AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒
本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至8 μg DNA（70bp-10Kb ），回收率为60-85%。琼脂糖凝胶在温和的缓冲液(DE-A溶液) 中熔化，其中的保护剂能防止线状DNA 在高温下降解，然后在DE-B 溶液的作用下使DNA 选择性结合到膜上。纯化的DNA 纯度高，并保持片断完整性和高生物活性，可直接用于连接、体外转录、PCR 扩增、测序、微注射等分子生物学实验。
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
Cat. No.
制备次数 制备管
2 ml离心管 1.5 ml离心管 Buffer DE-A Buffer DE-B Buffer W1
Buffer W2 concentrate Eluent 说明书
AP-GX-4 AP-GX-50 AP-GX-250 4 preps 50 preps 250 preps
4 50 250 4 50 250 4 50 250 6 ml 2×33 ml 2×165 ml 3 ml 33 ml 165 ml 2.8 ml 28 ml 135 ml 2.4 ml 24 ml 2×72 ml 1 ml 5 ml 25 ml
1 1 1
Buffer DE-A：凝胶熔化剂，含DNA 保护剂，防止DNA 在高温下降解。室温密闭贮存。
Buffer DE-B：结合液（促使大于70bp 的DNA 片段选择性结合到DNA 制备膜上）。室温密闭贮存。 Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。
Buffer W2 concentrate：去盐液，使用前，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇（用100%乙醇或95%
乙醇），混合均匀，室温密闭贮存。
Eluent ：洗脱液，室温密闭贮存。
二、注意事项
1. Buffer DE-A(含有β-巯基乙醇) 、Buffer DE-B和Buffer W1含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
2. 在步骤1中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间（线型DNA 长时间暴露在高温条件下易于水解），从而提高回收率。勿将含DNA 的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA 造成的损伤。
爱思进生物技术（杭州）有限公司 电话：0571-88124015 传真：0571-88995569 E-mail: [email protected] www.axygen.com.cn
3. 在步骤2中凝胶必须完全熔化，否则将严重影响DNA 回收率。 4. 将Eluent 或去离子水加热至65°C ，有利于提高洗脱效率。
5. DNA分子呈酸性，建议在2.5 mM Tris-HCl，pH 7.0-8.5洗脱液中保存。
三、实验准备
1. 第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。
2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip 头、离心管。 3. 准备75°C 水浴。
4. 使用前，检查Buffer DE-B是否出现沉淀，若出现沉淀，应于70°C 温浴加热熔化并冷却至室温后再
使用。
四、操作步骤
1. 在紫外灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录1.5 ml 离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100 mg=100 μl 体积）。
2. 加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75°C 加热（低熔点琼脂糖凝胶于40°C 加热），间断混合（每2-3 min），直至凝胶块完全熔化（约6-8 min）。
* Buffer DE-A为红色溶液。在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。
3. 加0.5个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA 片段小于400bp 时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。
* 加Buffer DE-B后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。
步骤4-6可以选择负压法或离心法。 A. 负压法
4A. 正确连接负压装置，将DNA 制备管插到负压装置的插口上。吸取步骤3中的混合液，转移到
制备管中，开启并调节负压至-25-30英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。 5A. 加500 μl Buffer W1，吸尽管中溶液。
6A. 加700 μl Buffer W2，吸尽管中溶液。以同样的方法再用700 μl Buffer W2洗涤一次。
* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
* 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响。
7A. 将制备管置于2 ml离心管（试剂盒提供）中，12,000×g 离心1 min。
爱思进生物技术（杭州）有限公司 电话：0571-88124015 传真：0571-88995569 E-mail: [email protected] www.axygen.com.cn
B. 离心法
4B. 吸取步骤3中的混合液，转移到DNA 制备管（置于2 ml（试剂盒内提供）离心管）中，12,000×g
离心1 min。弃滤液。
5B. 将制备管置回2 ml离心管，加500 μl Buffer W1，12,000×g 离心30 s，弃滤液。
6B. 将制备管置回2 ml离心管，加700 μl Buffer W2，12,000×g 离心30 s，弃滤液。以同样的方法
再用700 μl Buffer W2洗涤一次12,000×g 离心1 min。
* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响。
7B. 将制备管置回2 ml离心管中，12,000
×g
离心1 min。
8. 将制备管置于洁净的1.5 ml 离心管(试剂盒内提供) 中，在制备膜中央加25-30 μl Eluent或去离子水，室温静置1 min。12,000×g 离心1 min洗脱DNA 。
* 将Eluent 或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率。
五、流程图
计算凝胶体积
加3倍凝胶体积 Buffer DE-A ，温浴75°C 熔化凝胶
加含0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B
加500 μl Buffer W1
加700 μl Buffer W2 加700 μl Buffer W2
加25-30 μl Eluent或去离子水
爱思进生物技术（杭州）有限公司 电话：0571-88124015 传真：0571-88995569 E-mail: [email protected] www.axygen.com.cn
含有目的DNA 凝胶
熔化 结合
洗涤
洗脱
六、常见问题分析
主要问题 回收率低
原因
1. 目的片段结合量低
1) 琼脂糖凝胶未完全熔化时目的片段只有部分结合到膜上，导致其余的片段在后续洗涤过程中丢失以及出现制备管堵塞现象，最终影响回收效率。
2) 小于400bp 的片段未加异丙醇
3) 电泳缓冲液pH 值过高，影响目的片段的结合
2. 结合的DNA 片段过早的被洗脱
3. 洗脱效率低
Buffer W2中未加无水乙醇或者乙醇浓度不是95 - 100%的
洗脱液或者去离子水65°C 预热以及增加洗脱前静置时间至5min ，都可提高洗脱效率。
选用合适浓度的琼脂糖凝胶电泳，上样量不超过制备管的最大结合量（8μg ）。
后续酶促反应不理想
1. 盐污染
2. 乙醇污染
3. 琼脂糖残留
4. 洗脱产物中含有ssDNA
确保用Buffer W2洗涤2次。
在最后一次Buffer W2洗涤后可将制备管离心时间由原来1min 增加至2min 。
切胶时尽可能去除不含有DNA 片段部分的凝胶以便于对琼脂糖的处理，确保琼脂糖块在Buffer DE-A中完全熔化。
将洗脱产物95℃加热2min ，慢慢冷却至室温，使单链DNA 重新退火即可。
最后一次Buffer W2洗涤完后不要将制备管放于负压装置上抽得过干。
确保加入正确的乙醇量。每次使用后应拧紧瓶盖，以免乙醇挥发，降低回收率。 建议加入10μl 3M NaAC中和。
务必确保已加入1倍凝胶体积的异丙醇（100%）。建议
在切胶时尽可能去除不含目的片段的琼脂糖，确保buffer DE-A的正确用量。在熔胶过程中要仔细检查确保无固体琼脂糖残留，间隔性的对样品进行摇晃促进凝胶的充分熔化。
爱思进生物技术（杭州）有限公司 电话：0571-88124015 传真：0571-88995569 E-mail: [email protected] www.axygen.com.cn
AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒
本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至8 μg DNA（70bp-10Kb ），回收率为60-85%。琼脂糖凝胶在温和的缓冲液(DE-A溶液) 中熔化，其中的保护剂能防止线状DNA 在高温下降解，然后在DE-B 溶液的作用下使DNA 选择性结合到膜上。纯化的DNA 纯度高，并保持片断完整性和高生物活性，可直接用于连接、体外转录、PCR 扩增、测序、微注射等分子生物学实验。
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
Cat. No.
制备次数 制备管
2 ml离心管 1.5 ml离心管 Buffer DE-A Buffer DE-B Buffer W1
Buffer W2 concentrate Eluent 说明书
AP-GX-4 AP-GX-50 AP-GX-250 4 preps 50 preps 250 preps
4 50 250 4 50 250 4 50 250 6 ml 2×33 ml 2×165 ml 3 ml 33 ml 165 ml 2.8 ml 28 ml 135 ml 2.4 ml 24 ml 2×72 ml 1 ml 5 ml 25 ml
1 1 1
Buffer DE-A：凝胶熔化剂，含DNA 保护剂，防止DNA 在高温下降解。室温密闭贮存。
Buffer DE-B：结合液（促使大于70bp 的DNA 片段选择性结合到DNA 制备膜上）。室温密闭贮存。 Buffer W1：洗涤液，室温密闭贮存。
Buffer W2 concentrate：去盐液，使用前，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇（用100%乙醇或95%
乙醇），混合均匀，室温密闭贮存。
Eluent ：洗脱液，室温密闭贮存。
二、注意事项
1. Buffer DE-A(含有β-巯基乙醇) 、Buffer DE-B和Buffer W1含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服，谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。
2. 在步骤1中，将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶熔化时间（线型DNA 长时间暴露在高温条件下易于水解），从而提高回收率。勿将含DNA 的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA 造成的损伤。
爱思进生物技术（杭州）有限公司 电话：0571-88124015 传真：0571-88995569 E-mail: [email protected] www.axygen.com.cn
3. 在步骤2中凝胶必须完全熔化，否则将严重影响DNA 回收率。 4. 将Eluent 或去离子水加热至65°C ，有利于提高洗脱效率。
5. DNA分子呈酸性，建议在2.5 mM Tris-HCl，pH 7.0-8.5洗脱液中保存。
三、实验准备
1. 第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。
2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip 头、离心管。 3. 准备75°C 水浴。
4. 使用前，检查Buffer DE-B是否出现沉淀，若出现沉淀，应于70°C 温浴加热熔化并冷却至室温后再
使用。
四、操作步骤
1. 在紫外灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录1.5 ml 离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100 mg=100 μl 体积）。
2. 加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75°C 加热（低熔点琼脂糖凝胶于40°C 加热），间断混合（每2-3 min），直至凝胶块完全熔化（约6-8 min）。
* Buffer DE-A为红色溶液。在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。
3. 加0.5个Buffer DE-A 体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA 片段小于400bp 时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。
* 加Buffer DE-B后混合物颜色变为黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。
步骤4-6可以选择负压法或离心法。 A. 负压法
4A. 正确连接负压装置，将DNA 制备管插到负压装置的插口上。吸取步骤3中的混合液，转移到
制备管中，开启并调节负压至-25-30英寸汞柱，缓慢吸走管中溶液。 5A. 加500 μl Buffer W1，吸尽管中溶液。
6A. 加700 μl Buffer W2，吸尽管中溶液。以同样的方法再用700 μl Buffer W2洗涤一次。
* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
* 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响。
7A. 将制备管置于2 ml离心管（试剂盒提供）中，12,000×g 离心1 min。
爱思进生物技术（杭州）有限公司 电话：0571-88124015 传真：0571-88995569 E-mail: [email protected] www.axygen.com.cn
B. 离心法
4B. 吸取步骤3中的混合液，转移到DNA 制备管（置于2 ml（试剂盒内提供）离心管）中，12,000×g
离心1 min。弃滤液。
5B. 将制备管置回2 ml离心管，加500 μl Buffer W1，12,000×g 离心30 s，弃滤液。
6B. 将制备管置回2 ml离心管，加700 μl Buffer W2，12,000×g 离心30 s，弃滤液。以同样的方法
再用700 μl Buffer W2洗涤一次12,000×g 离心1 min。
* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 两次使用Buffer W2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对后续实验的影响。
7B. 将制备管置回2 ml离心管中，12,000
×g
离心1 min。
8. 将制备管置于洁净的1.5 ml 离心管(试剂盒内提供) 中，在制备膜中央加25-30 μl Eluent或去离子水，室温静置1 min。12,000×g 离心1 min洗脱DNA 。
* 将Eluent 或去离子水加热至65℃将提高洗脱效率。
五、流程图
计算凝胶体积
加3倍凝胶体积 Buffer DE-A ，温浴75°C 熔化凝胶
加含0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B
加500 μl Buffer W1
加700 μl Buffer W2 加700 μl Buffer W2
加25-30 μl Eluent或去离子水
爱思进生物技术（杭州）有限公司 电话：0571-88124015 传真：0571-88995569 E-mail: [email protected] www.axygen.com.cn
含有目的DNA 凝胶
熔化 结合
洗涤
洗脱
六、常见问题分析
主要问题 回收率低
原因
1. 目的片段结合量低
1) 琼脂糖凝胶未完全熔化时目的片段只有部分结合到膜上，导致其余的片段在后续洗涤过程中丢失以及出现制备管堵塞现象，最终影响回收效率。
2) 小于400bp 的片段未加异丙醇
3) 电泳缓冲液pH 值过高，影响目的片段的结合
2. 结合的DNA 片段过早的被洗脱
3. 洗脱效率低
Buffer W2中未加无水乙醇或者乙醇浓度不是95 - 100%的
洗脱液或者去离子水65°C 预热以及增加洗脱前静置时间至5min ，都可提高洗脱效率。
选用合适浓度的琼脂糖凝胶电泳，上样量不超过制备管的最大结合量（8μg ）。
后续酶促反应不理想
1. 盐污染
2. 乙醇污染
3. 琼脂糖残留
4. 洗脱产物中含有ssDNA
确保用Buffer W2洗涤2次。
在最后一次Buffer W2洗涤后可将制备管离心时间由原来1min 增加至2min 。
切胶时尽可能去除不含有DNA 片段部分的凝胶以便于对琼脂糖的处理，确保琼脂糖块在Buffer DE-A中完全熔化。
将洗脱产物95℃加热2min ，慢慢冷却至室温，使单链DNA 重新退火即可。
最后一次Buffer W2洗涤完后不要将制备管放于负压装置上抽得过干。
确保加入正确的乙醇量。每次使用后应拧紧瓶盖，以免乙醇挥发，降低回收率。 建议加入10μl 3M NaAC中和。
务必确保已加入1倍凝胶体积的异丙醇（100%）。建议
在切胶时尽可能去除不含目的片段的琼脂糖，确保buffer DE-A的正确用量。在熔胶过程中要仔细检查确保无固体琼脂糖残留，间隔性的对样品进行摇晃促进凝胶的充分熔化。
爱思进生物技术（杭州）有限公司 电话：0571-88124015 传真：0571-88995569 E-mail: [email protected] www.axygen.com.cn