中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(2):16～20
二甲基亚砜作用下重组CHO细胞胞内乙型
3
肝炎表面抗原的定位
马浙永 易小萍 张元兴
(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 上海 200237)
33
摘要 在培养环境中添加二甲基亚砜(DMSO)能分别提高重组CHO(HBsAg)的产量和比生产速率70%和3.2倍以上,7.2倍。为了分析胞内HBsAg积累的区域,CHO细
胞胞内出现了很多的扩张区域,上,,经DMSO处理后的,同时发现在细胞核膜上也有分布,这可。以上工作有助于揭示在DMSO作用下重组CHO细胞胞内HBsAg大量积累的机制。
关键词 细胞培养 CHO细胞 HBsAg 电镜
中图分类号 Q819
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,
HBV)引起的全球性传染病,也是我国当前流行最广
DMSO有效刺激乙肝表面抗原表达的同时,胞内HBsAg
的大量积累制约了产量的进一步提高。因此,在细胞生物学的水平上,探求DMSO存在下,HBsAg胞内累积的区域,为进一步揭示胞内HBsAg积累的机制,并最终对解除分泌限制和进一步提高HBsAg的生产率具有非常重要的意义。
泛、危害最严重的一种传染病。自从1985年血源性乙肝疫苗(PDV)上市后,对乙肝的控制取得了良好的效果,在预防人类HBV感染方面发挥了很大作用。但是由于受血源、质控等限制,血源疫苗难以满足普通接种的需要,而由于重组DNA技术的发展,基因工程乙肝疫苗在产量、质量、免疫原性和安全性等方面都有较大的优越性,已基本上取代血源疫苗。目前研究和生产中应用的重组HBsAg表达系统主要有酵母表达和重组
CHO细胞表达。与酵母表达系统相比,重组CHO细胞
1 材料与方法
1.1 实验材料
基因工程CHO细胞株,为二氢叶酸还原酶缺陷型的CHO细胞株,整合有乙肝病毒的S基因,编码226个氨基酸残基的S主蛋白。细胞株由武汉生物制品研究所提供。培养基为DMEM(GIBCOBRL),添加10%
(v/v)的小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公
系统表达的HBsAg更接近天然形式,并且具有更好的免疫原性,但是由于CHO细胞表达的HBsAg产量低,生产成本很高,不利于推广应用
[1]
。因此提高HBsAg
在重组CHO细胞中的产量具有非常重要的意义。本实验室前期工作证实了DMSO能显著地提高重组CHO细胞表达HBsAg的产量和比生产速率
收稿日期:2007211224 修回日期:2007212221
3国家“863”计划资助项目(2004AA223792)33通讯作者,电子信箱:[email protected]
[2,3]
μmol/LMTX(ACROS)。司)和1
1.2 DMSO对CHO细胞生产HBsAg和胞内HBsAg
。然而,在
积累的影响
种子细胞长满单层后,用0.025%(w/v)胰蛋白酶消化片刻,倾去胰蛋白酶,加入10ml培养液并用移液管轻轻吹打成单细胞悬浮液,血球计数板计数后,以2×10
5
2008,28(2)
马浙永等:二甲基亚砜作用下重组CHO细胞胞内乙型肝炎表面抗原的定位
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cells/ml接种密度加入10ml培养基。细胞培养在37℃,5%CO2及一定湿度的培养箱中。待细胞生长24h后,以含1.5%DMSO的新鲜培养基换液,培养48h
射电镜下观察。
2 结 果
2.1 DMSO对重组CHO细胞生长、HBsAg生产和胞
后,细胞密度计数和收集上清并保存留待分析。
1.3 细胞胞内HBsAg提取液的制备
在100ml的细胞培养瓶中以2×10cells/ml接种,培养24h后,加入含1.5%(v/v)DMSO的新鲜培养基,对照组未加DMSO,培养48h后,经胰蛋白酶消化,吹打成单细胞悬液,收集细胞并重新悬浮在1ml的
4℃预冷的磷酸缓冲盐提取液中[2.5mmol/LKCl,1.5mmol/LNa2HPO4,
KH2PO4,
4mmol/L
MgCl2,
8mmol/L
100mmol/LNaCl,
2mmol/Ldithiothreitol
5
内HBsAg积累的影响
本研究证实了DMSO能分别提高重组HBsAg产量和比生产速率70%和3.2倍以上,但同时也造成了胞内HBsAg的大量积累,其积累量是未添加DMSO细胞胞内的7.2倍(表1)。在DMSO作用下,胞内HBsAg大量积累,这意味着在细胞的后加工修饰或分泌途径,或者DMSO作。
表1 DMSO对重组CHO细胞生长、HBsAg生产
和胞内积累的影响
Table1 rCHOcellgrowth,extracellularHBsAgproductionandintracellularHBsAgaccumulationinresponsetoDMSO
[4]
(DTT),1%phenylmethanesulfonylfluoride(PMSF),pH7.5]。冰浴中超声裂解细胞1min。细裂于4℃,12000g离心15min,-℃待分析。
1.4 HBsAg浓度
的测定
细胞计数参阅《组织培养技术》的方法
。培养上
清及胞内提取液中HBsAg的浓度采用HBsAg酶联免疫(ELISA)体外诊断试剂盒(上海华美生物工程公司)测定。标准(5ng/ml)购自国家临检中心。
1.5 电镜样品的制备
DMSO(%)1.50
细胞密度(106cells/ml)0.98±0.041.87±0.06
HBsAg产量
(mg/l)3.4±0.32.0±0.1
HBsAg胞内
比生产速率HBsAg含量
-6-(μ)(6μg/cell)
0.073±0.0088.6±0.20.023±0.0011.2±0.1
2.2 胞内HBsAg积累的区域分析
5
在100ml的细胞培养瓶中以2×10cells/ml接种,培养24h后加入含1.5%DMSO的新鲜培养基,对照组未加DMSO,培养48h后,经胰蛋白酶消化,吹打成单细胞悬液,收集1×10个细胞,用2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜;倒掉固定液,用PBS漂洗样品,再用
1%锇酸溶液固定样品1～2h。梯度乙醇、丙酮脱水对
6
为了深入研究在DMSO作用下胞内HBsAg积累的区域,通过透射电镜分析经DMSO处理的细胞样品后发现,胞内内质网扩张,形成了很多扩张区域,这些扩张区域分布整个胞浆,在细胞核周围也有大量分布,有的扩张区域已经侵蚀到细胞核内部,而对照组未发现明显的扩张区域(图1)。为了确定这些扩张区域跟胞内HBsAg积累之间的联系,进一步利用免疫电镜分析扩张区域与胞内HBsAg积累部位之间的关系。图2是添加1.5%DMSO经换液培养48h后,用胶体金标记胞内HBsAg积累的部位。结果显示胞内出现了很大的扩张区域,这跟电镜观察细胞超微结构的现象相符,并且胶体金标记的HBsAg绝大部分积累在这些扩张区域中,同时在细胞核膜上也有少量胶体金标记,这可能是这些在DMSO作用下形成的扩张区域侵蚀了细胞核膜。通过以上工作,发现胞内积累的HBsAg主要定位在胞内的扩张区域内,而这些扩张区域的出现跟DMSO刺激HBsAg大量表达密切相关。
样品进行脱水处理,包埋剂包埋,常规超薄切片,柠檬酸铅溶液、醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液染色,在透射电子显微镜中观察。在免疫电镜样品处理过程中,细胞样品最初的固定方法是先用0.5%戊二醛+4%多聚甲醛4℃固定2h,再用4%多聚甲醛4℃固定4h。细胞经PBS漂洗后,用常规方法的脱水、置换、浸透和包埋,制作超薄切片。切片用0.01mol/LPBS/1%BSA孵育
30min后,加入以1∶100稀释的一抗(小鼠抗人anti2HBsAg)室温反应过夜,用PBS(0.01mol/L)漂洗后,
加入20nm胶体金标记的二抗(1∶50)室温反应过夜。经PBS和清水漂洗后,用醋酸铀和硝酸铅染色后在透
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中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.2
2008
图1(DMSO处理(B)
细胞内部结构电镜图
Fi1 TheultrastructureofCHOcellsinthepresenceof1.5%DMSO(A)andintheabsenceofDMSO(B)
Thetypicaldilatedareaswereidentifiedby
+
图2 在DMSO作用下胞内HBsAg胶体金标记
Fig.2 ImmunogoldlabelingofHBsAginCHOcellsinthepresenceofDMSO
Thedilatedareascontaininglabelswereidentifiedbyarrow
3 讨 论
在众多提高CHO细胞重组蛋白表达的策略中,添加外源蛋白表达的刺激物是一种简单、有效及快速提高外源蛋白表达量的方法。丁酸钠是促进重组哺乳动
物细胞生产外源蛋白最常用的添加物。丁酸钠在多种细胞系中对多种蛋白质的生产都有明显的刺激作用。尽管对细胞生长会有抑制,但在CHO细胞中,添加3
mmol/L的丁酸钠提高了VIII因子的表达量2倍以上,
比生产速率提高了3倍以上
[5]
。在tPA(组织纤溶酶
2008,28(2)
马浙永等:二甲基亚砜作用下重组CHO细胞胞内乙型肝炎表面抗原的定位
YangRL,
Jin
YF,
ZhangYZ.
19
Pharmaceutical
原激活物)的生产中,用滚瓶培养重组CHO细胞,在无血清或低血清条件下添加丁酸钠提高了9种不同的
tPA类似物的产量2～9倍不等,并延长了滚瓶培养的
Biotechnology,2002,9(1):53～56
[2]LiJH,SunXM,ZhangYX.Understandingtheenhanced
effectofdimethylsulfoxideonhepatitisBsurfaceantigenexpressioninthecultureofChinesehamsterovarycellsonthebasisofproteomeanalysis.EnzymeMicrobTechnol,2006,38:372～380
周期
[6]
。二甲基亚砜(DMSO)是一种两性化合物,分子
包括极性的母体和两个非极性基团,使得它既可以溶于水也可以溶于有机溶剂,在细胞生物学中多作为细胞冻存的保护剂被广泛使用,而作为外源蛋白表达刺激物的报道比较少,是一种新颖的蛋白表达刺激物
Liu等
[8]
[7]
[3]Li,JH,Sun,XM,Zhang,YX.ImprovementofhepatitisB
surfaceantigenexpressionbydimethylsulfoxideinthecultureofrecombinantChinesehamsterovarycells.2006,41:317～322
ProcessBiochem,
。
发现,当DMSO浓度为1%时,融合蛋白和β2
半乳糖苷酶的产量分别提高了1.6倍和1.4倍,但细胞的生长却受到了抑制。
本实验室前期工作和本研究都发现DMSO能显著地刺激重组CHO表达HBsAg,其产量和比生产速率提高70%和3.2倍以上,但同时也造成了胞内s大量积累。胞外HBsAg显。O促进
HBsAg。通过电镜技术分
[4]鄂征.组织培养技术.北京:人民卫生出版社,1993
ETissueculture.Beijing:People’sMedical
[]T.IncreasedexpressionoffactorⅧ
inChinesehamsterovarycells.
In:SpierRE,
GriffithsJB,MeignierB.ProductionofBiologicalsbyAnimalCellsinCulture.Butterworth2Heinemann:Oxford,1999,104
～106
[6]PalermoDP,DeGraafME,MarottiKR,etal.Productionof
analyticalquantitiesofrecombinantproteinsinChinesehamsterovarycellsusingsodiumbutyratetoelevategeneexpression.JBiotechnol,1991,19:35～48
析后发现,在DMSO作用下,胞内形成了很多扩张区域,而对照组未发现这些扩张区域。Patzer等
[9]
用透射
电镜观察转染HBsAg基因的CHO细胞发现,细胞内部微观结构发生了很大变化,形成了很多很大的扩张区域,未转染HBsAg基因的CHO细胞没有发现这种现象。Mark等
[10]
[7]SantosNC,Figueira2CoelhoJ,Martins2SilvaJ,etal.
Multidisciplinary
utilization
of
dimethyl
sulfoxide:Biochem
也发现,转染HBsAg基因的大豆和烟草
pharmacological,cellular,andmolecularaspects.Pharm,2003,65:1035～1041
细胞存在很大很多的扩张区域,未转染基因的植物细胞没有发现这种扩张区域。通过免疫电镜观察发现,胞内HBsAg主要分布在这些扩张区域中,同时发现在细胞核膜上也有分布,这可能与扩张区域侵蚀细胞核有关。我们推测,这种扩张区域的出现,跟HBsAg产量的提高,特别是胞内HBsAg量的急剧增加相关。添加
1.5%DMSO经培养48h后,HBsAgmRNA提高了1.5
[8]LiuCH,ChuIM,HwangSM.Enhanceexpressionofvarious
exogenousgenesinrecombinantChinesehamsterovarycellsinpresenceofdimethylsulfoxide.BiotechnolLett,2001,23:1641～1645
[9]PatzerEJ,NakamuraGR,YaffeA.Intracellulartransportand
secretionofhepatitisBsurfaceantigeninmammaliancells.JVirol,1984,51(2):346～353
倍
[11]
,这引起胞内HBsAg含量的急剧增加,扩张区域
[10]MarkLS,HughSM,MichaelLS.HepatitisBsurfaceantigen
(HBsAg)expressioninplantcellculture:Kineticsofantigenaccumulationinbatchcultureanditsintracellularform.BiotechnolBioeng,2002,80:812～822
的大量出现是重组CHO细胞应对胞内HBsAg积累产生的应急反应。本研究分析了胞内HBsAg积累的区域,有助于进一步揭示胞内HBsAg大量积累的机制,为最终解决胞内HBsAg的积累并进一步提高重组HBsAg产量作铺垫。
[11]Wang,WY,Yi,XP,Zhang,YX.Genetranscription
acceleration:maincauseofhepatitisB
surfaceantigen
productionimprovementbydimethylsulfoxideinthecultureof
参考文献
[1]杨瑞丽,金勇丰,张耀洲.乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因
工程疫苗的研究进展.药物生物技术,2002,9(1):53～56
Chinesehamsterovarycells.Biotechnol.Bioeng,2007,97:526～535
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中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.22008
LocalizationofHepatitisBSurfaceAntigenWithinRecombinantCHO
CellsinResponsetoDimethylSulfoxide
MAZhe2yong YIXiao2ping ZHANGYuan2xing
(StatekeylaboratoryofBioreactorEngineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai 200237,China)
Abstract TheintracellularhepatitisBsurfaceantigen(HBsAg)contentpercellwasincreasedby7.22foldintheculturewith1.5%dimethylsulfoxide(DMSO)comparedwiththatinthecontrolwithoutDMSO,whiletheextracellularHBsAgproductionandspecificproductivitywereonlyimprovedby70%3.22fold,respectively.ElectronmicroscopehasbeenemployedtoreveallargedilatedCHOcellsinthepresenceDMSO.Thedilatedstructureshaveadistributiondilatedareaswereengulfedinthenucleus.Theselarge,dilatedinthecontrol.
Immunogoldlabeling
wasusedtodiscoverthewasthesedilatedareas,andsomeHBsAg2specificlabelswereowingtotheencroachmentofthedilatedareasuponnucleus.TheresultcouldhelptothemechanismofintracellularHBsAgaccumulationinthepresenceofDMSO.
Keywords Cellculture CHOcell HBsAg Electronmicroscope
中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(2):16～20
二甲基亚砜作用下重组CHO细胞胞内乙型
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肝炎表面抗原的定位
马浙永 易小萍 张元兴
(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 上海 200237)
33
摘要 在培养环境中添加二甲基亚砜(DMSO)能分别提高重组CHO(HBsAg)的产量和比生产速率70%和3.2倍以上,7.2倍。为了分析胞内HBsAg积累的区域,CHO细
胞胞内出现了很多的扩张区域,上,,经DMSO处理后的,同时发现在细胞核膜上也有分布,这可。以上工作有助于揭示在DMSO作用下重组CHO细胞胞内HBsAg大量积累的机制。
关键词 细胞培养 CHO细胞 HBsAg 电镜
中图分类号 Q819
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,
HBV)引起的全球性传染病,也是我国当前流行最广
DMSO有效刺激乙肝表面抗原表达的同时,胞内HBsAg
的大量积累制约了产量的进一步提高。因此,在细胞生物学的水平上,探求DMSO存在下,HBsAg胞内累积的区域,为进一步揭示胞内HBsAg积累的机制,并最终对解除分泌限制和进一步提高HBsAg的生产率具有非常重要的意义。
泛、危害最严重的一种传染病。自从1985年血源性乙肝疫苗(PDV)上市后,对乙肝的控制取得了良好的效果,在预防人类HBV感染方面发挥了很大作用。但是由于受血源、质控等限制,血源疫苗难以满足普通接种的需要,而由于重组DNA技术的发展,基因工程乙肝疫苗在产量、质量、免疫原性和安全性等方面都有较大的优越性,已基本上取代血源疫苗。目前研究和生产中应用的重组HBsAg表达系统主要有酵母表达和重组
CHO细胞表达。与酵母表达系统相比,重组CHO细胞
1 材料与方法
1.1 实验材料
基因工程CHO细胞株,为二氢叶酸还原酶缺陷型的CHO细胞株,整合有乙肝病毒的S基因,编码226个氨基酸残基的S主蛋白。细胞株由武汉生物制品研究所提供。培养基为DMEM(GIBCOBRL),添加10%
(v/v)的小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公
系统表达的HBsAg更接近天然形式,并且具有更好的免疫原性,但是由于CHO细胞表达的HBsAg产量低,生产成本很高,不利于推广应用
[1]
。因此提高HBsAg
在重组CHO细胞中的产量具有非常重要的意义。本实验室前期工作证实了DMSO能显著地提高重组CHO细胞表达HBsAg的产量和比生产速率
收稿日期:2007211224 修回日期:2007212221
3国家“863”计划资助项目(2004AA223792)33通讯作者,电子信箱:[email protected]
[2,3]
μmol/LMTX(ACROS)。司)和1
1.2 DMSO对CHO细胞生产HBsAg和胞内HBsAg
。然而,在
积累的影响
种子细胞长满单层后,用0.025%(w/v)胰蛋白酶消化片刻,倾去胰蛋白酶,加入10ml培养液并用移液管轻轻吹打成单细胞悬浮液,血球计数板计数后,以2×10
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2008,28(2)
马浙永等:二甲基亚砜作用下重组CHO细胞胞内乙型肝炎表面抗原的定位
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cells/ml接种密度加入10ml培养基。细胞培养在37℃,5%CO2及一定湿度的培养箱中。待细胞生长24h后,以含1.5%DMSO的新鲜培养基换液,培养48h
射电镜下观察。
2 结 果
2.1 DMSO对重组CHO细胞生长、HBsAg生产和胞
后,细胞密度计数和收集上清并保存留待分析。
1.3 细胞胞内HBsAg提取液的制备
在100ml的细胞培养瓶中以2×10cells/ml接种,培养24h后,加入含1.5%(v/v)DMSO的新鲜培养基,对照组未加DMSO,培养48h后,经胰蛋白酶消化,吹打成单细胞悬液,收集细胞并重新悬浮在1ml的
4℃预冷的磷酸缓冲盐提取液中[2.5mmol/LKCl,1.5mmol/LNa2HPO4,
KH2PO4,
4mmol/L
MgCl2,
8mmol/L
100mmol/LNaCl,
2mmol/Ldithiothreitol
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内HBsAg积累的影响
本研究证实了DMSO能分别提高重组HBsAg产量和比生产速率70%和3.2倍以上,但同时也造成了胞内HBsAg的大量积累,其积累量是未添加DMSO细胞胞内的7.2倍(表1)。在DMSO作用下,胞内HBsAg大量积累,这意味着在细胞的后加工修饰或分泌途径,或者DMSO作。
表1 DMSO对重组CHO细胞生长、HBsAg生产
和胞内积累的影响
Table1 rCHOcellgrowth,extracellularHBsAgproductionandintracellularHBsAgaccumulationinresponsetoDMSO
[4]
(DTT),1%phenylmethanesulfonylfluoride(PMSF),pH7.5]。冰浴中超声裂解细胞1min。细裂于4℃,12000g离心15min,-℃待分析。
1.4 HBsAg浓度
的测定
细胞计数参阅《组织培养技术》的方法
。培养上
清及胞内提取液中HBsAg的浓度采用HBsAg酶联免疫(ELISA)体外诊断试剂盒(上海华美生物工程公司)测定。标准(5ng/ml)购自国家临检中心。
1.5 电镜样品的制备
DMSO(%)1.50
细胞密度(106cells/ml)0.98±0.041.87±0.06
HBsAg产量
(mg/l)3.4±0.32.0±0.1
HBsAg胞内
比生产速率HBsAg含量
-6-(μ)(6μg/cell)
0.073±0.0088.6±0.20.023±0.0011.2±0.1
2.2 胞内HBsAg积累的区域分析
5
在100ml的细胞培养瓶中以2×10cells/ml接种,培养24h后加入含1.5%DMSO的新鲜培养基,对照组未加DMSO,培养48h后,经胰蛋白酶消化,吹打成单细胞悬液,收集1×10个细胞,用2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜;倒掉固定液,用PBS漂洗样品,再用
1%锇酸溶液固定样品1～2h。梯度乙醇、丙酮脱水对
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为了深入研究在DMSO作用下胞内HBsAg积累的区域,通过透射电镜分析经DMSO处理的细胞样品后发现,胞内内质网扩张,形成了很多扩张区域,这些扩张区域分布整个胞浆,在细胞核周围也有大量分布,有的扩张区域已经侵蚀到细胞核内部,而对照组未发现明显的扩张区域(图1)。为了确定这些扩张区域跟胞内HBsAg积累之间的联系,进一步利用免疫电镜分析扩张区域与胞内HBsAg积累部位之间的关系。图2是添加1.5%DMSO经换液培养48h后,用胶体金标记胞内HBsAg积累的部位。结果显示胞内出现了很大的扩张区域,这跟电镜观察细胞超微结构的现象相符,并且胶体金标记的HBsAg绝大部分积累在这些扩张区域中,同时在细胞核膜上也有少量胶体金标记,这可能是这些在DMSO作用下形成的扩张区域侵蚀了细胞核膜。通过以上工作,发现胞内积累的HBsAg主要定位在胞内的扩张区域内,而这些扩张区域的出现跟DMSO刺激HBsAg大量表达密切相关。
样品进行脱水处理,包埋剂包埋,常规超薄切片,柠檬酸铅溶液、醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液染色,在透射电子显微镜中观察。在免疫电镜样品处理过程中,细胞样品最初的固定方法是先用0.5%戊二醛+4%多聚甲醛4℃固定2h,再用4%多聚甲醛4℃固定4h。细胞经PBS漂洗后,用常规方法的脱水、置换、浸透和包埋,制作超薄切片。切片用0.01mol/LPBS/1%BSA孵育
30min后,加入以1∶100稀释的一抗(小鼠抗人anti2HBsAg)室温反应过夜,用PBS(0.01mol/L)漂洗后,
加入20nm胶体金标记的二抗(1∶50)室温反应过夜。经PBS和清水漂洗后,用醋酸铀和硝酸铅染色后在透
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中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.2
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图1(DMSO处理(B)
细胞内部结构电镜图
Fi1 TheultrastructureofCHOcellsinthepresenceof1.5%DMSO(A)andintheabsenceofDMSO(B)
Thetypicaldilatedareaswereidentifiedby
+
图2 在DMSO作用下胞内HBsAg胶体金标记
Fig.2 ImmunogoldlabelingofHBsAginCHOcellsinthepresenceofDMSO
Thedilatedareascontaininglabelswereidentifiedbyarrow
3 讨 论
在众多提高CHO细胞重组蛋白表达的策略中,添加外源蛋白表达的刺激物是一种简单、有效及快速提高外源蛋白表达量的方法。丁酸钠是促进重组哺乳动
物细胞生产外源蛋白最常用的添加物。丁酸钠在多种细胞系中对多种蛋白质的生产都有明显的刺激作用。尽管对细胞生长会有抑制,但在CHO细胞中,添加3
mmol/L的丁酸钠提高了VIII因子的表达量2倍以上,
比生产速率提高了3倍以上
[5]
。在tPA(组织纤溶酶
2008,28(2)
马浙永等:二甲基亚砜作用下重组CHO细胞胞内乙型肝炎表面抗原的定位
YangRL,
Jin
YF,
ZhangYZ.
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Pharmaceutical
原激活物)的生产中,用滚瓶培养重组CHO细胞,在无血清或低血清条件下添加丁酸钠提高了9种不同的
tPA类似物的产量2～9倍不等,并延长了滚瓶培养的
Biotechnology,2002,9(1):53～56
[2]LiJH,SunXM,ZhangYX.Understandingtheenhanced
effectofdimethylsulfoxideonhepatitisBsurfaceantigenexpressioninthecultureofChinesehamsterovarycellsonthebasisofproteomeanalysis.EnzymeMicrobTechnol,2006,38:372～380
周期
[6]
。二甲基亚砜(DMSO)是一种两性化合物,分子
包括极性的母体和两个非极性基团,使得它既可以溶于水也可以溶于有机溶剂,在细胞生物学中多作为细胞冻存的保护剂被广泛使用,而作为外源蛋白表达刺激物的报道比较少,是一种新颖的蛋白表达刺激物
Liu等
[8]
[7]
[3]Li,JH,Sun,XM,Zhang,YX.ImprovementofhepatitisB
surfaceantigenexpressionbydimethylsulfoxideinthecultureofrecombinantChinesehamsterovarycells.2006,41:317～322
ProcessBiochem,
。
发现,当DMSO浓度为1%时,融合蛋白和β2
半乳糖苷酶的产量分别提高了1.6倍和1.4倍,但细胞的生长却受到了抑制。
本实验室前期工作和本研究都发现DMSO能显著地刺激重组CHO表达HBsAg,其产量和比生产速率提高70%和3.2倍以上,但同时也造成了胞内s大量积累。胞外HBsAg显。O促进
HBsAg。通过电镜技术分
[4]鄂征.组织培养技术.北京:人民卫生出版社,1993
ETissueculture.Beijing:People’sMedical
[]T.IncreasedexpressionoffactorⅧ
inChinesehamsterovarycells.
In:SpierRE,
GriffithsJB,MeignierB.ProductionofBiologicalsbyAnimalCellsinCulture.Butterworth2Heinemann:Oxford,1999,104
～106
[6]PalermoDP,DeGraafME,MarottiKR,etal.Productionof
analyticalquantitiesofrecombinantproteinsinChinesehamsterovarycellsusingsodiumbutyratetoelevategeneexpression.JBiotechnol,1991,19:35～48
析后发现,在DMSO作用下,胞内形成了很多扩张区域,而对照组未发现这些扩张区域。Patzer等
[9]
用透射
电镜观察转染HBsAg基因的CHO细胞发现,细胞内部微观结构发生了很大变化,形成了很多很大的扩张区域,未转染HBsAg基因的CHO细胞没有发现这种现象。Mark等
[10]
[7]SantosNC,Figueira2CoelhoJ,Martins2SilvaJ,etal.
Multidisciplinary
utilization
of
dimethyl
sulfoxide:Biochem
也发现,转染HBsAg基因的大豆和烟草
pharmacological,cellular,andmolecularaspects.Pharm,2003,65:1035～1041
细胞存在很大很多的扩张区域,未转染基因的植物细胞没有发现这种扩张区域。通过免疫电镜观察发现,胞内HBsAg主要分布在这些扩张区域中,同时发现在细胞核膜上也有分布,这可能与扩张区域侵蚀细胞核有关。我们推测,这种扩张区域的出现,跟HBsAg产量的提高,特别是胞内HBsAg量的急剧增加相关。添加
1.5%DMSO经培养48h后,HBsAgmRNA提高了1.5
[8]LiuCH,ChuIM,HwangSM.Enhanceexpressionofvarious
exogenousgenesinrecombinantChinesehamsterovarycellsinpresenceofdimethylsulfoxide.BiotechnolLett,2001,23:1641～1645
[9]PatzerEJ,NakamuraGR,YaffeA.Intracellulartransportand
secretionofhepatitisBsurfaceantigeninmammaliancells.JVirol,1984,51(2):346～353
倍
[11]
,这引起胞内HBsAg含量的急剧增加,扩张区域
[10]MarkLS,HughSM,MichaelLS.HepatitisBsurfaceantigen
(HBsAg)expressioninplantcellculture:Kineticsofantigenaccumulationinbatchcultureanditsintracellularform.BiotechnolBioeng,2002,80:812～822
的大量出现是重组CHO细胞应对胞内HBsAg积累产生的应急反应。本研究分析了胞内HBsAg积累的区域,有助于进一步揭示胞内HBsAg大量积累的机制,为最终解决胞内HBsAg的积累并进一步提高重组HBsAg产量作铺垫。
[11]Wang,WY,Yi,XP,Zhang,YX.Genetranscription
acceleration:maincauseofhepatitisB
surfaceantigen
productionimprovementbydimethylsulfoxideinthecultureof
参考文献
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20
中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.28No.22008
LocalizationofHepatitisBSurfaceAntigenWithinRecombinantCHO
CellsinResponsetoDimethylSulfoxide
MAZhe2yong YIXiao2ping ZHANGYuan2xing
(StatekeylaboratoryofBioreactorEngineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai 200237,China)
Abstract TheintracellularhepatitisBsurfaceantigen(HBsAg)contentpercellwasincreasedby7.22foldintheculturewith1.5%dimethylsulfoxide(DMSO)comparedwiththatinthecontrolwithoutDMSO,whiletheextracellularHBsAgproductionandspecificproductivitywereonlyimprovedby70%3.22fold,respectively.ElectronmicroscopehasbeenemployedtoreveallargedilatedCHOcellsinthepresenceDMSO.Thedilatedstructureshaveadistributiondilatedareaswereengulfedinthenucleus.Theselarge,dilatedinthecontrol.
Immunogoldlabeling
wasusedtodiscoverthewasthesedilatedareas,andsomeHBsAg2specificlabelswereowingtotheencroachmentofthedilatedareasuponnucleus.TheresultcouldhelptothemechanismofintracellularHBsAgaccumulationinthepresenceofDMSO.
Keywords Cellculture CHOcell HBsAg Electronmicroscope