戊二醛与蛋白质反应的影响因素和反应机理
InfluenceFactorsonReactionsofGlutaraldehyde
withProteinandtheReactionMechanism
李临生 张淑娟(西北轻工业学院应用化学研究所,咸阳712081)
LiLinsheng ZhangShujuan(InstituteofApplied
Chemistry,NorthwestInstituteofLightIndustry,Xianyang712081)
摘 要 戊二醛与蛋白质的反应是二级反应,介质pH值对其反应的速度及产物有明显影响,戊二醛与蛋白质中的伯胺基可形成环状吡啶结构,这是共价交联蛋白质耐水解的主要原因。
关键词 戊二醛 交联 蛋白质 吡啶 反应机理
X
Abstract Theinfluencefactorson
nismwerediscussed.
reactionsof1,5-pentanedialwithproteinsandthereactionmecha-
Keywords
的因素
protein glutaraldehyde crosslinking reactionmechanism.
1 影响戊二醛与蛋白质反应20天左右。反应速度除与蛋白质pH7.0和10.5时反应速度没有显
性质(特别是渗透性)有关外,与浓度、温度、pH值以及其它物质的存
在都有关系。
反应与温度的关系服从Ar-rhenius公式:log10k=常数-△E/2.303RT
1.2pH值
在低pH值下戊二醛与蛋白质的反应进行得很慢,随着pH值的升高,反应迅速加快。一般说反应的最适pH值在等电点附近[1]。氨基酸分子上增加一个羟基对反应最适pH影响不大。
在pH=1.9时,戊二醛不与丙氨酸及赖氨酸反应,但pH提高到3则可以在薄层色谱上发现一个新的点,相应于赖氨酸—戊二醛和丙氨酸—戊二醛的复合物。随着pH值增大这个点变大,并且不可逆地结合,根据放射活性测量,在
pH4.65.26.06.57.2
著区别。与胶原的反应也是在pH3开始可以测量,在pH4—9的
范围内有一迅速增长的趋势,但最适pH在5—6左右。大多数实验指出戊二醛与蛋白质的反应在pH8时最快,高于9时由于戊二醛本身聚合速度的增加,反应速度反而相对下降[4]。表1说明随着pH的提高戊二醛对蛋白质的交联速度加快。
表1 pH值对戊二醛沉淀木瓜蛋
白酶反应的影响沉淀时间>24小时45分10分6分2分
酶活性保留%
50—6040—5035—4530—4020—30
[3]
1.1浓度与温度
戊二醛与胶原的反应是二级反应[1]。在戊二醛过量时,与蛋白质的反应是假一级的。低浓度戊二醛与蛋白质的反应是线性的,反应活化能大约在40KJ/mol左右,因此在一般条件下即可顺利进行。反应速度常数大约是1升/摩・秒。
戊二醛与蛋白质的反应速度并不是均匀的,很多作者指出,反应是分二步进行的,第一阶段比较快而第二阶段比较慢。
在不同pH值下用0.5%戊二醛处理牛血清白蛋白、卵白蛋白和人体C-球蛋白时,反应基本上在1小时内完成,然后速度下降。
与酸性前胶原的反应也是在第一天迅速进行,但达到平衡却要
[2]
X第一作者简介:李临生,男,1941年生,教授
表2 根据C—14测定确定的胶原(袋鼠尾腱)结合的戊二醛量鞣制条件
醛%
pH
以干重计4.05.06.58.04.05.06.58.0
3.03.03.03.012.012.012.012.0
由溶液中损耗计(克)
1.72.32.73.13.54.75.46.5
结合的醛由鞣样测定
%1.31.72.32.42.83.24.34.8
交联
由损耗计
%[**************]0
mol/105g
3468861113
的。但一般说来,通常商业上出售的25%水溶液,虽然含有聚合物等杂质,但与提纯的戊二醛(没有235nm吸收峰)相比,对蛋白质的交联效果差不多,表3中列出了二种戊二醛鞣制羊皮时的效果。当然如果戊二醛溶液粘度大、沉淀多显然也会降低鞣革性能。
半胱氨酸对戊二醛固定木瓜蛋白酶有促进作用而且产物是微晶,若没有半胱氨酸时产物则是纤维状的。
反应混合物中其它物质的存在会干扰戊二醛对蛋白质的反应。盐类或缓冲溶液都会减少戊二醛的结合量,不同的盐类影响也不同。如在磷酸盐中戊二醛与酸性前胶原在40℃反应后,于24℃放置时又会进一步变浑,在40℃加热时也不消失,分子量则相应变大。但在醋酸盐中则形成可溶性的分子量较低的产物。一般说反应混合物的离子强度低则反应较快。
尿素等与戊二醛反应的物质当然对反应也是有影响的。
2 反应机理
戊二醛主要与蛋白质中的氨基结合,但究竟是怎样结合的还没有彻底弄清楚。以下从四个方面进行讨论:
2.1单点结合与双点结合戊二醛与蛋白质的产物与希夫试剂等仍有醛基反应,这说明产物中含有醛基化合物,而且不能用水洗掉。因此不少人指出存在着单点结合。这种情况甚至比甲醛处理的样品还要明显。利用这种性质可以确定戊二醛向组织内渗透的深度[4]。
采用过量蛋白质与戊二醛反应,发现醛基逐渐消失。单点结合可能慢慢转变为双点结合,从胶原分子链中活性氨基的距离远大于单分子戊二醛分子的长度这一点看,似乎是分子内结合或成为环状
表3 市售戊二醛与纯戊二醛的鞣制效果
赖氨酸和羟基
戊二醛空白市售提纯空白市售提纯
pH4.04.04.08.18.18.1
赖氨酸的损失(残基/105)15.414.620.620.2
mmol0.360.430.550.53
57.284.883.158.486.186.0
戊二醛结合量
收缩温度
表4 戊二醛与袋鼠尾腱的反应量(moles/105g胶原)鞣制pH未鞣的4.05.06.58.0
结合的醛14c分析 交联00.2214.9243238
7.58.08.3
游离的30.814.911.18.28.0
氨 基反应的交联的15.919.722.622.8
9.414.615.616.2
单点结合的
6.55.17.06.6
应当指出pH值不仅影响反应的速度也影响产物的性质,比如:在pH4.0时戊二醛与人体C—球蛋白的反应产物是可溶性的,提高pH时产物变为不溶性的。而牛血清白蛋白在pH5.0时的产物是可溶的,其它pH值下产物不溶。在pH6或7的条件下卵白蛋白与牛血清白蛋白联接可得到水溶性产物,而在pH4时的产物是不溶的。由表2可以看出随着pH值的提高交联胶原的量也提高了[5]。
上面主要从化学的角度讨论了反应的动力学。实际上戊二醛与蛋白质组织作用的过程中,如鞣革、杀菌及组织固定等过程中决定
速度的是扩散过程。一般说若提高
浓度、温度,尤其是pH值可以加快反应过程。但每种蛋白质的最适反应条件并不一样,若考虑到渗透与结合,戊二醛与胶原反应的最适pH值约为6—8。提高浓度和pH值会加快鞣制,但也可能造成表面过鞣和鞣剂浪费,所以单独鞣革时戊二醛浓度应小于10%,并注意逐步提碱,在后期适当提温。
1.3其它因素对戊二醛与蛋白质反应的影响
很多研究者指出戊二醛的纯度会影响与蛋白质反应的结果。从超显微形态学的研究角度看,戊二醛中的杂质肯定是影响固定结果
结构产物为主。
采用应力—应变技术测量胶原中与戊二醛发生单点结合和交联的氨基数如表4所示。
不过我们认为聚合态的戊二醛参加交联的情况可能要复杂得多,结合的情况与条件有关。上面的现象并不是戊二醛的两个醛基进行单点结合或双点结合这样简单的原因所造成的。缩合反应会生成多醛基化合物又可以降低醛基含量,而经戊二醛鞣制的胶原在存放过程中收缩温度会略有提高可以说明进一步的交联仍在进行。2.2分子内的交联及分子间的交联
大量的试验表明戊二醛对蛋白质的交联有分子内与分子间的两种形式[4]。
一般说当蛋白质溶液浓度低时主要产生分子内的交联,这样的产物是可溶的。而分子间的交联会使蛋白质分子变大,溶解性降低,在凝胶电泳试验中迁移率减小。对肌动蛋白和原肌凝蛋白的交联作用,分子内的交联被称为G-action(globularform)。分子间的交联称为F-action(fibrousform)。G-作用产生在单个肽链上,产物的分子量45,000,但F-作用产物分子量可以大于106以上[6]。
用0.94%的明胶溶液在40℃于pH4.5时加入戊二醛(0.45%,g/100ml溶液)来研究产物粘度的变化,发现第一天产物的粘度迅速下降而以后则保持基本不变,说明这种条件下很少发生分子间的交联,而分子内的交联也是稳定的。因为在不加入戊二醛时明胶粘度是慢慢降低的。
在pH7.1时处理的胶原进行电泳实验时发现,A,B,C组份没有明显变化,但高度交联的X组份显著增加。这说明戊二醛交联活性
高,而且在这种条件下主要是分子间的交联。
2.3反应产物的紫外光谱Filachione等人发现戊二醛鞣制的胶原在6N盐酸中回流16个小时,并不像甲醛、丙烯醛、巴豆醛那样会重新析出醛,它的水解液与2,4—二硝基苯肼试剂不产生沉淀,但在250—320nm的波段有吸收峰,通常认为这是芳香族氨基酸存在的特征。但空白试验表明,水解液中芳香族氨基酸存在很少,并不产生显著的吸收。
胶原和明胶与戊二醛反应产物的水解液在265nm处有一吸收峰,羊毛和酪蛋白的情况也相似,但由于芳香族氨基酸含量较多,它们在275nm附近的吸收使峰形变得较宽。曾利用这一特点来测定被革结合的戊二醛。研究了在265nm吸长下的吸光度与被革吸收的戊二醛的关系时,发现在相当宽的范围内戊二醛结合量在100mg/g蛋白以内呈直线关系,铬盐对此没有干扰。
[8]
Bowes等人进一步肯定了胶原可吸收10—12%的戊二醛。[4]
[7]
pH4.5时反应产物吸收峰在264nm处,在pH13.0时,则在436nm和528nm处出现吸收峰,如果在pH4.5时加入0.5MCaCl2和KSCN或者脲,那么吸收则在436nm处。在pH4.5时KSCN会使264nm处的峰形不清楚,在pH13.0时则完全消失。
作为油鞣革预鞣剂时,0.5%戊二醛鞣制的革在6N盐酸中水解数小时出现的峰在243nm处,若用1%或2%的戊二醛则有三个峰(243、264、292nm),利用同样浓度预鞣的麂皮有二个峰(249、308nm)。
Bowes等人的试验表明在265nm处产生吸收的物质主要是戊二醛与氨基,尤其是赖氨酸的—氨基反应造成的,其组成复杂,E
而且与反应条件有关,其中可能有一种产物是由六个戊二醛分子与二个赖氨酸残基形成的。Habeeb等人认为在265nm处的吸收峰是由于戊二醛与酪氨酸反应的结果,因为他们用不含酪氨酸和色氨酸的鲑精朊与戊二醛反应时不出现这种吸收峰。化学分析也表明经戊二醛处理后蛋白质的酪氨酸含量是降低了。Hopwood等[11]也认为是这样,并指出吸收向短波方向的转移,但随着颜色变黄,有时会出现沉淀,这些现象与蛋白质的分子量、赖氨酸含量及总的芳香族氨基酸含量并没有关系[11]。
总之,戊二醛与不同的蛋白质,在不同条件下的电子光谱是不同的,这说明在不同条件下即使是消耗了同样多的戊二醛,产物的结构组成也会有不同。因此若不确定条件则不能通过测定在264nm处吸收强度的变化来确定反应程度,这一吸收强度与直接测定的戊二醛结合量并没有正比的关系。
2.4戊二醛与蛋白质的结合
[10]
在这个范围内265nm峰吸光度、赖氨酸残基的减少与吸收的醛量呈直线关系,每个赖氨酸残基可结合4—5毫摩尔戊二醛。虽然这些戊二醛并不完全是牢固结合的,但除去相当数量的游离醛后紫外吸收光谱没有什么变化。按被取代的E—氨基计算其摩尔吸光系数约为5×10。
其它的醛,如丙二醛、丙烯醛与胶原反应产物的水解液在265nm处也会有吸收,但峰形不明显。虽然卵白蛋白和牛血清白蛋白与戊二醛反应物在pH8.0的硼酸盐缓冲液中在265nm处也有吸收峰,但一般讲电子光谱要受到蛋白质的性质和反应条件的影响。
[9]
Thies等人指出戊二醛与明胶在
3
方式
醛与蛋白质的反应主要是羰基与氨基的反应,但并不是所有的醛都有鞣性。有人认为饱和醛具有鞣性大概是可以生成水合物的缘故,但后来又发现不尽如此。后来又提出过蛋白质中只有可以自由旋转的带孤对电子的氨基才有反应能力及双官能团化合物可产生交联的观点。这些推测虽能说明很多试验事实,但未涉及到反应的本质。
众所周知,醛与伯胺可以通过亲核反应生成希夫碱,因此戊二醛也会与伯胺基反应生成类似希夫碱的产物,很多作者都是这样考虑的[4]。
P—NH2+OHC—R—→P—N=CH-R+H2O
的pka值是8—8.5。根据这些特点Richards等人曾提出戊二醛可能通过Michael反应与蛋白质结合。他们认为这样的生成物是稳定的,其pka值也与实际产物相符。不过A、B—不饱和醛一般不发生Michael反应,而容易发生Kno-evenagel反应,这两种反应也都是可逆的。另外,这样也不易解释很多研究者所指出的单体戊二醛与蛋白质反应性能较好这一事实。此外已确定戊二醛与蛋白质反应时有水生成,其它的A、—不饱和醛B并不具有良好的交联性能,这些现象很难用上述的观点说明。Bowes则认为赖氨酸残基转化为相应的E—醛,又发生羟醛缩合生成不饱和醛,再进一步与氨基反应产生交联的可能性。但这仍不好解释产物的特殊稳定性等现象。
[3]
Monsan等人通过模型实验,示踪原子法、色谱、红外光谱、
[8]
共振稳定了结构,而产物的憎水性则进一步提高了对水解的抵抗能力。他们认为当氨基化合物过量时,可能发生对碳碳双键的加成
(即Richards提出的Michael反应),不过在蛋白质中这种情况大概很难出现。
在酸性介质中戊二醛与氨基化合物可生成希夫碱类型的产物是可以肯定的,有人采用E-氨基已酸作为胶原模型物与戊二醛反应,发现产物是HOOC(CH2)2N=CH(CH2)3CH=N(CH2)5COOH,它在269nm处有一强的吸收峰。不过对蛋白质来说问题不会这么简单。
人们很早就知道戊二醛与羟胺作用生成吡啶,吡啶也可转化为戊二醛[4]。
[12]
Lubig在研究羊毛与戊二醛的反应时,采用烷基胺为模型物与
但我们知道这一反应是可逆的,脂肪族醛生成的希夫碱不稳定,生成物很易被酸水解。但大量试验证明,戊二醛能与蛋白质发生不可逆的结合,它能使水解液中赖氨酸含量显著降低。别外,我们知道脂肪族醛亚胺的pKa值一般不高于5,而戊二醛与赖氨酸反应物
戊二醛反应,他们从反应混合物中分离出了N-烷基-2,6一二羟基四氢吡啶与2,6一二羟基四氢吡喃的聚醚,他们认为可能有如下反应
:
核磁共振、质谱等研究手段研究了戊二醛与蛋白质的反应,他们认为是由于生成的醛亚胺中的碳氮双键与碳碳双键形成共轭体系,通过
也有曾提出过戊二醛与伯胺基反应会生成N-烷基—烷氨基氢化吡啶的见解[4]。
[13]
-Hardy等人根据模型物E氨基已酸及A-乙酰基赖氨酸与戊
二醛反应产物的研究,认为形成了下面的化合物
:
其紫外吸收峰在265nm处,红外、核磁、元素分析、电势滴定、离子交换色谱、氨基酸分析以及化
学特性都支持这一形成吡啶正离子盐的结构。
因此他们认为戊二醛与蛋白
质也可能发生类似的结合,三个戊二醛分子与一个赖氨酸侧链可以生成
:
当然,色谱分析的结果证明产物是很复杂的,如戊二醛与6-氨基已酸的反应产物就至少有12种,因此上述反应仅是可能反应中的一种。
后来他们将戊二醛与卵白蛋白的产物进行酸性水解,又得到1-(5-氨基-5-羧基戊基)吡啶正离子盐。
结 论
戊二醛与蛋白质的反应产物是相当复杂的,其结构依条件不同而有所不同;戊二醛可与蛋白质分子中的E-氨基、肽链N-端氨基等伯胺基、杂环上的亚胺基、巯基、羟基以及酰胺基反应;其中与赖氨酸的E-氨基的结合最为牢固;在反应时,第一步是羰基与氨基的缩合生成希夫碱结构;共轭结构、环状结构稳定了这种结合;反应并不
停留在形成醛亚胺的结构这一步,而是会有进一步的反应;这些反应会被某些条件所促进,而形成更复杂的产物;其中有吡啶高价正离子盐的衍生物。它是一种相当稳定的结合,是引起蛋白质氨基酸分析时赖氨酸损失以及水解液出现新的紫外吸收峰的重要原因。
参考文献
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Cuir,63,5—6(1971)
2 Hopwood,D.Histochem.J2(2),
137—150(1970),Histochemie,24(1),56—64(1970)
3 Monsan,P.etal,Biochem,J,2
(2),137—150(11—12),1281—1292(1975)
4 李临生,戊二醛化学,轻工技术资
料,28,1,1—72,1981
5 Jansen,E.F.etal.Arch.Biochem,Biophys.129,221(1969)
6 Lehrer,s.s.Biochem,Biophys.
Res.Commum.48(4),967(1972)7 Filachione,E.M.etal.J.A.L.C.
A,62(6),450(1967)
8 Bowes,J.H.etal.Biochim.Bio-physActa,168(2),341(1968)9 Thies,C.etal.J.Colloid.Inter-face,Sci.27(4),673(1968)10 Habeeb,
(1968)
11Hopwood,D.Progr.Histochem.Cy-tochem.4,193(1972),
Histo-Chemie24(1)56(1970),His-tochem,J.2(2),137(1970),His-tochem.J.4(4),267(1972)12 Lubig,R.DissertationTechnische
HochshuleAachen,(1972)13 Hardy,P.M.etal,J.C.S.
ParkinT.I,9,958(1976),J.C.S.ChemComm,5,157(1976).
A.F.S.A.
Arch.
Biochem,Biophys.126(1),16
(收稿:1996年12月 编辑:王碧校对:周富春 王碧)
戊二醛与蛋白质反应的影响因素和反应机理
InfluenceFactorsonReactionsofGlutaraldehyde
withProteinandtheReactionMechanism
李临生 张淑娟(西北轻工业学院应用化学研究所,咸阳712081)
LiLinsheng ZhangShujuan(InstituteofApplied
Chemistry,NorthwestInstituteofLightIndustry,Xianyang712081)
摘 要 戊二醛与蛋白质的反应是二级反应,介质pH值对其反应的速度及产物有明显影响,戊二醛与蛋白质中的伯胺基可形成环状吡啶结构,这是共价交联蛋白质耐水解的主要原因。
关键词 戊二醛 交联 蛋白质 吡啶 反应机理
X
Abstract Theinfluencefactorson
nismwerediscussed.
reactionsof1,5-pentanedialwithproteinsandthereactionmecha-
Keywords
的因素
protein glutaraldehyde crosslinking reactionmechanism.
1 影响戊二醛与蛋白质反应20天左右。反应速度除与蛋白质pH7.0和10.5时反应速度没有显
性质(特别是渗透性)有关外,与浓度、温度、pH值以及其它物质的存
在都有关系。
反应与温度的关系服从Ar-rhenius公式:log10k=常数-△E/2.303RT
1.2pH值
在低pH值下戊二醛与蛋白质的反应进行得很慢,随着pH值的升高,反应迅速加快。一般说反应的最适pH值在等电点附近[1]。氨基酸分子上增加一个羟基对反应最适pH影响不大。
在pH=1.9时,戊二醛不与丙氨酸及赖氨酸反应,但pH提高到3则可以在薄层色谱上发现一个新的点,相应于赖氨酸—戊二醛和丙氨酸—戊二醛的复合物。随着pH值增大这个点变大,并且不可逆地结合,根据放射活性测量,在
pH4.65.26.06.57.2
著区别。与胶原的反应也是在pH3开始可以测量,在pH4—9的
范围内有一迅速增长的趋势,但最适pH在5—6左右。大多数实验指出戊二醛与蛋白质的反应在pH8时最快,高于9时由于戊二醛本身聚合速度的增加,反应速度反而相对下降[4]。表1说明随着pH的提高戊二醛对蛋白质的交联速度加快。
表1 pH值对戊二醛沉淀木瓜蛋
白酶反应的影响沉淀时间>24小时45分10分6分2分
酶活性保留%
50—6040—5035—4530—4020—30
[3]
1.1浓度与温度
戊二醛与胶原的反应是二级反应[1]。在戊二醛过量时,与蛋白质的反应是假一级的。低浓度戊二醛与蛋白质的反应是线性的,反应活化能大约在40KJ/mol左右,因此在一般条件下即可顺利进行。反应速度常数大约是1升/摩・秒。
戊二醛与蛋白质的反应速度并不是均匀的,很多作者指出,反应是分二步进行的,第一阶段比较快而第二阶段比较慢。
在不同pH值下用0.5%戊二醛处理牛血清白蛋白、卵白蛋白和人体C-球蛋白时,反应基本上在1小时内完成,然后速度下降。
与酸性前胶原的反应也是在第一天迅速进行,但达到平衡却要
[2]
X第一作者简介:李临生,男,1941年生,教授
表2 根据C—14测定确定的胶原(袋鼠尾腱)结合的戊二醛量鞣制条件
醛%
pH
以干重计4.05.06.58.04.05.06.58.0
3.03.03.03.012.012.012.012.0
由溶液中损耗计(克)
1.72.32.73.13.54.75.46.5
结合的醛由鞣样测定
%1.31.72.32.42.83.24.34.8
交联
由损耗计
%[**************]0
mol/105g
3468861113
的。但一般说来,通常商业上出售的25%水溶液,虽然含有聚合物等杂质,但与提纯的戊二醛(没有235nm吸收峰)相比,对蛋白质的交联效果差不多,表3中列出了二种戊二醛鞣制羊皮时的效果。当然如果戊二醛溶液粘度大、沉淀多显然也会降低鞣革性能。
半胱氨酸对戊二醛固定木瓜蛋白酶有促进作用而且产物是微晶,若没有半胱氨酸时产物则是纤维状的。
反应混合物中其它物质的存在会干扰戊二醛对蛋白质的反应。盐类或缓冲溶液都会减少戊二醛的结合量,不同的盐类影响也不同。如在磷酸盐中戊二醛与酸性前胶原在40℃反应后,于24℃放置时又会进一步变浑,在40℃加热时也不消失,分子量则相应变大。但在醋酸盐中则形成可溶性的分子量较低的产物。一般说反应混合物的离子强度低则反应较快。
尿素等与戊二醛反应的物质当然对反应也是有影响的。
2 反应机理
戊二醛主要与蛋白质中的氨基结合,但究竟是怎样结合的还没有彻底弄清楚。以下从四个方面进行讨论:
2.1单点结合与双点结合戊二醛与蛋白质的产物与希夫试剂等仍有醛基反应,这说明产物中含有醛基化合物,而且不能用水洗掉。因此不少人指出存在着单点结合。这种情况甚至比甲醛处理的样品还要明显。利用这种性质可以确定戊二醛向组织内渗透的深度[4]。
采用过量蛋白质与戊二醛反应,发现醛基逐渐消失。单点结合可能慢慢转变为双点结合,从胶原分子链中活性氨基的距离远大于单分子戊二醛分子的长度这一点看,似乎是分子内结合或成为环状
表3 市售戊二醛与纯戊二醛的鞣制效果
赖氨酸和羟基
戊二醛空白市售提纯空白市售提纯
pH4.04.04.08.18.18.1
赖氨酸的损失(残基/105)15.414.620.620.2
mmol0.360.430.550.53
57.284.883.158.486.186.0
戊二醛结合量
收缩温度
表4 戊二醛与袋鼠尾腱的反应量(moles/105g胶原)鞣制pH未鞣的4.05.06.58.0
结合的醛14c分析 交联00.2214.9243238
7.58.08.3
游离的30.814.911.18.28.0
氨 基反应的交联的15.919.722.622.8
9.414.615.616.2
单点结合的
6.55.17.06.6
应当指出pH值不仅影响反应的速度也影响产物的性质,比如:在pH4.0时戊二醛与人体C—球蛋白的反应产物是可溶性的,提高pH时产物变为不溶性的。而牛血清白蛋白在pH5.0时的产物是可溶的,其它pH值下产物不溶。在pH6或7的条件下卵白蛋白与牛血清白蛋白联接可得到水溶性产物,而在pH4时的产物是不溶的。由表2可以看出随着pH值的提高交联胶原的量也提高了[5]。
上面主要从化学的角度讨论了反应的动力学。实际上戊二醛与蛋白质组织作用的过程中,如鞣革、杀菌及组织固定等过程中决定
速度的是扩散过程。一般说若提高
浓度、温度,尤其是pH值可以加快反应过程。但每种蛋白质的最适反应条件并不一样,若考虑到渗透与结合,戊二醛与胶原反应的最适pH值约为6—8。提高浓度和pH值会加快鞣制,但也可能造成表面过鞣和鞣剂浪费,所以单独鞣革时戊二醛浓度应小于10%,并注意逐步提碱,在后期适当提温。
1.3其它因素对戊二醛与蛋白质反应的影响
很多研究者指出戊二醛的纯度会影响与蛋白质反应的结果。从超显微形态学的研究角度看,戊二醛中的杂质肯定是影响固定结果
结构产物为主。
采用应力—应变技术测量胶原中与戊二醛发生单点结合和交联的氨基数如表4所示。
不过我们认为聚合态的戊二醛参加交联的情况可能要复杂得多,结合的情况与条件有关。上面的现象并不是戊二醛的两个醛基进行单点结合或双点结合这样简单的原因所造成的。缩合反应会生成多醛基化合物又可以降低醛基含量,而经戊二醛鞣制的胶原在存放过程中收缩温度会略有提高可以说明进一步的交联仍在进行。2.2分子内的交联及分子间的交联
大量的试验表明戊二醛对蛋白质的交联有分子内与分子间的两种形式[4]。
一般说当蛋白质溶液浓度低时主要产生分子内的交联,这样的产物是可溶的。而分子间的交联会使蛋白质分子变大,溶解性降低,在凝胶电泳试验中迁移率减小。对肌动蛋白和原肌凝蛋白的交联作用,分子内的交联被称为G-action(globularform)。分子间的交联称为F-action(fibrousform)。G-作用产生在单个肽链上,产物的分子量45,000,但F-作用产物分子量可以大于106以上[6]。
用0.94%的明胶溶液在40℃于pH4.5时加入戊二醛(0.45%,g/100ml溶液)来研究产物粘度的变化,发现第一天产物的粘度迅速下降而以后则保持基本不变,说明这种条件下很少发生分子间的交联,而分子内的交联也是稳定的。因为在不加入戊二醛时明胶粘度是慢慢降低的。
在pH7.1时处理的胶原进行电泳实验时发现,A,B,C组份没有明显变化,但高度交联的X组份显著增加。这说明戊二醛交联活性
高,而且在这种条件下主要是分子间的交联。
2.3反应产物的紫外光谱Filachione等人发现戊二醛鞣制的胶原在6N盐酸中回流16个小时,并不像甲醛、丙烯醛、巴豆醛那样会重新析出醛,它的水解液与2,4—二硝基苯肼试剂不产生沉淀,但在250—320nm的波段有吸收峰,通常认为这是芳香族氨基酸存在的特征。但空白试验表明,水解液中芳香族氨基酸存在很少,并不产生显著的吸收。
胶原和明胶与戊二醛反应产物的水解液在265nm处有一吸收峰,羊毛和酪蛋白的情况也相似,但由于芳香族氨基酸含量较多,它们在275nm附近的吸收使峰形变得较宽。曾利用这一特点来测定被革结合的戊二醛。研究了在265nm吸长下的吸光度与被革吸收的戊二醛的关系时,发现在相当宽的范围内戊二醛结合量在100mg/g蛋白以内呈直线关系,铬盐对此没有干扰。
[8]
Bowes等人进一步肯定了胶原可吸收10—12%的戊二醛。[4]
[7]
pH4.5时反应产物吸收峰在264nm处,在pH13.0时,则在436nm和528nm处出现吸收峰,如果在pH4.5时加入0.5MCaCl2和KSCN或者脲,那么吸收则在436nm处。在pH4.5时KSCN会使264nm处的峰形不清楚,在pH13.0时则完全消失。
作为油鞣革预鞣剂时,0.5%戊二醛鞣制的革在6N盐酸中水解数小时出现的峰在243nm处,若用1%或2%的戊二醛则有三个峰(243、264、292nm),利用同样浓度预鞣的麂皮有二个峰(249、308nm)。
Bowes等人的试验表明在265nm处产生吸收的物质主要是戊二醛与氨基,尤其是赖氨酸的—氨基反应造成的,其组成复杂,E
而且与反应条件有关,其中可能有一种产物是由六个戊二醛分子与二个赖氨酸残基形成的。Habeeb等人认为在265nm处的吸收峰是由于戊二醛与酪氨酸反应的结果,因为他们用不含酪氨酸和色氨酸的鲑精朊与戊二醛反应时不出现这种吸收峰。化学分析也表明经戊二醛处理后蛋白质的酪氨酸含量是降低了。Hopwood等[11]也认为是这样,并指出吸收向短波方向的转移,但随着颜色变黄,有时会出现沉淀,这些现象与蛋白质的分子量、赖氨酸含量及总的芳香族氨基酸含量并没有关系[11]。
总之,戊二醛与不同的蛋白质,在不同条件下的电子光谱是不同的,这说明在不同条件下即使是消耗了同样多的戊二醛,产物的结构组成也会有不同。因此若不确定条件则不能通过测定在264nm处吸收强度的变化来确定反应程度,这一吸收强度与直接测定的戊二醛结合量并没有正比的关系。
2.4戊二醛与蛋白质的结合
[10]
在这个范围内265nm峰吸光度、赖氨酸残基的减少与吸收的醛量呈直线关系,每个赖氨酸残基可结合4—5毫摩尔戊二醛。虽然这些戊二醛并不完全是牢固结合的,但除去相当数量的游离醛后紫外吸收光谱没有什么变化。按被取代的E—氨基计算其摩尔吸光系数约为5×10。
其它的醛,如丙二醛、丙烯醛与胶原反应产物的水解液在265nm处也会有吸收,但峰形不明显。虽然卵白蛋白和牛血清白蛋白与戊二醛反应物在pH8.0的硼酸盐缓冲液中在265nm处也有吸收峰,但一般讲电子光谱要受到蛋白质的性质和反应条件的影响。
[9]
Thies等人指出戊二醛与明胶在
3
方式
醛与蛋白质的反应主要是羰基与氨基的反应,但并不是所有的醛都有鞣性。有人认为饱和醛具有鞣性大概是可以生成水合物的缘故,但后来又发现不尽如此。后来又提出过蛋白质中只有可以自由旋转的带孤对电子的氨基才有反应能力及双官能团化合物可产生交联的观点。这些推测虽能说明很多试验事实,但未涉及到反应的本质。
众所周知,醛与伯胺可以通过亲核反应生成希夫碱,因此戊二醛也会与伯胺基反应生成类似希夫碱的产物,很多作者都是这样考虑的[4]。
P—NH2+OHC—R—→P—N=CH-R+H2O
的pka值是8—8.5。根据这些特点Richards等人曾提出戊二醛可能通过Michael反应与蛋白质结合。他们认为这样的生成物是稳定的,其pka值也与实际产物相符。不过A、B—不饱和醛一般不发生Michael反应,而容易发生Kno-evenagel反应,这两种反应也都是可逆的。另外,这样也不易解释很多研究者所指出的单体戊二醛与蛋白质反应性能较好这一事实。此外已确定戊二醛与蛋白质反应时有水生成,其它的A、—不饱和醛B并不具有良好的交联性能,这些现象很难用上述的观点说明。Bowes则认为赖氨酸残基转化为相应的E—醛,又发生羟醛缩合生成不饱和醛,再进一步与氨基反应产生交联的可能性。但这仍不好解释产物的特殊稳定性等现象。
[3]
Monsan等人通过模型实验,示踪原子法、色谱、红外光谱、
[8]
共振稳定了结构,而产物的憎水性则进一步提高了对水解的抵抗能力。他们认为当氨基化合物过量时,可能发生对碳碳双键的加成
(即Richards提出的Michael反应),不过在蛋白质中这种情况大概很难出现。
在酸性介质中戊二醛与氨基化合物可生成希夫碱类型的产物是可以肯定的,有人采用E-氨基已酸作为胶原模型物与戊二醛反应,发现产物是HOOC(CH2)2N=CH(CH2)3CH=N(CH2)5COOH,它在269nm处有一强的吸收峰。不过对蛋白质来说问题不会这么简单。
人们很早就知道戊二醛与羟胺作用生成吡啶,吡啶也可转化为戊二醛[4]。
[12]
Lubig在研究羊毛与戊二醛的反应时,采用烷基胺为模型物与
但我们知道这一反应是可逆的,脂肪族醛生成的希夫碱不稳定,生成物很易被酸水解。但大量试验证明,戊二醛能与蛋白质发生不可逆的结合,它能使水解液中赖氨酸含量显著降低。别外,我们知道脂肪族醛亚胺的pKa值一般不高于5,而戊二醛与赖氨酸反应物
戊二醛反应,他们从反应混合物中分离出了N-烷基-2,6一二羟基四氢吡啶与2,6一二羟基四氢吡喃的聚醚,他们认为可能有如下反应
:
核磁共振、质谱等研究手段研究了戊二醛与蛋白质的反应,他们认为是由于生成的醛亚胺中的碳氮双键与碳碳双键形成共轭体系,通过
也有曾提出过戊二醛与伯胺基反应会生成N-烷基—烷氨基氢化吡啶的见解[4]。
[13]
-Hardy等人根据模型物E氨基已酸及A-乙酰基赖氨酸与戊
二醛反应产物的研究,认为形成了下面的化合物
:
其紫外吸收峰在265nm处,红外、核磁、元素分析、电势滴定、离子交换色谱、氨基酸分析以及化
学特性都支持这一形成吡啶正离子盐的结构。
因此他们认为戊二醛与蛋白
质也可能发生类似的结合,三个戊二醛分子与一个赖氨酸侧链可以生成
:
当然,色谱分析的结果证明产物是很复杂的,如戊二醛与6-氨基已酸的反应产物就至少有12种,因此上述反应仅是可能反应中的一种。
后来他们将戊二醛与卵白蛋白的产物进行酸性水解,又得到1-(5-氨基-5-羧基戊基)吡啶正离子盐。
结 论
戊二醛与蛋白质的反应产物是相当复杂的,其结构依条件不同而有所不同;戊二醛可与蛋白质分子中的E-氨基、肽链N-端氨基等伯胺基、杂环上的亚胺基、巯基、羟基以及酰胺基反应;其中与赖氨酸的E-氨基的结合最为牢固;在反应时,第一步是羰基与氨基的缩合生成希夫碱结构;共轭结构、环状结构稳定了这种结合;反应并不
停留在形成醛亚胺的结构这一步,而是会有进一步的反应;这些反应会被某些条件所促进,而形成更复杂的产物;其中有吡啶高价正离子盐的衍生物。它是一种相当稳定的结合,是引起蛋白质氨基酸分析时赖氨酸损失以及水解液出现新的紫外吸收峰的重要原因。
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(收稿:1996年12月 编辑:王碧校对:周富春 王碧)