整株植物产量的代 产物，例如通过新疆
紫草的细胞培养获得了比原植株含量高6倍的紫草素，甘草悬浮培养细胞中所含的甘草酸铵含量高于其他材料；可利用基因工程或创新的合成路线，对有效成分的合成进行遗传操作，提高所需次生代谢产物含量；也可进行生物反应器细胞培养，大规模生产有效的次生代谢产物[3-6]。
目前用于细胞培养的植物有200多种，可产生500多种有效成分，如培养人参细胞生产保健药物人参皂甙、紫草植物生产疗伤药物紫草宁、黄连细胞生产抗菌药物小蘖碱、长春花细胞生产阿吗碱、紫松果菊细胞生产免疫活性多糖、红豆杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇等。从细胞培养中得到的药用成分有：喜树碱、莨菪碱、小蘖碱、全宁、地高辛、天仙子胺、胆固醇、利血平、山萆、芥皂疳元、胰岛素等：实现规模化生产的有：中国科学院植物研究所的紫草培养、华中理工大学的红豆杉培养和中国药科大学的人参培养[4]。
二 单细胞悬浮体系的建立
挑选生长力旺盛、表面有颗粒突起、疏松易碎的愈伤组织，并用镊子尽量夹碎后转入液体培养基，液体培养基在摇床(1O0～120 r／min) 上连续振荡培养使细胞分散，得到细胞悬浮液。悬浮培养细胞的生长曲线为S 型，元宝草细胞生长分为延滞期(0～4 d) ，对数生长期（4～10d) 和静止期(10～18 d) ，元宝草在一个培养周期内细胞鲜质量可增加5倍左右[7]。对数生长期后，由于培养基中的营养物质减少，细胞代谢积累了大量有害物质，使细胞生长环境发生变化，导致细胞生长速度减慢。因此，继代培养应选择在对数生长末期或静止期初进行。悬浮细胞培养周期一般为14~20d。黄山药悬浮培养20 d左右生长量达到最大。保持新鲜培养基适当的比例也是必要的，继代过程中如接种量大，若养分不足，致使细胞死亡数增多[8]。油樟细胞悬浮培养过程中，在细胞生长量最高期, 待细胞沉淀后, 倾去上部培养液, 添加新鲜培养液继代, 经2次继代培养后取下三角瓶, 静置30分钟, 待较大块愈伤组织沉淀后, 用无菌移液管吸取5 mL 上层液, 移入新鲜培养基中继续在摇床上进行连续振荡培养, 以获得单细胞或小块愈伤组织悬浮液。通过显微镜观察检测单细胞及细胞团的存在[9]。通过不断选择获得分散性好的细胞悬浮物，经过6代以上的转接，建立稳定的悬浮细胞系。
三 提高植物细胞悬浮发酵过程中活性物质
1 筛选高通量植物细胞株
在不同属植物中均可能发现同种生物活性物质或者其衍生物，但不同种之间，活性物质及其衍生物的含量有显著差异。因此获得一高通量的植物细胞株是是活性物质生产的基础。一般说来，选择活性物质含量高的植物可获得高产细胞系。但不同环境，不同季节，同种不同个体间的植物，其活性物质的含量都不同。产活性物质的植物的针叶、幼茎、形成层、种胚等均可诱导出愈伤组织，其中以幼茎为最好的外植体材料。
2 前体饲喂
在植物细胞悬浮培养中加入活性物质生物合成的前体物是提高活性物质产量的有效途径之一。前体饲喂细胞一方面可通过增加底物量来加快反应速度和提高产率，另一方面还能够反馈抑制分支路径而促进反应顺利进行，有效提高活性物质的产量。但前体物在促进终产物合成时，往往对细胞生长会带来抑制作用。因此要对添加的浓度、时间等参数进行优化，在最佳时间加入适当浓度的前体物，才能获得最佳添加效果，如陈永勤等[10]在云南红豆杉细胞培养的第12天时向培养基中添加苯丙氨酸、丙酮酸钠和牛儿醇，结果可显著提高细胞中紫杉醇的含量，而在其它时间添加效果均不佳。
3 添加抑制剂
一些代谢抑制剂可切断费目的代谢产物的合成路径，使代谢流向目的产物，但一种或者几种抑制剂额的添加有可能抑制细胞的生长或者活性物质的合成，因此需要反复优化，确定抑制剂的添加种类，确保物质和能量向目的代谢物质流动，从而提高活性物质的产量。
4 添加诱导子
诱导子通过激活或诱导特定酶的合成，而引起植物细胞次生代谢途径、代谢通量、反应速率的改变，从而提高某次生代谢物的产量。诱导子可诱导植物细胞的防御反应，启动次生代谢物合成，从而促进活性物质的合成。在应用时，应选择对细胞株敏感的诱导子，许多研究表明诱导子的添加时间一般在细胞培养指数期的中后期较好[11]。
四 优化培养条件和培养环境
植物细胞的悬浮培养及活性物质的合成很易受外条件的影响，如培养基的组成、培养条件如温度、pH 、光照、通气等。培养基组成和培养条件的改变会影
响甚至改变植物活性物质合成的方向。
在植物的组织培养中，MS(1／2 MS)培养基和B5液体培养基是研究人员常使用的基本培养基。基本培养基可以提供细胞生长所需的大量和微量元素以及碳源，能用来培养生长快、易散碎的愈伤组织，一般来说也同样可以用于该物种的悬浮培养。培养基中的无机盐、蔗糖和激素水平等均会影响植物细胞生长和活性物质的合成。在悬浮培养初期，愈伤组织从固体培养转移到液体培养过程中，易出现褐化现象，提高培养基中2，4-D 浓度，可起到抑制褐化的作用[12]。
控制植物细胞培养过程中溶氧浓度对于细胞的生长也具有十分重要的意义，提高摇瓶转速并在一定范围内提高溶氧浓度能加速细胞生长[13]。氧促进某些次生代谢产物的产生，黄连和亚欧唐松草细胞的黄连素含量随溶氧浓度的提高而增加[13]；长春花在溶氧低于15％条件下，阿玛碱合成被抑制，升高溶氧至某一浓度，阿玛碱迅速人量合成[13]。说明溶氧对细胞的生长和代谢有很大的影响。
一定浓度的蔗糖不仅能促进植物细胞的生长，还能刺激次生物质的合成。采用4％(w／v) 蔗糖浓度培养紫草细胞，仍能提高花色素产 量[14]；培养液中可溶性糖浓度在元宝草悬浮细胞生长期间不断下降，应根据细胞培养的需要调整蔗糖的添加量[7]。植物种类及培养产物不同，最佳培养基也不同，如怀牛膝细胞悬浮培养生产多糖时，碳源便是影响怀牛膝细胞中多糖含量的关键因子[15]。
悬浮细胞系的建立过程中，激素是影响细胞状态的重要调控因素。不含2，4一D 的培养液完全不能建立悬浮细胞系。过低浓度的2，4-D 则不利于悬浮细胞系的分散，高浓度2，4一D 虽然能促进悬浮细胞的分裂，但是细胞液泡化，内含物少，不利于体细胞胚胎的发育。激素种类和配比对于培养细胞的生长和次生代谢物含量的增殖都有极大的影响。草莓的悬浮细胞随着生长调节物质浓度的增高细胞生长量加大，颜色为淡黄色或黄色。当生长调节物质浓度增至2.0 mg ／L 2，
4．D 、1.0 mg／L NAA、0.3rng ／L ZT时，悬浮细胞生长受到了明显的抑制，而且培养液浑浊。因此，在2，4一D 0.2 mg／L 、NAA 0.5 mg／L ，ZT 0.1 mg／L 时细胞增殖倍数最大，且细胞生长为淡黄色，颗粒明显，培养液较清。
光照条件也是影响红豆杉细胞生长和紫杉醇合成的重要因素，黑暗条件下有利于红豆杉愈伤组织的诱导、细胞生长和紫杉醇的形成[16]。在黑暗条件下细胞生长速度较快，约为光照条件下细胞生长速度的3倍，紫杉醇的产量也是光照条
件下细胞紫杉醇含量的3倍。表明红豆杉的悬浮细胞适于在较黑暗的条件下生长和合成紫杉醇[17]。
五 培养方式
除细胞悬浮培养外，改善红豆杉细胞合成紫杉醇的重要方法还有：
两相培养：两相培养是指在植物细胞培养液中加入脂溶性的有机相或具有吸附目的产物的固体多聚化学物，这样整个培养系统就形成了上下两相，细胞在水相生长，而分泌到胞外的代谢物被另一相所吸附。所以两相培养技术能够使活性产物及时转入第二相，可以减轻产物本身的反馈抑制作用，或保护产物免受细胞内部的分解酶的降解，从而提高产物的产量。另外，由于产物进入了第二相，简化了下游处理过程，所以可大幅度降低生产成本。Wang 等[18]在紫杉醇培养对数晚期加入10％(V／V) 的邻苯二甲酸二丁酯，不仅非常有效地促进紫杉醇释放，而且对细胞生长影响很少，能有效地促进紫杉醇的合成。
固定化培养：固定化培养具有连续、反应效率高、易于调控、对环境影响抗性高等优点，成为植物细胞培养研究中的一个重要方法。用于植物细胞固定化的材料有：海藻酸钠、角叉胶及其它合成材料。植物细胞被固定化后，与游离细胞相比，细胞密度更大，细胞与细胞间的距离变小，有利于细胞间的信号传递。这些细胞微环境的变化有利次生代谢物的合成。Bentebibel 等用海藻酸钠包埋红豆杉细胞，获得了高达2．71 mg／L·d 的生产力[19]。
两步法培养：细胞生长与活性物质合成并不同步进行，二者是非偶联型关系。活性物质一般在细胞生长对数后期合成，植物细胞对这两过程的培养条件和营养要求也不一样。
六 植物细胞反应器
植物细胞具有大的液泡，对剪切力敏感，因此搅拌釜内搅拌与通气产生的剪切应力对其生长和代谢有显著影响。选择合适的植物细胞反应器类型及操作方法，可提高植物细胞代谢产物活性物质的合成。剪切应力有一定的积极影响，如增加透气、保持良好的混合状态和细胞分散性，能提高细胞产率和增加活性物质的产量，但多数情况 易造成植物细胞损伤，影响细胞形态和代谢。当搅拌转速能够提供必要混合而又小于150 r／min 时，相应的剪切应力有利于细胞的生长和初生代谢；搅拌转速略大于150r ／min 时，搅拌釜内的剪切应力有利于细胞次生
代调产物的生成；当搅拌转速达到200 r／min 时，不适宜南方红豆杉细胞培养[20]。将搅拌速度控制在一定范围内，并有选择地寻求具有剪切力抗性的细胞，将为悬浮细胞培养生物反应器的设计提供指导。适于悬浮植物细胞培养的生物反应器要符合3个要求：合适的氧传递、良好的混合性能及较低的剪切力。
为加速植物细胞悬浮培养技术商业化生产活性物质进程，各国科学家一方面不断改进培养技术，如控制培养的气相环境，加人刺激剂、大孔树脂吸附剂等；一方面发展新的培养方法，如高密度培养、连续培养等。以期得到一种适合于植物细胞工业化生产的培养方式。目前国内外用于药用植物细胞悬浮培养的反应器主要有搅拌式、鼓泡式、气升式、振动混合式。
七 问题与展望
植物细胞悬浮培养发酵产活性物质研究已经取得了很多的成绩，但是这里需要注意一个问题，培养细胞毕竟与植株存在一定差异，如在植株水平上的活性氧可以在病原侵染部分形成局部的高浓度起一定的作用，但在悬浮细胞系统中就不能形成这种局部效应。在培养细胞中得出的结论要在活体细胞中验证，才能具有实用的价值。
尽管细胞悬浮培养的植物种类已达到百余种，但只有少数达到生产规模。原因：一是由于增殖率不高，产物不稳定(含量低于原植物水平) ，导致成本高，不能商品化。所以高产细胞株系的遗传稳定性研究有待进一步加强。二是由于植物细胞本身所具有的一些特殊性，研究适合于植物细胞大规模培养的生物反应器，己成为这一技术实用化转化的重要问题之一。植物细胞培养生物反应器应从实际出发，考虑工业放大的可能性。
另外，植物细胞悬浮培养的研究重点应放在资源匮乏、含量低、化学方法又难以合成，但临床需要量大，效益高的药用活性物质上，将具有巨大的经济效益和社会效益。
总之，植物细胞大规模培养发酵生物活性物质具有广阔的前景。随着对这一技术的深入研究，必将总结出一套通用的植物细胞工厂化生产活性物质的技术线路，以保护野生资源匮乏的珍贵植物，并开发更多有效成分珍贵、临床价值高的生物活性物质，用于研制新药以及功能性食品，更好地造福于人类。