第24卷第3期
Vol 124No 13
贺州
OF
学院学报2008年9月
Sep 12008
JOU RNAL HEZ HOU UNIVERSIT Y
工业微生物化学诱变育种研究及应用进展
欧 平
(贺州学院, 广西 贺州 542800)
[摘 要]文章着重介绍了当代化学诱变技术、发生突变的机理和诱变效率, 概述了化学诱变的原理及其在工业微生物育种上的应用进展, 选择性地介绍了几种公认有效的突变剂的作用机理。
[关键词]微生物; 化学诱变; 诱变剂
[中图分类号]Q933 [文献标识码]A [文章编号]1673-8861(2008) 03-0139-06 变异是生物进化的基础推动力(Stebbins 1950) , 也是保证物种多样性的前提, 是其他任何方式不能代替的重要演变方式。人为地利用这种方式, 用尽可能小地影响基础生命代谢的方式最大限度地追求对物种变异的加速, 正是诱导变异的研究目的。诱变育种是人为地利用诱变因素诱发生物遗传变异, 在较短时间内获得有利用价值的突变体, 根据育种目标要求, 选育成新品种直接生产利用, 或育成新种质作亲本在育种上利用的育种途径。诱变育种对于品种的改良有着很大的贡献, 而在生物的生理机制研究中, 诱变技术也功不可没, 许多代谢途径的发现都是建立在若干突变体的基础上的。随着分子水平的深入研究, 与诱变相关的基因umu D 、C 和din B 的克隆, 以及其他突变机理的进一步明晰, 诱变育种的工作变得更为有序和可操纵。
1927年, Muller 发现X 射线能诱发果蝇基因突变, 从此开创了诱变育种技术的先河。诱变育种技术发展至今形成了3种技术:辐射诱变、定点诱变和化学诱变。世界化学诱变育种研究工作始于20世纪50年代, 我国近几十年来这方面的研究工作也有了较大进展。20世纪70年代以来, 诱变因素从早期的单一诱变剂发展到多种化学诱变剂和生理活性物质, 诱变方法从单一处理发展到复合处理, 同时, 诱变育种与组织培养等密切结合, 大大提高了诱变育种的实际意义。
从自然环境中分离, 经过简单筛选而获得的的产酶菌株虽然具备了一定的产酶能力, 但是要达到某种特定代谢产物的大量积累, 实现高产、优质和低
耗的高效转化, 则需要对菌株进行改良, 解除或突破微生物的代谢调控[1]。微生物育种手段主要有:诱变育种、杂交育种和基因工程育种。虽然现代的基因操作技术对菌株改造更为精准, 但实际工业化生产上所使用的产酶菌株, 仍然是多采用一些传统诱变
技术。诱变育种就是利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群, 在大大提高其突变频率的基础上, 采用适当的筛选方法获得所需要的突变菌株, 以供科学实验和生产实践使用[2]。由于化学诱变育种技术还具有易操作、剂量易控制、对基因组损伤小、突变率高等特点, 因而近年来成为运用最为广泛的诱变技术。经过近一个世纪的不断发展和完善, 化学诱变育种技术已成为目前工业微生物育种中最为常用、最有效的技术之一。
1. 化学诱变的主要原理
化学诱变是通过采用一些分子结构不太稳定的化学诱变剂进行的, 它通过化学试剂造成生物的损伤和错误修复, 产生突变体。这些突变以点突变为主, 并且因试剂不同具有某些相对高频而且较为稳定的突变谱。单一碱基对改变而形成的点突变是化学诱变的主要形式。
化学诱变剂主要指某些烷化剂、碱基类似物、抗生素等化学药物, 常见的有甲基磺酸乙酯(EM S) 、硫酸二乙酯(DES) 、叠氮化钠(SA) 和乙烯亚胺(EI) 等, 这些化合物通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反应来诱发突变, 并对某特定的基因或核酸有选择性作用[3]。
其中烷化剂因可与核酸的碱基等直接发生化学
[收稿日期]2008-05-18
[作者简介]欧平(1970-) , 男, 广西贺州学院讲师, 微生物专业在读硕士。主要研究方向:微生物学。
反应, 在复制时导致碱基错配, 故更易引起基因突变, 常用的有亚硝基胍(NTG) 、硫酸二乙酯(DES) 、甲基磺酸乙酯(EMS) 、乙烯亚胺和环氧乙酸等。一般来说处理剂量大, 致死率高, 单位存活的正突变菌株少, 但是在不多的正突变菌株中可能会有目的产物产量大幅提高的突变株; 处理剂量小, 致死率低, 单位存活的正突变菌株虽多, 但一般目的产物产量提高不大, 并且由于正突变菌株量过多, 会大大增加复筛的工作量。不过因为各种诱变剂各有其特殊性、致死和变异作用并非同一过程的平行效应且有些菌株只对某些特定的诱变剂敏感, 所以对诱变剂的选择很大程度上依赖于经验以及最初在实验室所做的尝试性工作。
化学诱变的特点:突变频率比自然突变高几百倍至几千倍, 且变异谱广泛; 由诱变引起的断裂与重接, 可打破优良性状与不良性状间的连锁; 能比较有效地提高个别微生物的产酶量; 育种程序简单, 年限短; 变异的方向和性质不定; 诱发的变异较易稳定; 使用经济方便, 只需少量的药剂和简单的设备。
不同诱变剂对不同植物、组织或细胞、染色体节段、基因的诱变有一定专一性。在选择诱变剂时, 还要考虑下列标准:诱变剂的有效性、效率和专一性, 这是解决定向突变的一条途径。
化学诱变剂在微生物上的应用一般认为始于上世纪中, 通过近几十年的研究, 人们对诱变原理的认识也逐步加深。我们知道, 常规杂交育种基本上是染色体的重新组合, 这种技术一般并不引起染色体发生变异, 更难以触及到基因。而利用化学诱变, 有的药剂是用其烷基置换其它分子中的氢原子, 也有的本身是核苷酸碱基的类似物, 它可以/鱼目混珠0, 造成DNA 复制中的错误, 无疑这些都会使微生物的基因发生突变。化学因素的诱导作用使得细菌的突变率比平时高出千百倍, 有些变异是其它手段难以得到的。可遗传的优良性状一经获得便可育成品种或种质资源。
2. 化学诱变在工业微生物育种上的研究与应用2. 1 化学诱变育种技术
化学诱变剂与物理辐射相比在作用方式上和生物学效应的均有较大差异[4], 其优势主要有以下几个方面:第一, 化学诱变剂靠各自的活性基团和特有的化学特性直接与生物分子进行化学反应, 是化学基团之间的反应, 更多的是引起分子水平上的变化, 对生物分子的影响是个别、局部的, 不利作用少[5]; 第二, 化学诱变剂引起的突变频率较高, 尤其是产生非常高的叶绿素突变频率[6], 就突变的数量而言要
比辐射有效得多; 第三, 化学诱变剂有特异性, 遗传变异定位的程度比辐射高, 诱发的突变性状有明确的专一性。此外, 化学诱变剂很经济, 用量少, 操作方便。
化学诱变育种是通过化学诱变剂诱发微生物基因或染色体畸变, 经过培育和筛选, 育成产酶量高的品种的新方法。其优点是突变遗传性状稳定快, 可以缩短育种进程。化学诱变育种的一般步骤为:出发菌株叶纯化y 斜面培养y 单细胞或单孢子悬液y 诱变剂处理y 平板分离y 斜面培养y 初筛y 斜面培养y 复筛y 斜面培养y 中试y 生产实践。
2. 2 化学诱变育种工作的原则2. 2. 1 选择简便有效的诱变剂。
2. 2. 2 挑选优良的出发菌株(即用于育种的原始菌株) 。
2. 2. 3 处理单细胞或单孢子悬液, 使呈分散状态, 均匀接触诱变剂。细菌或酶母菌悬液中加玻璃珠并振荡, 或用脱脂棉过滤, 可获均匀分散的单细胞悬液。放线菌和霉菌的菌丝是多核的, 诱变育种应用其单核的孢子。用稀释的表面活性剂制备单孢子悬液, 常用的表面活性剂是吐温-80(Tween-80) , 浓度0. 01%~0. 1%。
2. 2. 4 选用最适剂量:在高诱变率的前提下, 既能扩大变异幅度, 又能促使变异移向正变范围的剂量, 即为最适剂量。
2. 2. 5 利用复合处理的协同效应:两种或多种诱变剂的先后使用, 同一种诱变剂的重复使用, 两种或多种诱变剂的同时使用, 均常呈现一定的协同效应, 会取得更好的诱变效果。
2. 2. 6 利用微生物形态、生理与产量间的相关指标, 如变色圈、水解圈、抑菌圈、反应圈的大小等, 以便在初筛中即可从形态性状估计其生产潜力。2. 2. 7 设计和采用高效筛选方案和方法, 以期花费最少的工作量, 在最短的时间内, 取得最大的成效。
2. 3 化学诱变技术突变机理及诱变效率2. 3. 1 化学诱变中DNA 损伤、修复系统与适应性突变
自然条件下, 损伤和发生复制差错的频率都是很高的。Ames [7](1989) 对鼠肝脏因氧化作用引起的损伤作了统计, 核基因组每130000bp 有1个损伤, 线粒体中每8000bp 有一个碱基损伤。DNA 复制的错误包括转座、倒位、移码和丢失。Haynes 和Kunz(1988) 报道, 复制错误频率大约是10, 即:/每一个复制的基因中会出现一个错误0。尽管这些
-2
错误大部分被各种DNA 修复系统, 包括复制中的和复制后的修复作用修复到人们公推的每个体10-8~10-9次突变。修复系统的高效率是物种维持遗传稳定的决定因素。
由近年来的研究来看, 修复系统的作用是明显的, 只不过它的功能并不是精确无误的。H all 在选择压力下为获得适应性作的基因水平的突变似乎是被允许的, 有选择性压力比中性环境能获得更多的基因突变。突变形成只出现在包含允许错误修复的DNA 聚合酶IV 的编码基因din+的克隆里, 筛选条件既可以刺激lac 突变体的反转突变, 也可以促使野生型基因发生适应性突变。Grzesiuk-E; Janion -C [9](1994) 用MM S 诱变大肠杆菌报道了umuDC 依赖型的突变。在umuDC 蛋白过量表达的细胞中富含AT 的argE(ochre) -Arg (+) 和另一基因Rif(R) -Rif(R) 突变率增高。他们的研究也表明:M MS 诱导产生的突变位点在细胞饥饿时被RecA 催化的重组修复方式修复。正常情况下, RecA 催化的重组修复方式是避免复制错误发生的途径, 但在代谢活跃的细胞里, 由于有U muDC-RecA 翻译合成的DNA 聚合酶3全酶复合体的出现, 也会以易产生差错的修复途经进行修复。以上研究不同程度地表明微生物为在逆境中求生是可以产生适应性突变的。
Bunnv -Kim [10](2002) 等人对阻遏蛋白LexA 编码基因进行诱变, 发现沙门氏菌中失效突变体是致死突变, 也就是说LexA 失效突变体不是突变效应的增效基因。这一结果和大肠杆菌中一样。进一步研究表明:RecA 和LexA 是特殊修复方式的作用因子。能造成DNA 损伤或复制受抑制的逆境会引发一系列称为应急反应(SOS response) 的复杂的诱导修复效应。在不利环境中, 突变有利于生物的生存的情况下, 细胞为避免死亡而启动这项特殊的求生功能, 包括DNA 损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等。有DNA 修复和导致变异两条支路, 具有双重功效。SOS 反应由RecA 蛋白和LexA 阻遏蛋白相互作用引起。RecA 蛋白是SOS 反应系统的发动因子, 单链DNA 和AT P 存在时, RecA 蛋白被激活, 促进LexA 阻遏蛋白水解, 使SOS 反应的一系列基因得到表达, 其中包括紫外线损伤的修复基因uv r A, uv r R, uvr O(分别编码切除酶的亚基) 以及Rec A 和Lex A 基因本身, 与诱变作用有关的基因umu DC 和din R, 与细胞分裂有关的基因sul A, ruv 和lon 等等。
从突变的后果看, 并非所有的碱基改变都能影响基因的功能和表型。可能性有3个, 即基因功能的
[8]
丢失、新功能的获得和对基因表达完全没有影响, 分
别由编码区的突变和非编码区的突变引发。基因编码区的突变可能会引起单个碱基的替换、缺失等, 从而造成合成的蛋白质类型改变, 造成基因功能的丢失或新功能的获得; 或者因移码引起阅读框改变合成了另一种蛋白质或提前终止转录转译而不合成有功能蛋白, 也能造成基因功能改变或尚失。而非编码区的突变是否影响基因功能就有很强的选择性。以E Coli 乳糖操纵子为例, 阅读框上游-10~-35非保守区发生碱基突变并不影响下游基因的启动转录, 但-70~50和-50~40区, -10区的突变影响就很大, 可以引起基因功能的变化甚至表型变化。起始位点上, 甚至单独一个碱基的突变都造成基因表达失活, 产生表型变异。
2. 3. 2 诱变效率
尽管微生物自然突变率只有10~10, 化学诱变率也只不过比自然突变率增加10倍, 但人们在过去的几十年已获得了许多的突变体并形成品种用于生产或研究。给出不完全统计数据:过去几十年全世界其中利用化学诱变育成微生物新品种约占诱变育成品种的50%以上。近年来, 一方面随着高效低诱变剂等的使用, 诱变的效率得到了提高, 方法也更为多样化; 另一方面, 由于化学诱变的操作可控性强、与新的分子生物学技术结合较容易, 效率也有了较大的上升, 由此化学诱变的使用频率迅速上升, 很快成为诱变的主流方法。
诱变的效率首先受基因型限制, 其次因化学诱变剂的种类、浓度、处理时间不同而不同。化学诱变效率得以提高的关键在于两方面:一是获取足够大的诱变群体; 二是科学家的研究证实获得高于自然变异的突变率是可能的。突变来源于染色体畸变、DNA 损伤、DNA 复制错误和修复系统对错误的忽略。突破生物体的保护, 造成DNA 损伤并在复制中保存下来, 使错误复制通过修复系统的作用稳定遗传给子代, 这些环节的加深认识和技术突破使得诱变率得以提高成为可能。
2. 4 工业微生物育种的几种诱变剂化学诱变剂大致包括碱基类似物、碱基修饰剂和嵌入染料3大类。碱基类似物是与DNA 正常碱基结构类似的化合物, 能在DNA 复制时取代正常碱基掺入并与互补碱基配对。如5-溴尿嘧啶(BU) 和2-氨基嘌呤(AP) , 都能引起碱基对转换为碱基对; 碱基修饰剂通过对DNA 碱基进行修饰作用而改变其配对性质。有专一作用于胞嘧啶的羟胺和种类众多、目前运用最多、效率公认为最好的烷化剂系列, -8
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包括氮芥、甲基磺酸乙酯(EMS) 、乙磺酸乙酯(EES) 、甲基磺酸甲酯(M MS) 、亚硝基胍(NTG) 等等; 吖啶橙(acridine) 、溴化乙锭(EB) 等可插入到碱基对之间的染料, 被称作嵌入染料, 也是较强的诱变剂, 能造成两条链错位或移码突变。此外, 叠氮类化合物和一些抗生素也被人们认为是良好的诱变剂。本文选择介绍EMS 、NTG 、DES 、叠氮钠和亚硝酸钠等常用的诱变剂, 并介绍了一些近年新的化学诱变剂。
2. 4. 1 EMS 分子式CH 3SO 2OC 2H 5, 中文名为甲基磺酸乙酯, 无色液体, 分子量124, 水中溶解度为8%。pH 为7的条件下在水中半衰期20e 时是93h, 30e 时26h 。EMS 是烷化剂的一种。烷化剂通常带有1个或多个活性烷基, 此基团能够转移到其它电子密度高的分子上去, 使碱基许多位置上增加了烷基, 从而在多方面改变氢键的能力。EM S 被证明是最为有效而且负面影响小的诱变剂。与其他烷化诱变剂类似, 是通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反应来诱发突变。EMS 诱发的突变主要通过两个步骤来完成, 首先鸟嘌呤的06位置被烷基化, 成为一个带正电荷的季铵基团, 从而发生两种遗传效应:一是烷化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对, 代替胞嘧啶, 发生转换型的突变; 二是由于鸟嘌呤的N27烷基活化, 糖苷键断裂造成脱嘌, 而后在DNA 复制过程中, 烷基化鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对, 导致碱基替换, 即G:C 变为A :T 。当然, 化学诱变存在着染色体结构和数量方面的诱导变异, 但这种单一碱基对改变而形成的点突变仍是化学诱变的主要形式, 这样的点突变将是品种改良和退化特性恢复的希望所在。诱变剂也可与核苷结构的磷酸反应, 形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断, 产生染色体的缺失。这些DNA 结构上的变化都可能促使不表达的基因或区段被激活, 而表现出被掩盖的性状。EM S 化学诱变产生点突变的频率较高, 而染色体畸变相对较少, 可以对作物的某一种特殊性状进行改良。与其它诱变剂相比, EMS 诱变后产生的突变频率高, 且多为显性突变体, 易于突变体的筛选, 是目前运用最广泛也是公认最为有效的诱变剂。
2. 4. 2 NTG 是一种黄色结晶状物质, 不溶于水, 使用时应新鲜配制并先溶于助溶剂(如丙酮) 。NT G 会根据溶液不同的PH 值产生不同的分解产物:在酸性条件下, 分解成对菌株进行诱变; 在中性条件下(pH =7) , NTG 本身和DNA 起烷化反应而引起突变; 在碱性条件下(pH >8) , NTG 会分解成重氮甲烷CHO 2N 2, 对DNA 起烷化作用。过程是称
取一定量的NTG 溶于少量丙酮, 加入5ml 最佳稀释
度的菌悬液(从原始菌液稀释时, 要用三种不同的缓冲液:pH 8. 0) 使其终浓度为1mg /ml, 适当温度轻微振荡作用不同的时间, 将菌悬液洗涤三次终止反应后涂布于平板筛选培养基上, 在适当温度培养。
2. 4. 3 叠氮化钠(NaN 3) 是一种呼吸抑制剂, 能引起染色体畸变和基因突变, 可获得较高的突变频率。NaN 3等电点是pH 为4. 18, 在pH 为3时NaN 3溶液中主要产生呈中性的分子HN 3, 易透过膜进入细胞内, 以碱基替换方式影响DNA 的正常合成, 从而导致点突变的产生。由于NaN 3只作用于复制中的DNA, 所以处理种子时把种子预浸到种胚中, 有利于提高处理效果。NaN 3具有高效、无毒、便宜及使用安全等优点。
2. 4. 4 硫酸二乙酯(DES) 是一种烷化剂, 在水溶液中的水解半衰期很短, 30e 时为一个小时, 所以需要在用前新鲜配制。取0. 5ml 硫酸二乙酯加入4. 5ml95%乙醇制成储备液, 取不同体积的储备液和最佳稀释度的菌液混合, 使其体积比(DES/菌液分别为不同值。适当温度振荡处理不同的时间, 将菌悬液洗涤三次终止反应后涂布于平板筛选培养基上, 在适当温度培养。
2. 4. 5 亚硝酸是一稀常用的诱卞剂, 毒性小. 不稳定, 易挥发. 其钠盐易在酸性缓冲液中产生NO 和NO 2。亚硝酸的诱变机制是脱去碱基中的氨基变成酮基, 引起转换而发生变异。A y H, C y U , G y X 。A:T y G:C 和G:C y A:T 。亚硝酸的诱变也可以发坐回复突变。亚硝酸除了脱氨基作用外, 还可引起DNA 交联作用, DNA 复制, 从而导致奕变。
ENS 、DES 、NTG 、NaN 3和亚硝酸等为常用的工业微生物化学诱变剂, 下面介绍一些新的化学诱变方法和试剂。
2. 4. 6 移码诱变剂
移码诱变剂与DNA 相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变。它们主要包括吖啶黄、吖啶橙、ICR-171、ICR-191等。移码诱变剂对噬菌体有强烈的诱变作用, 诱发细菌、放线菌的质粒脱落比其他诱变剂效果更为显著。如某些产生抗生素的放线菌。用处理后, 发现产量明显下降, 主要就是由于控制抗生素合成的质粒脱落造成的。
吖啶黄是淡黄色晶体, 微溶于热水, 溶于乙醇和乙醚, 不稳定, 见光易分解。使用时, 先用少许乙醇溶解, 配成一定浓度的母液。通常处理方法是特它们加入培养基中, 使最后浓度为10-50ug /ml, 混合后制
成平板, 适温培养, 在生长过程中处理。另外还可将吖啶黄加人到培养液中, 浓度为10-20ug/ml , 在适温条件下, 振荡培养过程中处理。
2. 4. 7 羟化剂(以羟胺为例)
羟胺的简称HA, 常以盐酸羟胺形式存在, 为白色晶体, 溶于水, 不稳定易分解, 具腐蚀性。
羟胺的诱变机制:当羟胺浓度为0. 1~1. 0mol/l pH 6. 0时, 主要与胞嘧啶反应, 使羟化的C 与A 配对, 在0. 1~1. 0mol/lpH9. 0, 羟胺可以与鸟嘧啶反应, 10-3mol/L 时, 羟胺可以与胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶起反应。但据分析, 羟胺与T 、G 反应的是它的产物, 而不是它本身。此外, 羟胺有时还能和细胞中其他物质作用产生过氧化氯, 也具有诱变作用。
羟胺的处理方法:常用浓度为0. 1%~5%, 可直接在溶液中处理, 时间1~2h, 然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中。然后接入孢子或细菌, 在适温下培养, 生长过程中处理. 所用浓度比直接处理时低些。
2. 4. 8 金属盐类
用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等。其中氯化理比较常用, 与其他诱变剂复合处理, 效果相当显著。氯化锂称之为助诱变剂, 氯化锂是白色粉末, 易溶于水, 使用时通常加到培养基中。为了速免受破坏. 倒平板时, 当培养基温度冷却到50~60e 时才加入制成平板, 然后把细菌或孢子涂布分离, 处理终浓度为0. 3%~1. 5%。
2. 4. 9 其他化学诱变剂2. 4. 9. 1 秋水仙素
秋水仙碱是诱发细胞染色休多倍体的诱变剂。秋水仙碱的主要作用是破坏细胞有丝分裂过程中纺锤丝的形成。导致多倍体的产生。
2. 4. 9. 2 抗生素
作为诱变剂的抗生素主要有链黑霉素、争光霉素、丝裂霉素、放线菌素、光辉霉素和阿霉素等。这些抗生素都是抗癌药物, 它们在微生物育种中虽有应用, 但效果不如烷化剂等诱变剂显著, 应用并不广泛。一般不单独使用, 常与其他诱变剂一起复合使用。平阳霉素(PYM ) 是一种抗生素, 属于博莱霉素的一类, 是博莱霉素的A5组分。目前主要作为抗肿瘤药应用于临床, 对多种癌症具有较好的疗效。抗生素具有高度选择性, 能抑制细胞的生长, 其中的大多数对维持生命有重要意义. 作为一种新的诱变剂, PYM 在许多实验中均被证明具有安全、高效、诱变频率高、范围大等特点。与EMS 的诱变特点相近, 在
某些方面优于EM S, 很具有开发和应用前景。
化学诱变剂多数是极毒的致癌药品, 在进行诱变操作后的处置以及诱变剂的保藏等方面的安全防护都是极其重要的。如有疏忽, 就可能对健康和环境带来恶果, 万万不可麻痹。
2. 5 化学诱变在工业微生物育种上的研究与应用
化学诱变研究始于上世纪初, 到了上世纪40年代, 化学药剂的诱变作用得到了肯定, 50年代人们开始探讨化学诱变在工业微生物育种上的应用。在己投入工业发酵生产的五、六十种酶制剂产品中, 特别是淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等, 其生产菌大多是经过化学诱变的改良菌种。
碱性蛋白酶作为一种重要的蛋白质水解酶, 早己实现了工业化生产, 但是人们对它研究开发的兴趣方兴未艾。多年以来, 国内外对产碱性蛋白酶的生产菌株的选育进行了大量的研究, 高产菌种的选育也由传统的单纯使用诱变手段逐步过渡到应用基因工程技术。但利用化学诱变剂单独或复合处理微生物来选育高产变种至今仍是选育碱性蛋白酶高产菌株的常规方法和主要的育种手段。1987年那淑敏等[11]利用亚硝基胍和紫外线复合处理, 获得变异株Bacillus lichenif or mis 533-F13, 产酶活力最高达10000U /ml; 1990年邱秀宝等从38份土样中筛选到一株嗜碱性短小芽抱杆菌R115[12], 经亚硝基肌诱变及利福平抗性株筛选得到高产稳产变异株B45, 经发酵条件研究酶活力达到18000U/ml [13]; 徐子渊等[14]将原碱性蛋白酶生产菌2709进行诱变育种, 获得变异株C1213, 酶产量提高了40%; 郑铁曾等进行了提高C1213菌碱性蛋白酶活力的研究, 酶活力提高了170%。
施巧琴[16]于1981年发表了我国第一篇关于碱性脂肪酶生产菌株诱变选育的论文, 作者用紫外照射、亚硝基胍、盐酸轻胺、5-溴尿嘧啶、秋水仙碱等诱变方法处理扩展青霉UN -596菌株, 得到了高产的突变菌株UN -503, 其产生的脂肪酶的活性比原始菌株的增加了近17倍。王龙英等人从蚕茧浸渍腐化水中分离获得一株产碱性脂肪酶菌株y -96, 通过紫外线和硫酸二乙酯多次诱变, 成功地选育出了一株高产菌株yz -145, 其在最适条件下产酶能力为1615U/m l, 该突变株通过5次传代培养产酶量稳定, 表明其具有良好的稳定遗传性。
耐高温A ) 淀粉酶通常是指最适反应温度为90e ~95e 、热稳定性90e 以上的。A ) 淀粉酶, 比解淀粉芽抱杆菌生产的中等耐热性A ) 淀粉酶高[17]
[15]
100e ~200e 。早在1915年法国Boiden 等开始由枯草杆菌生产细菌淀粉酶, 并在工业上用于纺织品退浆。1985年丸尾[18]报道以地衣芽泡杆菌NYK24为出发菌株, 对各种诱变方法作了比较, 发现NT G 的诱变效果最好, 通过六次连续诱变与自然选择, 挑选环丝氨酸抗性突变株, 随着抗药性增加, 酶活力增加了二千倍。
3. 结束语
目前, 运用ENS 、DES 、NTG 、NaN 3、PYM 、移码诱变剂、羟化剂和亚硝酸等诱变剂已成为微生物育种中主要的化学诱变技术, 并在育种实践中得到了广泛的应用, 其在机理方面也有了一定的研究, 但还
比较肤浅, 诱变机理还不甚清楚, 给育种工作带来很
大的盲目性。今后应深入研究各新型化学诱变源的主要诱变因素作用于出发菌株的生化和分子生物学机理, 探讨各诱变因素间的相互作用。同时, 对诱变后各变异类型的发生频率和所选性状的遗传规律进行统计分析, 以提高菌种选育的可预见性和诱变效率。如利用物理、化学等因素及其综合起来对微生物体的诱变作用机制进行进一步研究。这些新型诱变技术必将在工业微生物诱变育种过程中选育出更多的优良菌株, 探索新的化学诱变源的研究将具有广阔的发展前景。
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第24卷第3期
Vol 124No 13
贺州
OF
学院学报2008年9月
Sep 12008
JOU RNAL HEZ HOU UNIVERSIT Y
工业微生物化学诱变育种研究及应用进展
欧 平
(贺州学院, 广西 贺州 542800)
[摘 要]文章着重介绍了当代化学诱变技术、发生突变的机理和诱变效率, 概述了化学诱变的原理及其在工业微生物育种上的应用进展, 选择性地介绍了几种公认有效的突变剂的作用机理。
[关键词]微生物; 化学诱变; 诱变剂
[中图分类号]Q933 [文献标识码]A [文章编号]1673-8861(2008) 03-0139-06 变异是生物进化的基础推动力(Stebbins 1950) , 也是保证物种多样性的前提, 是其他任何方式不能代替的重要演变方式。人为地利用这种方式, 用尽可能小地影响基础生命代谢的方式最大限度地追求对物种变异的加速, 正是诱导变异的研究目的。诱变育种是人为地利用诱变因素诱发生物遗传变异, 在较短时间内获得有利用价值的突变体, 根据育种目标要求, 选育成新品种直接生产利用, 或育成新种质作亲本在育种上利用的育种途径。诱变育种对于品种的改良有着很大的贡献, 而在生物的生理机制研究中, 诱变技术也功不可没, 许多代谢途径的发现都是建立在若干突变体的基础上的。随着分子水平的深入研究, 与诱变相关的基因umu D 、C 和din B 的克隆, 以及其他突变机理的进一步明晰, 诱变育种的工作变得更为有序和可操纵。
1927年, Muller 发现X 射线能诱发果蝇基因突变, 从此开创了诱变育种技术的先河。诱变育种技术发展至今形成了3种技术:辐射诱变、定点诱变和化学诱变。世界化学诱变育种研究工作始于20世纪50年代, 我国近几十年来这方面的研究工作也有了较大进展。20世纪70年代以来, 诱变因素从早期的单一诱变剂发展到多种化学诱变剂和生理活性物质, 诱变方法从单一处理发展到复合处理, 同时, 诱变育种与组织培养等密切结合, 大大提高了诱变育种的实际意义。
从自然环境中分离, 经过简单筛选而获得的的产酶菌株虽然具备了一定的产酶能力, 但是要达到某种特定代谢产物的大量积累, 实现高产、优质和低
耗的高效转化, 则需要对菌株进行改良, 解除或突破微生物的代谢调控[1]。微生物育种手段主要有:诱变育种、杂交育种和基因工程育种。虽然现代的基因操作技术对菌株改造更为精准, 但实际工业化生产上所使用的产酶菌株, 仍然是多采用一些传统诱变
技术。诱变育种就是利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群, 在大大提高其突变频率的基础上, 采用适当的筛选方法获得所需要的突变菌株, 以供科学实验和生产实践使用[2]。由于化学诱变育种技术还具有易操作、剂量易控制、对基因组损伤小、突变率高等特点, 因而近年来成为运用最为广泛的诱变技术。经过近一个世纪的不断发展和完善, 化学诱变育种技术已成为目前工业微生物育种中最为常用、最有效的技术之一。
1. 化学诱变的主要原理
化学诱变是通过采用一些分子结构不太稳定的化学诱变剂进行的, 它通过化学试剂造成生物的损伤和错误修复, 产生突变体。这些突变以点突变为主, 并且因试剂不同具有某些相对高频而且较为稳定的突变谱。单一碱基对改变而形成的点突变是化学诱变的主要形式。
化学诱变剂主要指某些烷化剂、碱基类似物、抗生素等化学药物, 常见的有甲基磺酸乙酯(EM S) 、硫酸二乙酯(DES) 、叠氮化钠(SA) 和乙烯亚胺(EI) 等, 这些化合物通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反应来诱发突变, 并对某特定的基因或核酸有选择性作用[3]。
其中烷化剂因可与核酸的碱基等直接发生化学
[收稿日期]2008-05-18
[作者简介]欧平(1970-) , 男, 广西贺州学院讲师, 微生物专业在读硕士。主要研究方向:微生物学。
反应, 在复制时导致碱基错配, 故更易引起基因突变, 常用的有亚硝基胍(NTG) 、硫酸二乙酯(DES) 、甲基磺酸乙酯(EMS) 、乙烯亚胺和环氧乙酸等。一般来说处理剂量大, 致死率高, 单位存活的正突变菌株少, 但是在不多的正突变菌株中可能会有目的产物产量大幅提高的突变株; 处理剂量小, 致死率低, 单位存活的正突变菌株虽多, 但一般目的产物产量提高不大, 并且由于正突变菌株量过多, 会大大增加复筛的工作量。不过因为各种诱变剂各有其特殊性、致死和变异作用并非同一过程的平行效应且有些菌株只对某些特定的诱变剂敏感, 所以对诱变剂的选择很大程度上依赖于经验以及最初在实验室所做的尝试性工作。
化学诱变的特点:突变频率比自然突变高几百倍至几千倍, 且变异谱广泛; 由诱变引起的断裂与重接, 可打破优良性状与不良性状间的连锁; 能比较有效地提高个别微生物的产酶量; 育种程序简单, 年限短; 变异的方向和性质不定; 诱发的变异较易稳定; 使用经济方便, 只需少量的药剂和简单的设备。
不同诱变剂对不同植物、组织或细胞、染色体节段、基因的诱变有一定专一性。在选择诱变剂时, 还要考虑下列标准:诱变剂的有效性、效率和专一性, 这是解决定向突变的一条途径。
化学诱变剂在微生物上的应用一般认为始于上世纪中, 通过近几十年的研究, 人们对诱变原理的认识也逐步加深。我们知道, 常规杂交育种基本上是染色体的重新组合, 这种技术一般并不引起染色体发生变异, 更难以触及到基因。而利用化学诱变, 有的药剂是用其烷基置换其它分子中的氢原子, 也有的本身是核苷酸碱基的类似物, 它可以/鱼目混珠0, 造成DNA 复制中的错误, 无疑这些都会使微生物的基因发生突变。化学因素的诱导作用使得细菌的突变率比平时高出千百倍, 有些变异是其它手段难以得到的。可遗传的优良性状一经获得便可育成品种或种质资源。
2. 化学诱变在工业微生物育种上的研究与应用2. 1 化学诱变育种技术
化学诱变剂与物理辐射相比在作用方式上和生物学效应的均有较大差异[4], 其优势主要有以下几个方面:第一, 化学诱变剂靠各自的活性基团和特有的化学特性直接与生物分子进行化学反应, 是化学基团之间的反应, 更多的是引起分子水平上的变化, 对生物分子的影响是个别、局部的, 不利作用少[5]; 第二, 化学诱变剂引起的突变频率较高, 尤其是产生非常高的叶绿素突变频率[6], 就突变的数量而言要
比辐射有效得多; 第三, 化学诱变剂有特异性, 遗传变异定位的程度比辐射高, 诱发的突变性状有明确的专一性。此外, 化学诱变剂很经济, 用量少, 操作方便。
化学诱变育种是通过化学诱变剂诱发微生物基因或染色体畸变, 经过培育和筛选, 育成产酶量高的品种的新方法。其优点是突变遗传性状稳定快, 可以缩短育种进程。化学诱变育种的一般步骤为:出发菌株叶纯化y 斜面培养y 单细胞或单孢子悬液y 诱变剂处理y 平板分离y 斜面培养y 初筛y 斜面培养y 复筛y 斜面培养y 中试y 生产实践。
2. 2 化学诱变育种工作的原则2. 2. 1 选择简便有效的诱变剂。
2. 2. 2 挑选优良的出发菌株(即用于育种的原始菌株) 。
2. 2. 3 处理单细胞或单孢子悬液, 使呈分散状态, 均匀接触诱变剂。细菌或酶母菌悬液中加玻璃珠并振荡, 或用脱脂棉过滤, 可获均匀分散的单细胞悬液。放线菌和霉菌的菌丝是多核的, 诱变育种应用其单核的孢子。用稀释的表面活性剂制备单孢子悬液, 常用的表面活性剂是吐温-80(Tween-80) , 浓度0. 01%~0. 1%。
2. 2. 4 选用最适剂量:在高诱变率的前提下, 既能扩大变异幅度, 又能促使变异移向正变范围的剂量, 即为最适剂量。
2. 2. 5 利用复合处理的协同效应:两种或多种诱变剂的先后使用, 同一种诱变剂的重复使用, 两种或多种诱变剂的同时使用, 均常呈现一定的协同效应, 会取得更好的诱变效果。
2. 2. 6 利用微生物形态、生理与产量间的相关指标, 如变色圈、水解圈、抑菌圈、反应圈的大小等, 以便在初筛中即可从形态性状估计其生产潜力。2. 2. 7 设计和采用高效筛选方案和方法, 以期花费最少的工作量, 在最短的时间内, 取得最大的成效。
2. 3 化学诱变技术突变机理及诱变效率2. 3. 1 化学诱变中DNA 损伤、修复系统与适应性突变
自然条件下, 损伤和发生复制差错的频率都是很高的。Ames [7](1989) 对鼠肝脏因氧化作用引起的损伤作了统计, 核基因组每130000bp 有1个损伤, 线粒体中每8000bp 有一个碱基损伤。DNA 复制的错误包括转座、倒位、移码和丢失。Haynes 和Kunz(1988) 报道, 复制错误频率大约是10, 即:/每一个复制的基因中会出现一个错误0。尽管这些
-2
错误大部分被各种DNA 修复系统, 包括复制中的和复制后的修复作用修复到人们公推的每个体10-8~10-9次突变。修复系统的高效率是物种维持遗传稳定的决定因素。
由近年来的研究来看, 修复系统的作用是明显的, 只不过它的功能并不是精确无误的。H all 在选择压力下为获得适应性作的基因水平的突变似乎是被允许的, 有选择性压力比中性环境能获得更多的基因突变。突变形成只出现在包含允许错误修复的DNA 聚合酶IV 的编码基因din+的克隆里, 筛选条件既可以刺激lac 突变体的反转突变, 也可以促使野生型基因发生适应性突变。Grzesiuk-E; Janion -C [9](1994) 用MM S 诱变大肠杆菌报道了umuDC 依赖型的突变。在umuDC 蛋白过量表达的细胞中富含AT 的argE(ochre) -Arg (+) 和另一基因Rif(R) -Rif(R) 突变率增高。他们的研究也表明:M MS 诱导产生的突变位点在细胞饥饿时被RecA 催化的重组修复方式修复。正常情况下, RecA 催化的重组修复方式是避免复制错误发生的途径, 但在代谢活跃的细胞里, 由于有U muDC-RecA 翻译合成的DNA 聚合酶3全酶复合体的出现, 也会以易产生差错的修复途经进行修复。以上研究不同程度地表明微生物为在逆境中求生是可以产生适应性突变的。
Bunnv -Kim [10](2002) 等人对阻遏蛋白LexA 编码基因进行诱变, 发现沙门氏菌中失效突变体是致死突变, 也就是说LexA 失效突变体不是突变效应的增效基因。这一结果和大肠杆菌中一样。进一步研究表明:RecA 和LexA 是特殊修复方式的作用因子。能造成DNA 损伤或复制受抑制的逆境会引发一系列称为应急反应(SOS response) 的复杂的诱导修复效应。在不利环境中, 突变有利于生物的生存的情况下, 细胞为避免死亡而启动这项特殊的求生功能, 包括DNA 损伤修复、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等。有DNA 修复和导致变异两条支路, 具有双重功效。SOS 反应由RecA 蛋白和LexA 阻遏蛋白相互作用引起。RecA 蛋白是SOS 反应系统的发动因子, 单链DNA 和AT P 存在时, RecA 蛋白被激活, 促进LexA 阻遏蛋白水解, 使SOS 反应的一系列基因得到表达, 其中包括紫外线损伤的修复基因uv r A, uv r R, uvr O(分别编码切除酶的亚基) 以及Rec A 和Lex A 基因本身, 与诱变作用有关的基因umu DC 和din R, 与细胞分裂有关的基因sul A, ruv 和lon 等等。
从突变的后果看, 并非所有的碱基改变都能影响基因的功能和表型。可能性有3个, 即基因功能的
[8]
丢失、新功能的获得和对基因表达完全没有影响, 分
别由编码区的突变和非编码区的突变引发。基因编码区的突变可能会引起单个碱基的替换、缺失等, 从而造成合成的蛋白质类型改变, 造成基因功能的丢失或新功能的获得; 或者因移码引起阅读框改变合成了另一种蛋白质或提前终止转录转译而不合成有功能蛋白, 也能造成基因功能改变或尚失。而非编码区的突变是否影响基因功能就有很强的选择性。以E Coli 乳糖操纵子为例, 阅读框上游-10~-35非保守区发生碱基突变并不影响下游基因的启动转录, 但-70~50和-50~40区, -10区的突变影响就很大, 可以引起基因功能的变化甚至表型变化。起始位点上, 甚至单独一个碱基的突变都造成基因表达失活, 产生表型变异。
2. 3. 2 诱变效率
尽管微生物自然突变率只有10~10, 化学诱变率也只不过比自然突变率增加10倍, 但人们在过去的几十年已获得了许多的突变体并形成品种用于生产或研究。给出不完全统计数据:过去几十年全世界其中利用化学诱变育成微生物新品种约占诱变育成品种的50%以上。近年来, 一方面随着高效低诱变剂等的使用, 诱变的效率得到了提高, 方法也更为多样化; 另一方面, 由于化学诱变的操作可控性强、与新的分子生物学技术结合较容易, 效率也有了较大的上升, 由此化学诱变的使用频率迅速上升, 很快成为诱变的主流方法。
诱变的效率首先受基因型限制, 其次因化学诱变剂的种类、浓度、处理时间不同而不同。化学诱变效率得以提高的关键在于两方面:一是获取足够大的诱变群体; 二是科学家的研究证实获得高于自然变异的突变率是可能的。突变来源于染色体畸变、DNA 损伤、DNA 复制错误和修复系统对错误的忽略。突破生物体的保护, 造成DNA 损伤并在复制中保存下来, 使错误复制通过修复系统的作用稳定遗传给子代, 这些环节的加深认识和技术突破使得诱变率得以提高成为可能。
2. 4 工业微生物育种的几种诱变剂化学诱变剂大致包括碱基类似物、碱基修饰剂和嵌入染料3大类。碱基类似物是与DNA 正常碱基结构类似的化合物, 能在DNA 复制时取代正常碱基掺入并与互补碱基配对。如5-溴尿嘧啶(BU) 和2-氨基嘌呤(AP) , 都能引起碱基对转换为碱基对; 碱基修饰剂通过对DNA 碱基进行修饰作用而改变其配对性质。有专一作用于胞嘧啶的羟胺和种类众多、目前运用最多、效率公认为最好的烷化剂系列, -8
-9
包括氮芥、甲基磺酸乙酯(EMS) 、乙磺酸乙酯(EES) 、甲基磺酸甲酯(M MS) 、亚硝基胍(NTG) 等等; 吖啶橙(acridine) 、溴化乙锭(EB) 等可插入到碱基对之间的染料, 被称作嵌入染料, 也是较强的诱变剂, 能造成两条链错位或移码突变。此外, 叠氮类化合物和一些抗生素也被人们认为是良好的诱变剂。本文选择介绍EMS 、NTG 、DES 、叠氮钠和亚硝酸钠等常用的诱变剂, 并介绍了一些近年新的化学诱变剂。
2. 4. 1 EMS 分子式CH 3SO 2OC 2H 5, 中文名为甲基磺酸乙酯, 无色液体, 分子量124, 水中溶解度为8%。pH 为7的条件下在水中半衰期20e 时是93h, 30e 时26h 。EMS 是烷化剂的一种。烷化剂通常带有1个或多个活性烷基, 此基团能够转移到其它电子密度高的分子上去, 使碱基许多位置上增加了烷基, 从而在多方面改变氢键的能力。EM S 被证明是最为有效而且负面影响小的诱变剂。与其他烷化诱变剂类似, 是通过与核苷酸中的磷酸、嘌呤和嘧啶等分子直接反应来诱发突变。EMS 诱发的突变主要通过两个步骤来完成, 首先鸟嘌呤的06位置被烷基化, 成为一个带正电荷的季铵基团, 从而发生两种遗传效应:一是烷化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对, 代替胞嘧啶, 发生转换型的突变; 二是由于鸟嘌呤的N27烷基活化, 糖苷键断裂造成脱嘌, 而后在DNA 复制过程中, 烷基化鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对, 导致碱基替换, 即G:C 变为A :T 。当然, 化学诱变存在着染色体结构和数量方面的诱导变异, 但这种单一碱基对改变而形成的点突变仍是化学诱变的主要形式, 这样的点突变将是品种改良和退化特性恢复的希望所在。诱变剂也可与核苷结构的磷酸反应, 形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之间切断, 产生染色体的缺失。这些DNA 结构上的变化都可能促使不表达的基因或区段被激活, 而表现出被掩盖的性状。EM S 化学诱变产生点突变的频率较高, 而染色体畸变相对较少, 可以对作物的某一种特殊性状进行改良。与其它诱变剂相比, EMS 诱变后产生的突变频率高, 且多为显性突变体, 易于突变体的筛选, 是目前运用最广泛也是公认最为有效的诱变剂。
2. 4. 2 NTG 是一种黄色结晶状物质, 不溶于水, 使用时应新鲜配制并先溶于助溶剂(如丙酮) 。NT G 会根据溶液不同的PH 值产生不同的分解产物:在酸性条件下, 分解成对菌株进行诱变; 在中性条件下(pH =7) , NTG 本身和DNA 起烷化反应而引起突变; 在碱性条件下(pH >8) , NTG 会分解成重氮甲烷CHO 2N 2, 对DNA 起烷化作用。过程是称
取一定量的NTG 溶于少量丙酮, 加入5ml 最佳稀释
度的菌悬液(从原始菌液稀释时, 要用三种不同的缓冲液:pH 8. 0) 使其终浓度为1mg /ml, 适当温度轻微振荡作用不同的时间, 将菌悬液洗涤三次终止反应后涂布于平板筛选培养基上, 在适当温度培养。
2. 4. 3 叠氮化钠(NaN 3) 是一种呼吸抑制剂, 能引起染色体畸变和基因突变, 可获得较高的突变频率。NaN 3等电点是pH 为4. 18, 在pH 为3时NaN 3溶液中主要产生呈中性的分子HN 3, 易透过膜进入细胞内, 以碱基替换方式影响DNA 的正常合成, 从而导致点突变的产生。由于NaN 3只作用于复制中的DNA, 所以处理种子时把种子预浸到种胚中, 有利于提高处理效果。NaN 3具有高效、无毒、便宜及使用安全等优点。
2. 4. 4 硫酸二乙酯(DES) 是一种烷化剂, 在水溶液中的水解半衰期很短, 30e 时为一个小时, 所以需要在用前新鲜配制。取0. 5ml 硫酸二乙酯加入4. 5ml95%乙醇制成储备液, 取不同体积的储备液和最佳稀释度的菌液混合, 使其体积比(DES/菌液分别为不同值。适当温度振荡处理不同的时间, 将菌悬液洗涤三次终止反应后涂布于平板筛选培养基上, 在适当温度培养。
2. 4. 5 亚硝酸是一稀常用的诱卞剂, 毒性小. 不稳定, 易挥发. 其钠盐易在酸性缓冲液中产生NO 和NO 2。亚硝酸的诱变机制是脱去碱基中的氨基变成酮基, 引起转换而发生变异。A y H, C y U , G y X 。A:T y G:C 和G:C y A:T 。亚硝酸的诱变也可以发坐回复突变。亚硝酸除了脱氨基作用外, 还可引起DNA 交联作用, DNA 复制, 从而导致奕变。
ENS 、DES 、NTG 、NaN 3和亚硝酸等为常用的工业微生物化学诱变剂, 下面介绍一些新的化学诱变方法和试剂。
2. 4. 6 移码诱变剂
移码诱变剂与DNA 相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变。它们主要包括吖啶黄、吖啶橙、ICR-171、ICR-191等。移码诱变剂对噬菌体有强烈的诱变作用, 诱发细菌、放线菌的质粒脱落比其他诱变剂效果更为显著。如某些产生抗生素的放线菌。用处理后, 发现产量明显下降, 主要就是由于控制抗生素合成的质粒脱落造成的。
吖啶黄是淡黄色晶体, 微溶于热水, 溶于乙醇和乙醚, 不稳定, 见光易分解。使用时, 先用少许乙醇溶解, 配成一定浓度的母液。通常处理方法是特它们加入培养基中, 使最后浓度为10-50ug /ml, 混合后制
成平板, 适温培养, 在生长过程中处理。另外还可将吖啶黄加人到培养液中, 浓度为10-20ug/ml , 在适温条件下, 振荡培养过程中处理。
2. 4. 7 羟化剂(以羟胺为例)
羟胺的简称HA, 常以盐酸羟胺形式存在, 为白色晶体, 溶于水, 不稳定易分解, 具腐蚀性。
羟胺的诱变机制:当羟胺浓度为0. 1~1. 0mol/l pH 6. 0时, 主要与胞嘧啶反应, 使羟化的C 与A 配对, 在0. 1~1. 0mol/lpH9. 0, 羟胺可以与鸟嘧啶反应, 10-3mol/L 时, 羟胺可以与胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶起反应。但据分析, 羟胺与T 、G 反应的是它的产物, 而不是它本身。此外, 羟胺有时还能和细胞中其他物质作用产生过氧化氯, 也具有诱变作用。
羟胺的处理方法:常用浓度为0. 1%~5%, 可直接在溶液中处理, 时间1~2h, 然后分离培养。但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中。然后接入孢子或细菌, 在适温下培养, 生长过程中处理. 所用浓度比直接处理时低些。
2. 4. 8 金属盐类
用于诱变育种的金属盐类主要有氯化锂、硫酸锰等。其中氯化理比较常用, 与其他诱变剂复合处理, 效果相当显著。氯化锂称之为助诱变剂, 氯化锂是白色粉末, 易溶于水, 使用时通常加到培养基中。为了速免受破坏. 倒平板时, 当培养基温度冷却到50~60e 时才加入制成平板, 然后把细菌或孢子涂布分离, 处理终浓度为0. 3%~1. 5%。
2. 4. 9 其他化学诱变剂2. 4. 9. 1 秋水仙素
秋水仙碱是诱发细胞染色休多倍体的诱变剂。秋水仙碱的主要作用是破坏细胞有丝分裂过程中纺锤丝的形成。导致多倍体的产生。
2. 4. 9. 2 抗生素
作为诱变剂的抗生素主要有链黑霉素、争光霉素、丝裂霉素、放线菌素、光辉霉素和阿霉素等。这些抗生素都是抗癌药物, 它们在微生物育种中虽有应用, 但效果不如烷化剂等诱变剂显著, 应用并不广泛。一般不单独使用, 常与其他诱变剂一起复合使用。平阳霉素(PYM ) 是一种抗生素, 属于博莱霉素的一类, 是博莱霉素的A5组分。目前主要作为抗肿瘤药应用于临床, 对多种癌症具有较好的疗效。抗生素具有高度选择性, 能抑制细胞的生长, 其中的大多数对维持生命有重要意义. 作为一种新的诱变剂, PYM 在许多实验中均被证明具有安全、高效、诱变频率高、范围大等特点。与EMS 的诱变特点相近, 在
某些方面优于EM S, 很具有开发和应用前景。
化学诱变剂多数是极毒的致癌药品, 在进行诱变操作后的处置以及诱变剂的保藏等方面的安全防护都是极其重要的。如有疏忽, 就可能对健康和环境带来恶果, 万万不可麻痹。
2. 5 化学诱变在工业微生物育种上的研究与应用
化学诱变研究始于上世纪初, 到了上世纪40年代, 化学药剂的诱变作用得到了肯定, 50年代人们开始探讨化学诱变在工业微生物育种上的应用。在己投入工业发酵生产的五、六十种酶制剂产品中, 特别是淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等, 其生产菌大多是经过化学诱变的改良菌种。
碱性蛋白酶作为一种重要的蛋白质水解酶, 早己实现了工业化生产, 但是人们对它研究开发的兴趣方兴未艾。多年以来, 国内外对产碱性蛋白酶的生产菌株的选育进行了大量的研究, 高产菌种的选育也由传统的单纯使用诱变手段逐步过渡到应用基因工程技术。但利用化学诱变剂单独或复合处理微生物来选育高产变种至今仍是选育碱性蛋白酶高产菌株的常规方法和主要的育种手段。1987年那淑敏等[11]利用亚硝基胍和紫外线复合处理, 获得变异株Bacillus lichenif or mis 533-F13, 产酶活力最高达10000U /ml; 1990年邱秀宝等从38份土样中筛选到一株嗜碱性短小芽抱杆菌R115[12], 经亚硝基肌诱变及利福平抗性株筛选得到高产稳产变异株B45, 经发酵条件研究酶活力达到18000U/ml [13]; 徐子渊等[14]将原碱性蛋白酶生产菌2709进行诱变育种, 获得变异株C1213, 酶产量提高了40%; 郑铁曾等进行了提高C1213菌碱性蛋白酶活力的研究, 酶活力提高了170%。
施巧琴[16]于1981年发表了我国第一篇关于碱性脂肪酶生产菌株诱变选育的论文, 作者用紫外照射、亚硝基胍、盐酸轻胺、5-溴尿嘧啶、秋水仙碱等诱变方法处理扩展青霉UN -596菌株, 得到了高产的突变菌株UN -503, 其产生的脂肪酶的活性比原始菌株的增加了近17倍。王龙英等人从蚕茧浸渍腐化水中分离获得一株产碱性脂肪酶菌株y -96, 通过紫外线和硫酸二乙酯多次诱变, 成功地选育出了一株高产菌株yz -145, 其在最适条件下产酶能力为1615U/m l, 该突变株通过5次传代培养产酶量稳定, 表明其具有良好的稳定遗传性。
耐高温A ) 淀粉酶通常是指最适反应温度为90e ~95e 、热稳定性90e 以上的。A ) 淀粉酶, 比解淀粉芽抱杆菌生产的中等耐热性A ) 淀粉酶高[17]
[15]
100e ~200e 。早在1915年法国Boiden 等开始由枯草杆菌生产细菌淀粉酶, 并在工业上用于纺织品退浆。1985年丸尾[18]报道以地衣芽泡杆菌NYK24为出发菌株, 对各种诱变方法作了比较, 发现NT G 的诱变效果最好, 通过六次连续诱变与自然选择, 挑选环丝氨酸抗性突变株, 随着抗药性增加, 酶活力增加了二千倍。
3. 结束语
目前, 运用ENS 、DES 、NTG 、NaN 3、PYM 、移码诱变剂、羟化剂和亚硝酸等诱变剂已成为微生物育种中主要的化学诱变技术, 并在育种实践中得到了广泛的应用, 其在机理方面也有了一定的研究, 但还
比较肤浅, 诱变机理还不甚清楚, 给育种工作带来很
大的盲目性。今后应深入研究各新型化学诱变源的主要诱变因素作用于出发菌株的生化和分子生物学机理, 探讨各诱变因素间的相互作用。同时, 对诱变后各变异类型的发生频率和所选性状的遗传规律进行统计分析, 以提高菌种选育的可预见性和诱变效率。如利用物理、化学等因素及其综合起来对微生物体的诱变作用机制进行进一步研究。这些新型诱变技术必将在工业微生物诱变育种过程中选育出更多的优良菌株, 探索新的化学诱变源的研究将具有广阔的发展前景。
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