微量加样器的使用及注意事项
1 微量加样器的使用原理及分类
根据其加样的物理学原理可分为两种①空气垫加样器(又称活塞冲程);②无空气垫的活塞正移动加样器，这两种加样器具有不同的特定应用范围。
活塞冲程(空气垫) 加样器可很方便地用于固定或可调体积液体的加样，加样体积的范围在小于1μl～10ml之间。加样器中的空气垫的作用是将吸于塑料吸头内的液体样本与加样器内的活塞分隔开来，空气垫通过加样器活塞的弹簧样运动而移动，进而带动吸头中的液体，死体积和移液吸头中高度的增加决定了加样中这种空气垫的膨胀程度。因此，活塞移动的体积必须比所希望吸取的体积要大约2%～4%，温度、气压和空气湿度的影响必须通过对空气垫加样器进行结构上的改良而降低，使得在正常情况下不至于影响加样的准确度。一次性吸头是本加样系统的一个重要组成部分，其形状、材料特性及加样器的吻合程度均对加样的准确度有很大的影响。
以活塞正移动为原理的加样器和分配器与空气垫加样器所受物理因素的影响不同，因此，在空气垫加样器难以应用的情况下，活塞正移动加样器可以应用，如具有高蒸汽压的、高黏稠度以及密度大于2.0g/cm3的液体；又如在临床聚合酶链反应(PCR)测定中，为防止气溶胶的产生，最好使用活塞正移动加样器。活塞正移动加样器的吸头与空气垫加样器吸头有所不同。
2 微量加样器的一般使用原则
加样器根据其加样的物理学原理和结构的不同，其应用特点也有所不同。
（1）活塞正移动加样器无需任何校正，即可用于具不同化学组成和特性(密度和黏度)的液体的吸取加样；相反，空气垫加样器的使用则较受局限。
（2）具有高蒸汽压的液体如氯仿使用空气垫加样器吸取加样通常不能得到跟吸取加样蒸馏水相同的准确度和精密度。由于在液体吸取过程中有部分蒸发，因而加样的体积就会有所减少。可通过预先用液体湿润吸头数次，使得蒸汽相被液体饱和，可以改善加样的准确度。
（3）为防止由高蒸汽压引起液体从吸头中漏出，可使用在底部有瓣的吸头，此瓣只在其与管壁接触的时候打开。
（4）使用空气垫加样器加样，位于液体之上的空气体积膨胀依所加液体密度的不同而不同。当吸取密度高于水的液体时，吸入吸头的体积太低。例如，对于一个密度为1.1的较高浓缩的液体，误差的量将达到0.2%。而吸取较稀的水溶液的这种误差则可以忽略不计。因此，在吸取密度高的液体时，须对加样器吸取体积的设定作相应的校正，才能保证取到正确的体积。然而，在实验室实际工作中，加样器使用者很少碰到要准确吸取密度很高的液体的情况，故由于液体的密度所致加样器使用受限的情况通常难以遇到。
一般来说，为防止所吸取体积上出现误差，有一些基本的操作原则必须遵守。对吸取体积误差影响的因素主要有三个方面：①流体静压；②吸头润湿；③流体动力学。当样本体积从毫升范围降低至微升范围时，物理作用力的关系即发生变化，对于加样来说，其意味着液体表面的作用力效应与其体积或质量（例如重力）的作用力效应相比有所增加，因此，加样器生产厂家在设计和构建加样器和吸头中必须仔细考虑这种情况，而且在使用时也
必须注意。
流体静压：在吸取液体时，加样器吸头只能浸入液体几毫升以确保与排出液体时相同的流体静压条件，因此，加样器必须以几乎垂直的方式加取液体，因为倾斜的方式将减少液体柱的高度，导致吸取的液体过多。如果加样器以30℃下以垂直方式吸取液体，可吸取至0.15%更多的液体。
吸头润湿：当吸头排空时，仍会有一些残留的液体以薄膜的形式保留在吸头的侧面，其量取决于液体和吸头表面的相互作用，因此，其是一个常数，但依液体材料的不同而不同。对于水溶液，这种润湿影响在构建加样器时就应考虑。对于蛋白液等黏度高的液体，建议在加样前吸液体数次，以保证加样的一致性。
流体动力学：对体积吸取的第三个影响是从加样器吸头外壁液体的释放，在此过程中，吸头的几何形状起一个关键的作用。为确保加样中的稳定条件，加样器吸头应靠在管壁上，吸头中释放。如果吸头安装不正确或使用不相配的吸头，对加样误差将达到0.4%以上。尽管空气垫加样器的使用有一定的局限性，但其优点耀很明显的，其所覆盖的体积范围大，使用易于掌握。此类加样器很轻，可很空易地应用于各种情况下的加样。
3 注意事项
实验室基本上以使用连续可调的加样器为主。连续可调式加样器在使用时应注意以下几点，从而使加样器能发挥最佳性能。
3. 1 取液之前，所取液体应在室温（15℃～25℃）平衡。
3. 2 操作时要慢和稳。
3. 3 连续可调试加样器在取样加样过程中应注意移液吸头不能触及其他物品，以免被污染；移液吸头盒（架子）、废液瓶、所取试剂及加样的样品管应摆放合理，以方便操作过程、避免污染为原则。
3. 4 连续可调试加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。
3. 5 吸头浸入液体深度要合适，吸液过程尽量保持不变。
3. 6 改吸不同液体、样品或试剂前要换新吸头。
3. 7 发现吸头内有残液时必须更换。
3. 8 新吸头使用前应先预测。
3. 9 为防止液体进入加样器套筒内，必须注意以下几点：①压放按钮时保持平衡；②加样器不得倒转；③吸头中有液体时不可将加样器平放；④P5000及P10ML加样器一定要加滤芯。
3. 10 勿用油脂等润滑活塞或密封圈。
3. 11 不可把容量计数调超其适用范围。
3. 12 液体温度与室温有异时，将吸头预洗多次再用。
3. 13 移液温度不得超过70℃。
3. 14 使用了酸或有腐蚀蒸气的溶液后，最好拆下套筒，用蒸馏水清洗活塞及密封圈。
3. 15 连续可调式加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。
4. 加样器的校准
加样器容量性能的鉴定，可依据国际标准化组织（ISO）文件ISO/DIS8655和国家技术监督局颁发的有关定量、可调移液器的中华人民共和国国家计量检定规程《定量、可调移液器试行检定规程》（JJG646-90）规定的重量测
试方法。这是目前用于此类仪器有效的校准方法。
4.1. 适用加样器范围 各种品牌、型号的固定、可调和多通道加样器。
4.2. 校准环境和用具要求
4.2.1 室温20-25℃，测定中波动范围不大于0.5℃。
4.2.2 电子天平：放置于无尘和震动影响的台面上，房间尽可能有空调。称量时，为保证天平的湿度（相对湿度60%-90%），天平内应放置一装有10ml蒸馏水的小烧杯。
4.2.3 小烧杯：5-10ml体积。
4.2.4 测定液体：温度为20-25℃的去气双蒸水。
4.3. 选定校准体积 ①拟校准体积；②加样器标定体积的中间体积；③最小可调体积（不小于拟校准体积的10%）。如为固定体积加样器，则只有一种校准体积。
4.4. 校准步骤
4.4.1 将加样器调至拟校准体积，选择合适的吸头。
4.4.2 调节好天平。
4.4.3 来回吸吹蒸馏水3次，以使吸头湿润，用纱布拭干吸头。
4.4.4 垂直握住加样器，将吸头浸入液面2-3mm处，缓慢（1-3s）一致地吸取蒸馏水。
4.4.5 将吸头离开液面，靠在管壁，去掉吸头外部的液体。
4.4.6 将加样器以30角放入称量烧杯中，缓慢一致地将加样器压至第一档，等待1-3s，再压至第二档，使吸头里的液体完全排出。
4.4.7 记录称量值。
4.4.8 擦干吸头外面。
4.4.9 按上述步骤称量10次。
4.4.10 取10次测定值的均值作为最后加样器吸取的蒸馏水重量，按蒸馏水在不同温度及气压下的重量与体积的换算因子计算体积。然后，按校准结果调节加样器。
4.5加样器的维护保养程序
加样器应根据使用频率进行维护，但至少应每3个月进行一次，具体方法如下：
4.5.1.一般维护可用中性洗涤剂清洁，或者用60﹪的异丙醇，然后用蒸馏水反复洗涤，去除洗涤剂或异丙醇，晾干。清洁后活塞处可使用一定量的润滑剂。
4.5.2.如果有液体进入加样器内的严重污染，可将加样器拆开后进行清洁，具体拆开步骤参照加样器说明书。
4.5.3.高压消毒，有的加样器的吸管部分可高压消毒，但需注意的是消毒时不可超温超时，也不能挤压放置，以免造成变形。
4.5.4.可调式移液器在不使用时应妥善地竖立放于支架上，远离潮湿及腐蚀性物质。
4.5.5.在移液操作过程中为防止液体进入加样器套筒内，必须注意：压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。
4.5.6.每天开始工作之前应检查移液器的外表面是否有灰尘或污物，若有则小心抹去。
田士军
实验一 PCR
一 、实验原理： PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
二、设备：
微量移液器（10μl）；离心机(Eppendorf centrifuge 541B)；PCR仪（Bio-Rad S10000TMThermal cycler）
三、耗材：
吸头，1.5ml，200μl PCR八连管，
四、试剂和配制方法：
上游引物，下游引物，模板质粒，灭菌去离子水， Kit：天根生化[ 2×Pfu Master Mix Kp201（含有pfu DNA聚合酶，dNTPs，镁离子，反应缓冲液，PCR反应的增强剂，loading buffer）]。
五、步骤：
1．依次在管中加入：
（25μl PCR体系）按照kit的说明书：
Primer 1(10uM) 1μl
Primer 2(10μM) 1μl
2×Master Mix 12.5μl
ddH2O 9.5μl
Template 1μl
注：空白对照不加模板；其余先加ddH2O，最后加模板。注意加样顺序：ddH2O，Primer，2×Master Mix，Template。
2． 瞬离，将样品甩至管底。
3．PCR参数： 94℃ 5min
35×(94℃ 25sec - 60 ℃ 25sec - 72℃30sec)
- 72 ℃20min
（第一个10min后每管加1μl的普通Taq，然后继续72 ℃10min）若无需加A尾，只需72 ℃10min
4. 立即电泳或保存于4℃
注意事项：
PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，假阳性结果往往来自痕量污染和交叉污染，尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。
（1）DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。
(2）PCR在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。
超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品；移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。
（3）PCR操作应戴手套并勤于更换。
（4）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。
（5）试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。
（6）最后加模板DNA（包括在石蜡油后），马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。
（7）实验设阳性、阴性对照
（8）如要配多个管，配反应体系时应先在一个管中把所有共同的试剂混在一起，再分装到每个小管中，然后再加各自不同的模板或引物，这样省时省力，均一性好。
问题及解决办法：
1、出现假阳性的问题：
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、 DNA抽提仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。
解决办法：(1)工作区隔离。(2)改进实验操作，如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。(3)操作程序合理化，如后加阳性对照等。
2、假阴性的问题：
如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。造成假阴性的原因包括: (1) DNA 抽提过程不当。 (2) DNA 样品中含有 Taq 聚合酶抑制剂，如尿素、 DMSO 、SDS 等物质，可抑制 Taq 酶活性， DNA 样品中的蛋白质和重金属离子等亦影响 Taq 酶活性，尤其是含有较多脓液或分泌物的标本，其中虽有待查菌，但却因标本处理不当而出现假阴性。 设置内对照是判断假阴性较好的指示系统。在每一反应管中加入内对照，若内对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。
3.不出现扩增条带：
（1）引物：引物质量是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
解决办法：①选定合适的引物合成单位；②引物的浓度不仅要看OD值，最好用引物原液做琼脂糖凝胶电泳，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应与引物合成单位协商解决，如一条引物亮度高，一条引物亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏而导致变质降解失效；④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（2）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
（3）靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
4.出现非特异性扩增带：
（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带出现的原因：一是引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体；二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
（2）其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
解决办法：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
5.出现片状拖带或涂抹带：
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。可能由于Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，GC含量过高引起。
解决办法：适当降低Mg2+浓度；增加模板量；减少循环次数；加入添加剂甘油。
[肖硕,张秀娟]
实验二 Agarose电泳
一、实验原理：
琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)或者ＥＢ类似物，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。
一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。 三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：超螺旋DNA>线性DNA>开环DNA
正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片 段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用 质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液 常用的缓冲液有TAE（见下）和TB（硼酸）E，DNA在这样的溶液中会被去质子化，从而提高其溶解性，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳 时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH 值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
Marker的选择DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。
二、设备：
移液器，微波炉，电泳仪电源，水平式凝胶电泳槽，样品梳，电子秤， 锥形瓶，凝胶成像系统，烧杯，量筒
三、耗材：
PCR产物，质粒，枪头
四、试剂：
150×TAE缓冲液：取242gTris（三羟甲基氨基甲烷）碱于1L烧杯中，加入57.1ml的冰醋酸，○
100ml的0.5mol/L EDTA（pH 8.0），加入去离子水定容到1L。取2ml 50×TAE缓冲液加入98ml去离子水配成100ml 1×TAE稀释缓冲液备用。
21.5%琼脂糖 ○
3DNA相对分子质量标准样品：DL2000。 ○
4Goldview溶液：一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，3μl/100ml胶。 ○
56×上样缓冲液（loading buffer）：6*的缓冲液中可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚○
蓝，代表的片段大小是 300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。 loading buffer的功能主要有两个。第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。商品化产品，贮存于4℃。
五、实验步骤：
1．制备胶液：锥形瓶中的0.75g琼脂糖与50ml 1×TAE稀释缓冲液混匀后放入微波炉里加热至琼脂糖完全融化，取出摇匀。
2．制备胶板：将胶槽置于水平支持物上，插入样品梳，注意梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙；琼脂糖溶液中加入1.5μl Goldview溶液使其终浓度为3μl/100ml胶；将琼脂糖小心倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拔出梳子，注意不要损失梳子底部的凝胶，然后向槽内加入1×TAE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板表面。
3．加样：取25μl DNA样品（PCR产物中含有染液），用移液器小心加入样品槽中。每加完一个样品要用电泳槽中的buffer清洗枪头，上样时要小心不要将样品槽底部凝胶刺穿，同时将10μl的DL2000点样，记录点样顺序。
4．电泳：加完样后，合上电泳槽盖，连接好电线和电源，注意正负极，接通电源。恒压100V，待阴极有气泡冒出才能离开。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
5．观察：戴好手套小心取出电泳槽，滑出凝胶，放在一次性手套上，置于凝胶成像系统下观察，拍照。
6．清洁：电泳用具，晾干。
六、注意事项
1、Marker的选择
Marker的选择要适中，Marker 应该选择在目标片段大小附近 ladder 较密的，这样对目标片 段大小的估计才比较准确。如果marker太大就可能跑不开，挤到一起，起不到marker的作用。 2煮胶要完全，胶要摇匀
注意煮胶完全，不然有小颗粒会影响跑胶结果。如果胶没有摇匀，跑胶的时候，相同的DNA的速度就不会相同，这样会出现弥散条带。
3、电泳跑完后，怎样看跑胶效果？
先看marker跑的怎样，如果marker跑的很好，没有弯曲，就说明整个电泳体系是没有问题的。
4、点样时别锉到胶。
5、条带模糊暗淡
电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是 TAE 缓冲液，一般用 2～3 次就要更换，TBE 缓冲液则可使用 10 次左右。 如果是EB染色，可能是溴化乙锭见光易分解， 母液配制时间过长或保存不当(一般 4℃ 避光保存一年内有效)，或者终浓度没达到 0．5 vg ／ml
七、讨论
1关于凝胶浓度的选择
2跑胶时候。接近阴极的地方胶发黑？
ＴＡＥ的浓度太低，或者是误把水当成TAE，水不能导电，致使负极的胶碳化。 3加样时候，样品浮在缓冲液中，不能沉在加样孔里？ Loading buffer 里的甘油浓度太低，又或者根本没加甘油。 八、琼脂糖凝胶电泳常见问题
[于轹文、王楠]
实验三 凝胶中DNA的回收
一、实验原理：
PCR反应后获得的DNA片断、酶切后所得特定的DNA序列等，经过琼脂糖凝胶电泳后，DNA分子按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的 DNA片段，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等。
二、设备：
台式离心机、水浴锅、微量移液器（100ul、1ml）
三、耗材：
1.5ml离心管
四、试剂：
无水乙醇，Kit(Omega Gel Extraction Kit， D2500-01)
五、步骤
1．切胶：在长波紫外灯下观察电泳结果，用刀片割下含目的DNA的凝胶块。尽可能多地去掉不含DNA的凝胶，这样对提高质量、简化操作均有好处。
2．将凝胶块放入干净的1.5mlEP管中称重，按每0.1g凝胶加入100μL 的比例加入Binding Buffer（本实验加入700μL），置于55-60℃水浴7min，使琼脂糖块完全溶化，每2-3min颠倒混匀一次。
3．HiBind DNA吸附柱处理。
（1）取一个HiBind DNA吸附柱装在收集管中，吸取200μL Buffer GPS平衡缓冲液 （2）室温放置3-5min， （3）室温下12000g离心2min。
（4）倒弃滤液，将HiBind DNA吸附柱重新装在收集管中，加700μL灭菌水。 （5）室温12000g离心2min。
（6）倒弃滤液，将HiBind DNA吸附柱重新装在收集管中。
4．吸附：将溶化后的DNA 胶液700μL加到吸附柱中，室温放置2min，室温下10000g 离心1min，
倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。
5．洗涤：在HiBind DNA吸附柱中加入300μLBinding Buffer，室温下10000g 离心1min，充分洗涤吸附柱。倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。加入700μL 用乙醇稀释过的SPW Wash Buffer洗涤吸附柱，室温下10000g 离心1min，重复离心洗涤一次。
6．干燥：倒掉收集管中的液体，将HiBind DNA吸附柱于13000g离心2min，将离心柱套在干净1.5ml管上，13000g离心2min，于超净台内风干。
7．洗脱：将HiBind DNA吸附柱放入一个干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入40μL Elution Buffer，室温，静置2min。13000g离心2min.，即可将DNA回收。如果DNA含量较少，可重复洗脱。
8．检测：琼脂糖凝胶电泳鉴定回收的DNA。
六、注意事项：
1.电泳时最好使用新的缓冲液，以免影响电泳和回收效果。 2.如下一步实验要求较高，尽量使用TAE缓冲液。
3.切胶时，紫外线照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤。
4.如果胶回收率低，可在胶充分溶解后检测PH值，如PH值大于7.5，则可向胶溶液中加入磷酸钠（PH5.0），将PH值调到5-7之间。
5. Wash Buffer应保持在低温，否则可能使DNA从柱上脱落而导致回收率降低。 6. 洗脱之前，应再次离心或在空气中放置几分钟，防止其中混入乙醇，影响后续试验。 7.回收大于10kb的DNA片段时，Buffer EB应在50℃水浴预热，适当延长吸附和洗脱时间，可以增加回收效率。
8.回收率和初始DNA量和洗脱体积有关。 9.所有离心步骤均为台式离心机在室温下进行。
七、常见问题：
1. 未回收到DNA片段或回收效率很低 原因①：胶块未完全溶解。
建议：为加快凝胶的溶解，应将凝胶置于55℃水浴中溶解，期间不断上下颠倒，待确定凝胶完全溶解后再进行后续操作。每100 mg凝胶应加入100uL溶胶液，如果胶块过大，应将胶块切成小块，
以便于凝胶溶解。
原因②：加入溶胶液过少。
建议：每100 mg凝胶应加入不少于100uL溶胶液。 原因③：DNA Wash Buffer 中未加入无水乙醇。
建议：第一次使用前，按照说明书要求加入无水乙醇。Wash Buffer使用后，应旋紧瓶盖，以防乙醇挥发，导致漂洗时损失DNA，降低回收效率。 原因④：Elution Buffer不合适。
建议：洗脱液的pH值在7.0~8.5时，洗脱效率最高，洗脱液pH超出此范围，将会显著影响收获率，建议使用试剂盒配套的Elution Buffer（pH 8.5，10mM Tris-HCl），或者使用pH值在此范围的ddH2O。
原因⑤：Elution Buffer未加到离心柱中间。
建议：在洗脱时Elution Buffer应加在中间位置，并室温放置1~2分钟，然后再离心洗脱。另外，采用65℃预热的Elution Buffer将显著提高回收效率。 原因⑥：起始回收量太少。
建议：如果起始回收量很好的样品，应富集，最好使用不少于1ug的样品。 2．电泳时，产物漂出点样孔
原因：洗脱时，柱子中残留有乙醇。
建议：在进行洗脱前，如果柱子上残留乙醇，将会影响洗脱效率，在洗脱前应再次离心，或者空气中放置几分钟，再进行洗脱。 3．后续无法进行连接等实验操作。 原因：洗脱液中含有乙醇。
建议：洗脱前，确保柱子中乙醇已无残留乙醇，再次离心，或者空气中放置几分钟。
[李冠琳、缪新燕]
实验四 连接与转化
一、实验原理
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点，如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入感受态细胞，用所得到重组质粒转化细菌，再筛选就可获得重组的克隆。将感受态细胞与质粒混匀置于冰上，混合物中的DNA形成抗DNase羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，再经过42°C短时热激以促进质粒进入细胞实现转化，利用质粒上的遗传标记在LB平板上就可进行初步的筛选转化菌落。
二、设备：
灭菌锅、微量移液器（100ul,1ml）、恒温水浴锅、恒温摇床、制冰机、超净工作台、酒精灯、培养皿（灭菌）、玻璃涂棒（灭菌）、恒温培养箱、磁力搅拌器、天平、量筒、烧杯、玻璃棒
三、耗材：
1.5ml离心管、饭盒、灭菌枪头、过滤器
四、试剂：
pGMT 载体（北京天根生物VT202-01）、目的基因PCR后的回收产物、T4 DNA 连接酶、连接酶缓冲液、无菌ddH2O
LB液体培养基：配置每升培养基，应在900ml去离子水中加入10.0g蛋白胨、5.0g酵母提取物、10.0g NaCl，磁力搅拌至溶质完全溶解，用5M的NaOH（约0.2ml）调节pH至7.0，然后进行高压灭菌；
LB固体培养基（含抗生素）：固体培养基是在液体培养基中加入1.5%的琼脂制成，即先配置液体培养基，再加入琼脂15g/L，高压灭菌20min，取出后待其降至50℃左右时加入1‰体积的100mg/ml氨苄霉素，摇匀后倒入灭菌的培养皿中，铺成平板，4℃保存；1M IPTG：用8ml蒸馏
水溶解2.38gIPTG定容至10ml，可以用一次性针头过滤器过滤除菌，储存于-20℃；1M X-Gal（408.63 mg/ml）用二甲基甲酰胺（DMF）溶液配制， -20℃避光保存。
五、步骤
1．目的基因片段与载体连接：
取灭菌的1.5ml离心管，将PCR产物与 pGMT载体直接连接。 20μl的反应体系如下： 目的基因片段 8 μl pGMT载体 1 μl 2×连接buffer 10 μl T4 DNA连接酶 1 μl 24℃水浴10min ； 2．连接产物的转化：
（1）取存于-80℃的感受态细菌100μl，置于无菌1.5ml离心管中； （2）加入连接产物，轻轻混匀后放置冰上30min；
（3）放入42℃水浴中90s进行热休克，期间不要摇动试管；冰浴2min；
(4）向管中加入800μl的LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，37℃摇床（100-150r/min），温和震荡45min；
（5）将菌液离心，弃上清，留100μl上清，混匀后加入2μl 408.63mg/ml的X-gal，3.4μl浓度1M的IPTG，混匀，加至含100ug/ml Amp的LB平板培养皿中，用火焰灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）；
（6）将其放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜；
（7）克隆生长至合适大小后，放入4℃下1h，使蓝色克隆充分呈现。
六、注意事项
（1）进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。连接酶容易失活，注意低温操作，感受态细菌和连接产物混匀需要放置在冰上。
（2）感受态细胞应保存在-80℃，不可多次冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。
（3） 转化时各反应体系配比要正确，连接时可选择10*buffer 4℃过夜或2*buffer 22~26℃水浴10min。
（4）为防止转化试验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。 （5）氨苄青霉素(Amp)：使用前用无菌纯水配制母液，浓度为50mg/mL。 （6）实验分五组，离心管和平板都要标记好，对应好。
（7）涂布棒在使用前必须用酒精灯烧三遍，待火焰熄灭冷却了，再涂板。 （8）X-gal是闭光锡纸保存，使用之后立即用锡纸包裹。 （9）热休克期间不要动试管。
七、问题及分析
实验分五组，1是实验组，2是阳性对照组，3是空载体组，4是Amp抗性组，5是Kam抗性组。 1实验组是自己构建的质粒转入感受态细胞； 2是之前实验成功的产物转入感受态细胞，板上会长； 3是空载体组，没有目的片段，板上不会长；
4有Amp抗性的菌可以长，说明板是正常的有氨苄青霉素的LB平板。 5有Kam抗性的菌长不了，说明没有Amp抗性就长不了。
问题及解决方法：
问题1：蓝白斑筛选中，白斑多但是却没有阳性克隆（假阳性）。 解决方法：
1）检查质粒载体和目的片段的连接情况，避免载体自连的发生。 2）检查载体的酶切位点，排除酶切插入位点等没有出现设计问题。 3）控制好转化的时间和温度。
问题2：蓝白斑筛选，出现很多浅蓝色菌斑（假阴性）。
解决方法：当实际操作中发现当插入小片段时，重组子也有形成浅蓝斑的情况。即蓝色菌斑也有可能含外源基因。据最新报道，大概有30%的假阴性。用牙签挑取浅蓝色菌落，进行PCR扩增，
同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，判断浅蓝色菌落是否为重组子。
问题3：蓝白斑筛选，全是白斑，没有蓝斑。 解决方法：
1）可能是Ampicillin失效，让非抗性的菌种也生长出来。应该确定Ampicillin平板没有问题，2个周之内使用，再用一个加抗生素和一个不加抗生素的平板做对照，用抗生素敏感菌种划平板对照。2）做个空载背景对照，检查平板是否适合做蓝白斑筛选，而且筛选平板要新鲜。 3）做转化之前，用PCR检测一下连接产物，看是否连接成功，或者是否载体自连，这样就可以提前减少假阳性的可能性。
4) 用牙签挑取白色菌落，进行PCR扩增，同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，确定是否重组。 问题4：蓝白斑筛选，只有蓝斑，没有白斑。 解决方法：
1）先用PCR 检测一下连接产物，引物可以用载体上的相应序列，比如M13，检测一下连接是否成功，如果有大片段 (自己估计长度) 产生，那么连接就是成功的。
2）可能是片段浓度太低，连接时注意浓度比，片段和质粒载体浓度比1：5-1：9。
3）用牙签挑取蓝色菌落，进行PCR扩增，同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，判断蓝色菌落是否为重组子。
问题5：蓝斑较大，白斑很小附在周围，还有蓝白镶嵌的斑（卫星菌落）。 解决办法：
1）连接体系还需要优化，即载体和需连接的片段的相对比例必须适中，才会产生一定数量的转化子，比例过大过小都不行。
2）可能是氨苄失效，更换其他抗性载体。
3）中间菌落的生长可能消耗了培养基周围的Amp，导致了卫星菌落的出现，可以小心挑取中间的那个菌落，它一般是阳性克隆。
4）往培养基中加抗生素的时候，温度不能高了，不烫手为宜，防止抗生素失效。 5）培养时间不宜过长，出现阳性菌落就及时处理，以12-16小时为宜。
问题6：蓝白斑筛选时平板置于4度冰箱可以消除假阳性或假阴性吗，根据什么原理？ 解决方法：IPTG是b-半乳糖苷酶的活性诱导物质，X-Gal是b-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物，在b-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。做蓝白斑筛选是主要是依靠IPTG与X-gal的作用使假阳性菌呈蓝色，而将其置于4度是为了使其显色充分，不是一开始就4度，是等菌长出来之后。一般菌长出来就会有蓝色的了，4度之后会进一步显色。 问题7：蓝白斑筛选，过了很多天才显色，出现蓝色菌落。 解决方法：
1）IPTG和X-gal用pUC18空质粒检测时用的板是否与外源DNA片段连在pUC18后转化用的板是同一批的，即使是同一批次的板，由于倒板时培养基温度过高，导致IPTG和X-gal部分失效，且有可能混匀不均，使得倒的板蓝白筛选效果不同。 2）理由与上基本相似，抗生素失效，更换其他抗性载体。
3）检查外源片段以及载体酶切是否完全，连接时间可稍微加长一下。 4）检查感受态是否被污染，白斑是否为透明白斑，而不应该是白色的菌落。
载体图谱：
［石柳，刘静轶，宋何煜］
实验五 挑克隆及提质粒
一、 实验原理
pGMT 载体上携带有氨苄抗性基因以及lac操纵子，在转入感受态细胞经诱导后能产生β-半乳糖苷酶，可与生色底物x-gal反应产生蓝色菌落。外源基因插入到该载体上使得重组质粒为β-半乳糖苷酶缺陷型，不能与生色底物产生蓝色反应，进而出现白色菌落，因此，挑取培养板上的白色菌落即重组质粒克隆的菌落。
质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA，大小在1-200Kb之间，能在宿主菌中自主复制。宿主细胞中质粒的拷贝数各有不同，一种是低拷贝数的，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，称为“严紧型”复制的质粒，另一类高拷贝的质粒，拷贝数可达到20个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒。
质粒能编码一些遗传性状，如抗药性，利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。
质粒作为载体必备的条件：①具有一段特殊结构的DNA序列；②有一个或多个便于检测的遗传表型，如抗药性、显色表型反应等；③有一个或几个限制性内切酶位点，便于外源基因片段的插
入；④适当的拷贝数。
碱裂解法制备质粒DNA原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，加入中和液后，质粒分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
二、 设备
37℃温箱 摇床 离心机 微量加样器
三、 材料:
培养皿、试管 、枪头离心管、质粒提取盒、EP管(1.5ml) 菌种 无水乙醇
四、 试剂和配制方法：
LB培养基：称取10g胰蛋白酶，5g酵母提取物，10g Nacl，加950ml去离子水充分搅拌至溶解，将PH调至7.0，然后加去离子水定容至1L，高温高压灭菌后，4℃保存
Amp（100mg/ml）：称取100mgAmplicillin溶于1ml去离子水中，完全溶解后用0.2μm滤膜过滤除菌，-20℃保存，用时1000倍稀释。
五、 步骤：
1. 准备10支试管，每支加入2ml的Amp-LB培养基并做好标记。
2. 用镊子夹住一个白枪头从培养皿中挑取单克隆，放入含有液体培养基的试管中，37℃恒温培养
14-16h。
3. 收菌：将摇好的菌液从试管转入到EP管中做好标记，室温离心10000g×1min，弃上层培养液。
4. 重悬：加入250μl SolutionⅠ(已经加入200μl 的RNaseA)，反复吹打，充分 重悬细菌。
5. 裂解：加入250μl SolutionⅡ轻轻颠倒转动数次，变成清亮液，开盖有粘丝状液体出现，室温放
置4min。
6. 中和：加入350μl SolutionⅢ迅速颠倒数次，直到出现白色絮状物。立即离心 13000g×10min.将
上清分别转入到另一批EP管中。重复离心一次。
7. 吸附：首先，先处理柱子：将离心柱放在收集管上，加入200μl buffer GPS，室温放置5min，室
温离心10000g×1min，弃收集管中的废液；再加入700μl高压灭菌水离心1min，弃收集管中的废液。其次：小心将上清液转移到结合柱，室温放置2min，室温离心10000g×1min，弃流出液。
8. 去蛋白：弃流出液，向柱内加入500μl BufferHB洗液，室温离心10000g× min。
9. 清洗：向柱内加入700μlDNA Wash Buffer(已经加入80ml的无水乙醇)，室温离心10000g×1min.
重复离心洗涤一次。
10. 干燥：将柱子放在新的1.5mlEp管中离心，13000g×2min，将柱子打开盖放入超净台中吹干使乙
醇充分挥发。
11. 洗脱：把柱子放进1.5mlEP管中，加入40μl Elution Buffer，室温放置2min，离心13000g×2min，
收集流出液，存于-20℃。
六、 实验分析及注意事项
1.挑克隆注意事项
选单克隆时可以选取边缘颗粒较大的菌落。最好不要选择大的菌落，选择中等，一般0.5-1mm大小，菌落间隙不太近的；用移液枪枪头挑取，也可用灭菌牙签。菌落通常很密集很小，很难挑选单克隆。将挑好克隆的白枪头放入含有液体培养基的冻存管中进行恒温培养的时候，管盖不可拧的太紧，需倒转半圈，以便空气进入，但又不可太松，以防培养液摇出。
2.提质粒注意事项
实验室常用的是试剂盒提取质粒，但是每种试剂盒都会用到三种溶液，以下是针对这三种溶液使用时的溶剂组成成分的作用和实验注意事项以及相应的解决方案：
（1）溶液I：
组成成分：Tris-Cl溶液的主要作用是用来调节溶液的浓度和PH；葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌或其他细菌不会快速沉积到管子的底部EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其作用是抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
注意事项：
①实验中很多试剂盒在使用前要往溶液I中加入RNase, 用来水解RNA，加入后要在瓶体标记，以防漏加多加。
②某些试剂盒中溶液I注明需要低温4℃保存。
③在实验过程中，若试剂盒缺少或丢失溶液I，且急于提质粒的情况下，可以用等体积的水或
LB培养基来悬浮菌体。
④此步骤最重要的是：菌体一定要悬浮均匀。
（2）溶液II：
这个瓶子的盖子打开时瓶盖周围会有少量结晶。这是因为溶液中含有NaOH，因为裂解细胞的主要是碱性物质，所以也叫碱法抽提质粒。NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。若只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS是弱碱。
注意事项及解决办法：
时间不能过长，因为碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，
必须温柔各种角度混合，过度剧烈会使基因组DNA断裂，在之后的琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
注意瓶子底部是否有沉淀状物，可能是SDS析出，放到37°水浴锅里热一下即可。
（3）溶液III：
加入后就会有大量的白色沉淀，之后离心10分钟取上清。沉淀的出现是因为十二烷基硫酸钠（SDS）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（PDS），而PDS是不溶于水的，因此发生了沉淀。
注意事项及解决方法：
①此步骤离心一定要彻底，最好是离心10分钟。
②用枪轻吸上层清液防止吸入底部白色絮状沉淀而影响实验效果，可选用量程较小的枪头转移上清，如使用200μl移液枪。吸出上清，再离心5min，效果更好。
③加入溶液III后，复性时间不宜过长，一般是5分钟，否则会使染色体复性。
（4）处理吸附柱：
注意事项：一定不要有酒精残留，有酒精残留会影响质粒的洗脱效果。
（5）琼脂糖电泳
鉴定质粒DNA，多数情况下会出现三条带，这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
注意事项：若不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
附：手提质粒的试剂配置和实验步骤以及注意事项：
实验步骤： 1．将1.5ml菌液倒入微量离心管中，12000g离心30s，吸出上清，使细菌尽可能干燥； 2．将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，用枪吹匀，不要有气泡，放冰上5min；
3．加200μl新配制的溶液II，盖紧管口，快速但摇的动作要缓慢，颠倒离心管5次，以混合内容物，不要振荡，将离心管放置在冰上；
4．加150μl用冰预冷的溶液III，盖紧管口，将管倒置后温和振荡10s使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀之后将管倒置于冰上3-5m；
5．以12000g离心5min，最好10min，将上清转移到另一离心管中；
6．加等量的酚：氯仿：异戊醇，振荡混匀，用微量离心机12000g离心2min，将上清转移到另一离心管中；
7．用2倍体积的乙醇沉淀双链DNA，混匀，4度放置半小时；有絮状沉淀产生
8．用12000g离心5min，小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上（或用一次性的吸头与真空管扣连，轻缓抽吸），再将附于管壁的液滴除尽（可在空气中使核酸干燥10min）；
9. 用200ul 70%冰预冷的乙醇清洗管壁和沉淀，DNA在70%乙醇中不溶，30%水的目的是溶解盐，防止干扰后续的酶切或其它操作； 4度12000rpm离心5min；用黄枪头吸去上清，然后快速离心30s，再用白枪头吸走剩下的溶液；在工作台里吹风30min；
10．用50μlddw溶解核酸，贮存于-20度或4度。
注意事项以及解决办法：
1、加溶液I前菌液上清要吸干净
2、加溶液II、III时，要快轻混匀，提取的效果才会好；
3、严格控制反应的温度，加I，II，III后都要在冰上放置3-5分钟，反应才会缓慢且彻底；
4、溶液II的浓度可以根据菌的数量进行相应的调整，时间和进度的把握非常关键；
5、溶液III的反应在4度冰箱中进行，也是要观察沉淀的量和颜色，沉淀好，有利于离心酶切；
6、乙醇沉淀的时间可以久一些，增加产量。
[宋琳琳，田士军，徐菲一]
实验六 重组质粒的双酶切鉴定
一、实验原理：
利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒DNA）
根据酶切的目的不同，可采用小量酶切或大量酶切反应两种体系。如果基因片段插入位点两端的酶切位点不同时，则需进行双酶切反应。双酶切可采用不同的方法进行。如果这两种酶的反应缓冲液相同或相近，可以同时加入两种酶进行酶切，但反应体系应稍大些，以免甘油浓度过高，影响酶的活性。小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，典型的反应是20μl体积中含0.2~1μl DNA。
双酶切反应在两个酶反应条件相同时，可参照小量酶切反应进行。
酶切产物通常采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，该法可按酶切产物分子量的大小分离DNA片段，小片段比大片段迁移快，凝胶上迁移的距离与分子量的对数成反比。酶保存液：
10mm Tris-HCl pH7.5
400mm KCl
0.1mm EDTA
1mm DTT
0.01% DSA
50% Glycerol
二、设备：
100μl、20μl微量移液器、离心机、金属浴、锥形瓶、冰盒
三、耗材：
枪头、0.5mlEp管
四、试剂：
1、50×TAE Buffer(pH 8.5) ：取242gTris碱于1L烧杯中，加入57.1ml的冰醋酸，100ml的0.5mol/L
EDTA（pH 8.0），加入去离子水定容到1L。取2ml 50×TAE缓冲液加入98ml去离子水配成100ml 1×TAE稀释缓冲液备用。
2、凝胶加样缓冲液（10×loading-buffer）
3、限制性核算内切酶
4、质粒、Buffer、高压灭菌水、琼脂糖、GoldView
五、步骤：
1、构建酶切体系：按体系组成顺序在新的EP管中加入各物质
双酶切体系： 20μl
10×M buffer 2μl
质粒 16μl
KpnI 1μl
HindIII 1μl
2、将EP管1000rpm离心1 min，使液体充分混匀，放入37℃金属浴中反应4 h
3、电泳检测
六、注意事项
1.吸样量一定要准确；
2.为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶；
3.要求在冰上操作，并充分混匀；
4.开启EP管时，手不要接触到管盖内面，以防污染；
5.酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回－20℃中保存。
6.使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取前要小心地离心搜集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
七、问题分析及解决
限制性内切酶酶解中常见的问题和原因
1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。
2．DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。
3．DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力；②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它DNA。
[周雅琼，李纯]
实验七 菌种保存
一、 实验原理：
大多数大肠杆菌能在保存培养基中存活数年，若在-70℃或液氮中冻存则可长期保存。甘油保存菌种的条件是需要冻存。主要靠低温来降低微生物活性，达到保存的目的。甘油的主要作用就是防止在冻存细菌时产生的冰晶对细胞造成的损害，一般使用甘油的终浓度在10%-20%
菌种保存液可采用下述2种试剂：
（1）甘油溶液（80%或100%皆可）
（2）DMSO溶液
二、设备：
37℃温箱、摇床、高压锅、微波炉
三、耗材：
移液器、挑菌针、EP管、量筒，试管
四、试剂：
1．LB培养基：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g Nacl，加950ml去离子水充分搅拌至溶解，将pH调至7.0，然后加去离子水定容至1L，高温高压灭菌后（121ºC，15min），4℃保存。
2．Amp （100mg/ml）称取100mgAmplicillin溶于1ml去离子水中，完全溶解后用0.2μm滤膜过滤除菌，-20℃保存.用时1000倍稀释。
3．灭菌甘油， 4℃保存。
五、步骤：
1． 菌种扩大培养
从LB平板上挑取阳性克隆的单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基（含100mg/ml Amp 3-5μl）中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。
2． 20%甘油保存
将高压灭菌后的甘油放入微波炉中加热片刻至微热，增加其流动性。取标记好的1.5ml的EP，加入200μl甘油，冷却后加入800μl菌液，充分混匀，密封，存于-20℃或-80℃长期保存。
六、注意事项
1、注意在超净台内操作，避免污染。
2、在EP管中应先加入甘油，再加入菌液，并充分混匀。
七、问题分析及解决
问题：1、冻存的菌液再用时失活或检测有杂菌。可能是保菌操作时未在超净台内进行。需重新进行保菌。
2、在菌种液中加入甘油15－30％，但是发现过一段时间之后，甘油沉在下面，菌液在上面，甘油好像没冻，还是透明的，可菌液已经冰冻成白色得了。 可能是冻存之前未混匀，混匀就可以使用。
[金玺圆，李纯]
实验八 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
一、 实验原理：
体中具有卡那抗性的特点，先用含有卡那霉素的LB培养基进行转接，筛选出转化成功的细胞并继续培养。然后加入IPTG诱导表达，过表达之后再进行离心收菌，加入PBS重悬，放入-20度保存。 注：
卡那霉素：一种由卡那链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)产生的氨基糖苷类抗生素，含三个组分：
卡那霉素A、B和C，卡那霉素A为主要组分。通过与30S核糖体亚单位结合而使细菌蛋白质合成发生错读。若细菌中产生一种破坏卡那霉素的酶，则可变为抗性株。卡那霉素抗性的质粒经常被作为选择基因或标记基因用于分子克隆中。
IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，是一种乳糖类似物，能诱导乳糖操纵子的活化，而表达载体上具有乳糖操纵子，故活化乳糖操纵子能诱导蛋白表达。而且IPTG化学性质比较稳定，不易与其他组分发生反应，故能取代乳糖作为诱导剂。
二、 设备：
微量加样器（1ml,100ul,10ul,2.5ul），恒温振荡培养箱，超净台，离心机，恒温培养箱
三、 耗材 ：
无菌玻璃试管，无菌50mL离心管、枪头、1.5mL EP管
四、 试剂：
IPTG（100M）母液，LB培养基（含有50μg/mL终浓度的卡那霉素） 1．100mM IPTG的配制
0.2383g的IPTG（分子量238.30），溶于10mL无菌去离子水中， 0.22μm滤膜过滤，分装于无菌1.5mL的EP管，-20℃保存备用。 2．50mg/mL卡那霉素储存液的配制
0.5g卡那霉素粉末溶解于10mL无菌去离子水， 0.22μm滤膜过滤，分装于无菌1.5mL的EP管， -20℃保存备用。
3．LB培养基（含有50μg/mL终浓度的卡那霉素）的配制
胰蛋白胨10g，酵母提取物5g 和氯化钠10g，溶于900mL去离子水，用NaOH调节该培养基的pH至7.4，定容至1L后分装入摇瓶，高压灭菌后4℃密封保存备用，使用前加入1‰体积的50mg/mL卡那霉素使其终浓度为50μg/mL。 4．PBS的配制
氯化钠8g，氯化钾0.2g，二水合磷酸氢二钠1.56g和磷酸二氢钾0.2g，加入去离子水定容至1L，调pH至7.4，高压灭菌后使用。
四、步骤：
1．挑克隆：从37℃恒温培养箱中取出培养过夜的平板，倒置放入超净台。超净台中，用移液器吸取2mL LB液体培养基（含50μg/mL卡那霉素）加入到无菌玻璃试管中，用消毒后的镊子夹取一个小枪头，在平板上挑取一个形态饱满的单一菌落，投入已加入培养基的玻璃试管中，管口加胶塞后放入摇床37℃，250r/min过夜震荡培养。
2．转接：超净台中，按1%转接过夜菌，即吸取过夜菌60μL加入到6mL LB液体培养基（含50μg/mL卡那霉素）中，37℃摇床250r/min震荡培养3h（最终得到的菌液可能没有6ml，在保持浓度不变前提下可适当加大初始溶液体积）。
3．诱导：在超净台中，将6mL菌液分装到三支离心管，2mL/支。分别向两支离心管中加入10μL和2μL 的IPTG（100mM）溶液，使IPTG终浓度分别为0.5mM和0.1mM，进行外源基因的诱导表达，第三支离心管不加IPTG，分别做好标记。37℃，250r/min恒温摇床中震荡培养4h。
4．收菌：将两支离心管诱导的菌液分别倒入1.5mLEP管，同时收集未诱导菌，5000r/min离心2min
收集菌体，弃上清。
5．重悬：加入200μLPBS，将菌体吹打混匀，重悬菌体。 1．保存：菌体悬液在-20℃保存备用。
五、 注意事项：
1、 转接前先计算好各试剂所需剂量，对实验的各环节熟悉。
2、 由于液体损耗，摇菌前管中菌液应该大于所需菌液，保持浓度不变即可。
3、 摇菌时先将盖子拧紧，再稍微拧松，过紧会导致克隆效果不佳，过松可能会使盖子脱落。
六、 问题及分析：
1、 为什么要用IPTG进行诱导？IPTG是如何诱导蛋白表达的？
答：IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，是一种乳糖类似物，能诱导乳糖操纵子的活化，而表达载体上具有乳糖操纵子，故活化乳糖操纵子能诱导蛋白表达。而且IPTG化学性质比较稳定，不易与其他组分发生反应，故能取代乳糖作为诱导剂。 2、 为什么不能将转接和诱导同步进行？
答：转接到含有卡那抗性的LB培养基中进一步纯化了细胞，如果同时进行则可能会诱导产生非目的蛋白质。
3、 如果未知IPTG的最佳浓度，要怎样确定其最佳浓度？
答：通过设置浓度梯度的方法来得出最佳浓度，分两部进行，第一步是设置较大的浓度梯度，先确定一个合适范围，再在这个范围之内进行分隔度较小的浓度梯度，细化确定最佳浓度。
[赵萌，戴蒙]
实验九 超声碎菌
一、 实验原理 ：
胞破碎仪是利用超声波在液体中的分散效应,使液体产生空化的作用,从而使液体中的固体颗粒
或细胞组织破碎. 超声波细胞破碎仪由超声波发生器和换能器两大部分组成.超声波发生器电路将50/60Hz的市电转换成18-21KHz的高频高压电能，该能量被输到“压电换能器”中，并被转换成高频
机械震动，再经“变幅杆”的聚能和振幅位移放大后作用于液体中而产生强大的压力波，这个压力波则会形成千百万的微观气泡，随着高频振动，气泡将迅速增长，然后突然闭合，在气泡闭合时，由于液体间相互碰撞产生强大的冲击波，在其周围产生上千个大气压的压力（即超声空化）。它使得变幅杆顶部产生强有力的剪切活动，并使得气体中的分子强力地被搅动。该能量足以将细胞及各类无机物质破碎重组。
二、 设备：
冷冻高速离心机 、超声细胞破碎仪、高压蒸汽灭菌器。
三、 耗材：
1.5ml离心管 移液枪 枪头 1L烧杯 玻璃棒 1L容量瓶
四、 试剂：
PBS缓冲液体系：称取NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.42g KH2PO4 0.27g 溶于约800ml的去离子水中搅拌溶解，滴加浓盐酸至pH=7.4，然后定容至1L，灭菌备用。
五、 步骤：
1．将上个实验中用PBS重悬并冻存的菌液（空白对照组，0.1mM和0.5mM IPTG诱导组）解冻。 2．设置超声仪超声参数。
3．将离心管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率400 W，Φ15变幅杆，破碎20s，间歇20S) 3min后观察破碎后细胞悬液的浑浊程度。
4．两种浓度的细胞破碎悬液各取60μl于1.5 ml离心管中，将破碎液于10000 r/min，4℃离心10min，收集沉淀和上清。
1．取离心上清60μl于1.5 ml离心管中，用140μl PBS重悬沉淀，再取沉淀重悬 液60μl于1.5 ml离心管中。
6．在上述离心管中加入20μl的4XLoading buffer，混匀，存于-20℃备用。
六、 注意事项：
1、确保菌体混合物始终处于低温条件，防止蛋白质变性；
2、防止长时间超声，即一个周期不要太长。以免破碎混合物中心的热量得不到充分释放； 3、破碎时把握好破碎的度，既不要破不开也不要破过了（离心后会有黑色沉淀）！ 4、超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。
5、尽量防止泡沫的产生。蛋白以包涵体的形式表达，追求的是高破碎率，要求细胞碎片很小，而另
一种蛋白是可溶形式表达，所以细胞碎片不能很小，两种情况要求不同但目的相同，都是便于后期的固液分离。
七、 问题及分析：
一、判断是否超声完全：
1、外观判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声后完全变透明、清澈。 2、液体的粘滞性：超声后菌液从枪头滴下不粘连。
3、高速离心：用高速离心检测超声破碎程度（一般用6，000g10min,比一般离心收集菌体的转速高
一点）。沉淀是未破碎或破碎不完全的菌体。
4、染色：破碎后的菌液涂片，革兰氏结晶紫染色0.5分钟，镜检。
二、在破碎的时候出现的黑色的物质，为什么？
主要原因是在超声波破碎的时候，探头靠在了破碎的容器的边沿（主要是玻璃瓶子）上面，所以超声出来的液体里面会呈现黑色的。就算同样的超声时间和条件，唯一的差别就是探头不要靠在容器的边沿上面，都不会出现黑色。这个说明不是样品的炭化，而是探头将玻璃瓶子炭化了。同时也会损害探头。
其次，超声功率太强，也会现黑色沉淀。
三、还有什么方法能使细胞高效破碎？
反复冻融、加溶菌酶酶解 ,French压榨（French Pressure cell Press）一种细胞压力破碎仪，通过压力差来使得细胞胀裂）等再加上超声，细胞才破。而且在超声的时候最好用冰浴，因为超声时放热比较多，否则产生的大量的热会使胞内蛋白变性。
四、超声前后核内核酸被破碎成小片段了，为什么基质中的蛋白质却没有变性？
空化泡破裂时产生瞬时高温（约5000℃）、高压（可达500×104Pa），可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。
超声破碎的条件一般是300w，10s/10s，20分钟，具体条件根据自身情况而定，在一定时间和功率范围内设置相应的参数进行超声即可得到相应的蛋白，超声时间太长功率太高对蛋白活性也会有影
响。
[贺丽，张妮]
实验十 SDS-PAGE
一、 实验原理：
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂N,N,N＇,N＇-四甲基乙二胺（简称TEMED）和催化剂过硫酸铵（简称AP）作用下聚合交联成三维
网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）。免疫印迹（Western blotting或Immuno blotting）是检测蛋白质样品中特异性抗原的一种分析方法。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇(ME)，二硫苏糖醇（DTT）能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异，从而达到通过分子量差异分离蛋白的目的。
本实验第一步是将被分析的蛋白样品做SDS-PAGE凝胶电泳，使样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成条带。第二步把凝胶中的蛋白转移到膜上（所谓印迹），其中用的最多的材料是硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜。蛋白转移的方法多采用电转移，也有用吸印法转移的（原理与Southern blotting 类似）。电转移又有半干法和湿法之分，本实验采用后者。
二、实验设备：
蛋白质（Bio-Rad/0电泳装置，微量加样器（1ml，100ul，20ul，10ul）
三、实验器材：
100mL量桶×1，100mL烧杯×5，1L量杯×2，EP管，玻璃瓶×2，大培养皿（蛋白胶染色和脱色用）
四、试剂与配制：
1．30%凝胶储备液：29g丙烯酰胺和1g N，N-亚甲双丙烯酰胺，加去离子水溶解，用去离子水定容至100mL，过滤，避光贮存，4℃。
2．10%SDS（w/V）：10g SDS加去离子水溶解，定容至100mL。贮存于室温。 3．TEMED（N，N，N’，N’，四甲基乙二胺）
4．10%过硫酸胺(AP)：0.1g过硫酸胺溶于1mL去离子水中。分装于EP管中-20℃贮存。
5．1.5M （mol/L）Tris-HCl (pH8.8)：18.17gTris base置于100mL烧杯中，加入约80mL去离子水，充分搅拌溶解，加浓盐酸调pH值至8.8，定容至100mL。
1.0M(mol/L) Tris-HCl (pH6.8)： 12.11g Tris base置于100mL烧杯中，加入约80mL去离子水，充分搅拌溶解，加浓盐酸调pH值至6.8，定容至100mL。
6．电泳缓冲液×1：25mmol Tris base（3.02g）与250mmol甘氨酸（18.8g）组成缓冲体系，稳定电泳过程的PH，0.1%SDS（1g），加去离子水定容至1L。
电泳缓冲液×5：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g，加去离子水定容至1L。使用时稀释5倍。
7．1×电泳加样缓冲液：50mmol/L Tris-HCl 缓冲体系pH6.8（Tris base 0.604g），50mmol/L DTT，2%SDS（SDS2g），0.1g溴酚蓝（作为，因为呈蓝色，而蛋白质是白色，在SDS-凝胶中不明显，且溴酚蓝的相对分子量比蛋白质(绝大部分)小，电泳时速度比蛋白质稍快，因此当溴酚蓝到达电泳槽底部(可看蓝色调带)，则电泳结束。 ），10%甘油（甘油10mL），加水定容至100mL。
8．甲醇/醋酸溶液：90mL甲醇：水（1∶1即45mL甲醇45mL水）和10mL冰醋酸混匀。 9．考马斯亮蓝染液：0.25考马斯亮蓝（commassise blue R250）溶解于上液中，Whatman I号滤纸过滤。室温保存。
五、步骤：
1．配置10%分离胶（两块胶用10mL）
1) 组份表：水4mL，30%凝胶储备液3.3mL，1.5M Tris-HCl (pH8.8)2.5mL，10%SDS 0.1mL，
10%过硫酸胺（催化剂，用作醋酸乙烯、丙烯酸酯等烯类单体的）0.1mL，TEMED（加速剂）0.004mL。
2) 在烧杯内迅速搅拌均匀（TEMED最后加），用移液枪注入玻璃板间隙中，加入大约4mL
（也可左手将玻璃板倾斜，右手拿烧杯从较长的一侧中部缓缓倒入）。用1ul去离子水自左向右覆盖，去除气泡，防止胶被氧化。
3) 聚合完成（约30min）后，倒掉覆盖液体，尽可能用吸水纸吸干顶端残存液体。
2．配置5%成层胶(即浓缩胶，凝胶电泳时，在分离胶上方铺设的一薄层大孔凝胶。能使样品在电泳初始阶段快速浓集在分离胶界面，样品在分离胶就能达到更好的分离效果。样品通过成层胶浓集是采用等速电泳的原理。)（两块胶用5mL ）
1) 组份表：水3.4mL，30%凝胶储备液0.83mL，1.0M Tris-HCl (pH6.8) 0.63mL，10%SDS
0.05mL，10%过硫酸胺0.05mL，TEMED0.005mL
2) 搅拌均匀，注入玻璃板内，分离胶的顶部。平稳插入梳子，垂直放置于室温下。
3．装电泳槽：在成层胶聚合完成（约30min）后，用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电泳槽上。上下槽均加入1×电泳缓冲液，检查是否泄漏（上一次电泳的缓冲液可以作为下槽的缓冲液，以便试剂的节约）。驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡。
4．样品处理：在成层胶聚合的同时，样品与加样缓冲液混匀，100℃加热5min。
5．上样：按次序上样，不同样品的上样体积用1×loading buffer调成一致，将1×Loading Buffer加入未使用的梳孔中。
6．电泳：成层胶电压为90V，染料进入分离胶后，将电压增加到120V，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。（在电泳槽的底部有一条白金丝，清洗时注意不要损坏；在电泳槽正常工作的情况下，会有气泡产生，电泳开始一段时间后样品浓缩成一个窄带，此时方可离开做其他实验）。 7．染色：电泳结束后，用至少5倍体积的染色浸泡，放摇床上室温缓慢旋转3~4h；
8．脱色：换掉并回收染液，用水洗去多余的染色液，用甲醇/醋酸溶液浸泡凝胶，缓慢摇动4~8h脱色，其间换液3~4次，直到胶的背景很淡时为止；
9．观察结果：将脱色后的凝胶照相或干燥，也可用封闭塑料袋在含20%甘油的水中长期保存。
六、注意事项：
1、丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时要注意防护。
2、SDS-PAGE所得结果，在分子量为15,000—200，000的范围内，与用其他方法测得的分子量相比，误差一般在±10%以内，在此范围内结果才较为准确。
3、加样的量要合适，一个样品的0.25μg某种蛋白质，即可观察到其电泳带，而如果有20~100μg，该泳道便超载了。
4、对许多蛋白而言，电泳时速度越大则电泳带越清晰，但电流太大，玻璃板会因受热而破裂，故合适的电流应该是玻璃板热而不烫。
5、SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色可检测到0.1μg以上的单一条带的蛋白质。 6、如欲更快脱色可用下述方法：
（1）用30%甲醇、10%乙酸混合液脱色，但脱色时间过长，蛋白质带的着色深度将会部分丧失； （2）用正常的脱色液在45℃下脱色；
（3）正常的脱色液中加入数克阴离子交换树脂或一块海绵，吸附脱下来的染料； （4）使用商品化的专门仪器电泳脱色；
（5）染色过的凝胶不应贮存在脱色液中，因这将导致蛋白质带褪色。
7、实验中的玻璃器皿必须干净并用无离子水冲洗，否则，可大大减低银染的灵敏度。
8、为保存凝胶，将染色后的凝胶放在玻璃纸上，并在凝胶上面覆盖一层玻璃纸。这样干燥出来的直接用于照相、摄影或永久保存，效果甚佳。
七、常见问题分析：
SDS-PAGE凝胶电泳常见的问题分析
[常卓，王卓然、武晓燕、吴昊]
实验十一 Western blot
一、实验原理：
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
western显色的方法主要有以下几种：（1）放射自显影（2）底物化学发光ECL（3）底物荧光ECF（4）底物DAB呈色；其中ECL显色原理：HRP-ECL发光法：将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法。半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系统，可以同时高效转移大小不同的蛋白。然而，半干转移系统因缓冲液较少不适于长时间转移。半干转操作步骤与湿转基本类似，区别在于两边都是3 层Whatman 3#滤纸，转移电压和时间也有所不同。半干转移系统中，滤纸和膜切成与凝胶相同大小很重要，这样电流必须通过凝胶。否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡，气泡阻碍转移并在印迹膜上产生“秃斑”（即非转移区）。
湿法转膜将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜，
需冰盒散热。转膜条件：电流为300mA，转膜时间为1-3h。也可以60V转膜过夜16h。
半干法转膜将凝胶和固相基质象三明治一样加在缓冲液湿润滤纸之间。与湿转相比，半干法又快（15-45min）又方便。可以同时高效转移大小不同的蛋白。小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100kD以上）建议湿转。
二、设备：
Bio Rad电泳电源仪，转移电泳槽，剪刀，六孔板盒子，剪刀，镊子，1ml移液器，计时器，EP
管架
三、耗材：
NC膜，滤纸，保鲜膜，1.5mlEP管，1ml枪头
四、试剂：
1. 转移缓冲液（2L）：Tris 6.1g，甘氨酸28.8g，甲醇400ml，补ddH2O至1000ml，每次配完可用2-3次， 4℃保存。
2. 1x TBS（tris buffered saline 的简写）的配制： 10mmol/L，Tris含0.9%NaCl，用1N HC1调pH至7.4
1 x TBST（Tween-20是非离子型去污剂，用于洗脱未结合的抗体、减少非特异性结合。）： 1x TBS 中加入0.05％Tween20。
TBST Buffer： 20Mm Tris-HCl pH8.0→150mM NaCl→1LddH2O定容
3. 封闭缓冲液：5%脱脂奶粉（用TBST配制），5g脱脂奶粉加入100ml的TBST Buffer中4°C保存。
4. ECL Kit（Theron）
Luminol（发光液）发生氧化降解，并发射波长为428nm的光，此光可经X光片（放射自显影片）感光记录下来
ECL混合液液配置：4℃冰箱取出，然后用1ml移液器取A，B液各250μl，加到1.5mlEP管中，混匀备用。
5. 显影液：将显影粉盒中的小袋药粉溶于约50℃ 1升去离子水中，溶解后再将大袋药粉加入至全溶，完全冷却至20℃使用，使用时倒出少量液体，用后单独存放，出现沉淀过多可丢弃； 6. 定影液:取商品化定影药粉溶解于25℃1升去离子水中，待全溶后，冷却至20℃使用。使用时倒出少量液体，用后单独存放，出现沉淀过多可丢弃。
五、步骤
1. 转膜
1) 切胶：将电泳板从电泳槽中拿出，用Bio Rad配套的绿色切片将两玻璃板轻轻分开，在玻璃
板上将浓缩胶部分切除，再沿着玻璃板的边沿把胶与玻璃板分开，并切除多余的凝胶部分，只保留58KD和80KD之间的凝胶，在胶的右下角切角标记。将凝胶轻放入转移液中稍稍浸泡。
2) 裁膜：用尺子量取胶的大小，按胶的大小用铅笔在滤纸上画好线确定滤纸和NC膜的大小，
用剪刀沿线将滤纸和硝酸纤维素滤膜剪好，NC膜的一角剪角标记（若滤纸较薄，可适当增加数量）。把滤纸、转移夹中的两块海绵在转膜缓冲液中浸润。用镊子夹硝酸纤维素膜也浸入缓冲液中，以排除气泡。
3) “三明治”：从转移缓冲液中取出一块海绵，放在转移夹的黑色一面。在缓冲液中用滤纸
把胶托起，用镊子夹住一端，将其放在转移夹的海绵上，在其上均匀倒些转膜缓冲液，以排除气泡。再用镊子夹起NC膜的一端，让标记的一端与胶标记的一端在同侧，像放盖玻片一样将NC膜叠于胶上，加些转膜缓冲液。用同法在NC膜上附上一层滤纸，在滤纸上叠上海绵。均放好后，把两夹板合好扣紧。
4) 转膜：将转移架夹放置在电转仪的转移槽中，在转移槽中倒入缓冲液，使液体慢慢没过夹板。
安放时注意：夹板黑色面朝向阴极，红色面朝向阳极；即胶靠阴极。纤维素膜靠阳极。接通电源，恒流状态下，以200mA转移50 min。注意不同大小蛋白的转膜条件不同，例如180KD的蛋白可200mA 2h，50KD蛋白200mA 40-50min，20KD蛋白200mA 30min。
2. 封闭：将NC膜放在5%的脱脂奶粉中，室温震荡1小时。
3. 一抗：用5%的脱脂奶粉稀释抗体( His单抗1∶2000)，将抗体滴在湿盒中的封口膜上，倒扣NC
膜，4°C过夜。用TBST洗涤，RT，摇床，换液6次。
4. 二抗：用5%的脱脂奶粉稀释抗体( HRP-羊抗鼠，1∶3000)，RT震荡40min，同上洗膜。 取2张保鲜膜，平铺在实验台上，可在膜下面四角点水，以防褶皱。 5. ECL化学反应发光法显色
1) 取2张保鲜膜，平铺在实验台上，可在膜下面四角点水，以防褶皱。
2) 化学发光试剂盒中的两种试剂各取250μl，按1∶1的比例混合，吸去NC膜上多余液体后放在
保鲜膜上，滴加ECL混合液在NC上。反应5分钟。
3) 把NC膜平铺在另一张干净的保鲜膜上，保鲜膜折起覆上，使NC膜的两面都被保鲜膜包裹。
4) 暗室中，打开红灯。3个六孔板盒子依次倒入显影液，清水，定影液，备用。
取出感光胶片，根据NC膜大小剪成相应的大小，剪去右下角作为标记，与NC膜的左上角对齐。将厚书压在胶片上，曝光约5分钟。曝光后的感光胶片用镊子夹出，在显影液中显影约30秒钟，随后清水漂洗，定影液中定影1分钟，胶片逐渐清亮，取出晾干。根据曝光情况调整曝光时间，重复压片、显影及定影，选择满意的胶片。
六、注意事项：
1.免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关.因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低,如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一次梯度稀释,上样电泳后,直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量,纯化和浓缩的蛋白质样品必须注意盐的浓度过高,可平衡一下盐的浓度,如透析。
2.形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度,也将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度.因此,建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合.灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合。
3.未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内。
4.电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min)。
5.加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象。 6.为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
7.样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数,,但是反复冻融会使蛋白质降解。 8.为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印。 9.上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。
10.取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对NC膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系。
11.转膜时应依次放好NC膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,NC膜对应正极。 12.转膜时注意电压电流都不能过高，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。
13.转膜时“三明治”的叠放次序不错（黑板近胶），同时要防止产生气泡。 14.若长时间转膜则尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。 15.滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>膜>胶。
16.因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润。不能用手接触膜。
17.由于tris-buffer里含甲醇，故实验时注意自身安全。 18.保证蛋白的量，以防无条带。
19.一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择适当的比例，一抗二抗的选择与清洗直接影响实验结果及背景。
20. 封闭一般在室温下进行，值得注意的是，如果是生物素标记的二抗就不宜使用牛奶，因为牛奶中含有生物素，影响效果。
21. 严格控制一抗二抗反应时间，洗膜要注意尽可能的清洗干净，有利于降低背景
22. 一抗时，倒扣NC膜与一抗上，注意膜的正反方向，将与凝胶接触的面扣于一抗上（观察mark即可分辨正反面）
23.清洗时开始应换液频繁，4-5分钟换液一次，并置于摇床上，如此清洗5-8次后，再改为10分钟换液一次，清洗两次。
24.显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲及镊子不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
25.出现明显条带时，应立即终止显影。然后立即把胶片放入定影液中。 26.整个过程是在暗室中操作，所以应多加注意，避免出错。
七、常见问题：
SDS-PAGE
凝胶电泳常见的问题分析
[杨辛，江彦泽，郭芳]
[武晓燕，李金龙，侯雷，娄亮亮]
WB常见问题分析
微量加样器的使用及注意事项
1 微量加样器的使用原理及分类
根据其加样的物理学原理可分为两种①空气垫加样器(又称活塞冲程);②无空气垫的活塞正移动加样器，这两种加样器具有不同的特定应用范围。
活塞冲程(空气垫) 加样器可很方便地用于固定或可调体积液体的加样，加样体积的范围在小于1μl～10ml之间。加样器中的空气垫的作用是将吸于塑料吸头内的液体样本与加样器内的活塞分隔开来，空气垫通过加样器活塞的弹簧样运动而移动，进而带动吸头中的液体，死体积和移液吸头中高度的增加决定了加样中这种空气垫的膨胀程度。因此，活塞移动的体积必须比所希望吸取的体积要大约2%～4%，温度、气压和空气湿度的影响必须通过对空气垫加样器进行结构上的改良而降低，使得在正常情况下不至于影响加样的准确度。一次性吸头是本加样系统的一个重要组成部分，其形状、材料特性及加样器的吻合程度均对加样的准确度有很大的影响。
以活塞正移动为原理的加样器和分配器与空气垫加样器所受物理因素的影响不同，因此，在空气垫加样器难以应用的情况下，活塞正移动加样器可以应用，如具有高蒸汽压的、高黏稠度以及密度大于2.0g/cm3的液体；又如在临床聚合酶链反应(PCR)测定中，为防止气溶胶的产生，最好使用活塞正移动加样器。活塞正移动加样器的吸头与空气垫加样器吸头有所不同。
2 微量加样器的一般使用原则
加样器根据其加样的物理学原理和结构的不同，其应用特点也有所不同。
（1）活塞正移动加样器无需任何校正，即可用于具不同化学组成和特性(密度和黏度)的液体的吸取加样；相反，空气垫加样器的使用则较受局限。
（2）具有高蒸汽压的液体如氯仿使用空气垫加样器吸取加样通常不能得到跟吸取加样蒸馏水相同的准确度和精密度。由于在液体吸取过程中有部分蒸发，因而加样的体积就会有所减少。可通过预先用液体湿润吸头数次，使得蒸汽相被液体饱和，可以改善加样的准确度。
（3）为防止由高蒸汽压引起液体从吸头中漏出，可使用在底部有瓣的吸头，此瓣只在其与管壁接触的时候打开。
（4）使用空气垫加样器加样，位于液体之上的空气体积膨胀依所加液体密度的不同而不同。当吸取密度高于水的液体时，吸入吸头的体积太低。例如，对于一个密度为1.1的较高浓缩的液体，误差的量将达到0.2%。而吸取较稀的水溶液的这种误差则可以忽略不计。因此，在吸取密度高的液体时，须对加样器吸取体积的设定作相应的校正，才能保证取到正确的体积。然而，在实验室实际工作中，加样器使用者很少碰到要准确吸取密度很高的液体的情况，故由于液体的密度所致加样器使用受限的情况通常难以遇到。
一般来说，为防止所吸取体积上出现误差，有一些基本的操作原则必须遵守。对吸取体积误差影响的因素主要有三个方面：①流体静压；②吸头润湿；③流体动力学。当样本体积从毫升范围降低至微升范围时，物理作用力的关系即发生变化，对于加样来说，其意味着液体表面的作用力效应与其体积或质量（例如重力）的作用力效应相比有所增加，因此，加样器生产厂家在设计和构建加样器和吸头中必须仔细考虑这种情况，而且在使用时也
必须注意。
流体静压：在吸取液体时，加样器吸头只能浸入液体几毫升以确保与排出液体时相同的流体静压条件，因此，加样器必须以几乎垂直的方式加取液体，因为倾斜的方式将减少液体柱的高度，导致吸取的液体过多。如果加样器以30℃下以垂直方式吸取液体，可吸取至0.15%更多的液体。
吸头润湿：当吸头排空时，仍会有一些残留的液体以薄膜的形式保留在吸头的侧面，其量取决于液体和吸头表面的相互作用，因此，其是一个常数，但依液体材料的不同而不同。对于水溶液，这种润湿影响在构建加样器时就应考虑。对于蛋白液等黏度高的液体，建议在加样前吸液体数次，以保证加样的一致性。
流体动力学：对体积吸取的第三个影响是从加样器吸头外壁液体的释放，在此过程中，吸头的几何形状起一个关键的作用。为确保加样中的稳定条件，加样器吸头应靠在管壁上，吸头中释放。如果吸头安装不正确或使用不相配的吸头，对加样误差将达到0.4%以上。尽管空气垫加样器的使用有一定的局限性，但其优点耀很明显的，其所覆盖的体积范围大，使用易于掌握。此类加样器很轻，可很空易地应用于各种情况下的加样。
3 注意事项
实验室基本上以使用连续可调的加样器为主。连续可调式加样器在使用时应注意以下几点，从而使加样器能发挥最佳性能。
3. 1 取液之前，所取液体应在室温（15℃～25℃）平衡。
3. 2 操作时要慢和稳。
3. 3 连续可调试加样器在取样加样过程中应注意移液吸头不能触及其他物品，以免被污染；移液吸头盒（架子）、废液瓶、所取试剂及加样的样品管应摆放合理，以方便操作过程、避免污染为原则。
3. 4 连续可调试加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。
3. 5 吸头浸入液体深度要合适，吸液过程尽量保持不变。
3. 6 改吸不同液体、样品或试剂前要换新吸头。
3. 7 发现吸头内有残液时必须更换。
3. 8 新吸头使用前应先预测。
3. 9 为防止液体进入加样器套筒内，必须注意以下几点：①压放按钮时保持平衡；②加样器不得倒转；③吸头中有液体时不可将加样器平放；④P5000及P10ML加样器一定要加滤芯。
3. 10 勿用油脂等润滑活塞或密封圈。
3. 11 不可把容量计数调超其适用范围。
3. 12 液体温度与室温有异时，将吸头预洗多次再用。
3. 13 移液温度不得超过70℃。
3. 14 使用了酸或有腐蚀蒸气的溶液后，最好拆下套筒，用蒸馏水清洗活塞及密封圈。
3. 15 连续可调式加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。
4. 加样器的校准
加样器容量性能的鉴定，可依据国际标准化组织（ISO）文件ISO/DIS8655和国家技术监督局颁发的有关定量、可调移液器的中华人民共和国国家计量检定规程《定量、可调移液器试行检定规程》（JJG646-90）规定的重量测
试方法。这是目前用于此类仪器有效的校准方法。
4.1. 适用加样器范围 各种品牌、型号的固定、可调和多通道加样器。
4.2. 校准环境和用具要求
4.2.1 室温20-25℃，测定中波动范围不大于0.5℃。
4.2.2 电子天平：放置于无尘和震动影响的台面上，房间尽可能有空调。称量时，为保证天平的湿度（相对湿度60%-90%），天平内应放置一装有10ml蒸馏水的小烧杯。
4.2.3 小烧杯：5-10ml体积。
4.2.4 测定液体：温度为20-25℃的去气双蒸水。
4.3. 选定校准体积 ①拟校准体积；②加样器标定体积的中间体积；③最小可调体积（不小于拟校准体积的10%）。如为固定体积加样器，则只有一种校准体积。
4.4. 校准步骤
4.4.1 将加样器调至拟校准体积，选择合适的吸头。
4.4.2 调节好天平。
4.4.3 来回吸吹蒸馏水3次，以使吸头湿润，用纱布拭干吸头。
4.4.4 垂直握住加样器，将吸头浸入液面2-3mm处，缓慢（1-3s）一致地吸取蒸馏水。
4.4.5 将吸头离开液面，靠在管壁，去掉吸头外部的液体。
4.4.6 将加样器以30角放入称量烧杯中，缓慢一致地将加样器压至第一档，等待1-3s，再压至第二档，使吸头里的液体完全排出。
4.4.7 记录称量值。
4.4.8 擦干吸头外面。
4.4.9 按上述步骤称量10次。
4.4.10 取10次测定值的均值作为最后加样器吸取的蒸馏水重量，按蒸馏水在不同温度及气压下的重量与体积的换算因子计算体积。然后，按校准结果调节加样器。
4.5加样器的维护保养程序
加样器应根据使用频率进行维护，但至少应每3个月进行一次，具体方法如下：
4.5.1.一般维护可用中性洗涤剂清洁，或者用60﹪的异丙醇，然后用蒸馏水反复洗涤，去除洗涤剂或异丙醇，晾干。清洁后活塞处可使用一定量的润滑剂。
4.5.2.如果有液体进入加样器内的严重污染，可将加样器拆开后进行清洁，具体拆开步骤参照加样器说明书。
4.5.3.高压消毒，有的加样器的吸管部分可高压消毒，但需注意的是消毒时不可超温超时，也不能挤压放置，以免造成变形。
4.5.4.可调式移液器在不使用时应妥善地竖立放于支架上，远离潮湿及腐蚀性物质。
4.5.5.在移液操作过程中为防止液体进入加样器套筒内，必须注意：压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。
4.5.6.每天开始工作之前应检查移液器的外表面是否有灰尘或污物，若有则小心抹去。
田士军
实验一 PCR
一 、实验原理： PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
二、设备：
微量移液器（10μl）；离心机(Eppendorf centrifuge 541B)；PCR仪（Bio-Rad S10000TMThermal cycler）
三、耗材：
吸头，1.5ml，200μl PCR八连管，
四、试剂和配制方法：
上游引物，下游引物，模板质粒，灭菌去离子水， Kit：天根生化[ 2×Pfu Master Mix Kp201（含有pfu DNA聚合酶，dNTPs，镁离子，反应缓冲液，PCR反应的增强剂，loading buffer）]。
五、步骤：
1．依次在管中加入：
（25μl PCR体系）按照kit的说明书：
Primer 1(10uM) 1μl
Primer 2(10μM) 1μl
2×Master Mix 12.5μl
ddH2O 9.5μl
Template 1μl
注：空白对照不加模板；其余先加ddH2O，最后加模板。注意加样顺序：ddH2O，Primer，2×Master Mix，Template。
2． 瞬离，将样品甩至管底。
3．PCR参数： 94℃ 5min
35×(94℃ 25sec - 60 ℃ 25sec - 72℃30sec)
- 72 ℃20min
（第一个10min后每管加1μl的普通Taq，然后继续72 ℃10min）若无需加A尾，只需72 ℃10min
4. 立即电泳或保存于4℃
注意事项：
PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，假阳性结果往往来自痕量污染和交叉污染，尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。
（1）DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。
(2）PCR在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。
超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品；移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。
（3）PCR操作应戴手套并勤于更换。
（4）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。
（5）试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。
（6）最后加模板DNA（包括在石蜡油后），马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。
（7）实验设阳性、阴性对照
（8）如要配多个管，配反应体系时应先在一个管中把所有共同的试剂混在一起，再分装到每个小管中，然后再加各自不同的模板或引物，这样省时省力，均一性好。
问题及解决办法：
1、出现假阳性的问题：
实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、 DNA抽提仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。
解决办法：(1)工作区隔离。(2)改进实验操作，如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。(3)操作程序合理化，如后加阳性对照等。
2、假阴性的问题：
如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。造成假阴性的原因包括: (1) DNA 抽提过程不当。 (2) DNA 样品中含有 Taq 聚合酶抑制剂，如尿素、 DMSO 、SDS 等物质，可抑制 Taq 酶活性， DNA 样品中的蛋白质和重金属离子等亦影响 Taq 酶活性，尤其是含有较多脓液或分泌物的标本，其中虽有待查菌，但却因标本处理不当而出现假阴性。 设置内对照是判断假阴性较好的指示系统。在每一反应管中加入内对照，若内对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。
3.不出现扩增条带：
（1）引物：引物质量是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
解决办法：①选定合适的引物合成单位；②引物的浓度不仅要看OD值，最好用引物原液做琼脂糖凝胶电泳，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应与引物合成单位协商解决，如一条引物亮度高，一条引物亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏而导致变质降解失效；④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（2）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
（3）靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
4.出现非特异性扩增带：
（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带出现的原因：一是引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体；二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。
（2）其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
解决办法：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
5.出现片状拖带或涂抹带：
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。可能由于Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，GC含量过高引起。
解决办法：适当降低Mg2+浓度；增加模板量；减少循环次数；加入添加剂甘油。
[肖硕,张秀娟]
实验二 Agarose电泳
一、实验原理：
琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)或者ＥＢ类似物，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。
一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。 三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：超螺旋DNA>线性DNA>开环DNA
正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片 段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用 质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
适合的电泳缓冲液 常用的缓冲液有TAE（见下）和TB（硼酸）E，DNA在这样的溶液中会被去质子化，从而提高其溶解性，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳 时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH 值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
Marker的选择DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。
二、设备：
移液器，微波炉，电泳仪电源，水平式凝胶电泳槽，样品梳，电子秤， 锥形瓶，凝胶成像系统，烧杯，量筒
三、耗材：
PCR产物，质粒，枪头
四、试剂：
150×TAE缓冲液：取242gTris（三羟甲基氨基甲烷）碱于1L烧杯中，加入57.1ml的冰醋酸，○
100ml的0.5mol/L EDTA（pH 8.0），加入去离子水定容到1L。取2ml 50×TAE缓冲液加入98ml去离子水配成100ml 1×TAE稀释缓冲液备用。
21.5%琼脂糖 ○
3DNA相对分子质量标准样品：DL2000。 ○
4Goldview溶液：一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，3μl/100ml胶。 ○
56×上样缓冲液（loading buffer）：6*的缓冲液中可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚○
蓝，代表的片段大小是 300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。 loading buffer的功能主要有两个。第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。商品化产品，贮存于4℃。
五、实验步骤：
1．制备胶液：锥形瓶中的0.75g琼脂糖与50ml 1×TAE稀释缓冲液混匀后放入微波炉里加热至琼脂糖完全融化，取出摇匀。
2．制备胶板：将胶槽置于水平支持物上，插入样品梳，注意梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙；琼脂糖溶液中加入1.5μl Goldview溶液使其终浓度为3μl/100ml胶；将琼脂糖小心倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拔出梳子，注意不要损失梳子底部的凝胶，然后向槽内加入1×TAE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板表面。
3．加样：取25μl DNA样品（PCR产物中含有染液），用移液器小心加入样品槽中。每加完一个样品要用电泳槽中的buffer清洗枪头，上样时要小心不要将样品槽底部凝胶刺穿，同时将10μl的DL2000点样，记录点样顺序。
4．电泳：加完样后，合上电泳槽盖，连接好电线和电源，注意正负极，接通电源。恒压100V，待阴极有气泡冒出才能离开。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
5．观察：戴好手套小心取出电泳槽，滑出凝胶，放在一次性手套上，置于凝胶成像系统下观察，拍照。
6．清洁：电泳用具，晾干。
六、注意事项
1、Marker的选择
Marker的选择要适中，Marker 应该选择在目标片段大小附近 ladder 较密的，这样对目标片 段大小的估计才比较准确。如果marker太大就可能跑不开，挤到一起，起不到marker的作用。 2煮胶要完全，胶要摇匀
注意煮胶完全，不然有小颗粒会影响跑胶结果。如果胶没有摇匀，跑胶的时候，相同的DNA的速度就不会相同，这样会出现弥散条带。
3、电泳跑完后，怎样看跑胶效果？
先看marker跑的怎样，如果marker跑的很好，没有弯曲，就说明整个电泳体系是没有问题的。
4、点样时别锉到胶。
5、条带模糊暗淡
电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是 TAE 缓冲液，一般用 2～3 次就要更换，TBE 缓冲液则可使用 10 次左右。 如果是EB染色，可能是溴化乙锭见光易分解， 母液配制时间过长或保存不当(一般 4℃ 避光保存一年内有效)，或者终浓度没达到 0．5 vg ／ml
七、讨论
1关于凝胶浓度的选择
2跑胶时候。接近阴极的地方胶发黑？
ＴＡＥ的浓度太低，或者是误把水当成TAE，水不能导电，致使负极的胶碳化。 3加样时候，样品浮在缓冲液中，不能沉在加样孔里？ Loading buffer 里的甘油浓度太低，又或者根本没加甘油。 八、琼脂糖凝胶电泳常见问题
[于轹文、王楠]
实验三 凝胶中DNA的回收
一、实验原理：
PCR反应后获得的DNA片断、酶切后所得特定的DNA序列等，经过琼脂糖凝胶电泳后，DNA分子按分子量大小被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条DNA带所在的凝胶切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的 DNA片段，以用于以后分子杂交，重组子构建，序列分析等。
二、设备：
台式离心机、水浴锅、微量移液器（100ul、1ml）
三、耗材：
1.5ml离心管
四、试剂：
无水乙醇，Kit(Omega Gel Extraction Kit， D2500-01)
五、步骤
1．切胶：在长波紫外灯下观察电泳结果，用刀片割下含目的DNA的凝胶块。尽可能多地去掉不含DNA的凝胶，这样对提高质量、简化操作均有好处。
2．将凝胶块放入干净的1.5mlEP管中称重，按每0.1g凝胶加入100μL 的比例加入Binding Buffer（本实验加入700μL），置于55-60℃水浴7min，使琼脂糖块完全溶化，每2-3min颠倒混匀一次。
3．HiBind DNA吸附柱处理。
（1）取一个HiBind DNA吸附柱装在收集管中，吸取200μL Buffer GPS平衡缓冲液 （2）室温放置3-5min， （3）室温下12000g离心2min。
（4）倒弃滤液，将HiBind DNA吸附柱重新装在收集管中，加700μL灭菌水。 （5）室温12000g离心2min。
（6）倒弃滤液，将HiBind DNA吸附柱重新装在收集管中。
4．吸附：将溶化后的DNA 胶液700μL加到吸附柱中，室温放置2min，室温下10000g 离心1min，
倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。
5．洗涤：在HiBind DNA吸附柱中加入300μLBinding Buffer，室温下10000g 离心1min，充分洗涤吸附柱。倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。加入700μL 用乙醇稀释过的SPW Wash Buffer洗涤吸附柱，室温下10000g 离心1min，重复离心洗涤一次。
6．干燥：倒掉收集管中的液体，将HiBind DNA吸附柱于13000g离心2min，将离心柱套在干净1.5ml管上，13000g离心2min，于超净台内风干。
7．洗脱：将HiBind DNA吸附柱放入一个干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入40μL Elution Buffer，室温，静置2min。13000g离心2min.，即可将DNA回收。如果DNA含量较少，可重复洗脱。
8．检测：琼脂糖凝胶电泳鉴定回收的DNA。
六、注意事项：
1.电泳时最好使用新的缓冲液，以免影响电泳和回收效果。 2.如下一步实验要求较高，尽量使用TAE缓冲液。
3.切胶时，紫外线照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤。
4.如果胶回收率低，可在胶充分溶解后检测PH值，如PH值大于7.5，则可向胶溶液中加入磷酸钠（PH5.0），将PH值调到5-7之间。
5. Wash Buffer应保持在低温，否则可能使DNA从柱上脱落而导致回收率降低。 6. 洗脱之前，应再次离心或在空气中放置几分钟，防止其中混入乙醇，影响后续试验。 7.回收大于10kb的DNA片段时，Buffer EB应在50℃水浴预热，适当延长吸附和洗脱时间，可以增加回收效率。
8.回收率和初始DNA量和洗脱体积有关。 9.所有离心步骤均为台式离心机在室温下进行。
七、常见问题：
1. 未回收到DNA片段或回收效率很低 原因①：胶块未完全溶解。
建议：为加快凝胶的溶解，应将凝胶置于55℃水浴中溶解，期间不断上下颠倒，待确定凝胶完全溶解后再进行后续操作。每100 mg凝胶应加入100uL溶胶液，如果胶块过大，应将胶块切成小块，
以便于凝胶溶解。
原因②：加入溶胶液过少。
建议：每100 mg凝胶应加入不少于100uL溶胶液。 原因③：DNA Wash Buffer 中未加入无水乙醇。
建议：第一次使用前，按照说明书要求加入无水乙醇。Wash Buffer使用后，应旋紧瓶盖，以防乙醇挥发，导致漂洗时损失DNA，降低回收效率。 原因④：Elution Buffer不合适。
建议：洗脱液的pH值在7.0~8.5时，洗脱效率最高，洗脱液pH超出此范围，将会显著影响收获率，建议使用试剂盒配套的Elution Buffer（pH 8.5，10mM Tris-HCl），或者使用pH值在此范围的ddH2O。
原因⑤：Elution Buffer未加到离心柱中间。
建议：在洗脱时Elution Buffer应加在中间位置，并室温放置1~2分钟，然后再离心洗脱。另外，采用65℃预热的Elution Buffer将显著提高回收效率。 原因⑥：起始回收量太少。
建议：如果起始回收量很好的样品，应富集，最好使用不少于1ug的样品。 2．电泳时，产物漂出点样孔
原因：洗脱时，柱子中残留有乙醇。
建议：在进行洗脱前，如果柱子上残留乙醇，将会影响洗脱效率，在洗脱前应再次离心，或者空气中放置几分钟，再进行洗脱。 3．后续无法进行连接等实验操作。 原因：洗脱液中含有乙醇。
建议：洗脱前，确保柱子中乙醇已无残留乙醇，再次离心，或者空气中放置几分钟。
[李冠琳、缪新燕]
实验四 连接与转化
一、实验原理
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点，如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入感受态细胞，用所得到重组质粒转化细菌，再筛选就可获得重组的克隆。将感受态细胞与质粒混匀置于冰上，混合物中的DNA形成抗DNase羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，再经过42°C短时热激以促进质粒进入细胞实现转化，利用质粒上的遗传标记在LB平板上就可进行初步的筛选转化菌落。
二、设备：
灭菌锅、微量移液器（100ul,1ml）、恒温水浴锅、恒温摇床、制冰机、超净工作台、酒精灯、培养皿（灭菌）、玻璃涂棒（灭菌）、恒温培养箱、磁力搅拌器、天平、量筒、烧杯、玻璃棒
三、耗材：
1.5ml离心管、饭盒、灭菌枪头、过滤器
四、试剂：
pGMT 载体（北京天根生物VT202-01）、目的基因PCR后的回收产物、T4 DNA 连接酶、连接酶缓冲液、无菌ddH2O
LB液体培养基：配置每升培养基，应在900ml去离子水中加入10.0g蛋白胨、5.0g酵母提取物、10.0g NaCl，磁力搅拌至溶质完全溶解，用5M的NaOH（约0.2ml）调节pH至7.0，然后进行高压灭菌；
LB固体培养基（含抗生素）：固体培养基是在液体培养基中加入1.5%的琼脂制成，即先配置液体培养基，再加入琼脂15g/L，高压灭菌20min，取出后待其降至50℃左右时加入1‰体积的100mg/ml氨苄霉素，摇匀后倒入灭菌的培养皿中，铺成平板，4℃保存；1M IPTG：用8ml蒸馏
水溶解2.38gIPTG定容至10ml，可以用一次性针头过滤器过滤除菌，储存于-20℃；1M X-Gal（408.63 mg/ml）用二甲基甲酰胺（DMF）溶液配制， -20℃避光保存。
五、步骤
1．目的基因片段与载体连接：
取灭菌的1.5ml离心管，将PCR产物与 pGMT载体直接连接。 20μl的反应体系如下： 目的基因片段 8 μl pGMT载体 1 μl 2×连接buffer 10 μl T4 DNA连接酶 1 μl 24℃水浴10min ； 2．连接产物的转化：
（1）取存于-80℃的感受态细菌100μl，置于无菌1.5ml离心管中； （2）加入连接产物，轻轻混匀后放置冰上30min；
（3）放入42℃水浴中90s进行热休克，期间不要摇动试管；冰浴2min；
(4）向管中加入800μl的LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，37℃摇床（100-150r/min），温和震荡45min；
（5）将菌液离心，弃上清，留100μl上清，混匀后加入2μl 408.63mg/ml的X-gal，3.4μl浓度1M的IPTG，混匀，加至含100ug/ml Amp的LB平板培养皿中，用火焰灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）；
（6）将其放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜；
（7）克隆生长至合适大小后，放入4℃下1h，使蓝色克隆充分呈现。
六、注意事项
（1）进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要求进行。连接酶容易失活，注意低温操作，感受态细菌和连接产物混匀需要放置在冰上。
（2）感受态细胞应保存在-80℃，不可多次冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。
（3） 转化时各反应体系配比要正确，连接时可选择10*buffer 4℃过夜或2*buffer 22~26℃水浴10min。
（4）为防止转化试验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。 （5）氨苄青霉素(Amp)：使用前用无菌纯水配制母液，浓度为50mg/mL。 （6）实验分五组，离心管和平板都要标记好，对应好。
（7）涂布棒在使用前必须用酒精灯烧三遍，待火焰熄灭冷却了，再涂板。 （8）X-gal是闭光锡纸保存，使用之后立即用锡纸包裹。 （9）热休克期间不要动试管。
七、问题及分析
实验分五组，1是实验组，2是阳性对照组，3是空载体组，4是Amp抗性组，5是Kam抗性组。 1实验组是自己构建的质粒转入感受态细胞； 2是之前实验成功的产物转入感受态细胞，板上会长； 3是空载体组，没有目的片段，板上不会长；
4有Amp抗性的菌可以长，说明板是正常的有氨苄青霉素的LB平板。 5有Kam抗性的菌长不了，说明没有Amp抗性就长不了。
问题及解决方法：
问题1：蓝白斑筛选中，白斑多但是却没有阳性克隆（假阳性）。 解决方法：
1）检查质粒载体和目的片段的连接情况，避免载体自连的发生。 2）检查载体的酶切位点，排除酶切插入位点等没有出现设计问题。 3）控制好转化的时间和温度。
问题2：蓝白斑筛选，出现很多浅蓝色菌斑（假阴性）。
解决方法：当实际操作中发现当插入小片段时，重组子也有形成浅蓝斑的情况。即蓝色菌斑也有可能含外源基因。据最新报道，大概有30%的假阴性。用牙签挑取浅蓝色菌落，进行PCR扩增，
同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，判断浅蓝色菌落是否为重组子。
问题3：蓝白斑筛选，全是白斑，没有蓝斑。 解决方法：
1）可能是Ampicillin失效，让非抗性的菌种也生长出来。应该确定Ampicillin平板没有问题，2个周之内使用，再用一个加抗生素和一个不加抗生素的平板做对照，用抗生素敏感菌种划平板对照。2）做个空载背景对照，检查平板是否适合做蓝白斑筛选，而且筛选平板要新鲜。 3）做转化之前，用PCR检测一下连接产物，看是否连接成功，或者是否载体自连，这样就可以提前减少假阳性的可能性。
4) 用牙签挑取白色菌落，进行PCR扩增，同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，确定是否重组。 问题4：蓝白斑筛选，只有蓝斑，没有白斑。 解决方法：
1）先用PCR 检测一下连接产物，引物可以用载体上的相应序列，比如M13，检测一下连接是否成功，如果有大片段 (自己估计长度) 产生，那么连接就是成功的。
2）可能是片段浓度太低，连接时注意浓度比，片段和质粒载体浓度比1：5-1：9。
3）用牙签挑取蓝色菌落，进行PCR扩增，同时设立阳性、阴性和空白对照。阳性对照为经测序确认含有相同大小插入片段的重组菌落，阴性对照为经测序确认为不含插入片段的空载质粒菌落，空白对照为不加模板的PCR体系。PCR扩增产物通过非变性PAGE条带分析，判断蓝色菌落是否为重组子。
问题5：蓝斑较大，白斑很小附在周围，还有蓝白镶嵌的斑（卫星菌落）。 解决办法：
1）连接体系还需要优化，即载体和需连接的片段的相对比例必须适中，才会产生一定数量的转化子，比例过大过小都不行。
2）可能是氨苄失效，更换其他抗性载体。
3）中间菌落的生长可能消耗了培养基周围的Amp，导致了卫星菌落的出现，可以小心挑取中间的那个菌落，它一般是阳性克隆。
4）往培养基中加抗生素的时候，温度不能高了，不烫手为宜，防止抗生素失效。 5）培养时间不宜过长，出现阳性菌落就及时处理，以12-16小时为宜。
问题6：蓝白斑筛选时平板置于4度冰箱可以消除假阳性或假阴性吗，根据什么原理？ 解决方法：IPTG是b-半乳糖苷酶的活性诱导物质，X-Gal是b-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的显色底物，在b-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。做蓝白斑筛选是主要是依靠IPTG与X-gal的作用使假阳性菌呈蓝色，而将其置于4度是为了使其显色充分，不是一开始就4度，是等菌长出来之后。一般菌长出来就会有蓝色的了，4度之后会进一步显色。 问题7：蓝白斑筛选，过了很多天才显色，出现蓝色菌落。 解决方法：
1）IPTG和X-gal用pUC18空质粒检测时用的板是否与外源DNA片段连在pUC18后转化用的板是同一批的，即使是同一批次的板，由于倒板时培养基温度过高，导致IPTG和X-gal部分失效，且有可能混匀不均，使得倒的板蓝白筛选效果不同。 2）理由与上基本相似，抗生素失效，更换其他抗性载体。
3）检查外源片段以及载体酶切是否完全，连接时间可稍微加长一下。 4）检查感受态是否被污染，白斑是否为透明白斑，而不应该是白色的菌落。
载体图谱：
［石柳，刘静轶，宋何煜］
实验五 挑克隆及提质粒
一、 实验原理
pGMT 载体上携带有氨苄抗性基因以及lac操纵子，在转入感受态细胞经诱导后能产生β-半乳糖苷酶，可与生色底物x-gal反应产生蓝色菌落。外源基因插入到该载体上使得重组质粒为β-半乳糖苷酶缺陷型，不能与生色底物产生蓝色反应，进而出现白色菌落，因此，挑取培养板上的白色菌落即重组质粒克隆的菌落。
质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA，大小在1-200Kb之间，能在宿主菌中自主复制。宿主细胞中质粒的拷贝数各有不同，一种是低拷贝数的，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，称为“严紧型”复制的质粒，另一类高拷贝的质粒，拷贝数可达到20个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒。
质粒能编码一些遗传性状，如抗药性，利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。
质粒作为载体必备的条件：①具有一段特殊结构的DNA序列；②有一个或多个便于检测的遗传表型，如抗药性、显色表型反应等；③有一个或几个限制性内切酶位点，便于外源基因片段的插
入；④适当的拷贝数。
碱裂解法制备质粒DNA原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，加入中和液后，质粒分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
二、 设备
37℃温箱 摇床 离心机 微量加样器
三、 材料:
培养皿、试管 、枪头离心管、质粒提取盒、EP管(1.5ml) 菌种 无水乙醇
四、 试剂和配制方法：
LB培养基：称取10g胰蛋白酶，5g酵母提取物，10g Nacl，加950ml去离子水充分搅拌至溶解，将PH调至7.0，然后加去离子水定容至1L，高温高压灭菌后，4℃保存
Amp（100mg/ml）：称取100mgAmplicillin溶于1ml去离子水中，完全溶解后用0.2μm滤膜过滤除菌，-20℃保存，用时1000倍稀释。
五、 步骤：
1. 准备10支试管，每支加入2ml的Amp-LB培养基并做好标记。
2. 用镊子夹住一个白枪头从培养皿中挑取单克隆，放入含有液体培养基的试管中，37℃恒温培养
14-16h。
3. 收菌：将摇好的菌液从试管转入到EP管中做好标记，室温离心10000g×1min，弃上层培养液。
4. 重悬：加入250μl SolutionⅠ(已经加入200μl 的RNaseA)，反复吹打，充分 重悬细菌。
5. 裂解：加入250μl SolutionⅡ轻轻颠倒转动数次，变成清亮液，开盖有粘丝状液体出现，室温放
置4min。
6. 中和：加入350μl SolutionⅢ迅速颠倒数次，直到出现白色絮状物。立即离心 13000g×10min.将
上清分别转入到另一批EP管中。重复离心一次。
7. 吸附：首先，先处理柱子：将离心柱放在收集管上，加入200μl buffer GPS，室温放置5min，室
温离心10000g×1min，弃收集管中的废液；再加入700μl高压灭菌水离心1min，弃收集管中的废液。其次：小心将上清液转移到结合柱，室温放置2min，室温离心10000g×1min，弃流出液。
8. 去蛋白：弃流出液，向柱内加入500μl BufferHB洗液，室温离心10000g× min。
9. 清洗：向柱内加入700μlDNA Wash Buffer(已经加入80ml的无水乙醇)，室温离心10000g×1min.
重复离心洗涤一次。
10. 干燥：将柱子放在新的1.5mlEp管中离心，13000g×2min，将柱子打开盖放入超净台中吹干使乙
醇充分挥发。
11. 洗脱：把柱子放进1.5mlEP管中，加入40μl Elution Buffer，室温放置2min，离心13000g×2min，
收集流出液，存于-20℃。
六、 实验分析及注意事项
1.挑克隆注意事项
选单克隆时可以选取边缘颗粒较大的菌落。最好不要选择大的菌落，选择中等，一般0.5-1mm大小，菌落间隙不太近的；用移液枪枪头挑取，也可用灭菌牙签。菌落通常很密集很小，很难挑选单克隆。将挑好克隆的白枪头放入含有液体培养基的冻存管中进行恒温培养的时候，管盖不可拧的太紧，需倒转半圈，以便空气进入，但又不可太松，以防培养液摇出。
2.提质粒注意事项
实验室常用的是试剂盒提取质粒，但是每种试剂盒都会用到三种溶液，以下是针对这三种溶液使用时的溶剂组成成分的作用和实验注意事项以及相应的解决方案：
（1）溶液I：
组成成分：Tris-Cl溶液的主要作用是用来调节溶液的浓度和PH；葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌或其他细菌不会快速沉积到管子的底部EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其作用是抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
注意事项：
①实验中很多试剂盒在使用前要往溶液I中加入RNase, 用来水解RNA，加入后要在瓶体标记，以防漏加多加。
②某些试剂盒中溶液I注明需要低温4℃保存。
③在实验过程中，若试剂盒缺少或丢失溶液I，且急于提质粒的情况下，可以用等体积的水或
LB培养基来悬浮菌体。
④此步骤最重要的是：菌体一定要悬浮均匀。
（2）溶液II：
这个瓶子的盖子打开时瓶盖周围会有少量结晶。这是因为溶液中含有NaOH，因为裂解细胞的主要是碱性物质，所以也叫碱法抽提质粒。NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。若只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS是弱碱。
注意事项及解决办法：
时间不能过长，因为碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，
必须温柔各种角度混合，过度剧烈会使基因组DNA断裂，在之后的琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
注意瓶子底部是否有沉淀状物，可能是SDS析出，放到37°水浴锅里热一下即可。
（3）溶液III：
加入后就会有大量的白色沉淀，之后离心10分钟取上清。沉淀的出现是因为十二烷基硫酸钠（SDS）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（PDS），而PDS是不溶于水的，因此发生了沉淀。
注意事项及解决方法：
①此步骤离心一定要彻底，最好是离心10分钟。
②用枪轻吸上层清液防止吸入底部白色絮状沉淀而影响实验效果，可选用量程较小的枪头转移上清，如使用200μl移液枪。吸出上清，再离心5min，效果更好。
③加入溶液III后，复性时间不宜过长，一般是5分钟，否则会使染色体复性。
（4）处理吸附柱：
注意事项：一定不要有酒精残留，有酒精残留会影响质粒的洗脱效果。
（5）琼脂糖电泳
鉴定质粒DNA，多数情况下会出现三条带，这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。
注意事项：若不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
附：手提质粒的试剂配置和实验步骤以及注意事项：
实验步骤： 1．将1.5ml菌液倒入微量离心管中，12000g离心30s，吸出上清，使细菌尽可能干燥； 2．将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，用枪吹匀，不要有气泡，放冰上5min；
3．加200μl新配制的溶液II，盖紧管口，快速但摇的动作要缓慢，颠倒离心管5次，以混合内容物，不要振荡，将离心管放置在冰上；
4．加150μl用冰预冷的溶液III，盖紧管口，将管倒置后温和振荡10s使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀之后将管倒置于冰上3-5m；
5．以12000g离心5min，最好10min，将上清转移到另一离心管中；
6．加等量的酚：氯仿：异戊醇，振荡混匀，用微量离心机12000g离心2min，将上清转移到另一离心管中；
7．用2倍体积的乙醇沉淀双链DNA，混匀，4度放置半小时；有絮状沉淀产生
8．用12000g离心5min，小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上（或用一次性的吸头与真空管扣连，轻缓抽吸），再将附于管壁的液滴除尽（可在空气中使核酸干燥10min）；
9. 用200ul 70%冰预冷的乙醇清洗管壁和沉淀，DNA在70%乙醇中不溶，30%水的目的是溶解盐，防止干扰后续的酶切或其它操作； 4度12000rpm离心5min；用黄枪头吸去上清，然后快速离心30s，再用白枪头吸走剩下的溶液；在工作台里吹风30min；
10．用50μlddw溶解核酸，贮存于-20度或4度。
注意事项以及解决办法：
1、加溶液I前菌液上清要吸干净
2、加溶液II、III时，要快轻混匀，提取的效果才会好；
3、严格控制反应的温度，加I，II，III后都要在冰上放置3-5分钟，反应才会缓慢且彻底；
4、溶液II的浓度可以根据菌的数量进行相应的调整，时间和进度的把握非常关键；
5、溶液III的反应在4度冰箱中进行，也是要观察沉淀的量和颜色，沉淀好，有利于离心酶切；
6、乙醇沉淀的时间可以久一些，增加产量。
[宋琳琳，田士军，徐菲一]
实验六 重组质粒的双酶切鉴定
一、实验原理：
利用限制性内切酶特异的识别DNA特异的核苷酸序列，并切割DNA,产生一定长度的DNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒DNA）
根据酶切的目的不同，可采用小量酶切或大量酶切反应两种体系。如果基因片段插入位点两端的酶切位点不同时，则需进行双酶切反应。双酶切可采用不同的方法进行。如果这两种酶的反应缓冲液相同或相近，可以同时加入两种酶进行酶切，但反应体系应稍大些，以免甘油浓度过高，影响酶的活性。小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，典型的反应是20μl体积中含0.2~1μl DNA。
双酶切反应在两个酶反应条件相同时，可参照小量酶切反应进行。
酶切产物通常采用琼脂糖凝胶电泳鉴定，该法可按酶切产物分子量的大小分离DNA片段，小片段比大片段迁移快，凝胶上迁移的距离与分子量的对数成反比。酶保存液：
10mm Tris-HCl pH7.5
400mm KCl
0.1mm EDTA
1mm DTT
0.01% DSA
50% Glycerol
二、设备：
100μl、20μl微量移液器、离心机、金属浴、锥形瓶、冰盒
三、耗材：
枪头、0.5mlEp管
四、试剂：
1、50×TAE Buffer(pH 8.5) ：取242gTris碱于1L烧杯中，加入57.1ml的冰醋酸，100ml的0.5mol/L
EDTA（pH 8.0），加入去离子水定容到1L。取2ml 50×TAE缓冲液加入98ml去离子水配成100ml 1×TAE稀释缓冲液备用。
2、凝胶加样缓冲液（10×loading-buffer）
3、限制性核算内切酶
4、质粒、Buffer、高压灭菌水、琼脂糖、GoldView
五、步骤：
1、构建酶切体系：按体系组成顺序在新的EP管中加入各物质
双酶切体系： 20μl
10×M buffer 2μl
质粒 16μl
KpnI 1μl
HindIII 1μl
2、将EP管1000rpm离心1 min，使液体充分混匀，放入37℃金属浴中反应4 h
3、电泳检测
六、注意事项
1.吸样量一定要准确；
2.为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶；
3.要求在冰上操作，并充分混匀；
4.开启EP管时，手不要接触到管盖内面，以防污染；
5.酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回－20℃中保存。
6.使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取前要小心地离心搜集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。
七、问题分析及解决
限制性内切酶酶解中常见的问题和原因
1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。
2．DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。
3．DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力；②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它DNA。
[周雅琼，李纯]
实验七 菌种保存
一、 实验原理：
大多数大肠杆菌能在保存培养基中存活数年，若在-70℃或液氮中冻存则可长期保存。甘油保存菌种的条件是需要冻存。主要靠低温来降低微生物活性，达到保存的目的。甘油的主要作用就是防止在冻存细菌时产生的冰晶对细胞造成的损害，一般使用甘油的终浓度在10%-20%
菌种保存液可采用下述2种试剂：
（1）甘油溶液（80%或100%皆可）
（2）DMSO溶液
二、设备：
37℃温箱、摇床、高压锅、微波炉
三、耗材：
移液器、挑菌针、EP管、量筒，试管
四、试剂：
1．LB培养基：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g Nacl，加950ml去离子水充分搅拌至溶解，将pH调至7.0，然后加去离子水定容至1L，高温高压灭菌后（121ºC，15min），4℃保存。
2．Amp （100mg/ml）称取100mgAmplicillin溶于1ml去离子水中，完全溶解后用0.2μm滤膜过滤除菌，-20℃保存.用时1000倍稀释。
3．灭菌甘油， 4℃保存。
五、步骤：
1． 菌种扩大培养
从LB平板上挑取阳性克隆的单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基（含100mg/ml Amp 3-5μl）中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。
2． 20%甘油保存
将高压灭菌后的甘油放入微波炉中加热片刻至微热，增加其流动性。取标记好的1.5ml的EP，加入200μl甘油，冷却后加入800μl菌液，充分混匀，密封，存于-20℃或-80℃长期保存。
六、注意事项
1、注意在超净台内操作，避免污染。
2、在EP管中应先加入甘油，再加入菌液，并充分混匀。
七、问题分析及解决
问题：1、冻存的菌液再用时失活或检测有杂菌。可能是保菌操作时未在超净台内进行。需重新进行保菌。
2、在菌种液中加入甘油15－30％，但是发现过一段时间之后，甘油沉在下面，菌液在上面，甘油好像没冻，还是透明的，可菌液已经冰冻成白色得了。 可能是冻存之前未混匀，混匀就可以使用。
[金玺圆，李纯]
实验八 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
一、 实验原理：
体中具有卡那抗性的特点，先用含有卡那霉素的LB培养基进行转接，筛选出转化成功的细胞并继续培养。然后加入IPTG诱导表达，过表达之后再进行离心收菌，加入PBS重悬，放入-20度保存。 注：
卡那霉素：一种由卡那链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)产生的氨基糖苷类抗生素，含三个组分：
卡那霉素A、B和C，卡那霉素A为主要组分。通过与30S核糖体亚单位结合而使细菌蛋白质合成发生错读。若细菌中产生一种破坏卡那霉素的酶，则可变为抗性株。卡那霉素抗性的质粒经常被作为选择基因或标记基因用于分子克隆中。
IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，是一种乳糖类似物，能诱导乳糖操纵子的活化，而表达载体上具有乳糖操纵子，故活化乳糖操纵子能诱导蛋白表达。而且IPTG化学性质比较稳定，不易与其他组分发生反应，故能取代乳糖作为诱导剂。
二、 设备：
微量加样器（1ml,100ul,10ul,2.5ul），恒温振荡培养箱，超净台，离心机，恒温培养箱
三、 耗材 ：
无菌玻璃试管，无菌50mL离心管、枪头、1.5mL EP管
四、 试剂：
IPTG（100M）母液，LB培养基（含有50μg/mL终浓度的卡那霉素） 1．100mM IPTG的配制
0.2383g的IPTG（分子量238.30），溶于10mL无菌去离子水中， 0.22μm滤膜过滤，分装于无菌1.5mL的EP管，-20℃保存备用。 2．50mg/mL卡那霉素储存液的配制
0.5g卡那霉素粉末溶解于10mL无菌去离子水， 0.22μm滤膜过滤，分装于无菌1.5mL的EP管， -20℃保存备用。
3．LB培养基（含有50μg/mL终浓度的卡那霉素）的配制
胰蛋白胨10g，酵母提取物5g 和氯化钠10g，溶于900mL去离子水，用NaOH调节该培养基的pH至7.4，定容至1L后分装入摇瓶，高压灭菌后4℃密封保存备用，使用前加入1‰体积的50mg/mL卡那霉素使其终浓度为50μg/mL。 4．PBS的配制
氯化钠8g，氯化钾0.2g，二水合磷酸氢二钠1.56g和磷酸二氢钾0.2g，加入去离子水定容至1L，调pH至7.4，高压灭菌后使用。
四、步骤：
1．挑克隆：从37℃恒温培养箱中取出培养过夜的平板，倒置放入超净台。超净台中，用移液器吸取2mL LB液体培养基（含50μg/mL卡那霉素）加入到无菌玻璃试管中，用消毒后的镊子夹取一个小枪头，在平板上挑取一个形态饱满的单一菌落，投入已加入培养基的玻璃试管中，管口加胶塞后放入摇床37℃，250r/min过夜震荡培养。
2．转接：超净台中，按1%转接过夜菌，即吸取过夜菌60μL加入到6mL LB液体培养基（含50μg/mL卡那霉素）中，37℃摇床250r/min震荡培养3h（最终得到的菌液可能没有6ml，在保持浓度不变前提下可适当加大初始溶液体积）。
3．诱导：在超净台中，将6mL菌液分装到三支离心管，2mL/支。分别向两支离心管中加入10μL和2μL 的IPTG（100mM）溶液，使IPTG终浓度分别为0.5mM和0.1mM，进行外源基因的诱导表达，第三支离心管不加IPTG，分别做好标记。37℃，250r/min恒温摇床中震荡培养4h。
4．收菌：将两支离心管诱导的菌液分别倒入1.5mLEP管，同时收集未诱导菌，5000r/min离心2min
收集菌体，弃上清。
5．重悬：加入200μLPBS，将菌体吹打混匀，重悬菌体。 1．保存：菌体悬液在-20℃保存备用。
五、 注意事项：
1、 转接前先计算好各试剂所需剂量，对实验的各环节熟悉。
2、 由于液体损耗，摇菌前管中菌液应该大于所需菌液，保持浓度不变即可。
3、 摇菌时先将盖子拧紧，再稍微拧松，过紧会导致克隆效果不佳，过松可能会使盖子脱落。
六、 问题及分析：
1、 为什么要用IPTG进行诱导？IPTG是如何诱导蛋白表达的？
答：IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，是一种乳糖类似物，能诱导乳糖操纵子的活化，而表达载体上具有乳糖操纵子，故活化乳糖操纵子能诱导蛋白表达。而且IPTG化学性质比较稳定，不易与其他组分发生反应，故能取代乳糖作为诱导剂。 2、 为什么不能将转接和诱导同步进行？
答：转接到含有卡那抗性的LB培养基中进一步纯化了细胞，如果同时进行则可能会诱导产生非目的蛋白质。
3、 如果未知IPTG的最佳浓度，要怎样确定其最佳浓度？
答：通过设置浓度梯度的方法来得出最佳浓度，分两部进行，第一步是设置较大的浓度梯度，先确定一个合适范围，再在这个范围之内进行分隔度较小的浓度梯度，细化确定最佳浓度。
[赵萌，戴蒙]
实验九 超声碎菌
一、 实验原理 ：
胞破碎仪是利用超声波在液体中的分散效应,使液体产生空化的作用,从而使液体中的固体颗粒
或细胞组织破碎. 超声波细胞破碎仪由超声波发生器和换能器两大部分组成.超声波发生器电路将50/60Hz的市电转换成18-21KHz的高频高压电能，该能量被输到“压电换能器”中，并被转换成高频
机械震动，再经“变幅杆”的聚能和振幅位移放大后作用于液体中而产生强大的压力波，这个压力波则会形成千百万的微观气泡，随着高频振动，气泡将迅速增长，然后突然闭合，在气泡闭合时，由于液体间相互碰撞产生强大的冲击波，在其周围产生上千个大气压的压力（即超声空化）。它使得变幅杆顶部产生强有力的剪切活动，并使得气体中的分子强力地被搅动。该能量足以将细胞及各类无机物质破碎重组。
二、 设备：
冷冻高速离心机 、超声细胞破碎仪、高压蒸汽灭菌器。
三、 耗材：
1.5ml离心管 移液枪 枪头 1L烧杯 玻璃棒 1L容量瓶
四、 试剂：
PBS缓冲液体系：称取NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.42g KH2PO4 0.27g 溶于约800ml的去离子水中搅拌溶解，滴加浓盐酸至pH=7.4，然后定容至1L，灭菌备用。
五、 步骤：
1．将上个实验中用PBS重悬并冻存的菌液（空白对照组，0.1mM和0.5mM IPTG诱导组）解冻。 2．设置超声仪超声参数。
3．将离心管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率400 W，Φ15变幅杆，破碎20s，间歇20S) 3min后观察破碎后细胞悬液的浑浊程度。
4．两种浓度的细胞破碎悬液各取60μl于1.5 ml离心管中，将破碎液于10000 r/min，4℃离心10min，收集沉淀和上清。
1．取离心上清60μl于1.5 ml离心管中，用140μl PBS重悬沉淀，再取沉淀重悬 液60μl于1.5 ml离心管中。
6．在上述离心管中加入20μl的4XLoading buffer，混匀，存于-20℃备用。
六、 注意事项：
1、确保菌体混合物始终处于低温条件，防止蛋白质变性；
2、防止长时间超声，即一个周期不要太长。以免破碎混合物中心的热量得不到充分释放； 3、破碎时把握好破碎的度，既不要破不开也不要破过了（离心后会有黑色沉淀）！ 4、超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。
5、尽量防止泡沫的产生。蛋白以包涵体的形式表达，追求的是高破碎率，要求细胞碎片很小，而另
一种蛋白是可溶形式表达，所以细胞碎片不能很小，两种情况要求不同但目的相同，都是便于后期的固液分离。
七、 问题及分析：
一、判断是否超声完全：
1、外观判断：超声前菌悬液是浑浊的，超声后完全变透明、清澈。 2、液体的粘滞性：超声后菌液从枪头滴下不粘连。
3、高速离心：用高速离心检测超声破碎程度（一般用6，000g10min,比一般离心收集菌体的转速高
一点）。沉淀是未破碎或破碎不完全的菌体。
4、染色：破碎后的菌液涂片，革兰氏结晶紫染色0.5分钟，镜检。
二、在破碎的时候出现的黑色的物质，为什么？
主要原因是在超声波破碎的时候，探头靠在了破碎的容器的边沿（主要是玻璃瓶子）上面，所以超声出来的液体里面会呈现黑色的。就算同样的超声时间和条件，唯一的差别就是探头不要靠在容器的边沿上面，都不会出现黑色。这个说明不是样品的炭化，而是探头将玻璃瓶子炭化了。同时也会损害探头。
其次，超声功率太强，也会现黑色沉淀。
三、还有什么方法能使细胞高效破碎？
反复冻融、加溶菌酶酶解 ,French压榨（French Pressure cell Press）一种细胞压力破碎仪，通过压力差来使得细胞胀裂）等再加上超声，细胞才破。而且在超声的时候最好用冰浴，因为超声时放热比较多，否则产生的大量的热会使胞内蛋白变性。
四、超声前后核内核酸被破碎成小片段了，为什么基质中的蛋白质却没有变性？
空化泡破裂时产生瞬时高温（约5000℃）、高压（可达500×104Pa），可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。
超声破碎的条件一般是300w，10s/10s，20分钟，具体条件根据自身情况而定，在一定时间和功率范围内设置相应的参数进行超声即可得到相应的蛋白，超声时间太长功率太高对蛋白活性也会有影
响。
[贺丽，张妮]
实验十 SDS-PAGE
一、 实验原理：
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂N,N,N＇,N＇-四甲基乙二胺（简称TEMED）和催化剂过硫酸铵（简称AP）作用下聚合交联成三维
网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）。免疫印迹（Western blotting或Immuno blotting）是检测蛋白质样品中特异性抗原的一种分析方法。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇(ME)，二硫苏糖醇（DTT）能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异，从而达到通过分子量差异分离蛋白的目的。
本实验第一步是将被分析的蛋白样品做SDS-PAGE凝胶电泳，使样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成条带。第二步把凝胶中的蛋白转移到膜上（所谓印迹），其中用的最多的材料是硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜。蛋白转移的方法多采用电转移，也有用吸印法转移的（原理与Southern blotting 类似）。电转移又有半干法和湿法之分，本实验采用后者。
二、实验设备：
蛋白质（Bio-Rad/0电泳装置，微量加样器（1ml，100ul，20ul，10ul）
三、实验器材：
100mL量桶×1，100mL烧杯×5，1L量杯×2，EP管，玻璃瓶×2，大培养皿（蛋白胶染色和脱色用）
四、试剂与配制：
1．30%凝胶储备液：29g丙烯酰胺和1g N，N-亚甲双丙烯酰胺，加去离子水溶解，用去离子水定容至100mL，过滤，避光贮存，4℃。
2．10%SDS（w/V）：10g SDS加去离子水溶解，定容至100mL。贮存于室温。 3．TEMED（N，N，N’，N’，四甲基乙二胺）
4．10%过硫酸胺(AP)：0.1g过硫酸胺溶于1mL去离子水中。分装于EP管中-20℃贮存。
5．1.5M （mol/L）Tris-HCl (pH8.8)：18.17gTris base置于100mL烧杯中，加入约80mL去离子水，充分搅拌溶解，加浓盐酸调pH值至8.8，定容至100mL。
1.0M(mol/L) Tris-HCl (pH6.8)： 12.11g Tris base置于100mL烧杯中，加入约80mL去离子水，充分搅拌溶解，加浓盐酸调pH值至6.8，定容至100mL。
6．电泳缓冲液×1：25mmol Tris base（3.02g）与250mmol甘氨酸（18.8g）组成缓冲体系，稳定电泳过程的PH，0.1%SDS（1g），加去离子水定容至1L。
电泳缓冲液×5：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g，加去离子水定容至1L。使用时稀释5倍。
7．1×电泳加样缓冲液：50mmol/L Tris-HCl 缓冲体系pH6.8（Tris base 0.604g），50mmol/L DTT，2%SDS（SDS2g），0.1g溴酚蓝（作为，因为呈蓝色，而蛋白质是白色，在SDS-凝胶中不明显，且溴酚蓝的相对分子量比蛋白质(绝大部分)小，电泳时速度比蛋白质稍快，因此当溴酚蓝到达电泳槽底部(可看蓝色调带)，则电泳结束。 ），10%甘油（甘油10mL），加水定容至100mL。
8．甲醇/醋酸溶液：90mL甲醇：水（1∶1即45mL甲醇45mL水）和10mL冰醋酸混匀。 9．考马斯亮蓝染液：0.25考马斯亮蓝（commassise blue R250）溶解于上液中，Whatman I号滤纸过滤。室温保存。
五、步骤：
1．配置10%分离胶（两块胶用10mL）
1) 组份表：水4mL，30%凝胶储备液3.3mL，1.5M Tris-HCl (pH8.8)2.5mL，10%SDS 0.1mL，
10%过硫酸胺（催化剂，用作醋酸乙烯、丙烯酸酯等烯类单体的）0.1mL，TEMED（加速剂）0.004mL。
2) 在烧杯内迅速搅拌均匀（TEMED最后加），用移液枪注入玻璃板间隙中，加入大约4mL
（也可左手将玻璃板倾斜，右手拿烧杯从较长的一侧中部缓缓倒入）。用1ul去离子水自左向右覆盖，去除气泡，防止胶被氧化。
3) 聚合完成（约30min）后，倒掉覆盖液体，尽可能用吸水纸吸干顶端残存液体。
2．配置5%成层胶(即浓缩胶，凝胶电泳时，在分离胶上方铺设的一薄层大孔凝胶。能使样品在电泳初始阶段快速浓集在分离胶界面，样品在分离胶就能达到更好的分离效果。样品通过成层胶浓集是采用等速电泳的原理。)（两块胶用5mL ）
1) 组份表：水3.4mL，30%凝胶储备液0.83mL，1.0M Tris-HCl (pH6.8) 0.63mL，10%SDS
0.05mL，10%过硫酸胺0.05mL，TEMED0.005mL
2) 搅拌均匀，注入玻璃板内，分离胶的顶部。平稳插入梳子，垂直放置于室温下。
3．装电泳槽：在成层胶聚合完成（约30min）后，用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶放入电泳槽上。上下槽均加入1×电泳缓冲液，检查是否泄漏（上一次电泳的缓冲液可以作为下槽的缓冲液，以便试剂的节约）。驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡。
4．样品处理：在成层胶聚合的同时，样品与加样缓冲液混匀，100℃加热5min。
5．上样：按次序上样，不同样品的上样体积用1×loading buffer调成一致，将1×Loading Buffer加入未使用的梳孔中。
6．电泳：成层胶电压为90V，染料进入分离胶后，将电压增加到120V，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。（在电泳槽的底部有一条白金丝，清洗时注意不要损坏；在电泳槽正常工作的情况下，会有气泡产生，电泳开始一段时间后样品浓缩成一个窄带，此时方可离开做其他实验）。 7．染色：电泳结束后，用至少5倍体积的染色浸泡，放摇床上室温缓慢旋转3~4h；
8．脱色：换掉并回收染液，用水洗去多余的染色液，用甲醇/醋酸溶液浸泡凝胶，缓慢摇动4~8h脱色，其间换液3~4次，直到胶的背景很淡时为止；
9．观察结果：将脱色后的凝胶照相或干燥，也可用封闭塑料袋在含20%甘油的水中长期保存。
六、注意事项：
1、丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时要注意防护。
2、SDS-PAGE所得结果，在分子量为15,000—200，000的范围内，与用其他方法测得的分子量相比，误差一般在±10%以内，在此范围内结果才较为准确。
3、加样的量要合适，一个样品的0.25μg某种蛋白质，即可观察到其电泳带，而如果有20~100μg，该泳道便超载了。
4、对许多蛋白而言，电泳时速度越大则电泳带越清晰，但电流太大，玻璃板会因受热而破裂，故合适的电流应该是玻璃板热而不烫。
5、SDS-PAGE凝胶的考马斯亮蓝染色可检测到0.1μg以上的单一条带的蛋白质。 6、如欲更快脱色可用下述方法：
（1）用30%甲醇、10%乙酸混合液脱色，但脱色时间过长，蛋白质带的着色深度将会部分丧失； （2）用正常的脱色液在45℃下脱色；
（3）正常的脱色液中加入数克阴离子交换树脂或一块海绵，吸附脱下来的染料； （4）使用商品化的专门仪器电泳脱色；
（5）染色过的凝胶不应贮存在脱色液中，因这将导致蛋白质带褪色。
7、实验中的玻璃器皿必须干净并用无离子水冲洗，否则，可大大减低银染的灵敏度。
8、为保存凝胶，将染色后的凝胶放在玻璃纸上，并在凝胶上面覆盖一层玻璃纸。这样干燥出来的直接用于照相、摄影或永久保存，效果甚佳。
七、常见问题分析：
SDS-PAGE凝胶电泳常见的问题分析
[常卓，王卓然、武晓燕、吴昊]
实验十一 Western blot
一、实验原理：
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。
western显色的方法主要有以下几种：（1）放射自显影（2）底物化学发光ECL（3）底物荧光ECF（4）底物DAB呈色；其中ECL显色原理：HRP-ECL发光法：将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法。半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系统，可以同时高效转移大小不同的蛋白。然而，半干转移系统因缓冲液较少不适于长时间转移。半干转操作步骤与湿转基本类似，区别在于两边都是3 层Whatman 3#滤纸，转移电压和时间也有所不同。半干转移系统中，滤纸和膜切成与凝胶相同大小很重要，这样电流必须通过凝胶。否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡，气泡阻碍转移并在印迹膜上产生“秃斑”（即非转移区）。
湿法转膜将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜，
需冰盒散热。转膜条件：电流为300mA，转膜时间为1-3h。也可以60V转膜过夜16h。
半干法转膜将凝胶和固相基质象三明治一样加在缓冲液湿润滤纸之间。与湿转相比，半干法又快（15-45min）又方便。可以同时高效转移大小不同的蛋白。小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100kD以上）建议湿转。
二、设备：
Bio Rad电泳电源仪，转移电泳槽，剪刀，六孔板盒子，剪刀，镊子，1ml移液器，计时器，EP
管架
三、耗材：
NC膜，滤纸，保鲜膜，1.5mlEP管，1ml枪头
四、试剂：
1. 转移缓冲液（2L）：Tris 6.1g，甘氨酸28.8g，甲醇400ml，补ddH2O至1000ml，每次配完可用2-3次， 4℃保存。
2. 1x TBS（tris buffered saline 的简写）的配制： 10mmol/L，Tris含0.9%NaCl，用1N HC1调pH至7.4
1 x TBST（Tween-20是非离子型去污剂，用于洗脱未结合的抗体、减少非特异性结合。）： 1x TBS 中加入0.05％Tween20。
TBST Buffer： 20Mm Tris-HCl pH8.0→150mM NaCl→1LddH2O定容
3. 封闭缓冲液：5%脱脂奶粉（用TBST配制），5g脱脂奶粉加入100ml的TBST Buffer中4°C保存。
4. ECL Kit（Theron）
Luminol（发光液）发生氧化降解，并发射波长为428nm的光，此光可经X光片（放射自显影片）感光记录下来
ECL混合液液配置：4℃冰箱取出，然后用1ml移液器取A，B液各250μl，加到1.5mlEP管中，混匀备用。
5. 显影液：将显影粉盒中的小袋药粉溶于约50℃ 1升去离子水中，溶解后再将大袋药粉加入至全溶，完全冷却至20℃使用，使用时倒出少量液体，用后单独存放，出现沉淀过多可丢弃； 6. 定影液:取商品化定影药粉溶解于25℃1升去离子水中，待全溶后，冷却至20℃使用。使用时倒出少量液体，用后单独存放，出现沉淀过多可丢弃。
五、步骤
1. 转膜
1) 切胶：将电泳板从电泳槽中拿出，用Bio Rad配套的绿色切片将两玻璃板轻轻分开，在玻璃
板上将浓缩胶部分切除，再沿着玻璃板的边沿把胶与玻璃板分开，并切除多余的凝胶部分，只保留58KD和80KD之间的凝胶，在胶的右下角切角标记。将凝胶轻放入转移液中稍稍浸泡。
2) 裁膜：用尺子量取胶的大小，按胶的大小用铅笔在滤纸上画好线确定滤纸和NC膜的大小，
用剪刀沿线将滤纸和硝酸纤维素滤膜剪好，NC膜的一角剪角标记（若滤纸较薄，可适当增加数量）。把滤纸、转移夹中的两块海绵在转膜缓冲液中浸润。用镊子夹硝酸纤维素膜也浸入缓冲液中，以排除气泡。
3) “三明治”：从转移缓冲液中取出一块海绵，放在转移夹的黑色一面。在缓冲液中用滤纸
把胶托起，用镊子夹住一端，将其放在转移夹的海绵上，在其上均匀倒些转膜缓冲液，以排除气泡。再用镊子夹起NC膜的一端，让标记的一端与胶标记的一端在同侧，像放盖玻片一样将NC膜叠于胶上，加些转膜缓冲液。用同法在NC膜上附上一层滤纸，在滤纸上叠上海绵。均放好后，把两夹板合好扣紧。
4) 转膜：将转移架夹放置在电转仪的转移槽中，在转移槽中倒入缓冲液，使液体慢慢没过夹板。
安放时注意：夹板黑色面朝向阴极，红色面朝向阳极；即胶靠阴极。纤维素膜靠阳极。接通电源，恒流状态下，以200mA转移50 min。注意不同大小蛋白的转膜条件不同，例如180KD的蛋白可200mA 2h，50KD蛋白200mA 40-50min，20KD蛋白200mA 30min。
2. 封闭：将NC膜放在5%的脱脂奶粉中，室温震荡1小时。
3. 一抗：用5%的脱脂奶粉稀释抗体( His单抗1∶2000)，将抗体滴在湿盒中的封口膜上，倒扣NC
膜，4°C过夜。用TBST洗涤，RT，摇床，换液6次。
4. 二抗：用5%的脱脂奶粉稀释抗体( HRP-羊抗鼠，1∶3000)，RT震荡40min，同上洗膜。 取2张保鲜膜，平铺在实验台上，可在膜下面四角点水，以防褶皱。 5. ECL化学反应发光法显色
1) 取2张保鲜膜，平铺在实验台上，可在膜下面四角点水，以防褶皱。
2) 化学发光试剂盒中的两种试剂各取250μl，按1∶1的比例混合，吸去NC膜上多余液体后放在
保鲜膜上，滴加ECL混合液在NC上。反应5分钟。
3) 把NC膜平铺在另一张干净的保鲜膜上，保鲜膜折起覆上，使NC膜的两面都被保鲜膜包裹。
4) 暗室中，打开红灯。3个六孔板盒子依次倒入显影液，清水，定影液，备用。
取出感光胶片，根据NC膜大小剪成相应的大小，剪去右下角作为标记，与NC膜的左上角对齐。将厚书压在胶片上，曝光约5分钟。曝光后的感光胶片用镊子夹出，在显影液中显影约30秒钟，随后清水漂洗，定影液中定影1分钟，胶片逐渐清亮，取出晾干。根据曝光情况调整曝光时间，重复压片、显影及定影，选择满意的胶片。
六、注意事项：
1.免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关.因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低,如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一次梯度稀释,上样电泳后,直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量,纯化和浓缩的蛋白质样品必须注意盐的浓度过高,可平衡一下盐的浓度,如透析。
2.形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度,也将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度.因此,建议要根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为15-20分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为8-10分钟开始可见聚合.灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合。
3.未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内。
4.电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10-20V,20-30min)。
5.加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象。 6.为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。
7.样品缓冲液中煮沸的样品可在-20℃存放数,,但是反复冻融会使蛋白质降解。 8.为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印。 9.上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。
10.取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对NC膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系。
11.转膜时应依次放好NC膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,NC膜对应正极。 12.转膜时注意电压电流都不能过高，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。
13.转膜时“三明治”的叠放次序不错（黑板近胶），同时要防止产生气泡。 14.若长时间转膜则尽量让电转温度保持在10度以下，冰浴为宜。 15.滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>膜>胶。
16.因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润。不能用手接触膜。
17.由于tris-buffer里含甲醇，故实验时注意自身安全。 18.保证蛋白的量，以防无条带。
19.一抗、二抗的浓度一般要参照抗体说明书选择适当的比例，一抗二抗的选择与清洗直接影响实验结果及背景。
20. 封闭一般在室温下进行，值得注意的是，如果是生物素标记的二抗就不宜使用牛奶，因为牛奶中含有生物素，影响效果。
21. 严格控制一抗二抗反应时间，洗膜要注意尽可能的清洗干净，有利于降低背景
22. 一抗时，倒扣NC膜与一抗上，注意膜的正反方向，将与凝胶接触的面扣于一抗上（观察mark即可分辨正反面）
23.清洗时开始应换液频繁，4-5分钟换液一次，并置于摇床上，如此清洗5-8次后，再改为10分钟换液一次，清洗两次。
24.显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲及镊子不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
25.出现明显条带时，应立即终止显影。然后立即把胶片放入定影液中。 26.整个过程是在暗室中操作，所以应多加注意，避免出错。
七、常见问题：
SDS-PAGE
凝胶电泳常见的问题分析
[杨辛，江彦泽，郭芳]
[武晓燕，李金龙，侯雷，娄亮亮]
WB常见问题分析