实验报告
实验项目名称：基因工程综合实验
所属课程名称：基因工程原理
班 级：12生物工程3班
学 号：[1**********]2
姓 名：李杰锋
指 导 老 师 ：徐学锋
目 录
0. 摘要..........................................................1
1. 前言..........................................................1
2. 实验材料和仪器................................................2
2.1 实验材料 .................................................2
2.2 实验仪器 .................................................2
3. 实验试剂......................................................2
3.1 DNA 提取所需试剂........................................2
3.2 PCR 实验所需试剂 .......................................2
3.3 双酶切实验所需试剂.......................................2
4. 实验步骤......................................................3
4.1 质粒DNA 提取.............................................3
4.2 聚合酶链式反应（PCR ）....................................3
4.3 质粒DNA 的双酶切分析 ....................................4
4.4 琼脂糖凝胶制备............................................4
5. 实验结果与分析.................................................5
5.1质粒DNA 提取所得凝胶电泳结果..............................5
5.2 PCR扩增实验结果...........................................5
5.3质粒DNA 的双酶切分析结果..................................6
摘 要：本实验包括质粒DNA 的提取、DNA 的凝胶电泳、质粒DNA 中靶基因的酶切分析及质粒DNA 中重组进的靶DNA 序列的PCR 扩增。通过本综合实验，进一步理解质粒DNA 的提取原理、凝胶电泳中DNA 分离的机理、限制性内切酶的工作原理及PCR 是如何实现DNA 扩增的，也掌握了DNA 的提取技术、凝胶电泳技术、DNA 酶切分析技术及靶基因的体外快速扩增技术，进而了解实验中出现的现象并学会分析与解决实验中出现的有关问题。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR ）是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA 得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA 或RNA 的地方。
关 键 词：凝胶电泳 限制线内切酶 DNA 质粒
1 前言
本次实验对象为含有重组了1kb DNA 片段的PET32.a 表达质粒。该表达质粒中长度约6kb 。首先采用离心破碎法破碎细胞，再使用碱裂解法提取质粒DNA 。最后通过各种化学抽提纯化质粒DNA ，最后得到纯化后的DNA 质粒作为之后实验的材料。在碱性溶液中，双链DNA 氢键断裂，DNA 双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA 分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH 条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA 又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA 则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS 等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA 及小分子量的RNA 则留在上清液中。混杂的RNA 可用RNaseA 酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA 的目的。
PCR 是根据DNA 双螺旋结构在变性温度下解链为单链DNA ，在退火温度下加入反应体系的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA 特异结合，然后在延伸温度下，通过DNA 聚合酶的聚合作用，不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则，由引物引导合成出与模板DNA 互补的新链，实现DNA 的扩增的技术。 本次实验我们将以纯化后的质粒DNA 作实验材料，在预先设计好引物后
用PCR 技术扩增目的片段。
利用提取的质粒DNA 作目的序列的双酶切实验。限制性内切酶能在适当温度、pH 等条件下识别DNA 序列中的特定序列并对识别序列进行有效切割。
利用琼脂糖凝胶电泳，通过电泳结果检验DNA 提取纯度、PCR 和双酶切实验的效果，并对比各组实验效果了解实验各步骤的各项影响因素核试验操作。 2 实验材料和仪器
2.1实验材料
大肠杆菌DH5α（含重组了约1000bp DNA片断的PET32.a 表达质粒，Amp 抗性）
2.2 实验仪器
高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪、小三角瓶、PCR 仪、微量移液器、冰盒、制胶模、电泳仪
3 实验试剂
3.1 DNA提取所需试剂
LB 培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE 缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA （10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖
溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl （pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0) 溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)，现配现用
溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH 值至5.2
3.2 PCR实验所需试剂
实验一提取的质粒DNA ，0.5U/μL 的 Taq酶及5 × PCR buffer、1 mmol/L 的dNTP 、克隆基因特异引物PF 、PR （各1µmol/L），0.2mL 的PCR 管，TIP 头，goldview DNA 染色剂，琼脂糖，10×上样缓冲液，0.5×TBE 、marker DNA等。 PCR 扩增引物： PF：5`—CTCGGATCCATGGAGCTAGCTACTGCGGG —3`
PR：5`—CCGGTCGACTCCATCAATCTTGGAAAGCA —3`
3.3双酶切实验所需试剂
实验一提取的质粒DNA ，BamH I （3 U /μL ），Hind Ⅲ（3 U /μL ），1.5mL 的EP 管，TIP 头，goldview DNA染色剂，琼脂糖，6×上样缓冲液，0.5×TBE 等。
4 实验步骤
4.1 提取质粒DNA
4.1.1 挑LB 固体平板菌落于2ml 含Amp 的LB 液体培养基中，37℃振摇培养过夜。
4.1.2 取1mL 菌液放入Ep 管中，12000 r/min（简写rpm ）离心1min ；弃尽上清。
4.1.3 加入200μL 预冷的含RNaseA 的溶液I ，旋涡以充分混匀。
4.1.4 加入200μL 的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min 以充分裂解细菌。
4.1.5 加入200μL 的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min ，12000rpm 离心5min ；吸上清至另一新的1.5mL EP管，加500μL 氯仿/异戊醇（V ：V=24：1）充分混匀，12000rpm 离心5min 。
4.1.6 移取上清液500μL 至一新1.5mL EP 管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20℃静置10min ，12000 rpm 离心10min ，弃上清；加入200μL 70%乙醇洗DNA 沉淀，12000rpm 离心5min ，倒掉乙醇，再12000rpm 离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干。
4.1.7 加入20μL RTE （含10μg/mL RNaseA 的TE ，pH8.0）溶解质粒DNA ， 37℃放置10min ，乃至30min ，以充分消化RNA 。
4.1.8 取4～5μL 质粒DNA 溶液于另一干净离心管中，加入8μL TE及2μL 上样缓冲液，混匀后全部点样于一个琼脂糖凝胶点样孔中。
4.1.9 打开电源开关，调电压为80～100伏进行电泳。
4.1.10 电泳约40分钟后关掉电源，把凝胶置于紫外仪上观察结果并记录。
4.2 聚合酶链式反应
4.2.1 PCR反应液配制
反应液组分 起始浓度 反应系终浓度 20µL反应体系所需量
取2μL 已稀释20×的质粒DNA 溶液
4µL
4µL
2µL
2µL DNA 模板 引物PF 引物PR dNTP mix 反应buffer
Taq 酶
无菌水H 2O 提取的质粒 5ng 到10ng 1µmol/L 1µmol/L 2.5mmol/L 10× 0.5U/µL — 0.2µmol/L 0.2µmol/L 0.25mmol/L 1× 20µL体系加1U 2µL — 补水至总体积20µL，混匀盖上盖
4.2.2 把上述配制的反应液体系放置于PCR 仪中，并使PCR 仪运行如下PCR 反应程序，实现靶DNA 的扩增。
94℃ 3min→94℃ 50sec→54℃ 50sec→72℃ 1.5min→72℃ 5min
↑ 20循环 ↑
4.2.3 PCR扩增过程中，全班分组按实验一的方法制备1％的琼脂糖凝胶。
4.2.4 PCR 结束后取10µL反应产物，加入2µL上样缓冲液，混匀并全部上样于1％琼脂糖凝胶1点样孔中；每块琼脂糖凝胶分别留一个点样孔并上样5µL marker DNA 做标准分子量大小对照。
4.2.5 接通电源，调电压80～90伏开始电泳，电泳持续约30～40分钟。
4.2.6 切断电源，取出凝胶并置于紫外仪中观察、记录实验结果。
4.3 质粒DNA 的双酶切分析
4.3.1 在一1.5mL 离心管中配制反应体系为20µL的质粒双酶切反应液：
加入成分
质粒DNA （
10×Buffer 加入量 2-5μL 1μL
1μL
1μL
补水至20μL BamH I Hind Ⅲ ddH 2O
用移液器tip 头轻轻混匀。
4.3.2 37℃恒温条件下酶切反应约1-1.5h 。
4.3.3 酶切结束后，往酶切反应管中加入4μL 6×上样缓冲液，轻轻混匀。
4.3.4 取10μL 酶切液点样于琼脂糖凝胶1点样孔中；每块琼脂糖凝胶分别留一个点样孔并上样5µL标准分子量 marker DNA。
4.3.5 接通电源，调电压80～90伏开始电泳，电泳持续约30～40分钟。
4.3.6 切断电源，取出凝胶并置于紫外仪中观察、记录实验结果。
4.4 琼脂糖凝胶制备
4.4.1 称量0.3g 的琼脂糖粉置于一干净的小三角瓶中。
4.4.2 加入30mL 0.5×TBE 于三角瓶中，称出总重量并记录。
4.4.3在微波炉中充分溶解，称溶解后的总重量并用蒸馏水补充至原总重量。
4.4.4 室温条件下放置或自来水冲三角瓶下部到溶液温度冷却到约50度，并经常摇动防止降温不均匀导致局部凝固现象，此时再加入1.5μL goldview 染料(原则上按照100mL 琼脂糖液加goldview 染料3-5μL ) ，混匀。
4.4.5 把混合液倒入一已插入梳子的制胶模具中，让其自然充分凝固。
4.4.6 拔掉梳子，把凝胶转移到电泳槽中，即可用于点样和电泳检测。 5 实验结果与分析
5.1 质粒
DNA 提取所得凝胶电泳结果
bp M 1 2 3 4 5 6
4500
3000
2000
1200
800
图1 质粒DNA 的电泳图
M:DNA marker III；泳道1-6：不同样品提取质粒
上图中有3条相近的条带（第一条最亮），原因是提取的质粒DNA 相对质量相同，但各种因素导致会出现螺旋、线形和开环这三种泳动速度不同的构像。
5.2 PCR扩增实验结果
bp M 1 2 3 4 5 6
4500
3000
2000
1200
800
图2 质粒的PCR 扩增
M:DNA marker III；泳道1-6：PCR 扩增产物
以pF/pR 为引物，使用PCR 克隆技术扩增不同样品的质粒，经凝胶电泳，结果显示扩增片段大小约为1kb ，与预期结果相符（图2）。其中根据显色效果，5号样品扩增结果最为理想。
PCR 基本影响因素有变性-退火温度、引物设计、温度循环参数、不同的DNA 聚合酶、模板序列本身。模板变性温度是决定PCR 反应中双链DNA 解链的温度，达不到就不会产生单链DNA 模板，PCR 不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA 双链会很快复性，因而减少产量。引物退火温度决定PCR 特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA 扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。
引物设计也影响PCR 扩增的特异性，设计引物时会按照模板链长度决定引物长度，使其序列在该长度下仅可能出现一次。还要遵循引物内不含发夹结构等次级结构，引物间不互补。可按特殊需要设计特殊序列或增加其他功能集团。
不同的DNA 聚合酶通常配合不同的目的载体，达到不同的功能与目的。如Taq 酶具有在扩增序列3‘段结果添加一个腺嘌呤，配合相关载体可在扩增后用于载体的构建。酶的最大酶活力和最适催化条件也不同，这也影响PCR 结果。
最后模板序列本身对PCR 也有影响，如模板序列中（G+C）%过大或过小、序列中存在次级结构等因素，这都会影响PCR 扩增结果。
5.3质粒DNA 的双酶切分析结果
bp M 1 2 3 4 5 6
4500
3000
2000
1200
800
图3 重组质粒酶切鉴定
M:DNA marker III；泳道1-6：不同质粒样品双酶切
将重组质粒进行BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定，结果显示：5kb ，6kb 处出现特异性条带（图3）。据分析，实验应现三种条带，一种是没被酶切或仅仅被切了一端的长度还是6kb 的质粒DNA ，该DNA 特点是会再附近出现多种构象导致的三重条带；第二种是已被完整切去目的序列剩下的5kb 的线性DNA ；第三种是被酶切出来的1kb 目的序列。可能酶切效率较低，目的序列较少，不能显示。
实验报告
实验项目名称：基因工程综合实验
所属课程名称：基因工程原理
班 级：12生物工程3班
学 号：[1**********]2
姓 名：李杰锋
指 导 老 师 ：徐学锋
目 录
0. 摘要..........................................................1
1. 前言..........................................................1
2. 实验材料和仪器................................................2
2.1 实验材料 .................................................2
2.2 实验仪器 .................................................2
3. 实验试剂......................................................2
3.1 DNA 提取所需试剂........................................2
3.2 PCR 实验所需试剂 .......................................2
3.3 双酶切实验所需试剂.......................................2
4. 实验步骤......................................................3
4.1 质粒DNA 提取.............................................3
4.2 聚合酶链式反应（PCR ）....................................3
4.3 质粒DNA 的双酶切分析 ....................................4
4.4 琼脂糖凝胶制备............................................4
5. 实验结果与分析.................................................5
5.1质粒DNA 提取所得凝胶电泳结果..............................5
5.2 PCR扩增实验结果...........................................5
5.3质粒DNA 的双酶切分析结果..................................6
摘 要：本实验包括质粒DNA 的提取、DNA 的凝胶电泳、质粒DNA 中靶基因的酶切分析及质粒DNA 中重组进的靶DNA 序列的PCR 扩增。通过本综合实验，进一步理解质粒DNA 的提取原理、凝胶电泳中DNA 分离的机理、限制性内切酶的工作原理及PCR 是如何实现DNA 扩增的，也掌握了DNA 的提取技术、凝胶电泳技术、DNA 酶切分析技术及靶基因的体外快速扩增技术，进而了解实验中出现的现象并学会分析与解决实验中出现的有关问题。
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR ）是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA 得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA 或RNA 的地方。
关 键 词：凝胶电泳 限制线内切酶 DNA 质粒
1 前言
本次实验对象为含有重组了1kb DNA 片段的PET32.a 表达质粒。该表达质粒中长度约6kb 。首先采用离心破碎法破碎细胞，再使用碱裂解法提取质粒DNA 。最后通过各种化学抽提纯化质粒DNA ，最后得到纯化后的DNA 质粒作为之后实验的材料。在碱性溶液中，双链DNA 氢键断裂，DNA 双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA 分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH 条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA 又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA 则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS 等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA 及小分子量的RNA 则留在上清液中。混杂的RNA 可用RNaseA 酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA 的目的。
PCR 是根据DNA 双螺旋结构在变性温度下解链为单链DNA ，在退火温度下加入反应体系的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA 特异结合，然后在延伸温度下，通过DNA 聚合酶的聚合作用，不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则，由引物引导合成出与模板DNA 互补的新链，实现DNA 的扩增的技术。 本次实验我们将以纯化后的质粒DNA 作实验材料，在预先设计好引物后
用PCR 技术扩增目的片段。
利用提取的质粒DNA 作目的序列的双酶切实验。限制性内切酶能在适当温度、pH 等条件下识别DNA 序列中的特定序列并对识别序列进行有效切割。
利用琼脂糖凝胶电泳，通过电泳结果检验DNA 提取纯度、PCR 和双酶切实验的效果，并对比各组实验效果了解实验各步骤的各项影响因素核试验操作。 2 实验材料和仪器
2.1实验材料
大肠杆菌DH5α（含重组了约1000bp DNA片断的PET32.a 表达质粒，Amp 抗性）
2.2 实验仪器
高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪、小三角瓶、PCR 仪、微量移液器、冰盒、制胶模、电泳仪
3 实验试剂
3.1 DNA提取所需试剂
LB 培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE 缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA （10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖
溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl （pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0) 溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)，现配现用
溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH 值至5.2
3.2 PCR实验所需试剂
实验一提取的质粒DNA ，0.5U/μL 的 Taq酶及5 × PCR buffer、1 mmol/L 的dNTP 、克隆基因特异引物PF 、PR （各1µmol/L），0.2mL 的PCR 管，TIP 头，goldview DNA 染色剂，琼脂糖，10×上样缓冲液，0.5×TBE 、marker DNA等。 PCR 扩增引物： PF：5`—CTCGGATCCATGGAGCTAGCTACTGCGGG —3`
PR：5`—CCGGTCGACTCCATCAATCTTGGAAAGCA —3`
3.3双酶切实验所需试剂
实验一提取的质粒DNA ，BamH I （3 U /μL ），Hind Ⅲ（3 U /μL ），1.5mL 的EP 管，TIP 头，goldview DNA染色剂，琼脂糖，6×上样缓冲液，0.5×TBE 等。
4 实验步骤
4.1 提取质粒DNA
4.1.1 挑LB 固体平板菌落于2ml 含Amp 的LB 液体培养基中，37℃振摇培养过夜。
4.1.2 取1mL 菌液放入Ep 管中，12000 r/min（简写rpm ）离心1min ；弃尽上清。
4.1.3 加入200μL 预冷的含RNaseA 的溶液I ，旋涡以充分混匀。
4.1.4 加入200μL 的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min 以充分裂解细菌。
4.1.5 加入200μL 的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min ，12000rpm 离心5min ；吸上清至另一新的1.5mL EP管，加500μL 氯仿/异戊醇（V ：V=24：1）充分混匀，12000rpm 离心5min 。
4.1.6 移取上清液500μL 至一新1.5mL EP 管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20℃静置10min ，12000 rpm 离心10min ，弃上清；加入200μL 70%乙醇洗DNA 沉淀，12000rpm 离心5min ，倒掉乙醇，再12000rpm 离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干。
4.1.7 加入20μL RTE （含10μg/mL RNaseA 的TE ，pH8.0）溶解质粒DNA ， 37℃放置10min ，乃至30min ，以充分消化RNA 。
4.1.8 取4～5μL 质粒DNA 溶液于另一干净离心管中，加入8μL TE及2μL 上样缓冲液，混匀后全部点样于一个琼脂糖凝胶点样孔中。
4.1.9 打开电源开关，调电压为80～100伏进行电泳。
4.1.10 电泳约40分钟后关掉电源，把凝胶置于紫外仪上观察结果并记录。
4.2 聚合酶链式反应
4.2.1 PCR反应液配制
反应液组分 起始浓度 反应系终浓度 20µL反应体系所需量
取2μL 已稀释20×的质粒DNA 溶液
4µL
4µL
2µL
2µL DNA 模板 引物PF 引物PR dNTP mix 反应buffer
Taq 酶
无菌水H 2O 提取的质粒 5ng 到10ng 1µmol/L 1µmol/L 2.5mmol/L 10× 0.5U/µL — 0.2µmol/L 0.2µmol/L 0.25mmol/L 1× 20µL体系加1U 2µL — 补水至总体积20µL，混匀盖上盖
4.2.2 把上述配制的反应液体系放置于PCR 仪中，并使PCR 仪运行如下PCR 反应程序，实现靶DNA 的扩增。
94℃ 3min→94℃ 50sec→54℃ 50sec→72℃ 1.5min→72℃ 5min
↑ 20循环 ↑
4.2.3 PCR扩增过程中，全班分组按实验一的方法制备1％的琼脂糖凝胶。
4.2.4 PCR 结束后取10µL反应产物，加入2µL上样缓冲液，混匀并全部上样于1％琼脂糖凝胶1点样孔中；每块琼脂糖凝胶分别留一个点样孔并上样5µL marker DNA 做标准分子量大小对照。
4.2.5 接通电源，调电压80～90伏开始电泳，电泳持续约30～40分钟。
4.2.6 切断电源，取出凝胶并置于紫外仪中观察、记录实验结果。
4.3 质粒DNA 的双酶切分析
4.3.1 在一1.5mL 离心管中配制反应体系为20µL的质粒双酶切反应液：
加入成分
质粒DNA （
10×Buffer 加入量 2-5μL 1μL
1μL
1μL
补水至20μL BamH I Hind Ⅲ ddH 2O
用移液器tip 头轻轻混匀。
4.3.2 37℃恒温条件下酶切反应约1-1.5h 。
4.3.3 酶切结束后，往酶切反应管中加入4μL 6×上样缓冲液，轻轻混匀。
4.3.4 取10μL 酶切液点样于琼脂糖凝胶1点样孔中；每块琼脂糖凝胶分别留一个点样孔并上样5µL标准分子量 marker DNA。
4.3.5 接通电源，调电压80～90伏开始电泳，电泳持续约30～40分钟。
4.3.6 切断电源，取出凝胶并置于紫外仪中观察、记录实验结果。
4.4 琼脂糖凝胶制备
4.4.1 称量0.3g 的琼脂糖粉置于一干净的小三角瓶中。
4.4.2 加入30mL 0.5×TBE 于三角瓶中，称出总重量并记录。
4.4.3在微波炉中充分溶解，称溶解后的总重量并用蒸馏水补充至原总重量。
4.4.4 室温条件下放置或自来水冲三角瓶下部到溶液温度冷却到约50度，并经常摇动防止降温不均匀导致局部凝固现象，此时再加入1.5μL goldview 染料(原则上按照100mL 琼脂糖液加goldview 染料3-5μL ) ，混匀。
4.4.5 把混合液倒入一已插入梳子的制胶模具中，让其自然充分凝固。
4.4.6 拔掉梳子，把凝胶转移到电泳槽中，即可用于点样和电泳检测。 5 实验结果与分析
5.1 质粒
DNA 提取所得凝胶电泳结果
bp M 1 2 3 4 5 6
4500
3000
2000
1200
800
图1 质粒DNA 的电泳图
M:DNA marker III；泳道1-6：不同样品提取质粒
上图中有3条相近的条带（第一条最亮），原因是提取的质粒DNA 相对质量相同，但各种因素导致会出现螺旋、线形和开环这三种泳动速度不同的构像。
5.2 PCR扩增实验结果
bp M 1 2 3 4 5 6
4500
3000
2000
1200
800
图2 质粒的PCR 扩增
M:DNA marker III；泳道1-6：PCR 扩增产物
以pF/pR 为引物，使用PCR 克隆技术扩增不同样品的质粒，经凝胶电泳，结果显示扩增片段大小约为1kb ，与预期结果相符（图2）。其中根据显色效果，5号样品扩增结果最为理想。
PCR 基本影响因素有变性-退火温度、引物设计、温度循环参数、不同的DNA 聚合酶、模板序列本身。模板变性温度是决定PCR 反应中双链DNA 解链的温度，达不到就不会产生单链DNA 模板，PCR 不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA 双链会很快复性，因而减少产量。引物退火温度决定PCR 特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA 扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。
引物设计也影响PCR 扩增的特异性，设计引物时会按照模板链长度决定引物长度，使其序列在该长度下仅可能出现一次。还要遵循引物内不含发夹结构等次级结构，引物间不互补。可按特殊需要设计特殊序列或增加其他功能集团。
不同的DNA 聚合酶通常配合不同的目的载体，达到不同的功能与目的。如Taq 酶具有在扩增序列3‘段结果添加一个腺嘌呤，配合相关载体可在扩增后用于载体的构建。酶的最大酶活力和最适催化条件也不同，这也影响PCR 结果。
最后模板序列本身对PCR 也有影响，如模板序列中（G+C）%过大或过小、序列中存在次级结构等因素，这都会影响PCR 扩增结果。
5.3质粒DNA 的双酶切分析结果
bp M 1 2 3 4 5 6
4500
3000
2000
1200
800
图3 重组质粒酶切鉴定
M:DNA marker III；泳道1-6：不同质粒样品双酶切
将重组质粒进行BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定，结果显示：5kb ，6kb 处出现特异性条带（图3）。据分析，实验应现三种条带，一种是没被酶切或仅仅被切了一端的长度还是6kb 的质粒DNA ，该DNA 特点是会再附近出现多种构象导致的三重条带；第二种是已被完整切去目的序列剩下的5kb 的线性DNA ；第三种是被酶切出来的1kb 目的序列。可能酶切效率较低，目的序列较少，不能显示。