基因工程乙肝疫苗的制备
【摘要】基因工程乙肝疫苗是通过构建含有乙肝表面抗原的重组质粒转染酵母细胞，制备乙肝病毒表面的有效蛋白。本文主要介绍基因工程疫苗--重组酵母乙肝疫苗制备的基本原理和工艺流程，以及乙肝疫苗的纯度分析方法。
【关键词】 乙肝疫苗 重组质粒 工艺流程
1.基因工程乙肝疫苗产生背景
疫苗是人类目前可以彻底消灭某一疾病的唯一武器，接种疫苗被认为是最有效、最经济的疾病预防手段。《发展中国家消灭乙型肝炎免疫接种计划实施指南》中指出：“世界上四分之三的人口生活在中或高乙肝流行区，因此，唯一的策略就是有效地减少乙肝的流行，最终消灭乙肝······”
世界卫生组织肝炎专家及计划免疫全球咨询组认为：控制全球乙型肝炎及减少死亡的策略是开展大规模的婴儿及学龄前儿童的乙肝疫苗接种。
我国卫生部制定的目标是从92年开始在全国逐步推行乙型肝炎（HB）计划免疫。92年全国共生产血源疫苗1500万人份，尚不能满足新生儿接种需要，如考虑其他人群，缺口更大。为了实现HB计划目标，进一步为控制全球HB做出贡献，我们必须大规模提高HB疫苗的产量和进一步提高质量。
血源HB疫苗原料为无症状带毒者的HBsAg阳性血浆。血源价格昂贵，供应量有限，采集困难。因此血源疫苗的产量和成本受到原料的限制。利用基因工程重组微生物细胞表达HBsAg生产HB疫苗的技术，原料易得，价廉，适宜进行大规模生产，有可能大幅度降低成本。
2.使用重组酵母的原因和重组酵母构建
2.1使用重组酵母的原因
使用重组酵母进行乙肝疫苗的大规模生产，有如下几点原因：
（1）.酵母对培养基的要求低，价廉易得。
（2）.酵母细胞生长快，故生产率高。
（3）.动物细胞生长慢，容易染菌，对操作要求严。
（4）.酵母系统容易放大，动物细胞系统放大难。
2.2重组酵母构建
HBV只有3200bp，为双链的DNA,是一个相当小的病毒。其基因组共有四个ORF，编码以下一些蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白（L、M、S）。故重组酵母可用以下方法：
（1）.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化学合成法直接合成目的基因或者通过鸟枪法克隆目的基因。用识别相同黏性末端的限制性内切酶将外源DNA和质
粒分子切开。（切）
（2）.用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上，构成DNA重组分子。（接）
（3）.借组细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。（转）
（4）.短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。（增）
（5）.筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的基因工程菌。（检）
3.酵母表达的HBsAg之特性
重组酵母表达的HBsAg在没有化学处理的条件下自发地构成平均直径为22nm的球形颗粒。这些颗粒含有未糖基化的HBsAg多肽和主要由酵母特有的磷脂构成的脂基。其氨基酸的构成、羟基和氨基酸末端序列分析、质谱仪分析的肽谱等表明，重组酵母忠实地表达和生产了HBsAg。
酵母生产的HBsAg在细胞内以颗粒形式存在，其中的亚单位通过非共价键不紧密地结合在一起。在细胞外它转变成第二种形式，即单个多肽通过二硫键结合成二聚体，最后二聚体之间形成二硫键，得到二硫键交联的颗粒。它在表观上、化学性质和免疫性等方面都与血源HBsAg类似。
HBsAg比大部分生物分子要大，但比细胞要小，很适宜用膜分离方法纯化。
HBsAg表现出很强的疏水性，可用硫酸铵或聚乙二醇进行分步沉淀，或用疏水层析纯化。
HBsAg含有大量的二硫键，是其对热稳定的主要原因。在制备血源疫苗时，可运用长时间保温法以灭活HBV。但在制备重组HBsAg时没有必要。可选用更加温和的条件。
HBsAg对蛋白酶的抵抗力很强，可在pH为2的时候耐胰蛋白酶的处理。
HBsAg因其脂含量高，密度比一般蛋白低。利用其密度特性，可进行梯度离心分离。
4.疫苗的工作原理
任何疾病的疫苗都遵循以下免疫原理：
（1）.将疫苗注射到人体内，疫苗通常含有已经死亡或者弱化的病毒。而乙肝疫苗就是一类没有感染能力的病毒蛋白，能引起机体的特异性反应。
（2）.免疫系统识别出体内的外来物质（病毒和细菌），这些外来物质也被称之为抗原。
（3）.一旦发现抗原，免疫系统就分泌出被称为抗体的蛋白质。这些蛋白质在血液中流动，将抗原杀死以消灭身体感染的病毒（或者与病毒蛋白质特异性结合，使之失去生物活性）。抗体是由淋巴细胞制造的。这些细胞也被称为B细胞，它的主要功能是产生能够特异性与抗原结合的抗体。
（4）.人体会储存这些抗体，淋巴细胞也会有记忆这种特殊抗原的功能。所以再次染病时，它们会及时消灭此种疾病的病毒，然而抗体的针对性很强，所以曾经接种过乙肝疫苗的人，面对其他疾病时仍旧会感染（值得注意的是：当人体感染真正的病毒时，抗体会不停繁殖，直到病毒最终被消灭。而疫苗会提供数量恰到好处的抗原，以帮助人体完成识别病毒和免疫反应的过程，从而使人体能够对这种病毒免疫）。
5.疫苗制备工艺
5.1.菌种制备和发酵
用成功构造的基因工程菌进行扩大培养，经过逐级放大至发酵罐。发酵过程应该具有下列特点：原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机和无机氮源；能容易进行
大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产；生物反应过程是以生命体的自动调节方式进行的，多个反应像一个反应一样，在单一设备中进行；生产过程中，通常常温进行，操作温和，不考虑防爆问题；能够高度选择性的进行复杂化合物在特定部分的反应，如氧化、还原、官能团导入；生产过程中考虑防止杂菌的污染。
发酵过程中，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生长和维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡。可添加诱导剂如乳糖到发酵液中去以诱导可调节启动子的表达。
有人对重组酵母表达的HBsAg的影响进行过研究，发现在碳源中降低葡萄糖浓度，补充甘油和蔗糖能较明显地改善比活值和HBsAg的相对浓度。将发酵前期、中期和后期温度分别控制在27℃、33℃、25℃；发酵从pH4.5开始，逐步上升到pH6；以及维持溶氧浓度在最适水平（70%饱和度），都可以提高重组质粒的稳定性和HBsAg在发酵液中的积累。当然，需要根据不同菌种发酵的最适条件、培养基异同、当地条件等各种因素适当对以上数据进行微调，以保证发酵的顺利高效进行。
5.2.分离纯化和纯度测定工艺
虽然我们已经有从人血中分离纯化HBsAg的丰富经验，但由于重组酵母表达的抗原是在细胞内，存在的量相当小，仅占酵母蛋白、核酸和脂的5%不到，酵母细胞和培养基的成分与血浆有很大不同，为了从重组酵母中得到高纯度的抗原，有必要研究、探索新的纯化工艺。
对于血源性乙肝疫苗分离纯化的重点是除去活性污染物或使其失活，对于基因工程乙肝疫苗而言是去除细胞和培养基成分。
下图表示文献报道的国外工业化生产重组酵母乙肝疫苗的工艺路线，可作为技术开发的参考。
工艺1：
发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，然后细胞通过高压匀浆机破碎，释放出抗原。酵母的细胞壁较厚，比大肠杆菌难破碎，
可在高压匀浆机内施加几千个大气压力，通过针形阀突然降压到零，使细胞破碎。在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂以防抗原被分解。细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。粗细胞裂解物用0.2um中空纤维柱进行微滤。抗原和大部分低分子量宿主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被膜拦截。滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子量宿主细胞内含物通过滤膜除去。
残留的表面活性剂通过吸附在一种聚苯乙烯小珠上除去。再用硅胶吸附抗原，用热硼酸缓冲液洗脱。
纯化最后一步是用丁基琼脂糖进行疏水层析。纯化后的抗原用硫氰酸盐处理以完成二硫键的交联。纯化后的抗原再与氢氧化铝共沉淀，在共沉淀时，抗原吸附在氢氧化铝上。
除了上述一种工艺外，某些文献中还提到如下两种：
工艺2：
工艺
3：
三种工艺大致相同，不同之处在于：
工艺2在细胞破碎之后经过二步沉淀和离心除去大部分杂质和所有细胞碎片，然后通过超滤浓缩。用阴离子交换层析去除DNA是该工艺的一个关键步骤。
工艺3用吐温80处理破碎细胞，细胞碎片通过离心除去，上清超滤浓缩，用体积排阻层析和离子交换纯化以除去核酸，并进一步做氯化銫梯度等密度离心，然后脱盐。
因HBsAg的体积大，适宜采用体积排阻层析纯化。但如果用于大规模生产的话，层析住体积会很大，要求在纯化工艺的最后阶段，对产品进行浓缩，以减小其体积。
用免疫层析也可以分离酵母源HBsAg。柱中的抗体是从羊血中纯化来的。用人血HBsAg免疫羊，将羊的IgG通过一根含有血源HBsAg的亲和层析柱纯化抗HBsAg抗体。这种方法，即用一种抗原制备抗体，再用此抗体纯化另一种不同来源的抗原，可保证最后的亲和层析柱不会含有酵母杂质的抗体。
5.3.疫苗纯度的测定
乙肝疫苗是通过肌肉注射的方式进入人体系统，为了降低疫苗内杂质含量对人体产生的不良影响，必须进行疫苗的纯度检测。
乙肝疫苗表面抗原的纯度检定是疫苗质量控制的关键手段之一。目前分析测定重组乙型肝炎疫苗纯度的HPLC常用方法是应用TSK-G5000PW分子筛。中国药品生物制品检定所疫苗二室曾报道应用该系统对Merck酿酒酵母重组乙肝疫苗和CHO细胞重组乙肝疫苗进行纯度分析，可获得良好的分离效果。对重组汉逊酵母乙肝疫苗，现有的HPLC检测系统应用0.1mol/L DTT与1:50吐温80等量混合处理后能有效地检测不同类型重组乙肝疫苗表面抗原的纯度。
5.4疫苗的保存
疫苗的稳定性较差，一般在2~8℃下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。为了使疫苗的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。这样，疫苗的有效期往往可延长1倍或以上，在室温下其效价的损失亦较慢。
冻干要点是：（1）冷冻，即将疫苗冷冻至共熔点以下。（2）真空升华，即在真空状态下降水分直接由固态升华为气态。（3）升温缓慢，即升温的过程尽量缓慢，不使疫苗在任何时
间下有融解的情况发生。（4）冻干好的疫苗应在真空或充氮气后密封保存，使其残余水分保持在3%以下。这样的疫苗能保持良好的稳定性。
6.结语
国内已规模化生产预防用基因乙肝疫苗—重组乙型肝炎疫苗，免疫性强、安全性好、母婴传播阻断率高。自主研制的国家一类新药治疗性乙肝DNA疫苗已进入临床研究，这是国内首次批准用于人体的DNA疫苗试验；第一个具有完全自主知识产权的治疗用合成肽乙肝疫苗也已经正式进入临床试验阶段。全国肝炎治疗用药市场规模约200亿元，乙肝疫苗市场容量可维持在4000万人份左右，基因工程乙肝疫苗具有广阔的前景。
基因工程乙肝疫苗的制备
【摘要】基因工程乙肝疫苗是通过构建含有乙肝表面抗原的重组质粒转染酵母细胞，制备乙肝病毒表面的有效蛋白。本文主要介绍基因工程疫苗--重组酵母乙肝疫苗制备的基本原理和工艺流程，以及乙肝疫苗的纯度分析方法。
【关键词】 乙肝疫苗 重组质粒 工艺流程
1.基因工程乙肝疫苗产生背景
疫苗是人类目前可以彻底消灭某一疾病的唯一武器，接种疫苗被认为是最有效、最经济的疾病预防手段。《发展中国家消灭乙型肝炎免疫接种计划实施指南》中指出：“世界上四分之三的人口生活在中或高乙肝流行区，因此，唯一的策略就是有效地减少乙肝的流行，最终消灭乙肝······”
世界卫生组织肝炎专家及计划免疫全球咨询组认为：控制全球乙型肝炎及减少死亡的策略是开展大规模的婴儿及学龄前儿童的乙肝疫苗接种。
我国卫生部制定的目标是从92年开始在全国逐步推行乙型肝炎（HB）计划免疫。92年全国共生产血源疫苗1500万人份，尚不能满足新生儿接种需要，如考虑其他人群，缺口更大。为了实现HB计划目标，进一步为控制全球HB做出贡献，我们必须大规模提高HB疫苗的产量和进一步提高质量。
血源HB疫苗原料为无症状带毒者的HBsAg阳性血浆。血源价格昂贵，供应量有限，采集困难。因此血源疫苗的产量和成本受到原料的限制。利用基因工程重组微生物细胞表达HBsAg生产HB疫苗的技术，原料易得，价廉，适宜进行大规模生产，有可能大幅度降低成本。
2.使用重组酵母的原因和重组酵母构建
2.1使用重组酵母的原因
使用重组酵母进行乙肝疫苗的大规模生产，有如下几点原因：
（1）.酵母对培养基的要求低，价廉易得。
（2）.酵母细胞生长快，故生产率高。
（3）.动物细胞生长慢，容易染菌，对操作要求严。
（4）.酵母系统容易放大，动物细胞系统放大难。
2.2重组酵母构建
HBV只有3200bp，为双链的DNA,是一个相当小的病毒。其基因组共有四个ORF，编码以下一些蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白（L、M、S）。故重组酵母可用以下方法：
（1）.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化学合成法直接合成目的基因或者通过鸟枪法克隆目的基因。用识别相同黏性末端的限制性内切酶将外源DNA和质
粒分子切开。（切）
（2）.用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到质粒分子上，构成DNA重组分子。（接）
（3）.借组细胞转化手段将DNA重组分子导入酵母细胞内。（转）
（4）.短时间培养转化酵母细胞，以扩增DNA重组分子。（增）
（5）.筛选和鉴定经转化处理的酵母细胞，获得外源基因高效表达的基因工程菌。（检）
3.酵母表达的HBsAg之特性
重组酵母表达的HBsAg在没有化学处理的条件下自发地构成平均直径为22nm的球形颗粒。这些颗粒含有未糖基化的HBsAg多肽和主要由酵母特有的磷脂构成的脂基。其氨基酸的构成、羟基和氨基酸末端序列分析、质谱仪分析的肽谱等表明，重组酵母忠实地表达和生产了HBsAg。
酵母生产的HBsAg在细胞内以颗粒形式存在，其中的亚单位通过非共价键不紧密地结合在一起。在细胞外它转变成第二种形式，即单个多肽通过二硫键结合成二聚体，最后二聚体之间形成二硫键，得到二硫键交联的颗粒。它在表观上、化学性质和免疫性等方面都与血源HBsAg类似。
HBsAg比大部分生物分子要大，但比细胞要小，很适宜用膜分离方法纯化。
HBsAg表现出很强的疏水性，可用硫酸铵或聚乙二醇进行分步沉淀，或用疏水层析纯化。
HBsAg含有大量的二硫键，是其对热稳定的主要原因。在制备血源疫苗时，可运用长时间保温法以灭活HBV。但在制备重组HBsAg时没有必要。可选用更加温和的条件。
HBsAg对蛋白酶的抵抗力很强，可在pH为2的时候耐胰蛋白酶的处理。
HBsAg因其脂含量高，密度比一般蛋白低。利用其密度特性，可进行梯度离心分离。
4.疫苗的工作原理
任何疾病的疫苗都遵循以下免疫原理：
（1）.将疫苗注射到人体内，疫苗通常含有已经死亡或者弱化的病毒。而乙肝疫苗就是一类没有感染能力的病毒蛋白，能引起机体的特异性反应。
（2）.免疫系统识别出体内的外来物质（病毒和细菌），这些外来物质也被称之为抗原。
（3）.一旦发现抗原，免疫系统就分泌出被称为抗体的蛋白质。这些蛋白质在血液中流动，将抗原杀死以消灭身体感染的病毒（或者与病毒蛋白质特异性结合，使之失去生物活性）。抗体是由淋巴细胞制造的。这些细胞也被称为B细胞，它的主要功能是产生能够特异性与抗原结合的抗体。
（4）.人体会储存这些抗体，淋巴细胞也会有记忆这种特殊抗原的功能。所以再次染病时，它们会及时消灭此种疾病的病毒，然而抗体的针对性很强，所以曾经接种过乙肝疫苗的人，面对其他疾病时仍旧会感染（值得注意的是：当人体感染真正的病毒时，抗体会不停繁殖，直到病毒最终被消灭。而疫苗会提供数量恰到好处的抗原，以帮助人体完成识别病毒和免疫反应的过程，从而使人体能够对这种病毒免疫）。
5.疫苗制备工艺
5.1.菌种制备和发酵
用成功构造的基因工程菌进行扩大培养，经过逐级放大至发酵罐。发酵过程应该具有下列特点：原料以碳水化合物为主，不含有毒物质，并加入少量有机和无机氮源；能容易进行
大量有效的乙肝病毒表面抗原的生产；生物反应过程是以生命体的自动调节方式进行的，多个反应像一个反应一样，在单一设备中进行；生产过程中，通常常温进行，操作温和，不考虑防爆问题；能够高度选择性的进行复杂化合物在特定部分的反应，如氧化、还原、官能团导入；生产过程中考虑防止杂菌的污染。
发酵过程中，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生长和维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡。可添加诱导剂如乳糖到发酵液中去以诱导可调节启动子的表达。
有人对重组酵母表达的HBsAg的影响进行过研究，发现在碳源中降低葡萄糖浓度，补充甘油和蔗糖能较明显地改善比活值和HBsAg的相对浓度。将发酵前期、中期和后期温度分别控制在27℃、33℃、25℃；发酵从pH4.5开始，逐步上升到pH6；以及维持溶氧浓度在最适水平（70%饱和度），都可以提高重组质粒的稳定性和HBsAg在发酵液中的积累。当然，需要根据不同菌种发酵的最适条件、培养基异同、当地条件等各种因素适当对以上数据进行微调，以保证发酵的顺利高效进行。
5.2.分离纯化和纯度测定工艺
虽然我们已经有从人血中分离纯化HBsAg的丰富经验，但由于重组酵母表达的抗原是在细胞内，存在的量相当小，仅占酵母蛋白、核酸和脂的5%不到，酵母细胞和培养基的成分与血浆有很大不同，为了从重组酵母中得到高纯度的抗原，有必要研究、探索新的纯化工艺。
对于血源性乙肝疫苗分离纯化的重点是除去活性污染物或使其失活，对于基因工程乙肝疫苗而言是去除细胞和培养基成分。
下图表示文献报道的国外工业化生产重组酵母乙肝疫苗的工艺路线，可作为技术开发的参考。
工艺1：
发酵结束后，通过过滤或离心，使酵母与发酵液分离，然后细胞通过高压匀浆机破碎，释放出抗原。酵母的细胞壁较厚，比大肠杆菌难破碎，
可在高压匀浆机内施加几千个大气压力，通过针形阀突然降压到零，使细胞破碎。在细胞破碎前加入蛋白酶抑制剂以防抗原被分解。细胞破碎后加入表面活性剂使抗原溶解。粗细胞裂解物用0.2um中空纤维柱进行微滤。抗原和大部分低分子量宿主细胞内含物通过滤膜，细胞碎片被膜拦截。滤液再进行超滤，此时抗原被膜拦截而低分子量宿主细胞内含物通过滤膜除去。
残留的表面活性剂通过吸附在一种聚苯乙烯小珠上除去。再用硅胶吸附抗原，用热硼酸缓冲液洗脱。
纯化最后一步是用丁基琼脂糖进行疏水层析。纯化后的抗原用硫氰酸盐处理以完成二硫键的交联。纯化后的抗原再与氢氧化铝共沉淀，在共沉淀时，抗原吸附在氢氧化铝上。
除了上述一种工艺外，某些文献中还提到如下两种：
工艺2：
工艺
3：
三种工艺大致相同，不同之处在于：
工艺2在细胞破碎之后经过二步沉淀和离心除去大部分杂质和所有细胞碎片，然后通过超滤浓缩。用阴离子交换层析去除DNA是该工艺的一个关键步骤。
工艺3用吐温80处理破碎细胞，细胞碎片通过离心除去，上清超滤浓缩，用体积排阻层析和离子交换纯化以除去核酸，并进一步做氯化銫梯度等密度离心，然后脱盐。
因HBsAg的体积大，适宜采用体积排阻层析纯化。但如果用于大规模生产的话，层析住体积会很大，要求在纯化工艺的最后阶段，对产品进行浓缩，以减小其体积。
用免疫层析也可以分离酵母源HBsAg。柱中的抗体是从羊血中纯化来的。用人血HBsAg免疫羊，将羊的IgG通过一根含有血源HBsAg的亲和层析柱纯化抗HBsAg抗体。这种方法，即用一种抗原制备抗体，再用此抗体纯化另一种不同来源的抗原，可保证最后的亲和层析柱不会含有酵母杂质的抗体。
5.3.疫苗纯度的测定
乙肝疫苗是通过肌肉注射的方式进入人体系统，为了降低疫苗内杂质含量对人体产生的不良影响，必须进行疫苗的纯度检测。
乙肝疫苗表面抗原的纯度检定是疫苗质量控制的关键手段之一。目前分析测定重组乙型肝炎疫苗纯度的HPLC常用方法是应用TSK-G5000PW分子筛。中国药品生物制品检定所疫苗二室曾报道应用该系统对Merck酿酒酵母重组乙肝疫苗和CHO细胞重组乙肝疫苗进行纯度分析，可获得良好的分离效果。对重组汉逊酵母乙肝疫苗，现有的HPLC检测系统应用0.1mol/L DTT与1:50吐温80等量混合处理后能有效地检测不同类型重组乙肝疫苗表面抗原的纯度。
5.4疫苗的保存
疫苗的稳定性较差，一般在2~8℃下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。在37℃下，许多疫苗只能稳定几天或者几个小时，非常不利于在室温下运输。为了使疫苗的稳定性提高，可用冻干的方法使之干燥。这样，疫苗的有效期往往可延长1倍或以上，在室温下其效价的损失亦较慢。
冻干要点是：（1）冷冻，即将疫苗冷冻至共熔点以下。（2）真空升华，即在真空状态下降水分直接由固态升华为气态。（3）升温缓慢，即升温的过程尽量缓慢，不使疫苗在任何时
间下有融解的情况发生。（4）冻干好的疫苗应在真空或充氮气后密封保存，使其残余水分保持在3%以下。这样的疫苗能保持良好的稳定性。
6.结语
国内已规模化生产预防用基因乙肝疫苗—重组乙型肝炎疫苗，免疫性强、安全性好、母婴传播阻断率高。自主研制的国家一类新药治疗性乙肝DNA疫苗已进入临床研究，这是国内首次批准用于人体的DNA疫苗试验；第一个具有完全自主知识产权的治疗用合成肽乙肝疫苗也已经正式进入临床试验阶段。全国肝炎治疗用药市场规模约200亿元，乙肝疫苗市场容量可维持在4000万人份左右，基因工程乙肝疫苗具有广阔的前景。