2013年3月第20卷第3期 中国中医药信息杂志 ・39・
禁食对生川乌醇提物急性毒性的影响
刘强强, 徐策, 郭海东
1
1
1,2
, 杨润芳
1,2
, 夏祺悦
1,2
, 李宏霞
1
1.四川大学华西医院国家成都中药安全性评价中心,四川 成都 610041；2.四川大学华西公共卫生学院,四川 成都 610041 摘要：目的 观察给予生川乌醇提物前禁食与未禁食对大鼠急性毒性的影响。方法 将108只SD 大鼠分为禁食组(48只)与未禁食组(60只)。禁食组每组8只,未禁食组每组10只,雌雄各半。2组分别依次设6个剂量组：2.25、4.5、9、18、36、72 g 原药材/kg。禁食组于给药前禁食12 h。2组以20 mL/kg灌胃给药。观察14 d并于观察结束后采集血液进行血液学和血生化分析。结果 禁食组半数致死量(LD50)为12.17 g原药材/kg,在4.5 g原药材/kg及更高剂量下能观察到明显的中毒症状。未禁食组LD 50为75.27 g原药材/kg,在36 g原药材/kg及更高剂量下能观察到明显的中毒症状。2组中毒症状一致,主要表现为全身被毛湿润、步态蹒跚、呼吸急促、腹式呼吸、抽搐,部分大鼠出现流涎、角弓反张等症状,甚至死亡。症状出现时间集中在给药后10 min内,出现死亡的时间集中在给药后4 h内。根据观察到的症状初步认为川乌急性毒性的主要靶器官为神经系统。死亡动物解剖后,发现部分死亡动物肺部有水肿以及出血点,胸腔及肺组织中发现粉红色浆液和泡沫。根据解剖结果推测川乌急性毒性致动物死亡的主要原因可能是心脏衰竭与呼吸抑制。结论 给药前未禁食组LD 50是禁食组LD 50的6.18倍,未禁食组出现症状的剂量远远高于禁食组,禁食对生川乌醇提物毒性影响很大。
关键词：禁食；川乌；急性毒性；半数致死量；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.03.016
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2013)03-0039-04
Influence of Fasting in Acute Toxicity of Alcohol Extract of Radix Aconiti LIU Qiang-qiang1, XU Ce1,
GUO Hai-dong1,2, YANG Run-fang1,2, XIA Qi-yue1,2, LI Hong-xia1 (1.National Chengdu Center for Safety Evaluation of Drugs, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China；2.West China School of Public Health, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Abstract ：Objective To study the influence of fasting or non-fasting in acute toxicity of alcohol extract of Radix Aconiti. Methods Totally 108 SD rats were divided into fasting group (48 rats) and non-fasting group (60 rats), 6 doses (2.25, 4.5, 9, 18, 36, 72 g raw drug/kg) in each group. The fasting group was administrated after the rats were fasted 12 h. The toxic reaction and the death condition after administrations were observed for 14 days. Blood was collected for hematology and blood biochemistry analysis. Results It showed symptoms of poisoning in 4.5 g raw drug/kg and higher doses in fasting group, or in 36 g raw drug/kg and higher doses in non-fasting group. Main symptoms included wet body hair, staggering gait, rapid breathing, abdominal breathing, seizures. Some rats showed salivation, opisthotonus and death. Symptoms occurred within 10 min after administration for most rats, and the time of death was within 4 h after administration. The nervous system is the main target organ of Radix Aconiti acute toxicity. The causes of animal death may from heart failure and respiratory depression. The LD50 of fasting group was 12.17 g/kg, and the non-fasting group was 75.27 g/kg, there was 6.18-fold difference between the 2 groups. Conclusion The toxicity of alcohol extract of Radix Aconiti in fasting group is higher than that in non-fasting group. Fasting has significant effect on acute toxicity. Key words：fasting ；Radix Aconiti；acute toxicity；LD 50；rats 基金项目：国家重点基础研究发展计划(2009CB522801) 通讯作者：李宏霞,E-mail：[email protected] Carcinogenesis,2010,31：9-18.
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急性毒性试验作为动物毒性试验的基础,为进一步的重复给药试验提供剂量设计依据。急性毒性试验结果通常是在禁食情况下得出的,然而在重复给药等试验中动物都是处于未禁食
(收稿日期：2012-08-29,编辑：华强)
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状态。因此,如果禁食对受试物质的急性毒性影响较大,则传统急性毒性试验的结果将不能很好地为后续的毒性试验研究提供试验设计的依据。
川乌是毛茛科植物川乌Radix Aconiti 的干燥块根[1],化学成分为双酯型二萜类生物碱,包括乌头碱、次乌头碱、杰斯乌头碱、异翠雀碱等。此类生物碱毒性很大,是乌头中的主要毒性成分。川乌药用价值很高,文献研究表明,川乌有抗炎、麻醉镇痛、扩血管降压、强心、降血糖、抗肿瘤、治疗子宫脱垂等作用[3-8]。但同时川乌也是一种能对全身多个系统产生毒性作用的药物。本研究选择生川乌的醇提物作为受试物质,研究给药前禁食与未禁食对大鼠急性毒性、死亡率、血液学以及血生化的影响。 1 实验材料 1.1 动物
SPF级SD 大鼠108只,雌雄各半,体质量160～230 g,上海斯莱克公司提供,动物许可证号：SCXK(沪)2007-0005。饲养于国家成都中药安全性评价中心SPF 动物房,动物房使用许可证号：SYXK(川)2008-009。塑料大鼠笼具合笼饲养。 1.2 药物
生川乌醇提物,批号02E-2,四川省中医药科学院中药药学研究所提供。提取物均为棕褐色浸膏,临用前取原液配制备用。
1.3 主要仪器
灌胃针、解剖器械、全自动血液生化分析仪(瑞士Roche COBAS Integra 400 Plus)、全自动血液细胞分析仪(美国雅培CELL-DYN 3700SL)、全自动网织红细胞分析仪(日本希森美康R-500)、全自动血栓/止血分析仪(日本希森美康CA-530)、电子天平等。 2 实验方法
2.1 分组及剂量设计
将SD 大鼠分为禁食组(48只)与未禁食组(60只),雌雄各半。2组分别设6个生川乌醇提物剂量组,剂量依次为2.25、4.5、9、18、36、72 g原药材/kg。 2.2 给药
川乌临床上主要用于口服,所以实验选择灌胃给药。给药1次,给药后观察14 d。按20 mL/kg供试品对大鼠进行灌胃。 2.3 一般观察
给药后4 h 内多次观察动物外观体征、行为活动及其他中毒表现,以后每日观察1次,给药后第14日观察结束后解剖所有存活动物。戊巴比妥钠麻醉动物后腹主动脉采血安乐死,进行血液学和血生化指标检测,并进行系统尸解,全面观察动物的外观和内脏情况。 2.4 血液学指标检测
检测红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞容积(HCT)、平均红细胞容积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、网织红细胞计数(RET)、白细胞计数(WBC)及分类[中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、单
组别 72 g/kg组 36 g/kg组 18 g/kg组 9 g/kg组 4.5 g/kg组2.25 g/kg组
只数＜5 min888888
4 4 5 3 1 0
5～10 min ＞10～30 min ＞30 min
4 3 3 4 2 0
0 1 0 1 1 0
0 0 0 0 0 0
[2]
核细胞(MONO)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BASO)]、血小板计数(PLT)。 2.5 血生化检测
检测天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酸磷酸激酶(CK)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、白球比(A/G)、血糖(GLU)、总胆红素(TBIL)、肌酐(CREA)、总胆固醇(CHOL)、三酰甘油(TG),钠离子浓度(Na)、钾离子浓度(K)、氯离子浓度(Cl-)。 3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,对率的比较采用卡方检验,对血液学以及血生化学的数据使用t 检验,P ＜0.05表示差异有统计学意义。 4 结果
4.1 2组毒性症状及死亡情况比较
大鼠经口给药后,禁食组的4.5 g原药材/kg及以上剂量和未禁食组的36 g 原药材/kg及以上剂量,可以观察到明显的中毒症状。最先出现的症状是部分被毛湿润,出现的时间集中在给药后10 min 以内,紧接着大鼠会全身被毛湿润、流涎、呼吸急促、腹式呼吸、步态蹒跚、抽搐等,部分大鼠出现角弓反张后死亡。实验过程中,有2只动物在刚表现出被毛湿润的症状后立即猝死。禁食组与未禁食组中毒症状出现的时间都集中在给药后10 min内,个别大鼠症状出现在10～30 min,没有大鼠在给药30 min后才出现症状。见表1、表2。
动物的死亡时间集中在给药后4 h内,给药后0.5～2 h是动物死亡的高峰。给药后30 min 内部分毒性症状出现早的动物死亡,给药4 h 以后死亡的动物比较少。观察中还发现部分症状较轻的大鼠会在出现毒性症状后逐渐恢复。见表3、表4。
表1 生川乌醇提物禁食组不同时间毒理症状出现情况(只)
出现率(%)100.0100.0100.0100.0 50.00
+
+
表2 生川乌醇提物未禁食组不同时间毒理症状出现情况(只) 组别 72 g/kg组 36 g/kg组 18 g/kg组 9 g/kg组 4.5 g/kg组
只数＜5 min1010101010
3 1 0 0 0 0
5～10 min ＞10～30 min ＞30 min
4 2 0 0 0 0
1 1 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
出现率(%)80.040.0 0 0 0 0
2.25 g/kg组10
2013年3月第20卷第3期 中国中医药信息杂志 ・41・
表3 生川乌醇提物禁食组不同时间动物死亡情况(只) 组别 72 g/kg组 36 g/kg组 18 g/kg组 9 g/kg组 4.5 g/kg组 2.25 g/kg组
只数 ＜30 min 0.5～2 h ＞2～4 h ＞4 h8 8 8 8 8 8
2 2 1 1 0 0
3 3 4 3 0 0
1 2 2 2 1 0
1 0 1 0 0 0
死亡率(%) 87.5 87.5100.0 75.0 12.5 0
表6 雌性大鼠血液学指标禁食组与未禁食组比较(x ±s ) 项目 WBC(10/L) NEU(%) LYM(%) MONO(%) EOS(%) BASO(%) RBC(10/L) HGB(g/L)
组别 72 g/kg组 36 g/kg组 18 g/kg组 9 g/kg组 4.5 g/kg组
只数 ＜30 min 0.5～2 h ＞2～4 h ＞4 h10 10 10 10 10
0 0 0 0 0 0
2 1 0 0 0 0
1 1 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0
死亡率(%) 40.0 20.0 0 0 0 0
HCT(%) MCV(fL) MCH(pg) MCHC(g/L) RDW(%) PLT(10/L) MPV(fL) PCT(%) PDW(%)
9129
—
未禁食组(24只) 2.545± 1.061 0.283± 0.163 2.210± 0.976 0.027± 0.018 0.021± 0.010 0.004± 0.003 6.593± 0.405 131.292± 5.676 41.608± 1.790 63.196± 1.641 19.946± 0.561 315.583± 2.781 14.183± 0.935 1036.792±197.579 4.988± 0.240 0.515± 0.100 17.658± 0.587
禁食组(8只) 2.980± 0.711 0.221± 0.976 2.679± 0.679 0.040± 0.014 0.037± 0.030 0.004± 0.003 6.644± 0.408131.500± 4.567 40.800± 1.233 61.525± 2.624 19.838± 0.811322.250± 3.576 14.563± 0.6571 004.875±385.337 4.853± 0.245 0.490± 0.184 17.350± 0.466
***
表4 生川乌醇提物未禁食组不同时间动物死亡情况(只)
2.25 g/kg组 10
对生川乌醇提物所致动物死亡的性别差异进行分析,发现雌性动物与雄性动物死亡率比较差异无统计学意义,χ2＝3.424。禁食组生川乌醇提物的半数致死量(LD50)为12.17 g原g 原药材/kg,二者LD50相差6.18药材/kg,未禁食组LD50为75.27
倍。对未禁食和禁食组实验结果进行比较,发现2组动物死亡说明禁食后给药率差异有统计学意义(χ＝30.94,P ＜0.05)。
能增加生川乌醇提物对大鼠的毒性,导致其死亡率明显增高。 4.2 血液学检测结果
通过对SD 大鼠血液学的检测,发现禁食组与未禁食组大部分血液学指标差异无统计学意义。而出现差异的指标,雄性大鼠与雌性大鼠也不完全相同,雄鼠为RBC、HGB、HCT、MCV、MCHC,雌鼠为EOS、MCV、MCHC。这些出项差异的指标的绝对值均在正常值范围内,故这种差异无生物学意义。见表5、表6。
表5 雄性大鼠血液学指标禁食组与未禁食组比较(x ±s ) 项目 WBC(10/L) NEU(%) LYM(%) MONO(%) EOS(%) BASO(%) RBC(10/L) HGB(g/L) HCT(%) MCV(fL) MCH(pg) MCHC(g/L) RDW(%) PLT(10/L) MPV(fL) PCT(%) PDW(%)
9129
—
4.3 血生化检测结果
通过对SD 大鼠血生化指标的检测,发现禁食组与未禁食组部分血液学指标差异有统计学意义。但是雄性大鼠与雌性大鼠出现差异的指标不完全相同,雄鼠为A/G、CREA、GLO、K、Na +、TP、BUN,雌鼠为ALB、ALT、AST、CK、GLO、Na+、TBIL、TP、TG。见表7、表8。这些指标中ALT、AST、TBIL、GLO、TP、CREA、BUN是反映肝肾功能的指标,禁食组均比未禁食组高,提示禁食组比未禁食组可能更容易产生肝脏和肾脏损害；CK、TG是反映心脏状况的指标,禁食组也比未禁食组高,提示禁食组可能更易产生心脏损害。
表7 雄性大鼠血生化指标禁食组与未禁食组比较(x ±s ) 项目 A/G ALB(g/L) ALP(U/L) ALT(U/L) AST(U/L) CREA(µmol/L) Cl (mmol/L) CHOL(mmol/L) CK(U/L) GLO(g/L) GLU(mmol/L) K (mmol/L) Na (mmol/L) TBIL(µmol/L) TP(g/L) TG(mmol/L) BUN(mmol/L)
+++
—
2+
未禁食组(29只) 2.47± 0.20 39.68± 1.36 164.27± 37.68 53.56± 7.05 138.63± 30.71 22.09± 2.15 102.70± 1.30 1.17± 0.25 666.66±239.81 16.12± 1.11 6.60± 0.85 4.19± 0.23 141.67± 0.97 3.02± 0.92 55.81± 1.69 0.37± 0.13 5.31± 0.53
禁食组(11只) 2.33± 0.17 40.40± 1.36 183.70± 52.43 55.80± 6.13 153.24± 24.35 23.69± 1.75 102.78± 1.95 1.11± 0.13 734.64±182.47 17.36± 1.04 6.82± 1.15 3.97± 0.20 143.03± 1.97 3.55± 0.97 57.75± 1.61 0.38± 0.13 4.53± 0.45
*******
未禁食组(29只) 2.938± 0.672 0.432± 0.154 2.434± 0.628 0.053± 0.063 0.023± 0.016 0.006± 0.004 6.700± 0.318 135.655± 5.115 41.945± 1.644 62.659± 1.817 20.266± 0.611 323.448± 3.180 15.310± 0.918 1 014.138±75.119 5.048± 0.182 0.513± 0.046 17.507± 0.470
禁食组(11只) 3.482± 1.219 0.391± 0.127 3.018± 1.122 0.040± 0.027 0.027± 0.014 0.007± 0.005 7.070± 0.273 141.818± 3.945 43.364± 1.476 61.345± 1.601 20.082± 0.546 327.182± 2.750 15.091± 0.664 978.818±113.986 4.901± 0.247 0.479± 0.052 17.309± 0.251
*****
注：与未禁食组比较,*P ＜0.05(下同)
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表8 雌性大鼠血生化指标禁食组与未禁食组比较(x ±s ) 项目 A/G ALB(g/L) ALP(U/L) ALT(U/L) AST(U/L) CREA(µmol/L) Cl (mmol/L) CHOL(mmol/L) CK(U/L) GLO(g/L) GLU(mmol/L) K (mmol/L) Na (mmol/L) TBIL(µmol/L) TP(g/L) TG(mmol/L) BUN(mmol/L)
+++
—
基本是神经系统功能改变而引起的,如汗腺分泌、抽搐、步态蹒跚、角弓反张等。在临床发现服用川乌导致中毒的案例中患者通常会出现神经系统的症状,如头晕、视物不清、昏迷、皮肤蚁行感、刺痛以及麻木等[8]。目前认为川乌的神经毒性是由于川乌的主要毒性物质乌头碱作用于神经系统,过度的突触前去极化导致神经动作电位和终板电位阻滞,阻断了神经-肌肉接头的传导功能。赵氏等
[12]
[13]
未禁食组(24只) 2.61± 0.23 41.49± 1.67 75.31± 23.14 35.67± 3.25 111.95± 16.92 27.55± 3.65 103.77± 1.33 1.15± 0.26 495.67±150.88 15.99± 1.15 6.60± 0.47 3.99± 0.28 140.75± 0.88 3.23± 0.84 57.46± 1.97 0.19± 0.05 6.37± 1.02
禁食组(8只) 2.51± 0.23 43.25± 1.54 87.98± 23.62 43.44± 4.99 151.35± 33.21 31.49± 5.44 104.09± 1.24 1.29± 0.16 807.00±272.00 17.30± 1.33 6.16± 0.72 3.80± 0.46 141.99± 1.20 4.48± 1.12 60.54± 1.63 0.24± 0.07 6.11± 1.13
*********
研究川乌的神经毒性时发现,给
药组动物脊髓胸段灰质内部分的神经元肿大,腰段灰质内多数神经元胞浆淡染呈现细颗粒状,或见胞浆呈现雪花状、风轮状、柳叶状的空泡改变,神经细胞可见坏死崩解、卫星现象、噬神经细胞现象,Nissl小体崩解成微细颗粒。
川乌致动物死亡的原因可能是由于心脏衰竭与呼吸抑制。死亡动物解剖后,发现部分死亡动物肺部有水肿以及出血点,胸腔及肺组织中发现粉红色浆液和泡沫。实验过程中有2只动物在刚表现出被毛湿润的症状后即猝死,这很可能是恶性的心律失常、室性心动过速或室颤,然后导致了心源性猝死。文献报道乌头碱重度中毒者可引起位于延髓的呼吸中枢麻痹,导致呼吸抑制等,与实验观察结果一致。 参考文献：
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[14]
4.4 解剖结果
在对死亡动物进行解剖时发现：部分死亡动物肺部有水肿及出血点,胸腔及肺组织中发现粉红色浆液和泡沫。实验结束时对动物进行解剖,未发现肉眼可见的病理改变。 5 讨论
本研究结果显示,禁食组生川乌醇提物的LD 50为12.17 g原药材/kg。查阅文献后发现,川乌的毒性还受品种、采集时间、炮制、煎煮时间等影响,所以川乌的LD 50波动范围较大,特别是各种炮制品的LD 50甚至相差上百倍[9]。生川乌的LD 50主要集中在2.5～14.56 g/kg之间,本实验所得结果也在此范围内。 本实验测得禁食组生川乌醇提物的LD 50为12.17 g原药材/kg,未禁食组LD 50为75.27 g原药材/kg。禁食和未禁食情况下的LD 50相差6.18倍。造成如此大差距可能的原因：①未禁食情况下,药物进入胃肠道,由于胃肠道未能排空,药物和食物残渣混合,导致药物浓度被稀释；②未禁食情况下,川乌与胃肠道中的食物以及在消化酶或菌群的作用后,可产生新的成分而影响其吸收或改变其毒性；③禁食情况下,胃肠道的内容物减少、胃排空时间和肠蠕动减缓均有助于增加川乌的吸收[10-11]。
根据血液学指标检测结果,虽然有少数指标出现差异,但是总体来说未发现生川乌醇提物对SD 大鼠血液学指标有明显影响。血生化分析结果显示,ALT、AST、TBIL、GLO、TP、CREA、BUN 等反映肝、肾功能的指标和CK、TG等反映心脏状况的指标,禁食组都比未禁食组高,提示禁食组对大鼠的毒性作用更大,而且更容易产生肝、肾和心脏方面的损害。这和本实验所观察到的毒性症状、解剖结果以及文献报道的川乌毒性的资料相符合。
根据实验的毒性症状以及解剖的结果,可以推断大鼠生川乌醇提物急性中毒的靶器官为神经系统。能清楚观察到的症状
(收稿日期：2012-07-06,编辑：华强)
2013年3月第20卷第3期 中国中医药信息杂志 ・39・
禁食对生川乌醇提物急性毒性的影响
刘强强, 徐策, 郭海东
1
1
1,2
, 杨润芳
1,2
, 夏祺悦
1,2
, 李宏霞
1
1.四川大学华西医院国家成都中药安全性评价中心,四川 成都 610041；2.四川大学华西公共卫生学院,四川 成都 610041 摘要：目的 观察给予生川乌醇提物前禁食与未禁食对大鼠急性毒性的影响。方法 将108只SD 大鼠分为禁食组(48只)与未禁食组(60只)。禁食组每组8只,未禁食组每组10只,雌雄各半。2组分别依次设6个剂量组：2.25、4.5、9、18、36、72 g 原药材/kg。禁食组于给药前禁食12 h。2组以20 mL/kg灌胃给药。观察14 d并于观察结束后采集血液进行血液学和血生化分析。结果 禁食组半数致死量(LD50)为12.17 g原药材/kg,在4.5 g原药材/kg及更高剂量下能观察到明显的中毒症状。未禁食组LD 50为75.27 g原药材/kg,在36 g原药材/kg及更高剂量下能观察到明显的中毒症状。2组中毒症状一致,主要表现为全身被毛湿润、步态蹒跚、呼吸急促、腹式呼吸、抽搐,部分大鼠出现流涎、角弓反张等症状,甚至死亡。症状出现时间集中在给药后10 min内,出现死亡的时间集中在给药后4 h内。根据观察到的症状初步认为川乌急性毒性的主要靶器官为神经系统。死亡动物解剖后,发现部分死亡动物肺部有水肿以及出血点,胸腔及肺组织中发现粉红色浆液和泡沫。根据解剖结果推测川乌急性毒性致动物死亡的主要原因可能是心脏衰竭与呼吸抑制。结论 给药前未禁食组LD 50是禁食组LD 50的6.18倍,未禁食组出现症状的剂量远远高于禁食组,禁食对生川乌醇提物毒性影响很大。
关键词：禁食；川乌；急性毒性；半数致死量；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.03.016
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2013)03-0039-04
Influence of Fasting in Acute Toxicity of Alcohol Extract of Radix Aconiti LIU Qiang-qiang1, XU Ce1,
GUO Hai-dong1,2, YANG Run-fang1,2, XIA Qi-yue1,2, LI Hong-xia1 (1.National Chengdu Center for Safety Evaluation of Drugs, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China；2.West China School of Public Health, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Abstract ：Objective To study the influence of fasting or non-fasting in acute toxicity of alcohol extract of Radix Aconiti. Methods Totally 108 SD rats were divided into fasting group (48 rats) and non-fasting group (60 rats), 6 doses (2.25, 4.5, 9, 18, 36, 72 g raw drug/kg) in each group. The fasting group was administrated after the rats were fasted 12 h. The toxic reaction and the death condition after administrations were observed for 14 days. Blood was collected for hematology and blood biochemistry analysis. Results It showed symptoms of poisoning in 4.5 g raw drug/kg and higher doses in fasting group, or in 36 g raw drug/kg and higher doses in non-fasting group. Main symptoms included wet body hair, staggering gait, rapid breathing, abdominal breathing, seizures. Some rats showed salivation, opisthotonus and death. Symptoms occurred within 10 min after administration for most rats, and the time of death was within 4 h after administration. The nervous system is the main target organ of Radix Aconiti acute toxicity. The causes of animal death may from heart failure and respiratory depression. The LD50 of fasting group was 12.17 g/kg, and the non-fasting group was 75.27 g/kg, there was 6.18-fold difference between the 2 groups. Conclusion The toxicity of alcohol extract of Radix Aconiti in fasting group is higher than that in non-fasting group. Fasting has significant effect on acute toxicity. Key words：fasting ；Radix Aconiti；acute toxicity；LD 50；rats 基金项目：国家重点基础研究发展计划(2009CB522801) 通讯作者：李宏霞,E-mail：[email protected] Carcinogenesis,2010,31：9-18.
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急性毒性试验作为动物毒性试验的基础,为进一步的重复给药试验提供剂量设计依据。急性毒性试验结果通常是在禁食情况下得出的,然而在重复给药等试验中动物都是处于未禁食
(收稿日期：2012-08-29,编辑：华强)
・40・ Chinese Journal of Information on TCM Mar.2013 Vol.20 No.3
状态。因此,如果禁食对受试物质的急性毒性影响较大,则传统急性毒性试验的结果将不能很好地为后续的毒性试验研究提供试验设计的依据。
川乌是毛茛科植物川乌Radix Aconiti 的干燥块根[1],化学成分为双酯型二萜类生物碱,包括乌头碱、次乌头碱、杰斯乌头碱、异翠雀碱等。此类生物碱毒性很大,是乌头中的主要毒性成分。川乌药用价值很高,文献研究表明,川乌有抗炎、麻醉镇痛、扩血管降压、强心、降血糖、抗肿瘤、治疗子宫脱垂等作用[3-8]。但同时川乌也是一种能对全身多个系统产生毒性作用的药物。本研究选择生川乌的醇提物作为受试物质,研究给药前禁食与未禁食对大鼠急性毒性、死亡率、血液学以及血生化的影响。 1 实验材料 1.1 动物
SPF级SD 大鼠108只,雌雄各半,体质量160～230 g,上海斯莱克公司提供,动物许可证号：SCXK(沪)2007-0005。饲养于国家成都中药安全性评价中心SPF 动物房,动物房使用许可证号：SYXK(川)2008-009。塑料大鼠笼具合笼饲养。 1.2 药物
生川乌醇提物,批号02E-2,四川省中医药科学院中药药学研究所提供。提取物均为棕褐色浸膏,临用前取原液配制备用。
1.3 主要仪器
灌胃针、解剖器械、全自动血液生化分析仪(瑞士Roche COBAS Integra 400 Plus)、全自动血液细胞分析仪(美国雅培CELL-DYN 3700SL)、全自动网织红细胞分析仪(日本希森美康R-500)、全自动血栓/止血分析仪(日本希森美康CA-530)、电子天平等。 2 实验方法
2.1 分组及剂量设计
将SD 大鼠分为禁食组(48只)与未禁食组(60只),雌雄各半。2组分别设6个生川乌醇提物剂量组,剂量依次为2.25、4.5、9、18、36、72 g原药材/kg。 2.2 给药
川乌临床上主要用于口服,所以实验选择灌胃给药。给药1次,给药后观察14 d。按20 mL/kg供试品对大鼠进行灌胃。 2.3 一般观察
给药后4 h 内多次观察动物外观体征、行为活动及其他中毒表现,以后每日观察1次,给药后第14日观察结束后解剖所有存活动物。戊巴比妥钠麻醉动物后腹主动脉采血安乐死,进行血液学和血生化指标检测,并进行系统尸解,全面观察动物的外观和内脏情况。 2.4 血液学指标检测
检测红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞容积(HCT)、平均红细胞容积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、网织红细胞计数(RET)、白细胞计数(WBC)及分类[中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、单
组别 72 g/kg组 36 g/kg组 18 g/kg组 9 g/kg组 4.5 g/kg组2.25 g/kg组
只数＜5 min888888
4 4 5 3 1 0
5～10 min ＞10～30 min ＞30 min
4 3 3 4 2 0
0 1 0 1 1 0
0 0 0 0 0 0
[2]
核细胞(MONO)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BASO)]、血小板计数(PLT)。 2.5 血生化检测
检测天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肌酸磷酸激酶(CK)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、白球比(A/G)、血糖(GLU)、总胆红素(TBIL)、肌酐(CREA)、总胆固醇(CHOL)、三酰甘油(TG),钠离子浓度(Na)、钾离子浓度(K)、氯离子浓度(Cl-)。 3 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,对率的比较采用卡方检验,对血液学以及血生化学的数据使用t 检验,P ＜0.05表示差异有统计学意义。 4 结果
4.1 2组毒性症状及死亡情况比较
大鼠经口给药后,禁食组的4.5 g原药材/kg及以上剂量和未禁食组的36 g 原药材/kg及以上剂量,可以观察到明显的中毒症状。最先出现的症状是部分被毛湿润,出现的时间集中在给药后10 min 以内,紧接着大鼠会全身被毛湿润、流涎、呼吸急促、腹式呼吸、步态蹒跚、抽搐等,部分大鼠出现角弓反张后死亡。实验过程中,有2只动物在刚表现出被毛湿润的症状后立即猝死。禁食组与未禁食组中毒症状出现的时间都集中在给药后10 min内,个别大鼠症状出现在10～30 min,没有大鼠在给药30 min后才出现症状。见表1、表2。
动物的死亡时间集中在给药后4 h内,给药后0.5～2 h是动物死亡的高峰。给药后30 min 内部分毒性症状出现早的动物死亡,给药4 h 以后死亡的动物比较少。观察中还发现部分症状较轻的大鼠会在出现毒性症状后逐渐恢复。见表3、表4。
表1 生川乌醇提物禁食组不同时间毒理症状出现情况(只)
出现率(%)100.0100.0100.0100.0 50.00
+
+
表2 生川乌醇提物未禁食组不同时间毒理症状出现情况(只) 组别 72 g/kg组 36 g/kg组 18 g/kg组 9 g/kg组 4.5 g/kg组
只数＜5 min1010101010
3 1 0 0 0 0
5～10 min ＞10～30 min ＞30 min
4 2 0 0 0 0
1 1 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
出现率(%)80.040.0 0 0 0 0
2.25 g/kg组10
2013年3月第20卷第3期 中国中医药信息杂志 ・41・
表3 生川乌醇提物禁食组不同时间动物死亡情况(只) 组别 72 g/kg组 36 g/kg组 18 g/kg组 9 g/kg组 4.5 g/kg组 2.25 g/kg组
只数 ＜30 min 0.5～2 h ＞2～4 h ＞4 h8 8 8 8 8 8
2 2 1 1 0 0
3 3 4 3 0 0
1 2 2 2 1 0
1 0 1 0 0 0
死亡率(%) 87.5 87.5100.0 75.0 12.5 0
表6 雌性大鼠血液学指标禁食组与未禁食组比较(x ±s ) 项目 WBC(10/L) NEU(%) LYM(%) MONO(%) EOS(%) BASO(%) RBC(10/L) HGB(g/L)
组别 72 g/kg组 36 g/kg组 18 g/kg组 9 g/kg组 4.5 g/kg组
只数 ＜30 min 0.5～2 h ＞2～4 h ＞4 h10 10 10 10 10
0 0 0 0 0 0
2 1 0 0 0 0
1 1 0 0 0 0
1 0 0 0 0 0
死亡率(%) 40.0 20.0 0 0 0 0
HCT(%) MCV(fL) MCH(pg) MCHC(g/L) RDW(%) PLT(10/L) MPV(fL) PCT(%) PDW(%)
9129
—
未禁食组(24只) 2.545± 1.061 0.283± 0.163 2.210± 0.976 0.027± 0.018 0.021± 0.010 0.004± 0.003 6.593± 0.405 131.292± 5.676 41.608± 1.790 63.196± 1.641 19.946± 0.561 315.583± 2.781 14.183± 0.935 1036.792±197.579 4.988± 0.240 0.515± 0.100 17.658± 0.587
禁食组(8只) 2.980± 0.711 0.221± 0.976 2.679± 0.679 0.040± 0.014 0.037± 0.030 0.004± 0.003 6.644± 0.408131.500± 4.567 40.800± 1.233 61.525± 2.624 19.838± 0.811322.250± 3.576 14.563± 0.6571 004.875±385.337 4.853± 0.245 0.490± 0.184 17.350± 0.466
***
表4 生川乌醇提物未禁食组不同时间动物死亡情况(只)
2.25 g/kg组 10
对生川乌醇提物所致动物死亡的性别差异进行分析,发现雌性动物与雄性动物死亡率比较差异无统计学意义,χ2＝3.424。禁食组生川乌醇提物的半数致死量(LD50)为12.17 g原g 原药材/kg,二者LD50相差6.18药材/kg,未禁食组LD50为75.27
倍。对未禁食和禁食组实验结果进行比较,发现2组动物死亡说明禁食后给药率差异有统计学意义(χ＝30.94,P ＜0.05)。
能增加生川乌醇提物对大鼠的毒性,导致其死亡率明显增高。 4.2 血液学检测结果
通过对SD 大鼠血液学的检测,发现禁食组与未禁食组大部分血液学指标差异无统计学意义。而出现差异的指标,雄性大鼠与雌性大鼠也不完全相同,雄鼠为RBC、HGB、HCT、MCV、MCHC,雌鼠为EOS、MCV、MCHC。这些出项差异的指标的绝对值均在正常值范围内,故这种差异无生物学意义。见表5、表6。
表5 雄性大鼠血液学指标禁食组与未禁食组比较(x ±s ) 项目 WBC(10/L) NEU(%) LYM(%) MONO(%) EOS(%) BASO(%) RBC(10/L) HGB(g/L) HCT(%) MCV(fL) MCH(pg) MCHC(g/L) RDW(%) PLT(10/L) MPV(fL) PCT(%) PDW(%)
9129
—
4.3 血生化检测结果
通过对SD 大鼠血生化指标的检测,发现禁食组与未禁食组部分血液学指标差异有统计学意义。但是雄性大鼠与雌性大鼠出现差异的指标不完全相同,雄鼠为A/G、CREA、GLO、K、Na +、TP、BUN,雌鼠为ALB、ALT、AST、CK、GLO、Na+、TBIL、TP、TG。见表7、表8。这些指标中ALT、AST、TBIL、GLO、TP、CREA、BUN是反映肝肾功能的指标,禁食组均比未禁食组高,提示禁食组比未禁食组可能更容易产生肝脏和肾脏损害；CK、TG是反映心脏状况的指标,禁食组也比未禁食组高,提示禁食组可能更易产生心脏损害。
表7 雄性大鼠血生化指标禁食组与未禁食组比较(x ±s ) 项目 A/G ALB(g/L) ALP(U/L) ALT(U/L) AST(U/L) CREA(µmol/L) Cl (mmol/L) CHOL(mmol/L) CK(U/L) GLO(g/L) GLU(mmol/L) K (mmol/L) Na (mmol/L) TBIL(µmol/L) TP(g/L) TG(mmol/L) BUN(mmol/L)
+++
—
2+
未禁食组(29只) 2.47± 0.20 39.68± 1.36 164.27± 37.68 53.56± 7.05 138.63± 30.71 22.09± 2.15 102.70± 1.30 1.17± 0.25 666.66±239.81 16.12± 1.11 6.60± 0.85 4.19± 0.23 141.67± 0.97 3.02± 0.92 55.81± 1.69 0.37± 0.13 5.31± 0.53
禁食组(11只) 2.33± 0.17 40.40± 1.36 183.70± 52.43 55.80± 6.13 153.24± 24.35 23.69± 1.75 102.78± 1.95 1.11± 0.13 734.64±182.47 17.36± 1.04 6.82± 1.15 3.97± 0.20 143.03± 1.97 3.55± 0.97 57.75± 1.61 0.38± 0.13 4.53± 0.45
*******
未禁食组(29只) 2.938± 0.672 0.432± 0.154 2.434± 0.628 0.053± 0.063 0.023± 0.016 0.006± 0.004 6.700± 0.318 135.655± 5.115 41.945± 1.644 62.659± 1.817 20.266± 0.611 323.448± 3.180 15.310± 0.918 1 014.138±75.119 5.048± 0.182 0.513± 0.046 17.507± 0.470
禁食组(11只) 3.482± 1.219 0.391± 0.127 3.018± 1.122 0.040± 0.027 0.027± 0.014 0.007± 0.005 7.070± 0.273 141.818± 3.945 43.364± 1.476 61.345± 1.601 20.082± 0.546 327.182± 2.750 15.091± 0.664 978.818±113.986 4.901± 0.247 0.479± 0.052 17.309± 0.251
*****
注：与未禁食组比较,*P ＜0.05(下同)
・42・ Chinese Journal of Information on TCM Mar.2013 Vol.20 No.3
表8 雌性大鼠血生化指标禁食组与未禁食组比较(x ±s ) 项目 A/G ALB(g/L) ALP(U/L) ALT(U/L) AST(U/L) CREA(µmol/L) Cl (mmol/L) CHOL(mmol/L) CK(U/L) GLO(g/L) GLU(mmol/L) K (mmol/L) Na (mmol/L) TBIL(µmol/L) TP(g/L) TG(mmol/L) BUN(mmol/L)
+++
—
基本是神经系统功能改变而引起的,如汗腺分泌、抽搐、步态蹒跚、角弓反张等。在临床发现服用川乌导致中毒的案例中患者通常会出现神经系统的症状,如头晕、视物不清、昏迷、皮肤蚁行感、刺痛以及麻木等[8]。目前认为川乌的神经毒性是由于川乌的主要毒性物质乌头碱作用于神经系统,过度的突触前去极化导致神经动作电位和终板电位阻滞,阻断了神经-肌肉接头的传导功能。赵氏等
[12]
[13]
未禁食组(24只) 2.61± 0.23 41.49± 1.67 75.31± 23.14 35.67± 3.25 111.95± 16.92 27.55± 3.65 103.77± 1.33 1.15± 0.26 495.67±150.88 15.99± 1.15 6.60± 0.47 3.99± 0.28 140.75± 0.88 3.23± 0.84 57.46± 1.97 0.19± 0.05 6.37± 1.02
禁食组(8只) 2.51± 0.23 43.25± 1.54 87.98± 23.62 43.44± 4.99 151.35± 33.21 31.49± 5.44 104.09± 1.24 1.29± 0.16 807.00±272.00 17.30± 1.33 6.16± 0.72 3.80± 0.46 141.99± 1.20 4.48± 1.12 60.54± 1.63 0.24± 0.07 6.11± 1.13
*********
研究川乌的神经毒性时发现,给
药组动物脊髓胸段灰质内部分的神经元肿大,腰段灰质内多数神经元胞浆淡染呈现细颗粒状,或见胞浆呈现雪花状、风轮状、柳叶状的空泡改变,神经细胞可见坏死崩解、卫星现象、噬神经细胞现象,Nissl小体崩解成微细颗粒。
川乌致动物死亡的原因可能是由于心脏衰竭与呼吸抑制。死亡动物解剖后,发现部分死亡动物肺部有水肿以及出血点,胸腔及肺组织中发现粉红色浆液和泡沫。实验过程中有2只动物在刚表现出被毛湿润的症状后即猝死,这很可能是恶性的心律失常、室性心动过速或室颤,然后导致了心源性猝死。文献报道乌头碱重度中毒者可引起位于延髓的呼吸中枢麻痹,导致呼吸抑制等,与实验观察结果一致。 参考文献：
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[14]
4.4 解剖结果
在对死亡动物进行解剖时发现：部分死亡动物肺部有水肿及出血点,胸腔及肺组织中发现粉红色浆液和泡沫。实验结束时对动物进行解剖,未发现肉眼可见的病理改变。 5 讨论
本研究结果显示,禁食组生川乌醇提物的LD 50为12.17 g原药材/kg。查阅文献后发现,川乌的毒性还受品种、采集时间、炮制、煎煮时间等影响,所以川乌的LD 50波动范围较大,特别是各种炮制品的LD 50甚至相差上百倍[9]。生川乌的LD 50主要集中在2.5～14.56 g/kg之间,本实验所得结果也在此范围内。 本实验测得禁食组生川乌醇提物的LD 50为12.17 g原药材/kg,未禁食组LD 50为75.27 g原药材/kg。禁食和未禁食情况下的LD 50相差6.18倍。造成如此大差距可能的原因：①未禁食情况下,药物进入胃肠道,由于胃肠道未能排空,药物和食物残渣混合,导致药物浓度被稀释；②未禁食情况下,川乌与胃肠道中的食物以及在消化酶或菌群的作用后,可产生新的成分而影响其吸收或改变其毒性；③禁食情况下,胃肠道的内容物减少、胃排空时间和肠蠕动减缓均有助于增加川乌的吸收[10-11]。
根据血液学指标检测结果,虽然有少数指标出现差异,但是总体来说未发现生川乌醇提物对SD 大鼠血液学指标有明显影响。血生化分析结果显示,ALT、AST、TBIL、GLO、TP、CREA、BUN 等反映肝、肾功能的指标和CK、TG等反映心脏状况的指标,禁食组都比未禁食组高,提示禁食组对大鼠的毒性作用更大,而且更容易产生肝、肾和心脏方面的损害。这和本实验所观察到的毒性症状、解剖结果以及文献报道的川乌毒性的资料相符合。
根据实验的毒性症状以及解剖的结果,可以推断大鼠生川乌醇提物急性中毒的靶器官为神经系统。能清楚观察到的症状
(收稿日期：2012-07-06,编辑：华强)