《海洋微生物学论文》
微生物的诱变育种类型
学院：海洋学院
专业：海洋科学
学号：08051228
姓名：刘萍
前言
微生物常规育种是以自然突变为基础, 从中筛选出具有优良性状菌株的一种方法。一般情况下, 发生自然突变的几率特别低, 而且用于工业生产的菌株的性状往往由单一或少数基因控制, 所以常规育种时间较长, 工作量较大。
自从1927年Miller 发现X-射线能诱发果蝇基因突变之后，人们发现其他一些因素也能诱导基因突变并逐渐弄清了一些诱变因素的机理, 为工业微生物诱变育种提供了前提条件. 根据育种需要, 有目的利用诱变因素, 可使菌株的基因发生突变以改良其生产性状。 以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种, 具有速度快、收效大和方法简单等优点, 是菌种选育的1个重要途径, 诱变筛选方法相对简便, 是菌种选育的基本、常规和经典方法。特别是对遗传背景不很清楚的对象, 诱变育种更是必不可少。近年来, 随着新诱变因子的不断发现和筛选体系的进一步完善, 微生物诱变育种有了长足发展。为人类的生活提供了很大的方便。
1. 微生物诱变育种的作用
从自然界分离的野生菌种, 不论是在产量上还是在质量上, 均难适合工业化生产的要求。理想的工业化菌种必须具备遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存、能经诱变产生变异和遗传、生产能力具有再现性、具有高产量和高收率等特性。微生物发酵工业中, 诱变育种主要有以下作用: 提高有效产物的产量; 改善菌种特性, 提高
产品质量; 简化工艺条件; 开发新品种, 产生新物质; 用于研究推测产物的生物合成途径; 与其他育种方法相结合[ 1, 2 ]。 2.
2 菌种选育的方法
2.1自然随机筛选
不经人工处理, 利用微生物在一定条件下可产生自发突变的原理, 通过分离筛选排除衰退菌落, 从中选择维持原有生产水平的菌株的方法, 称为自然随机选育。
自然突变由2种原因引起: 多因素低剂量效应和互变异构效应。自然突变可能会产生2种不同的结果, 一种是菌种退化而导致目标产量或质量下降; 另一种是对生产有益的突变。利用自发突变可以分离高生产能力的菌种再用于生产, 同时也可以利用自发突变而出现的菌种性状的变化, 去选育优良的菌株。也可以用来选育高产菌株, 但微生物自发突变频率很低( 10 - 8 ～10 - 6 ) , 正变频率更低。通过自然选育提高菌种生产能力、筛选高产菌株的效率较低, 效果不明显。因此, 在生产实践中自然选育的主要目的是用来纯化、复壮和稳定菌种。
2.2诱变育种
2.2.1 激光(Laser)
激光作用于生物体产生压力、热效应、电磁效应及其综合作用, 引起生物大分子的变化, 导致遗传变异。激光作为一种育种方法, 具有
操作简单、使用安全等优点, 近年来应用于微生物育种中取得不少进展。胡卫红等[3 ] 采用CO2 激光辐照酿酒酵母( S accharomyces cereisi ae) AS2. 1189 ,筛选到乙醇产量有较大提高的变异株。通过对变异株乙醇脱氢酶同工酶的比较分析发现, 其酶谱与出发菌株有所不同, 证实CO2 激光确实有诱变作用。韩建荣等[4 ] 采用He2Ne 激光对青霉PT95 ( Penici l i un sp . ) 的原生质体进行诱变处理, 选育到一株生物量和类胡萝卜素含量均有显著提高的变异菌株L05 ,传代试验表明L05 具有良好的遗传稳定性。周蓬蓬等[5 ] 应用YA G激光照射高山被孢霉( Mort ierel l a al pi na) 获得了花生四稀酸和油脂含量分别提高2. 45 倍和1. 71 倍的高产菌株。彭益强等[6] 采用1. 06μm 、15 kHz 高重复率声光QN d :
YA G激光分别对产植酸酶黑曲霉的孢子悬液和原生质体进行处理, 发现原生质体比孢子耐受激光诱变的能力强, 并且效果好, 选育到一株酶活提高3. 75 倍的变异株。
2.2.2微波(Microwave)
微波辐射属于一种低能电磁辐射, 具有较强生物效应的频率范围在300 MHz ～3000GHz , 对生物体具有热效应和非热效应。其热效应是指它能引起生物体局部温度上升, 从而引起生理生化反应; 非热效应指在微波作用下, 生物体会产生非温度关联的各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下, 生物体会产生一系列突变效应[7,8] 。因而, 微波也被用于多个领域的诱变育种, 如农作物育种、禽兽育种和工业微生物育种, 并取得了一定成果。这方面的工作贾红华等[9 ] 和雷肇
祖等[10 ] 作了详尽总结, 在此不再赘述。
2.2.3 紫外线。
紫外线本身能够作为能量被物质吸收, 所以广泛地用作微生物诱变剂。紫外辐射诱变的作用机制有很多解释, 但较为确定的是紫外辐射使DNA 分子形成嘧啶二聚体, 阻碍碱基正常配对, 并可能引起突变或死亡。另外, 嘧啶二聚体的形成, 还会妨碍双链的解开, 因而影响DNA 的复制和转录。紫外诱变技术是诱变和筛选优良菌株的常规育种方法。其由于设备简单、诱变效率高、操作安简便等, 而被广泛应用。此外, 紫外诱变在核酸中往往造成比较单一的损伤, 所以在DNA 的损伤与修复研究中也有一定的意义。申玉香等[ 11 ]将APV 菌株经紫外线诱变后筛出苯黄隆抗性菌株2#菌株, 发酵双乙酰峰值为0136mg/L, 真正发酵度为6518%。Walid A Lotfy等[ 12 ]用紫外线柠檬酸生菌Aspergillus 2niger UMIP2564 获得成品收率达到60125%的变异菌株W5。石一珺等[13 ]采用紫外线2次复合诱变处理内生真菌哈茨木霉, 获得了突变株UV2523, 大大提高了原始菌株发酵液的活性, 其抗生素含量远远超出出发菌株。
2.2.4 γ射线。
γ射线是1种高能电磁波, 其诱发的突变率与射线剂量有直接关系, 它能产生电离作用, 直接或间接地改变DNA 结构, 直接的效应是导致碱基的化学键、脱氧核糖的化学键、糖2磷酸相连接的化学键断裂; 间接的效应是电离辐射使水和有机分子产生自由基, 自由基作用于DNA 分子, 特别是对嘧啶的作用较强, 可引起缺失和损伤, 造
成基因突变, 还可引起染色体断裂, 引起倒位、缺失和易位等畸变, 从而改变微生物遗传性状[ 14]。60Co γ射线辐射诱变既能获得较高的突变率和较宽的突变谱, 同时还有利于筛选新的突变型。据统计, 诱变育成的品种中使用60 Coγ射线的占7510%～8412%。目前, 用于工业化生产的抗生素高产菌株几乎无一不是经过60 Co2γ射线辐照诱变途径的[ 15 ] 。徐丽等[ 16 ]应用60Co γ射线照射阿维链霉菌H20216, 得到发酵单位比出发菌株提高17313%的高产菌株Co39215。Namkyu Sun 等[ 17 ]通过γ射线辐射类胡萝卜素产生菌Phaffia rhodozyma , 得到产量比出发菌株提高50%的变异菌株3A428。
2.2.5 离子注入微生物的方法
微生物诱变育种, 一般采用生理状态一致、处于对数生长期菌体的单细胞进行理化处理, 这样才能使菌体均匀接触诱变剂, 减少分离现象的发生, 获得较理想的效果。对于以菌丝生长的菌体, 则利用孢子来诱变。同样, 离子注入微生物育种也符合该规律。
离子注入机装置固定、操作程序规范, 因此菌体的前处理, 获得高活性的单细胞是离子注入微生物育种的关键点。许多研究证明, 利用菌膜法或干孢法进行离子注入效果较好。首先, 取培养活化的菌体种子液或斜面活化的菌苔进行稀释, 一般是10 - 2～10 - 3的稀释度, 菌体浓度为108～109 个/ ml 为宜; 然后, 吸取适量的菌体稀释液涂布于无菌的玻璃片或无菌培养皿上, 显微镜检验保证无重叠细胞, 自然干燥(约10 min) 或用无菌风吹干形成菌膜; 放入离子注入机的靶室(具有一定的真空度) 进行脉冲注入离子。要有无离子注入的真空对照和
空气对照[19-25] 。离子注入过程中, 菌体活性的研究鲜有报道。甄卫军等[26] 初步研究了无菌水、无菌生理盐水、无菌脱脂奶保护剂对菌膜菌株活性的影响, 发现保护剂保护作用强, 但是影响离子注入, 起到能量反射和屏蔽作用; 无菌生理盐水对菌株的活性保留最好.
2.2.6热诱变
尽管热处理使大肠杆菌的耐热突变频率增高、基因的不稳定性增加的现象[27]早已被发现, 有关热诱变的机理还不清楚。目前, 有关热诱变机理研究的成果主要是以大肠埃希氏菌(Escherichia coli )T4Baltz 等[28]于1976 年发现, 热处理使T4 噬菌体中胞嘧啶C(5-羟甲基胞嘧啶) 脱氨基形成U(尿嘧啶), 而未经校正的尿嘧啶会在下一轮复制过程中和A(腺嘌呤) 配对, 形成U-A 碱基对, 在第二次复制中则由于A 和T(胸腺嘧啶) 配对, 实现G-C →A-T 的转换, 且该转换频率受溶液的pH 值和离子强度的影响。
随后的研究又发现热处理T4 噬菌体引起G-C 碱基对的颠换, 这种途径的突变位点依然是G-C 碱基对, 但首先发生变化的碱基却是G 。由于热的作用G 的糖苷结合位点从N9 移到N2 变为G*, G*在复制过程中有时会被作为一种嘧啶, 分别与G 和A 配对。G*与G 配对时形成G*-G 碱基对, 在下一轮的复G*还可以与A 配对, 形成G*-A 错配, 然后在下一轮复制过程中形成T-A 碱基对, 实现G-C 到T-A 的颠换
[29]。噬菌体为材料, 一般认为, 热对微生物的
诱变作用是通过热引起DNA 中G-C 碱基对的置换实现的, 但有关置换的具体机制研究却得到了明显不同的结果。
3．诱变育种的价值
我国利用离子注入对真菌进行诱变育种也已经取得了丰硕的成果。之江菌素[30 ] 、多抗灵、柠檬酸[31] 和红霉素[32] 的效价分别提高250 %、50 %、52. 8 %和20 %以上。尤其是中国科学院等离子体物理研究所的姚建铭等[33]利用此技术对花生四烯酸产生菌进行诱变高产菌筛选, 其产酸量最终提高致细胞干重的45 % , 在50 t 罐发酵生产花生四烯酸占总脂的50 %以上, 是美国专利水平的2. 5 倍。目前向砥等[34]利用离子注入选育高产壮观链霉菌, 初步实验结果其效价较出发菌株提高了102. 3 %。
总结：微生物的诱变育种的方法不断地引进与创新，突破传统的思维，使得更加的简单易行，缩短了育种时间，菌种遗传稳定性高、简便、易行和安全，诱变得到的性状更加符合诱变的目的，使的更加满足人们的需要，我相信随着科学技术的发展诱变育种会得到更大的发展的空间，将会给人类社会提供很大的方便。
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《海洋微生物学论文》
微生物的诱变育种类型
学院：海洋学院
专业：海洋科学
学号：08051228
姓名：刘萍
前言
微生物常规育种是以自然突变为基础, 从中筛选出具有优良性状菌株的一种方法。一般情况下, 发生自然突变的几率特别低, 而且用于工业生产的菌株的性状往往由单一或少数基因控制, 所以常规育种时间较长, 工作量较大。
自从1927年Miller 发现X-射线能诱发果蝇基因突变之后，人们发现其他一些因素也能诱导基因突变并逐渐弄清了一些诱变因素的机理, 为工业微生物诱变育种提供了前提条件. 根据育种需要, 有目的利用诱变因素, 可使菌株的基因发生突变以改良其生产性状。 以人工诱发突变为基础的微生物诱变育种, 具有速度快、收效大和方法简单等优点, 是菌种选育的1个重要途径, 诱变筛选方法相对简便, 是菌种选育的基本、常规和经典方法。特别是对遗传背景不很清楚的对象, 诱变育种更是必不可少。近年来, 随着新诱变因子的不断发现和筛选体系的进一步完善, 微生物诱变育种有了长足发展。为人类的生活提供了很大的方便。
1. 微生物诱变育种的作用
从自然界分离的野生菌种, 不论是在产量上还是在质量上, 均难适合工业化生产的要求。理想的工业化菌种必须具备遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存、能经诱变产生变异和遗传、生产能力具有再现性、具有高产量和高收率等特性。微生物发酵工业中, 诱变育种主要有以下作用: 提高有效产物的产量; 改善菌种特性, 提高
产品质量; 简化工艺条件; 开发新品种, 产生新物质; 用于研究推测产物的生物合成途径; 与其他育种方法相结合[ 1, 2 ]。 2.
2 菌种选育的方法
2.1自然随机筛选
不经人工处理, 利用微生物在一定条件下可产生自发突变的原理, 通过分离筛选排除衰退菌落, 从中选择维持原有生产水平的菌株的方法, 称为自然随机选育。
自然突变由2种原因引起: 多因素低剂量效应和互变异构效应。自然突变可能会产生2种不同的结果, 一种是菌种退化而导致目标产量或质量下降; 另一种是对生产有益的突变。利用自发突变可以分离高生产能力的菌种再用于生产, 同时也可以利用自发突变而出现的菌种性状的变化, 去选育优良的菌株。也可以用来选育高产菌株, 但微生物自发突变频率很低( 10 - 8 ～10 - 6 ) , 正变频率更低。通过自然选育提高菌种生产能力、筛选高产菌株的效率较低, 效果不明显。因此, 在生产实践中自然选育的主要目的是用来纯化、复壮和稳定菌种。
2.2诱变育种
2.2.1 激光(Laser)
激光作用于生物体产生压力、热效应、电磁效应及其综合作用, 引起生物大分子的变化, 导致遗传变异。激光作为一种育种方法, 具有
操作简单、使用安全等优点, 近年来应用于微生物育种中取得不少进展。胡卫红等[3 ] 采用CO2 激光辐照酿酒酵母( S accharomyces cereisi ae) AS2. 1189 ,筛选到乙醇产量有较大提高的变异株。通过对变异株乙醇脱氢酶同工酶的比较分析发现, 其酶谱与出发菌株有所不同, 证实CO2 激光确实有诱变作用。韩建荣等[4 ] 采用He2Ne 激光对青霉PT95 ( Penici l i un sp . ) 的原生质体进行诱变处理, 选育到一株生物量和类胡萝卜素含量均有显著提高的变异菌株L05 ,传代试验表明L05 具有良好的遗传稳定性。周蓬蓬等[5 ] 应用YA G激光照射高山被孢霉( Mort ierel l a al pi na) 获得了花生四稀酸和油脂含量分别提高2. 45 倍和1. 71 倍的高产菌株。彭益强等[6] 采用1. 06μm 、15 kHz 高重复率声光QN d :
YA G激光分别对产植酸酶黑曲霉的孢子悬液和原生质体进行处理, 发现原生质体比孢子耐受激光诱变的能力强, 并且效果好, 选育到一株酶活提高3. 75 倍的变异株。
2.2.2微波(Microwave)
微波辐射属于一种低能电磁辐射, 具有较强生物效应的频率范围在300 MHz ～3000GHz , 对生物体具有热效应和非热效应。其热效应是指它能引起生物体局部温度上升, 从而引起生理生化反应; 非热效应指在微波作用下, 生物体会产生非温度关联的各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下, 生物体会产生一系列突变效应[7,8] 。因而, 微波也被用于多个领域的诱变育种, 如农作物育种、禽兽育种和工业微生物育种, 并取得了一定成果。这方面的工作贾红华等[9 ] 和雷肇
祖等[10 ] 作了详尽总结, 在此不再赘述。
2.2.3 紫外线。
紫外线本身能够作为能量被物质吸收, 所以广泛地用作微生物诱变剂。紫外辐射诱变的作用机制有很多解释, 但较为确定的是紫外辐射使DNA 分子形成嘧啶二聚体, 阻碍碱基正常配对, 并可能引起突变或死亡。另外, 嘧啶二聚体的形成, 还会妨碍双链的解开, 因而影响DNA 的复制和转录。紫外诱变技术是诱变和筛选优良菌株的常规育种方法。其由于设备简单、诱变效率高、操作安简便等, 而被广泛应用。此外, 紫外诱变在核酸中往往造成比较单一的损伤, 所以在DNA 的损伤与修复研究中也有一定的意义。申玉香等[ 11 ]将APV 菌株经紫外线诱变后筛出苯黄隆抗性菌株2#菌株, 发酵双乙酰峰值为0136mg/L, 真正发酵度为6518%。Walid A Lotfy等[ 12 ]用紫外线柠檬酸生菌Aspergillus 2niger UMIP2564 获得成品收率达到60125%的变异菌株W5。石一珺等[13 ]采用紫外线2次复合诱变处理内生真菌哈茨木霉, 获得了突变株UV2523, 大大提高了原始菌株发酵液的活性, 其抗生素含量远远超出出发菌株。
2.2.4 γ射线。
γ射线是1种高能电磁波, 其诱发的突变率与射线剂量有直接关系, 它能产生电离作用, 直接或间接地改变DNA 结构, 直接的效应是导致碱基的化学键、脱氧核糖的化学键、糖2磷酸相连接的化学键断裂; 间接的效应是电离辐射使水和有机分子产生自由基, 自由基作用于DNA 分子, 特别是对嘧啶的作用较强, 可引起缺失和损伤, 造
成基因突变, 还可引起染色体断裂, 引起倒位、缺失和易位等畸变, 从而改变微生物遗传性状[ 14]。60Co γ射线辐射诱变既能获得较高的突变率和较宽的突变谱, 同时还有利于筛选新的突变型。据统计, 诱变育成的品种中使用60 Coγ射线的占7510%～8412%。目前, 用于工业化生产的抗生素高产菌株几乎无一不是经过60 Co2γ射线辐照诱变途径的[ 15 ] 。徐丽等[ 16 ]应用60Co γ射线照射阿维链霉菌H20216, 得到发酵单位比出发菌株提高17313%的高产菌株Co39215。Namkyu Sun 等[ 17 ]通过γ射线辐射类胡萝卜素产生菌Phaffia rhodozyma , 得到产量比出发菌株提高50%的变异菌株3A428。
2.2.5 离子注入微生物的方法
微生物诱变育种, 一般采用生理状态一致、处于对数生长期菌体的单细胞进行理化处理, 这样才能使菌体均匀接触诱变剂, 减少分离现象的发生, 获得较理想的效果。对于以菌丝生长的菌体, 则利用孢子来诱变。同样, 离子注入微生物育种也符合该规律。
离子注入机装置固定、操作程序规范, 因此菌体的前处理, 获得高活性的单细胞是离子注入微生物育种的关键点。许多研究证明, 利用菌膜法或干孢法进行离子注入效果较好。首先, 取培养活化的菌体种子液或斜面活化的菌苔进行稀释, 一般是10 - 2～10 - 3的稀释度, 菌体浓度为108～109 个/ ml 为宜; 然后, 吸取适量的菌体稀释液涂布于无菌的玻璃片或无菌培养皿上, 显微镜检验保证无重叠细胞, 自然干燥(约10 min) 或用无菌风吹干形成菌膜; 放入离子注入机的靶室(具有一定的真空度) 进行脉冲注入离子。要有无离子注入的真空对照和
空气对照[19-25] 。离子注入过程中, 菌体活性的研究鲜有报道。甄卫军等[26] 初步研究了无菌水、无菌生理盐水、无菌脱脂奶保护剂对菌膜菌株活性的影响, 发现保护剂保护作用强, 但是影响离子注入, 起到能量反射和屏蔽作用; 无菌生理盐水对菌株的活性保留最好.
2.2.6热诱变
尽管热处理使大肠杆菌的耐热突变频率增高、基因的不稳定性增加的现象[27]早已被发现, 有关热诱变的机理还不清楚。目前, 有关热诱变机理研究的成果主要是以大肠埃希氏菌(Escherichia coli )T4Baltz 等[28]于1976 年发现, 热处理使T4 噬菌体中胞嘧啶C(5-羟甲基胞嘧啶) 脱氨基形成U(尿嘧啶), 而未经校正的尿嘧啶会在下一轮复制过程中和A(腺嘌呤) 配对, 形成U-A 碱基对, 在第二次复制中则由于A 和T(胸腺嘧啶) 配对, 实现G-C →A-T 的转换, 且该转换频率受溶液的pH 值和离子强度的影响。
随后的研究又发现热处理T4 噬菌体引起G-C 碱基对的颠换, 这种途径的突变位点依然是G-C 碱基对, 但首先发生变化的碱基却是G 。由于热的作用G 的糖苷结合位点从N9 移到N2 变为G*, G*在复制过程中有时会被作为一种嘧啶, 分别与G 和A 配对。G*与G 配对时形成G*-G 碱基对, 在下一轮的复G*还可以与A 配对, 形成G*-A 错配, 然后在下一轮复制过程中形成T-A 碱基对, 实现G-C 到T-A 的颠换
[29]。噬菌体为材料, 一般认为, 热对微生物的
诱变作用是通过热引起DNA 中G-C 碱基对的置换实现的, 但有关置换的具体机制研究却得到了明显不同的结果。
3．诱变育种的价值
我国利用离子注入对真菌进行诱变育种也已经取得了丰硕的成果。之江菌素[30 ] 、多抗灵、柠檬酸[31] 和红霉素[32] 的效价分别提高250 %、50 %、52. 8 %和20 %以上。尤其是中国科学院等离子体物理研究所的姚建铭等[33]利用此技术对花生四烯酸产生菌进行诱变高产菌筛选, 其产酸量最终提高致细胞干重的45 % , 在50 t 罐发酵生产花生四烯酸占总脂的50 %以上, 是美国专利水平的2. 5 倍。目前向砥等[34]利用离子注入选育高产壮观链霉菌, 初步实验结果其效价较出发菌株提高了102. 3 %。
总结：微生物的诱变育种的方法不断地引进与创新，突破传统的思维，使得更加的简单易行，缩短了育种时间，菌种遗传稳定性高、简便、易行和安全，诱变得到的性状更加符合诱变的目的，使的更加满足人们的需要，我相信随着科学技术的发展诱变育种会得到更大的发展的空间，将会给人类社会提供很大的方便。
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