课程论
课题名称 纤维素酶产生菌的研究进展
专业名称2013级生物工程
学生姓名 付 燕
指导教师 高 健
2016年4月10日
文
内容摘要·····································································2目录
1.纤维素酶的研究概况··························································2
1.1纤维素酶的来源····························································2
1.2纤维素酶的种类····························································2 2纤维素酶产生菌选育的研究进展················································2 3培养体系的优化······························································3
3.1碳源的作用································································3
3.2氮源的作用································································4
3.3表面活性剂································································4 4培养条件的优化······························································4
4.1温度的影响································································4
4.2 pH的影响·································································5
4.3溶氧量的影
响·······························································5
5.菌种改造····································································5
5.1物理诱
变···································································6
5.2化学诱
变···································································6
5.3基因工程
法·································································6
6.结语········································································7
摘要纤维素酶能够将纤维素分解为葡萄糖。该酶在解决当前世界面临的能源、粮食、环境污染等危机方面具有重要意义。然而，迄今为止纤维素酶活和产率均较低、生产周期长、成本高，都严重地阻碍其工业化的应用。纤维素的降解有赖于纤维素酶。自然界中很多微生·物可以产生纤维素酶。因此，如何提高纤维素产生菌产酶能力是近年来研究的热点。近年来，国内外对细菌、真菌等产纤维素酶的微生物进行了大量的研究，利用化学、物理以及紫外诱变等方法获得了大量纤维素酶高产菌株。本文对国内外选育纤维素酶高产菌的研究以及利用木霉等菌产纤维素酶、产纤维素酶菌种选育、混合菌产纤维素酶等方面的研究进展进行了综述。
关键词纤维素酶；纤维素；微生物；培养体系；培养条件；菌种改造
纤维素（cellulose）作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源，据估计，纤维素生成量每年高达1 000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限，目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。其中纤维素作为数量极其庞大的可再生资源，对其开展深入研究和利用是新世纪能源技术开发的关键，对于解决工农业原料、能源危机、环境保护等问题具有十分重要的意义。
自然界中微生物是纤维素酶的主要贡献者。可以分泌纤维素酶的菌种包括细菌、放线菌和真菌，其中丝状真菌是研究最多的纤维素降解类群。纵观国内外的研究，发现纤维素高效分解菌的选育仍然是纤维素酶研究的重点之一。同时，利用合适的方法提高筛选的微生物菌株的产酶能力、稳定产酶特性是进一步研究的重点。相关的研究也将对解决目前能源危机、粮食短缺以及环境污染等一系列问题具有重要的意义。该研究综合目前国内外的研究成果，对提高纤维素酶活的方法进行总结，并且根据现状提出进一步提高酶活方法的建议，以期为纤维素酶的生产提供技术指导。纤维素的降解主要有三条途径，即酸解法、酶解法和微生物降解法。酸解法因生产成本高且对环境造成巨大污染而较少应用，酶解法和微生物降解法均以高效降解纤维素的菌株为基础。因此开展对纤维素酶及其高效分解菌株的筛选及功能学研究，不仅是开发利用纤维素资源的前提和关键，而且为纤维素酶基因的克隆及纤维素酶基因工程菌的构建奠定基础。
1纤维素酶的研究概况
1.1纤维素酶的来源
纤维素酶分布非常广泛。不但分布于细菌、真菌、植物和原生动物，而且无脊椎动物包括昆虫、疥虫、环节动物、贝类和线虫类等均可产生纤维素酶。在反刍动物的瘤胃中含有共生的纤维分解菌和原生动物；在高等植物中也含有纤维素酶；在微生物方面，真菌、放线菌及细菌等在一定条件下也可产生纤维素酶。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，其中研究较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属，其中以1956年发现的木霉属真菌最为突出。
1.2纤维素酶的种类
纤维素酶是指能够降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，是由三类起协同作用且具有不同催化反应功能的酶组成的多酶体系，根据其催化功能的不同将其分为：Cx酶，又称葡聚糖内切酶、内切型纤维素酶（endo-1.4-β-D,glucanase，EC 3.2.1.4，来自真菌的简称EG，来自细菌的简称Len），这类酶作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1,4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。Cx酶分子量介于23~146 ku之间；C1酶，又称葡聚糖外切酶、外切型纤维素酶、纤维二糖水解酶
(exo-1.4-β-D-glucanase,EC 3.2.1.91,来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex),这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解1，4-β-D糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase），C1酶分子量介于38~118 ku之间；β-葡萄糖苷
酶（β-1.4-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG），这类酶一般将纤维二糖水解成葡萄糖分子，β-葡萄糖苷酶分子量约为76 ku。这三类酶均具有专一性，但能相互协调，在这三类酶的协同作用下,将纤维素最终降解成为葡萄糖。
2纤维素酶产生菌选育的研究进展
选育优良菌种是提高纤维素酶活力的关键,纤维素酶高产菌株的筛选方法主要有诱变筛选和基因工程筛选方法。通常自然界分离筛选的野生型菌株其产酶能力相对较低。邱晔平等在腐烂的水葫芦中利用刚果红平板染色法分离筛选出一株产纤维素酶活性较高同时能高效降解水葫芦的优良菌株D1。在降解水葫芦中CMC酶活最高为2.262μmol/(min·ml),滤纸酶活最高为1.592μmol/(min·ml),该菌株经初步鉴定为绿色木霉。刘占英等从绵羊瘤胃内容物中分离出一株高效纤维素降解细菌,经形态学、生理生化反应和基因型的鉴定,鉴定为肠球菌属的一个种,将所测得的序列用Clustal W软件按Neighbor-Joining方法构建了16Sr DNA系统发育树,并对该菌降解纤维素的特性进行了初步研究。Vladimir等比较了Lentinusedode和Pleurotus在不同植物材料底物及固态、液态发酵方式下产酶量变化，结果产酶差异很大，纤维素材料的性质和菌株培养的方法是影响酶表达和酶组成比例的决定因素。You-Jung Lee等筛选出一株可降解稻壳的菌株,通过16Sr DNA分析和gyr A序列分析确定为Bacillus amyloliquefaciens并命名为B.amyloliquefacien s DL-3。通过SDS-PAGE分析,分子量大约54 ku。纯化酶可降解Avicel、羧甲基纤维素、纤维二糖，β-葡聚糖和木聚糖。最适温度50℃，最适p H值7.0。纤维素酶开放读码框架编码一个含499个氨基酸的蛋白。为进一步提高纤维素酶活力，诱变育种是一种有效的方法。诱变育种又分为单一诱变和复合诱变。包衎等从堆肥、污泥、马粪和土壤中分离得到7株纤维分解菌。并以其中纤维素分解能力较高的一株菌为出发菌株,经紫外线诱变,刚果红纤维素平板透明圈选育法获得一突变株,对突变株纤维素分解菌进行酶活测定。结果表明,突变株具有最高的CMC酶活4.288 U/ml和FPA酶活4.957 U/ml。兰时乐以纤维素酶产生菌TP1202为出发菌株，通过微波诱变和硫酸二乙酯、氯化锂诱变剂进行诱变，选育到1株纤维素酶高产菌株AS5。在适宜条件下，其产生的羧甲基纤维素酶（CMC）活力、滤纸酶（FPA）活力和棉花糖酶活力分别是出发菌株的107%、152.4%和140.5%。Adsul等研究发现，Penicilliumjanthinellum NCIM1171通过硫酸二乙酯处理24 h,然后紫外线处理3 min能得到产酶提高和透明圈明显的菌株,可在含0.2%2-脱氧-D-葡萄糖的培养基上迅速生长。然后转到含1.5%的2-脱氧-D-葡萄糖的培养基有5个突变体。周新萍等从朽木中分离到1株产纤维酶活力高的放线菌NC-7菌株,经形态观察和生理生化测定,初步鉴定为放线菌链霉菌属,生二素链霉菌(Streptomyce,ambofaciens)。采用硫酸二乙酯和紫外线复合诱变方法对NC-7孢子进行诱变,得到产纤维素酶活力高的X402菌株和P3032菌株,其FPA酶活力分别为2.85、2.52 IU/ml，比出发菌株分别高38.95%、22.44%；CMC酶活力分别为4.83、5.29 IU/ml,比出发菌株提高13.21%、23.92%。由于纤维素降解菌诱变筛选具有一定的局限性，所以人们通过定向进化和分子改造基因工程方法筛选重组型高比活力的产纤维素酶菌株。目前利用基因工程技术将纤维素酶基因克隆到细菌、酵母、真菌和植物中取得了一定进展。刘永生等从具有降解天然纤维素稻草粉、甘蔗渣粉活性的地衣芽孢杆菌GXN151中分离、克隆出8个能够表达羧甲基纤维素酶活的基因，其中一个克隆为p GXNL2上的cei5A基因1 626 kb，可编码含542个氨基酸的羧甲基纤维素酶。这些克隆均在含CMC的LA平板上表达CMCaes活性，说明克隆基因可在大肠杆菌中表达且表达产物可被大肠杆菌分泌系统分泌到胞外。唐婧从花腐败残余物中分离到一株β-葡萄糖苷酶高产菌株，通过菌体个体形态特征，菌落特征和生理生化试验结果，并结合16Sr DNA序列分析对该菌进行了分类鉴定，该菌归属于克雷伯氏杆菌属，并将其命名为Klebsiella sp.SWU-27。提取该菌株的全基因组DNA，以大肠杆菌为表达宿主菌，通过鸟枪法，构建全基因组文库，从该菌株的基因组中克隆到一个含有1 230 bp，编码409个氨基酸的新的β-葡萄糖苷酶基因nglu02，HCA位点同源性分析及系统发育树分析表明，该基因属于纤维素酶Ⅰ家族。李旺从陕西杨凌取暖用地热水样中筛选出一种耐热性好、可分解纤维素的菌株，并通过基因工程技术改造其纤维素酶的调控基因，研究表明该菌产生的纤维素酶属于耐热性纤维素酶，具有较强的耐高温特性。Yoon等从桑粒天牛幼虫肠道中成功获得产纤维素酶菌株，并对其进行酶活性研究和纤维素酶基因克隆与表达。Ni J等将来自白蚁的4个内切葡聚糖酶基因进行了家族DNA改组（family shuffling）以获得热稳定性高的突变酶，所得PA68突变体酶的热稳定性提高了10℃，其CMC比活力达到其中一个亲本酶rRsEG的13.1倍。
3培养体系的优化
3.1碳源纤维素酶是诱导酶。理想的碳源应该既能提供菌种生长所需能量，又能诱导纤维素酶基因的高效表达。据报道，碳源对菌丝细胞合成纤维素酶的影响很大。一般认为，碳源的性质和类型是决定酶产生成败的关键之一。培养基的碳源一般为碳水化合物。碳源在酶制剂生产中的作用较复杂。除了供给微生物所需的能源外，它往往对产酶有诱导与阻遏作用。碳源的种类有很多，研究主要侧重能够促使产酶量增加的纤维素类和糖类。季更生等对绿色木霉的研究发现，当以5.0 g/L硫酸盐纸浆为碳源，纤维素酶活值为27.96IU/ml，其值是
以纤维素为碳源时的2.19倍。Dashtban等研究3种不同类型的Trichoderma reesei，分别为QM6a(野生型)、QM9414(突变体)和ＲUT-C30，发现以微晶纤维素为碳源时均有较高的酶活性，并且突变体和ＲUT-C30显著大于野生型。Aftab等发现，利用更高浓度纤维素(50 g/L)和乳糖(150 g/L)的培养基可获得更高的产酶量。Matkar等分离出一株Aspergillus niger，也发现在菌种产酶补给碳源时，乳糖对纤维素酶的生产有诱导作用。还有一些其他碳源也被发现，例如Deswal等新分离出一株褐腐菌，研究其产纤维素酶培养基条件的优化。在不同的碳源试验中，发现以麦麸为碳源时产酶的酶活性最大。一些经预处理得到的碳源被证明更能激发菌种的产酶能力。Parka等将milk pack(MP)与纤维素酶(3 Fillter-Paper
Unit(FPA)/g MP)混合处理作为Acremonium cellulolyticus菌种的唯一碳源时，在3 L发酵罐培养，所得纤维素酶的活性为16 FPA/ml，相比未处理的纯纤维素高出25倍。目前，产纤维素酶的菌种培养基中的碳源主要有纤维素、乳糖、蔗糖、羧甲基纤维素(CMC)、葡萄糖。其中，以纤维素、乳糖为碳源时更能诱导菌种产酶。笔者研究Trichodermasp．菌种产酶时发现，添加乳糖可以显著增加培养体系的滤纸酶活，体系内添加10 g/L乳糖可以使滤纸酶活由原始的最高值0.16 IU上升到0.56 IU。葡萄糖主要是提供菌种生长所需能量，对产酶促进作用不大，用同位素14 C、3H标记发现葡萄糖是抑制纤维素酶的合成，而不是抑制酶的分泌。
3.2氮源在培养基中添加合适的营养成分能够显著提高纤维素酶活性，比如适宜的氮源能较好地促进微生物的生长，调控和改善其产酶能力。氮源的种类有很多。不同的菌种适宜的氮源有很大的差异。目前，在一些研究中发现酵母提取物能够促进产酶。Aftab等在利用丝状真菌(T．reesei)产纤维素酶时发现，使用纤维素———酵母提取物的培养基能达到最大酶活性和细胞生长量，FPA达到5．02 U/ml，CMC酶活为4．2 U/ml，并且真菌生物量达14．7 g/L。由此可知，以酵母提取物为氮源能促进酶的产量、活性。类似的发现还有Domingues等在研究T．reeseiＲUT-C30产纤维素酶时也发现酵母提取物能促进菌种的生长、产酶量。笔者等研究发现在Trichoderma sp．菌种产酶的培养体系中加入15 g/L酵母提取物，可以使得体系2 d的滤纸酶活由0．60 IU提高到0．92 IU。蛋白胨作为比较普遍的氮源也被肯定了其价值。勇强等在研究里氏木霉木聚糖酶和纤维素酶的生物合成时发现在各种氮源中，蛋白胨是最好的氮源，并且在复合氮源中当硫酸铵和尿素的比例为1∶3时，木聚糖酶活力最高，达93．3IU/ml;当比例为1∶1时，FPA和CMC酶活力达到最大值，分别为0．263和0．026 IU/ml。由此可知，调整不同的氮源比例显示不同纤维素酶活力。一些铵盐、尿素也被用作氮源，并显示出其对产酶的促进作用。邱雁临发现，在绿色木霉的纤维素酶酶活培养基中添加氮源(NH4)2SO4为0．5%时，纤维素酶活性达到较高水平。Deswal等在对产纤维素酶的褐腐菌的培养基条件的优化中，发现以尿素为氮源时可以达到最大产酶量。Vu等经钴60γ射线、紫外线照射，与N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍诱变处理后得一突变菌———曲霉菌。在研究其固态发酵优化条件时，发现在培养基中添加氯化铵、尿素、麦芽提取物等氮源能够显著提高纤维素酶产量。目前的研究表明，培养不同菌株的适宜氮源不同。主要的氮源有蛋白胨、酵母提取物、铵盐、尿素等，且有机氮优于无机氮，铵态氮优于硝态氮，无机氮中以硫酸铵最佳，有机氮中蛋白胨促进产酶的效果最好，并能够保持菌种良好生长，且被认为是最佳氮源。大量研究也表明，酵母提取物能够显著促进菌种产酶，其他氮源也有一定的促进作用。但是，关于它起作用的程度、机制还需进一步研究。
3.3表面活性剂和未知生长因子研究表明，一些表面活性剂可以提高菌种的产酶能力。有研究表明，纤维素酶的分泌与细胞膜的通透性有着密切的关系。在绿色木霉QM86培养基中添加一定浓度的油酸钠、亚油酸钠、Tween 80和蔗糖单棕榈酯等表面活性剂，结果表明它们都大量增加纤维素酶产量，且缩短产酶时间。Domingues等研究发现，使用Tween 80能抑制发酵过程中菌丝体形成球状，促进酶的分泌。有研究表明，在纤维素酶解体系中添加适量的Tween20，能够显著提高纤维素酶的酶解效果。Soni等研究一个多功能的烟曲霉，发现适当浓度的Tween 80(0．24%)能够促进纤维素酶的产生。这可能是由于表面活性剂的非离子型的刺激作用改变了细胞膜的通透性。Vu等在研究诱变菌株的固态发酵培养时，发现在培养体系中添加吐温80和EDTA能够有效地促进纤维素酶的生产。笔者研究发现，添加Tween 80对Trichoderma sp．培养体系4 d的酶活有微弱的促进作用。当Tween 80与酵母提取物联合添加时对酶活的增加效果与单独增加酵母提取物的处理没有显著的区别。还有一些离子也起到促进的作用。蒲海燕发现，钙离子是纤维素酶的重要稳定剂，添加含钙离子的溶液对酶的产生有显著的促进效果，NaH2PO4对产酶也有一定的促进作用。有些未知的营养成分对产酶也有效果。据文献报道，玉米芯有利于β-葡萄糖苷酶的生产，同时玉米芯中某些成分对木聚糖酶也有一定的促进作用。这可能与玉米芯除了具有一定的诱导作用外还含有相对较多的可以供菌体生长所利用的营养成分和未知因子有关。表面活性剂和一些未知生长因子能够促进菌种产酶。现在国内外研究较多的为Tween 80的促进作用，其他因子作用很少见报道，由于机理尚不清楚，所以具有一定偶然性。当确定应用表面活性剂和一些未知生长因子时，由于菌种、培养条件有所不同，在应用剂量上需要调试。这些均需要进一步的探
索及总结。
4培养条件的优化
4.1温度在发酵物的培养条件中，温度对菌种的生长、产酶量的影响很大。研究发现，不同培养温度下，菌体生长速度、孢子数量、菌落颜色、酶活力高峰期的出现时间均有不同。徐昶等对灰绿曲霉的研究中发现，灰绿曲霉XC9在较低温度(25℃)下培养，菌体生长缓慢，孢子数量少，呈浅绿色，酶活力高峰期出现晚。在温度较高(35℃)时培养，菌体生长旺盛，孢子多，呈绿色，酶活高峰期出现早，但酶量偏低，表明该菌株产酶较适宜的温度为30℃。董志扬等采用物理化学诱变的方法诱变出一株产酶能力较高的菌株T801，发现最适培养温度为28～30℃。同时，发现一些菌种产酶的适宜温度较高，比如Liu等发现一株耐高温的产纤维素酶的烟曲霉，在固态发酵下最优产酶温度为50℃。Shu等在研究T．reesei产纤维素酶的影响因子中，菌种的最佳产酶温度为30℃。Gautam等在优化菌种产酶条件的试验中，发现黑曲霉与木霉的产酶能力要高于其他真菌，并且其最适产酶温度分别为40和45℃。Sohail等在研究曲霉MS82产纤维素酶时发现发酵培养温度在35℃时，酶产量最高。Chandra等利用木霉以青蒿渣为底物进行发酵生产纤维素酶，测得FP酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的3种酶产量最高时的培养温度为28℃。Chu等研究由griseoaurantiacus ZQBC691降解竹叶中的纤维素产酶，发现其最佳培养温度为30℃，此时的CMC浓度为15 g/L，还原糖的最终浓度达到1．60 g/L。已有的研究表明，当温度过高时，菌体生长旺盛，酶量偏低。当温度较低时，菌体生长缓慢，产酶效率低;当温度处于中间适宜时，菌种的生长和产酶量达到一个理想的平衡状态。一般，多数菌体产纤维素酶的适宜温度为28～35℃。也有一些耐热菌的最适产酶温度较高，可达到40～50℃。
4.2 pH在菌种生长的培养条件中，适宜的pH对其菌体的自身生长、产酶量也起着重要的作用。它是一个重要的衡量指标。曾露等从堆肥化处理的甘蔗叶中分离出一株纤维素酶产生菌，通过调整发酵过程中pH的变化，发现当pH为8时，酶活性相对较高。甄静等从枯枝败叶的土壤中分离出一株耐高温、碱性纤维素酶的真菌，并通过优化培养条件，调整pH，最后锁定该菌产酶的最适pH为7．5。钱林从黄浦江淀山湖的水底沉积物中筛选、分离得到一株产纤维素酶的菌株，发现该菌株在pH 7．0的条件下，发酵66 h后纤维素酶活达到最高值。Gautam等在优化菌种产酶条件的试验中，为选出最适pH，使黑曲霉与木霉在含有50 ml的优化培养基中培养，设置pH范围为3．0～9．0，发现两者的最适pH分别为6．7和6．5。也有的产纤维素酶的菌种经诱变处理后，其最适产酶pH偏酸性，比如Liu等将产纤维素酶菌株经过甲磺酸乙酯(EMS)和紫外线照射处理获得突变体，改突变体的最适产酶pH是5．7。研究表明，在菌体产酶的培养条件中，过酸和过碱环境都不利于菌种产酶，一般中性环境下菌体产酶量较理想，也有一些诱变处理后的菌体最适产酶pH与原始出发菌株相比会发生变化。这需要在实际工作中进一步摸索。
4.3溶氧量产纤维素酶的菌种中有很多是属于好养菌。在发酵培养过程中适当的溶氧量既能保证菌体的优良生长，又能促使菌体产酶。氧气不足，致使菌体生长受限;氧气过高，致使培养体系蒸发失水，微生物代谢受限。因此，调控好发酵培养时的溶氧量对优化培养条件尤为重要。实验室中多采用摇瓶培养的方法，此时的溶氧量由摇床转速和摇瓶装液量来实现。刘靖在优化斜卧青霉的产酶条件时，发现载量和转速过高或过低，都不利于菌种生长、产酶。一般，在500 ml摇瓶中加入100 ml培养基，200 r/min时，其菌种产酶活力最高。摇瓶培养为菌种从实验室走向生产的必经阶段。由于摇瓶培养属于小规模实验性质的培养，菌种应用于生产前具体培养条件、产酶条件的摸索需要通过反应器来实现。相关研究表明，在搅拌式生物反应器中培养的菌种细胞生长量和纤维素酶产量相比于在摇床振荡培养中高出2倍。从实验室转到发酵生产中，影响溶氧量的因素也发生变化，一般在生产中溶氧量的改变通常通过改变转速和通气量来实现的。通过通气量改变溶氧量的方法比较常见。Zhi等研究了溶氧量对里氏木霉的影响，发现在通气量从0．4提到0．5 VVM过程中，菌丝体的质量浓度也在增加，从2．77g/L到2．98 g/L，相应产生的滤纸酶活从2．79 IU/ml到2．98IU/ml，由此看出在一定范围内，溶氧量增加可以小幅度促使菌种产酶。Shahriarinour等研究了在恒定搅拌速度下，不同溶氧量对由Aspergillus菌种产生的胞外纤维素酶(FPA、CMC酶、β-葡萄糖苷酶)产量的影响。结果表明，当空气饱和度为55%时细胞生长量和纤维素酶产量最大，在40%和80%时都较小，而且在55%时，FPA、CMC酶和β-葡萄糖苷酶的活性均最高，分别为2．33、51．10、16．18 U/ml。由此可知，通气量过高和过低都不利于菌种生长和产酶，通气量适中较合适。研究还发现，适合菌种生长和适合菌种产酶的溶氧量可能有所不同。Cao等研究了由BH-14 Cellulophaga lytica生产CMC酶，在7 L生物反应器中培养微生物、搅拌速度和通气量共同影响纤维素酶的产量，利用响应面法优化生长和产酶条件，发现适合细胞生长的最佳搅拌速度为395 r/min，通气量为0．98 VVM，而在生产CMC酶的反应体系中最佳搅拌速度为357 r/min，通气量为0．55 VVM。从摇瓶到反应器即从实验室到生产上的过渡过程中，溶氧量对菌种产酶的影响至关重要。在优化菌种产酶的培养条件下，溶氧量即是保证菌种正常生长所需的必要条件，也是控制菌种产酶的重要因素。大量试验表明，溶
氧量要控制在一定范围内才能有效地促进菌种生长、产酶。
5菌种改造
菌种改造是指在人为的条件下，采取物理、化学、生物基因工程等技术手段致使菌体本身的结构发生改变。这种改变是随机的、不定向的，采取诱变方法获得新菌种，探究其生长、应用能力。其目的是诱发基因突变，选育出有利于投入生产的优良菌种。其意义在于诱发生物体产生突变后，可从中选择、培育微生物的新品种。新品种可能具有潜在的应用价值。关于采用不同方法对产纤维素酶菌种进行诱变的研究很多，但是何种诱变方法对纤维素菌种选育最有效，不同诱变方法获得的菌种是否具有相同的性能，都存在很大的争议。
5.1物理诱变诱变选育中应用较多的是辐射诱变，即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异。但是，关于产酶菌种的诱变还是以紫外诱变居多，并且达到理想的效果。方尚玲等对分离筛选出的1株产纤维素酶活力较高的木霉(CMC酶活609．5 U/g干曲、FPA酶活133．8 U/g干曲)进行紫外线及原生质体紫外线复合诱变，得到产酶活力很高的菌株，其CMC酶活达到1 332．9 U/g干曲，FPA酶活达到301．6 U/g干曲，分别为原始菌株的2．19、2．25倍。Liu等从土壤中分离一株菌株，紫外诱变产纤维素酶菌株，发现暴露于紫外线4 min的条件下酶活达到最高［(107．75μg/(ml·min)］。韩铭海等通过紫外线和γ射线交替诱变，筛选得到一株高产纤维素酶的突变菌株BE40239，与出发株相比，其产酶能力提高1．3倍，发酵性状与出发菌株也有明显的差异。孙君社等以康氏木霉TＲ为出发菌株，经过紫外线诱变，结合双层平板分离技术选育出1株纤维素酶活力明显提高的菌株TＲ6，并通过对康氏木霉固体发酵培养基、接种量、氮源、培养时间和培养温度等培养条件的研究，通过测定其所产CMC酶活和FPA，找到最佳的产酶条件，即秸秆粉∶麸皮为1∶1，固液比为1∶3，添加硫酸铵为氮源，添加量为2%，接种量5%，30℃培养84 h左右为宜，CMC酶活、FPA分别达到468．27和275．31 U/g。物理诱变的方法较简便、快捷，能迅速诱变菌体，但其诱变有不明确性，突变较随机，需要重复性大量试验才能确定适宜的诱变条件，获得产酶活性较高的诱变育种。由于目前该方法仍是一种快捷的方法，被广泛使用。最普遍的物理诱变方法是紫外诱变，也有一些是射线诱变，还有一些是微波辐射诱变等。
5.2化学诱变化学诱变除能引起基因突变外，还具有和辐射相类似的生物学效应，如引起染色体断裂等，常用于处理迟发突变，并对某特定的基因或核酸有选择性作用。化学诱变剂主要有烷化剂，常用的有甲基磺酸乙酯(EMS)、乙烯亚胺(EI)、亚硝基乙基脲烷(NEU)、亚硝基甲基脲烷(NMU)、硫酸二乙酯(DES)等;核酸碱基类似物，常用的有5-溴尿嘧啶(BU)、5-溴去氧尿核苷(BudＲ)等;抗生素，如重氮丝氨酸、丝裂毒素C等，具有破坏DNA和核酸的能力，造成染色体断裂。Chand等用溴乙锭和亚硝基胍复合诱变，在含有两性霉素B浓度为2μg/ml的平板上选育出木霉属抗性突变株CMV5-A10，其FPA酶活、CMC酶活分别是野生菌的2．2和2．1倍。李西波等用青霉(Penicillium sp．)HK2003为原始菌，经亚硝基胍(NTG)、羟胺复合诱变，筛选出一株高产、稳定的纤维素酶菌株LX2435，其产酶能力由200 U/ml提高到415 U/ml，比出发菌株提高2 108倍。对该菌种进行了连续8次继代培养，结果表明其遗传性状稳定。关于单独的化学诱变产酶菌株鲜有报道，多数是物理化学复合诱变。这是因为复合诱变可达到更理想的效果。化学诱变所需的试剂一般为剧毒的诱变剂，其作用效果较明显。寻找到适宜的诱变浓度、条件，能达到较理想的诱变种，但其诱变具有突变性和随机性，也需要不断尝试寻找适宜的条件，一般所用诱变剂较多的是亚硝基胍(NTG)，也可以是多种化学诱变及复合诱变，效果会更明显。
5.3基因工程法基因工程技术是提高纤维素酶活的一种高效、便捷的方法。通过改变菌体结构，迅速、直接地改造菌体。Wang等通过与碳代谢阻遏相关的ＲNA干扰技术来提高康氏木霉菌种产酶，主要是使与产纤维素酶和木聚糖酶相关的代谢产物阻遏调控基因沉默。结果表明，ＲNA干扰后的菌株在滤纸酶活、内切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活和木聚糖酶活方面分别提高2．1、1．4、0．8和0．8倍。可见，ＲNA干扰利用在分析基因表达调控机制和提高纤维素酶活方面是可行的。Ma等通过对斜卧青霉中β-葡萄糖苷酶基因的异源表达来提高里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶活。该研究将斜卧青霉β-葡萄糖苷酶I的编码序列与T．reesei的纤维二糖水解酶I(cbh1)启动子进行连接，通过农杆菌介导转化，转入里氏木霉Ｒut-30的基因组。与亲代菌株相比，2个筛选的转化菌株中的β-葡萄糖苷酶活增加了6～8倍，同时它们的FPA平均增加了30%。Salazar等为了获取高效的纤维素酶，采用反转录PCＲ的方法，建立白腐真菌(WＲF)文库，从中克隆获得Polysticus versicolor编码内切葡聚糖酶的一个基因和Agrocybe aegerita编码纤维二糖纤维二糖水解酶一个基因，将这些基因在原核系统和真核系统进行重组表达，发现这些新酶具有纤维素酶特性。建立白腐真菌(WＲF)文库也是一个产纤维素酶有前景的方法。已有研究表明，通过调节纤维素酶产生菌的调控因子可以在不同程度改变酶的产生量。Coradetti等以模式丝状真菌Neurospora crassa为研究对象，筛选与纤维素降解相关的非特异性转录因子，发现转录因子clr-1和clr-2。系统发育分析结果表明，CLＲ-1和CLＲ-2在多数降解纤维素的丝状真菌中存在且
保守。CLＲ-1对于clr-2的表达和纤维二糖的利用是必需的。缺失clr-2的Aspergillus nidulans菌株不能诱导纤维素酶基因的表达，且缺乏木聚糖酶活力。为提高T．reesei的纤维素降解能力，Ｒahman等将egl3和xyn3与β-葡萄糖苷酶I编码区进行同源重组，重组菌株的β-葡萄糖苷酶I的活力分别比出发菌株提高4．0、7．5倍。由此可知，通过对产酶菌种的纤维素酶基因进行启动子的调控，也可以有效地提高纤维素酶的表达量。陈科等研究了Erwinia chrysanthemi的纤维素酶基因。为提高纤维素酶celY基因在原核细胞中的分泌表达量，分别构建由脂蛋白启动子、T7启动子、果胶酶信号肽调控的多种表达载体。与由纤维素酶celY基因自身的启动子和信号肽调控的表达载体相比，发现由脂蛋白启动子、T7启动子、果胶酶信号肽调控的表达载体都在不同程度提高celY基因的分泌表达量。基因组改组(Genome shuffling)是微生物育种学中的一项新兴技术。这种技术的优点是可在微生物遗传背景未知的条件下改变遗传性状。它已被视为是一种快速提高细胞表型的新型基因工程方法，不仅用于改良菌种，而且用于提供复杂的表型信息。目前，这项技术已被应用到提高纤维素酶生产菌产酶能力的研究中，并初见成效。Cheng在研究Penicillium decumbens JU-A10菌种产酶时，经过2轮基因组改组，获得3个融合子GS2-15、GS2-21和GS2-22，相比于初始菌株，融合子菌株的FPA分别提高100%、109%和94%。当以玉米芯为培养基质时，培养44 h后相比于初始菌株FPA增长117%、142%和118%，结果证实通过基因组改组的方法可以使得菌株更早的大量产酶。Xu等利用基因组改组技术来增强T．viride产纤维素酶的能力，通过紫外(UV)照射、低能离子注入和常压非平衡放电等离子体(APNEDP)方法得到初始突变群体。突变群体进行反复原生质体融合后，获得菌株T．viride F161，其在秸秆中固态发酵培养后纤维素酶活是原始出发菌株的1．97倍。随着基因工程技术的发展，利用生物反应器生产纤维素酶，运用基因工程技术在分子水平上对纤维素酶基因进行分子改造，有望解决一些纤维素酶活性(热稳定性、pH、阻遏性等)低的应用缺陷。但是，通过基因工程方法构建的菌种多数存在着基因结构不稳定的缺陷，且目前大部分纤维素酶基因的表达水平还较低，纤维素酶基因工程的主要难题是如何实现不同组分的有效表达和提高表达量。这些都需要进一步的攻关。无论如何纤维素酶的基因工程研究，目前已得到足够的重视，并且有望在纤维素酶生产上起到革命性的作用。
6结语
纤维素酶作为一种高分子复合酶，具有复杂的空间结构且不易分离、纯化的特点。纤维素酶的生产历史较短、规模较小、酶活力也较低，生产工艺需要进一步研究和完善。选择优良的菌种是提高纤维素酶活力的关键，但还需要有适当的生产方法和培养条件才能充分发挥优良菌种的性能，得到较高的酶产量。早在20世纪70年代，国内外就对纤维素酶进行相关的研究。研究表明，大部分的纤维素酶是由细菌、真菌、放线菌等微生物发酵产生的。里氏木霉T．reesei(Hypocreajecoriha)是迄今为止研究的最为清楚的，并且通过菌种改造、发酵工艺的改进，T．reesei生产纤维素酶的能力得到很大的提高。目前，人们对真菌和细菌的纤维素酶研究较多，而对放线菌纤维素酶的研究很少，并且纤维素酶的产量和活性都偏低。今后，应加强菌种选育和发酵工艺等基础研究工作，分离和筛选出高效纤维素分解菌群，并且用分子生物学手段进一步优化菌种，提高酶活。国内外学者对提高纤维素酶活性的方法都在逐渐探索阶段，主要集中在微生物分离、选育、产酶条件优化以及一些已知纤维素酶基因的克隆和异源表达，虽在培养条件优化和菌种分子改造方面初有成效，但没有一种方法能快速提高酶产量，大幅提高酶活性。纤维素酶的广泛应用对解决食品短缺、缓解能源危机、减少环境污染、加快工业进程等方面有重要的现实意义。如何筛选纤维素酶高产菌株、提高现有菌种的产酶能力，需要科研工作者们进一步的研究。摸索适合不同菌种的产酶工艺、保持酶活的稳定性是进一步研究的主要内容。通过不断的努力攻关，纤维素酶的成本会不断降低，直至实现生物燃料的工业化生产。
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课程论
课题名称 纤维素酶产生菌的研究进展
专业名称2013级生物工程
学生姓名 付 燕
指导教师 高 健
2016年4月10日
文
内容摘要·····································································2目录
1.纤维素酶的研究概况··························································2
1.1纤维素酶的来源····························································2
1.2纤维素酶的种类····························································2 2纤维素酶产生菌选育的研究进展················································2 3培养体系的优化······························································3
3.1碳源的作用································································3
3.2氮源的作用································································4
3.3表面活性剂································································4 4培养条件的优化······························································4
4.1温度的影响································································4
4.2 pH的影响·································································5
4.3溶氧量的影
响·······························································5
5.菌种改造····································································5
5.1物理诱
变···································································6
5.2化学诱
变···································································6
5.3基因工程
法·································································6
6.结语········································································7
摘要纤维素酶能够将纤维素分解为葡萄糖。该酶在解决当前世界面临的能源、粮食、环境污染等危机方面具有重要意义。然而，迄今为止纤维素酶活和产率均较低、生产周期长、成本高，都严重地阻碍其工业化的应用。纤维素的降解有赖于纤维素酶。自然界中很多微生·物可以产生纤维素酶。因此，如何提高纤维素产生菌产酶能力是近年来研究的热点。近年来，国内外对细菌、真菌等产纤维素酶的微生物进行了大量的研究，利用化学、物理以及紫外诱变等方法获得了大量纤维素酶高产菌株。本文对国内外选育纤维素酶高产菌的研究以及利用木霉等菌产纤维素酶、产纤维素酶菌种选育、混合菌产纤维素酶等方面的研究进展进行了综述。
关键词纤维素酶；纤维素；微生物；培养体系；培养条件；菌种改造
纤维素（cellulose）作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源，据估计，纤维素生成量每年高达1 000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限，目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。其中纤维素作为数量极其庞大的可再生资源，对其开展深入研究和利用是新世纪能源技术开发的关键，对于解决工农业原料、能源危机、环境保护等问题具有十分重要的意义。
自然界中微生物是纤维素酶的主要贡献者。可以分泌纤维素酶的菌种包括细菌、放线菌和真菌，其中丝状真菌是研究最多的纤维素降解类群。纵观国内外的研究，发现纤维素高效分解菌的选育仍然是纤维素酶研究的重点之一。同时，利用合适的方法提高筛选的微生物菌株的产酶能力、稳定产酶特性是进一步研究的重点。相关的研究也将对解决目前能源危机、粮食短缺以及环境污染等一系列问题具有重要的意义。该研究综合目前国内外的研究成果，对提高纤维素酶活的方法进行总结，并且根据现状提出进一步提高酶活方法的建议，以期为纤维素酶的生产提供技术指导。纤维素的降解主要有三条途径，即酸解法、酶解法和微生物降解法。酸解法因生产成本高且对环境造成巨大污染而较少应用，酶解法和微生物降解法均以高效降解纤维素的菌株为基础。因此开展对纤维素酶及其高效分解菌株的筛选及功能学研究，不仅是开发利用纤维素资源的前提和关键，而且为纤维素酶基因的克隆及纤维素酶基因工程菌的构建奠定基础。
1纤维素酶的研究概况
1.1纤维素酶的来源
纤维素酶分布非常广泛。不但分布于细菌、真菌、植物和原生动物，而且无脊椎动物包括昆虫、疥虫、环节动物、贝类和线虫类等均可产生纤维素酶。在反刍动物的瘤胃中含有共生的纤维分解菌和原生动物；在高等植物中也含有纤维素酶；在微生物方面，真菌、放线菌及细菌等在一定条件下也可产生纤维素酶。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，其中研究较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属，其中以1956年发现的木霉属真菌最为突出。
1.2纤维素酶的种类
纤维素酶是指能够降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，是由三类起协同作用且具有不同催化反应功能的酶组成的多酶体系，根据其催化功能的不同将其分为：Cx酶，又称葡聚糖内切酶、内切型纤维素酶（endo-1.4-β-D,glucanase，EC 3.2.1.4，来自真菌的简称EG，来自细菌的简称Len），这类酶作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1,4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。Cx酶分子量介于23~146 ku之间；C1酶，又称葡聚糖外切酶、外切型纤维素酶、纤维二糖水解酶
(exo-1.4-β-D-glucanase,EC 3.2.1.91,来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex),这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解1，4-β-D糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase），C1酶分子量介于38~118 ku之间；β-葡萄糖苷
酶（β-1.4-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG），这类酶一般将纤维二糖水解成葡萄糖分子，β-葡萄糖苷酶分子量约为76 ku。这三类酶均具有专一性，但能相互协调，在这三类酶的协同作用下,将纤维素最终降解成为葡萄糖。
2纤维素酶产生菌选育的研究进展
选育优良菌种是提高纤维素酶活力的关键,纤维素酶高产菌株的筛选方法主要有诱变筛选和基因工程筛选方法。通常自然界分离筛选的野生型菌株其产酶能力相对较低。邱晔平等在腐烂的水葫芦中利用刚果红平板染色法分离筛选出一株产纤维素酶活性较高同时能高效降解水葫芦的优良菌株D1。在降解水葫芦中CMC酶活最高为2.262μmol/(min·ml),滤纸酶活最高为1.592μmol/(min·ml),该菌株经初步鉴定为绿色木霉。刘占英等从绵羊瘤胃内容物中分离出一株高效纤维素降解细菌,经形态学、生理生化反应和基因型的鉴定,鉴定为肠球菌属的一个种,将所测得的序列用Clustal W软件按Neighbor-Joining方法构建了16Sr DNA系统发育树,并对该菌降解纤维素的特性进行了初步研究。Vladimir等比较了Lentinusedode和Pleurotus在不同植物材料底物及固态、液态发酵方式下产酶量变化，结果产酶差异很大，纤维素材料的性质和菌株培养的方法是影响酶表达和酶组成比例的决定因素。You-Jung Lee等筛选出一株可降解稻壳的菌株,通过16Sr DNA分析和gyr A序列分析确定为Bacillus amyloliquefaciens并命名为B.amyloliquefacien s DL-3。通过SDS-PAGE分析,分子量大约54 ku。纯化酶可降解Avicel、羧甲基纤维素、纤维二糖，β-葡聚糖和木聚糖。最适温度50℃，最适p H值7.0。纤维素酶开放读码框架编码一个含499个氨基酸的蛋白。为进一步提高纤维素酶活力，诱变育种是一种有效的方法。诱变育种又分为单一诱变和复合诱变。包衎等从堆肥、污泥、马粪和土壤中分离得到7株纤维分解菌。并以其中纤维素分解能力较高的一株菌为出发菌株,经紫外线诱变,刚果红纤维素平板透明圈选育法获得一突变株,对突变株纤维素分解菌进行酶活测定。结果表明,突变株具有最高的CMC酶活4.288 U/ml和FPA酶活4.957 U/ml。兰时乐以纤维素酶产生菌TP1202为出发菌株，通过微波诱变和硫酸二乙酯、氯化锂诱变剂进行诱变，选育到1株纤维素酶高产菌株AS5。在适宜条件下，其产生的羧甲基纤维素酶（CMC）活力、滤纸酶（FPA）活力和棉花糖酶活力分别是出发菌株的107%、152.4%和140.5%。Adsul等研究发现，Penicilliumjanthinellum NCIM1171通过硫酸二乙酯处理24 h,然后紫外线处理3 min能得到产酶提高和透明圈明显的菌株,可在含0.2%2-脱氧-D-葡萄糖的培养基上迅速生长。然后转到含1.5%的2-脱氧-D-葡萄糖的培养基有5个突变体。周新萍等从朽木中分离到1株产纤维酶活力高的放线菌NC-7菌株,经形态观察和生理生化测定,初步鉴定为放线菌链霉菌属,生二素链霉菌(Streptomyce,ambofaciens)。采用硫酸二乙酯和紫外线复合诱变方法对NC-7孢子进行诱变,得到产纤维素酶活力高的X402菌株和P3032菌株,其FPA酶活力分别为2.85、2.52 IU/ml，比出发菌株分别高38.95%、22.44%；CMC酶活力分别为4.83、5.29 IU/ml,比出发菌株提高13.21%、23.92%。由于纤维素降解菌诱变筛选具有一定的局限性，所以人们通过定向进化和分子改造基因工程方法筛选重组型高比活力的产纤维素酶菌株。目前利用基因工程技术将纤维素酶基因克隆到细菌、酵母、真菌和植物中取得了一定进展。刘永生等从具有降解天然纤维素稻草粉、甘蔗渣粉活性的地衣芽孢杆菌GXN151中分离、克隆出8个能够表达羧甲基纤维素酶活的基因，其中一个克隆为p GXNL2上的cei5A基因1 626 kb，可编码含542个氨基酸的羧甲基纤维素酶。这些克隆均在含CMC的LA平板上表达CMCaes活性，说明克隆基因可在大肠杆菌中表达且表达产物可被大肠杆菌分泌系统分泌到胞外。唐婧从花腐败残余物中分离到一株β-葡萄糖苷酶高产菌株，通过菌体个体形态特征，菌落特征和生理生化试验结果，并结合16Sr DNA序列分析对该菌进行了分类鉴定，该菌归属于克雷伯氏杆菌属，并将其命名为Klebsiella sp.SWU-27。提取该菌株的全基因组DNA，以大肠杆菌为表达宿主菌，通过鸟枪法，构建全基因组文库，从该菌株的基因组中克隆到一个含有1 230 bp，编码409个氨基酸的新的β-葡萄糖苷酶基因nglu02，HCA位点同源性分析及系统发育树分析表明，该基因属于纤维素酶Ⅰ家族。李旺从陕西杨凌取暖用地热水样中筛选出一种耐热性好、可分解纤维素的菌株，并通过基因工程技术改造其纤维素酶的调控基因，研究表明该菌产生的纤维素酶属于耐热性纤维素酶，具有较强的耐高温特性。Yoon等从桑粒天牛幼虫肠道中成功获得产纤维素酶菌株，并对其进行酶活性研究和纤维素酶基因克隆与表达。Ni J等将来自白蚁的4个内切葡聚糖酶基因进行了家族DNA改组（family shuffling）以获得热稳定性高的突变酶，所得PA68突变体酶的热稳定性提高了10℃，其CMC比活力达到其中一个亲本酶rRsEG的13.1倍。
3培养体系的优化
3.1碳源纤维素酶是诱导酶。理想的碳源应该既能提供菌种生长所需能量，又能诱导纤维素酶基因的高效表达。据报道，碳源对菌丝细胞合成纤维素酶的影响很大。一般认为，碳源的性质和类型是决定酶产生成败的关键之一。培养基的碳源一般为碳水化合物。碳源在酶制剂生产中的作用较复杂。除了供给微生物所需的能源外，它往往对产酶有诱导与阻遏作用。碳源的种类有很多，研究主要侧重能够促使产酶量增加的纤维素类和糖类。季更生等对绿色木霉的研究发现，当以5.0 g/L硫酸盐纸浆为碳源，纤维素酶活值为27.96IU/ml，其值是
以纤维素为碳源时的2.19倍。Dashtban等研究3种不同类型的Trichoderma reesei，分别为QM6a(野生型)、QM9414(突变体)和ＲUT-C30，发现以微晶纤维素为碳源时均有较高的酶活性，并且突变体和ＲUT-C30显著大于野生型。Aftab等发现，利用更高浓度纤维素(50 g/L)和乳糖(150 g/L)的培养基可获得更高的产酶量。Matkar等分离出一株Aspergillus niger，也发现在菌种产酶补给碳源时，乳糖对纤维素酶的生产有诱导作用。还有一些其他碳源也被发现，例如Deswal等新分离出一株褐腐菌，研究其产纤维素酶培养基条件的优化。在不同的碳源试验中，发现以麦麸为碳源时产酶的酶活性最大。一些经预处理得到的碳源被证明更能激发菌种的产酶能力。Parka等将milk pack(MP)与纤维素酶(3 Fillter-Paper
Unit(FPA)/g MP)混合处理作为Acremonium cellulolyticus菌种的唯一碳源时，在3 L发酵罐培养，所得纤维素酶的活性为16 FPA/ml，相比未处理的纯纤维素高出25倍。目前，产纤维素酶的菌种培养基中的碳源主要有纤维素、乳糖、蔗糖、羧甲基纤维素(CMC)、葡萄糖。其中，以纤维素、乳糖为碳源时更能诱导菌种产酶。笔者研究Trichodermasp．菌种产酶时发现，添加乳糖可以显著增加培养体系的滤纸酶活，体系内添加10 g/L乳糖可以使滤纸酶活由原始的最高值0.16 IU上升到0.56 IU。葡萄糖主要是提供菌种生长所需能量，对产酶促进作用不大，用同位素14 C、3H标记发现葡萄糖是抑制纤维素酶的合成，而不是抑制酶的分泌。
3.2氮源在培养基中添加合适的营养成分能够显著提高纤维素酶活性，比如适宜的氮源能较好地促进微生物的生长，调控和改善其产酶能力。氮源的种类有很多。不同的菌种适宜的氮源有很大的差异。目前，在一些研究中发现酵母提取物能够促进产酶。Aftab等在利用丝状真菌(T．reesei)产纤维素酶时发现，使用纤维素———酵母提取物的培养基能达到最大酶活性和细胞生长量，FPA达到5．02 U/ml，CMC酶活为4．2 U/ml，并且真菌生物量达14．7 g/L。由此可知，以酵母提取物为氮源能促进酶的产量、活性。类似的发现还有Domingues等在研究T．reeseiＲUT-C30产纤维素酶时也发现酵母提取物能促进菌种的生长、产酶量。笔者等研究发现在Trichoderma sp．菌种产酶的培养体系中加入15 g/L酵母提取物，可以使得体系2 d的滤纸酶活由0．60 IU提高到0．92 IU。蛋白胨作为比较普遍的氮源也被肯定了其价值。勇强等在研究里氏木霉木聚糖酶和纤维素酶的生物合成时发现在各种氮源中，蛋白胨是最好的氮源，并且在复合氮源中当硫酸铵和尿素的比例为1∶3时，木聚糖酶活力最高，达93．3IU/ml;当比例为1∶1时，FPA和CMC酶活力达到最大值，分别为0．263和0．026 IU/ml。由此可知，调整不同的氮源比例显示不同纤维素酶活力。一些铵盐、尿素也被用作氮源，并显示出其对产酶的促进作用。邱雁临发现，在绿色木霉的纤维素酶酶活培养基中添加氮源(NH4)2SO4为0．5%时，纤维素酶活性达到较高水平。Deswal等在对产纤维素酶的褐腐菌的培养基条件的优化中，发现以尿素为氮源时可以达到最大产酶量。Vu等经钴60γ射线、紫外线照射，与N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍诱变处理后得一突变菌———曲霉菌。在研究其固态发酵优化条件时，发现在培养基中添加氯化铵、尿素、麦芽提取物等氮源能够显著提高纤维素酶产量。目前的研究表明，培养不同菌株的适宜氮源不同。主要的氮源有蛋白胨、酵母提取物、铵盐、尿素等，且有机氮优于无机氮，铵态氮优于硝态氮，无机氮中以硫酸铵最佳，有机氮中蛋白胨促进产酶的效果最好，并能够保持菌种良好生长，且被认为是最佳氮源。大量研究也表明，酵母提取物能够显著促进菌种产酶，其他氮源也有一定的促进作用。但是，关于它起作用的程度、机制还需进一步研究。
3.3表面活性剂和未知生长因子研究表明，一些表面活性剂可以提高菌种的产酶能力。有研究表明，纤维素酶的分泌与细胞膜的通透性有着密切的关系。在绿色木霉QM86培养基中添加一定浓度的油酸钠、亚油酸钠、Tween 80和蔗糖单棕榈酯等表面活性剂，结果表明它们都大量增加纤维素酶产量，且缩短产酶时间。Domingues等研究发现，使用Tween 80能抑制发酵过程中菌丝体形成球状，促进酶的分泌。有研究表明，在纤维素酶解体系中添加适量的Tween20，能够显著提高纤维素酶的酶解效果。Soni等研究一个多功能的烟曲霉，发现适当浓度的Tween 80(0．24%)能够促进纤维素酶的产生。这可能是由于表面活性剂的非离子型的刺激作用改变了细胞膜的通透性。Vu等在研究诱变菌株的固态发酵培养时，发现在培养体系中添加吐温80和EDTA能够有效地促进纤维素酶的生产。笔者研究发现，添加Tween 80对Trichoderma sp．培养体系4 d的酶活有微弱的促进作用。当Tween 80与酵母提取物联合添加时对酶活的增加效果与单独增加酵母提取物的处理没有显著的区别。还有一些离子也起到促进的作用。蒲海燕发现，钙离子是纤维素酶的重要稳定剂，添加含钙离子的溶液对酶的产生有显著的促进效果，NaH2PO4对产酶也有一定的促进作用。有些未知的营养成分对产酶也有效果。据文献报道，玉米芯有利于β-葡萄糖苷酶的生产，同时玉米芯中某些成分对木聚糖酶也有一定的促进作用。这可能与玉米芯除了具有一定的诱导作用外还含有相对较多的可以供菌体生长所利用的营养成分和未知因子有关。表面活性剂和一些未知生长因子能够促进菌种产酶。现在国内外研究较多的为Tween 80的促进作用，其他因子作用很少见报道，由于机理尚不清楚，所以具有一定偶然性。当确定应用表面活性剂和一些未知生长因子时，由于菌种、培养条件有所不同，在应用剂量上需要调试。这些均需要进一步的探
索及总结。
4培养条件的优化
4.1温度在发酵物的培养条件中，温度对菌种的生长、产酶量的影响很大。研究发现，不同培养温度下，菌体生长速度、孢子数量、菌落颜色、酶活力高峰期的出现时间均有不同。徐昶等对灰绿曲霉的研究中发现，灰绿曲霉XC9在较低温度(25℃)下培养，菌体生长缓慢，孢子数量少，呈浅绿色，酶活力高峰期出现晚。在温度较高(35℃)时培养，菌体生长旺盛，孢子多，呈绿色，酶活高峰期出现早，但酶量偏低，表明该菌株产酶较适宜的温度为30℃。董志扬等采用物理化学诱变的方法诱变出一株产酶能力较高的菌株T801，发现最适培养温度为28～30℃。同时，发现一些菌种产酶的适宜温度较高，比如Liu等发现一株耐高温的产纤维素酶的烟曲霉，在固态发酵下最优产酶温度为50℃。Shu等在研究T．reesei产纤维素酶的影响因子中，菌种的最佳产酶温度为30℃。Gautam等在优化菌种产酶条件的试验中，发现黑曲霉与木霉的产酶能力要高于其他真菌，并且其最适产酶温度分别为40和45℃。Sohail等在研究曲霉MS82产纤维素酶时发现发酵培养温度在35℃时，酶产量最高。Chandra等利用木霉以青蒿渣为底物进行发酵生产纤维素酶，测得FP酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的3种酶产量最高时的培养温度为28℃。Chu等研究由griseoaurantiacus ZQBC691降解竹叶中的纤维素产酶，发现其最佳培养温度为30℃，此时的CMC浓度为15 g/L，还原糖的最终浓度达到1．60 g/L。已有的研究表明，当温度过高时，菌体生长旺盛，酶量偏低。当温度较低时，菌体生长缓慢，产酶效率低;当温度处于中间适宜时，菌种的生长和产酶量达到一个理想的平衡状态。一般，多数菌体产纤维素酶的适宜温度为28～35℃。也有一些耐热菌的最适产酶温度较高，可达到40～50℃。
4.2 pH在菌种生长的培养条件中，适宜的pH对其菌体的自身生长、产酶量也起着重要的作用。它是一个重要的衡量指标。曾露等从堆肥化处理的甘蔗叶中分离出一株纤维素酶产生菌，通过调整发酵过程中pH的变化，发现当pH为8时，酶活性相对较高。甄静等从枯枝败叶的土壤中分离出一株耐高温、碱性纤维素酶的真菌，并通过优化培养条件，调整pH，最后锁定该菌产酶的最适pH为7．5。钱林从黄浦江淀山湖的水底沉积物中筛选、分离得到一株产纤维素酶的菌株，发现该菌株在pH 7．0的条件下，发酵66 h后纤维素酶活达到最高值。Gautam等在优化菌种产酶条件的试验中，为选出最适pH，使黑曲霉与木霉在含有50 ml的优化培养基中培养，设置pH范围为3．0～9．0，发现两者的最适pH分别为6．7和6．5。也有的产纤维素酶的菌种经诱变处理后，其最适产酶pH偏酸性，比如Liu等将产纤维素酶菌株经过甲磺酸乙酯(EMS)和紫外线照射处理获得突变体，改突变体的最适产酶pH是5．7。研究表明，在菌体产酶的培养条件中，过酸和过碱环境都不利于菌种产酶，一般中性环境下菌体产酶量较理想，也有一些诱变处理后的菌体最适产酶pH与原始出发菌株相比会发生变化。这需要在实际工作中进一步摸索。
4.3溶氧量产纤维素酶的菌种中有很多是属于好养菌。在发酵培养过程中适当的溶氧量既能保证菌体的优良生长，又能促使菌体产酶。氧气不足，致使菌体生长受限;氧气过高，致使培养体系蒸发失水，微生物代谢受限。因此，调控好发酵培养时的溶氧量对优化培养条件尤为重要。实验室中多采用摇瓶培养的方法，此时的溶氧量由摇床转速和摇瓶装液量来实现。刘靖在优化斜卧青霉的产酶条件时，发现载量和转速过高或过低，都不利于菌种生长、产酶。一般，在500 ml摇瓶中加入100 ml培养基，200 r/min时，其菌种产酶活力最高。摇瓶培养为菌种从实验室走向生产的必经阶段。由于摇瓶培养属于小规模实验性质的培养，菌种应用于生产前具体培养条件、产酶条件的摸索需要通过反应器来实现。相关研究表明，在搅拌式生物反应器中培养的菌种细胞生长量和纤维素酶产量相比于在摇床振荡培养中高出2倍。从实验室转到发酵生产中，影响溶氧量的因素也发生变化，一般在生产中溶氧量的改变通常通过改变转速和通气量来实现的。通过通气量改变溶氧量的方法比较常见。Zhi等研究了溶氧量对里氏木霉的影响，发现在通气量从0．4提到0．5 VVM过程中，菌丝体的质量浓度也在增加，从2．77g/L到2．98 g/L，相应产生的滤纸酶活从2．79 IU/ml到2．98IU/ml，由此看出在一定范围内，溶氧量增加可以小幅度促使菌种产酶。Shahriarinour等研究了在恒定搅拌速度下，不同溶氧量对由Aspergillus菌种产生的胞外纤维素酶(FPA、CMC酶、β-葡萄糖苷酶)产量的影响。结果表明，当空气饱和度为55%时细胞生长量和纤维素酶产量最大，在40%和80%时都较小，而且在55%时，FPA、CMC酶和β-葡萄糖苷酶的活性均最高，分别为2．33、51．10、16．18 U/ml。由此可知，通气量过高和过低都不利于菌种生长和产酶，通气量适中较合适。研究还发现，适合菌种生长和适合菌种产酶的溶氧量可能有所不同。Cao等研究了由BH-14 Cellulophaga lytica生产CMC酶，在7 L生物反应器中培养微生物、搅拌速度和通气量共同影响纤维素酶的产量，利用响应面法优化生长和产酶条件，发现适合细胞生长的最佳搅拌速度为395 r/min，通气量为0．98 VVM，而在生产CMC酶的反应体系中最佳搅拌速度为357 r/min，通气量为0．55 VVM。从摇瓶到反应器即从实验室到生产上的过渡过程中，溶氧量对菌种产酶的影响至关重要。在优化菌种产酶的培养条件下，溶氧量即是保证菌种正常生长所需的必要条件，也是控制菌种产酶的重要因素。大量试验表明，溶
氧量要控制在一定范围内才能有效地促进菌种生长、产酶。
5菌种改造
菌种改造是指在人为的条件下，采取物理、化学、生物基因工程等技术手段致使菌体本身的结构发生改变。这种改变是随机的、不定向的，采取诱变方法获得新菌种，探究其生长、应用能力。其目的是诱发基因突变，选育出有利于投入生产的优良菌种。其意义在于诱发生物体产生突变后，可从中选择、培育微生物的新品种。新品种可能具有潜在的应用价值。关于采用不同方法对产纤维素酶菌种进行诱变的研究很多，但是何种诱变方法对纤维素菌种选育最有效，不同诱变方法获得的菌种是否具有相同的性能，都存在很大的争议。
5.1物理诱变诱变选育中应用较多的是辐射诱变，即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异。但是，关于产酶菌种的诱变还是以紫外诱变居多，并且达到理想的效果。方尚玲等对分离筛选出的1株产纤维素酶活力较高的木霉(CMC酶活609．5 U/g干曲、FPA酶活133．8 U/g干曲)进行紫外线及原生质体紫外线复合诱变，得到产酶活力很高的菌株，其CMC酶活达到1 332．9 U/g干曲，FPA酶活达到301．6 U/g干曲，分别为原始菌株的2．19、2．25倍。Liu等从土壤中分离一株菌株，紫外诱变产纤维素酶菌株，发现暴露于紫外线4 min的条件下酶活达到最高［(107．75μg/(ml·min)］。韩铭海等通过紫外线和γ射线交替诱变，筛选得到一株高产纤维素酶的突变菌株BE40239，与出发株相比，其产酶能力提高1．3倍，发酵性状与出发菌株也有明显的差异。孙君社等以康氏木霉TＲ为出发菌株，经过紫外线诱变，结合双层平板分离技术选育出1株纤维素酶活力明显提高的菌株TＲ6，并通过对康氏木霉固体发酵培养基、接种量、氮源、培养时间和培养温度等培养条件的研究，通过测定其所产CMC酶活和FPA，找到最佳的产酶条件，即秸秆粉∶麸皮为1∶1，固液比为1∶3，添加硫酸铵为氮源，添加量为2%，接种量5%，30℃培养84 h左右为宜，CMC酶活、FPA分别达到468．27和275．31 U/g。物理诱变的方法较简便、快捷，能迅速诱变菌体，但其诱变有不明确性，突变较随机，需要重复性大量试验才能确定适宜的诱变条件，获得产酶活性较高的诱变育种。由于目前该方法仍是一种快捷的方法，被广泛使用。最普遍的物理诱变方法是紫外诱变，也有一些是射线诱变，还有一些是微波辐射诱变等。
5.2化学诱变化学诱变除能引起基因突变外，还具有和辐射相类似的生物学效应，如引起染色体断裂等，常用于处理迟发突变，并对某特定的基因或核酸有选择性作用。化学诱变剂主要有烷化剂，常用的有甲基磺酸乙酯(EMS)、乙烯亚胺(EI)、亚硝基乙基脲烷(NEU)、亚硝基甲基脲烷(NMU)、硫酸二乙酯(DES)等;核酸碱基类似物，常用的有5-溴尿嘧啶(BU)、5-溴去氧尿核苷(BudＲ)等;抗生素，如重氮丝氨酸、丝裂毒素C等，具有破坏DNA和核酸的能力，造成染色体断裂。Chand等用溴乙锭和亚硝基胍复合诱变，在含有两性霉素B浓度为2μg/ml的平板上选育出木霉属抗性突变株CMV5-A10，其FPA酶活、CMC酶活分别是野生菌的2．2和2．1倍。李西波等用青霉(Penicillium sp．)HK2003为原始菌，经亚硝基胍(NTG)、羟胺复合诱变，筛选出一株高产、稳定的纤维素酶菌株LX2435，其产酶能力由200 U/ml提高到415 U/ml，比出发菌株提高2 108倍。对该菌种进行了连续8次继代培养，结果表明其遗传性状稳定。关于单独的化学诱变产酶菌株鲜有报道，多数是物理化学复合诱变。这是因为复合诱变可达到更理想的效果。化学诱变所需的试剂一般为剧毒的诱变剂，其作用效果较明显。寻找到适宜的诱变浓度、条件，能达到较理想的诱变种，但其诱变具有突变性和随机性，也需要不断尝试寻找适宜的条件，一般所用诱变剂较多的是亚硝基胍(NTG)，也可以是多种化学诱变及复合诱变，效果会更明显。
5.3基因工程法基因工程技术是提高纤维素酶活的一种高效、便捷的方法。通过改变菌体结构，迅速、直接地改造菌体。Wang等通过与碳代谢阻遏相关的ＲNA干扰技术来提高康氏木霉菌种产酶，主要是使与产纤维素酶和木聚糖酶相关的代谢产物阻遏调控基因沉默。结果表明，ＲNA干扰后的菌株在滤纸酶活、内切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活和木聚糖酶活方面分别提高2．1、1．4、0．8和0．8倍。可见，ＲNA干扰利用在分析基因表达调控机制和提高纤维素酶活方面是可行的。Ma等通过对斜卧青霉中β-葡萄糖苷酶基因的异源表达来提高里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶活。该研究将斜卧青霉β-葡萄糖苷酶I的编码序列与T．reesei的纤维二糖水解酶I(cbh1)启动子进行连接，通过农杆菌介导转化，转入里氏木霉Ｒut-30的基因组。与亲代菌株相比，2个筛选的转化菌株中的β-葡萄糖苷酶活增加了6～8倍，同时它们的FPA平均增加了30%。Salazar等为了获取高效的纤维素酶，采用反转录PCＲ的方法，建立白腐真菌(WＲF)文库，从中克隆获得Polysticus versicolor编码内切葡聚糖酶的一个基因和Agrocybe aegerita编码纤维二糖纤维二糖水解酶一个基因，将这些基因在原核系统和真核系统进行重组表达，发现这些新酶具有纤维素酶特性。建立白腐真菌(WＲF)文库也是一个产纤维素酶有前景的方法。已有研究表明，通过调节纤维素酶产生菌的调控因子可以在不同程度改变酶的产生量。Coradetti等以模式丝状真菌Neurospora crassa为研究对象，筛选与纤维素降解相关的非特异性转录因子，发现转录因子clr-1和clr-2。系统发育分析结果表明，CLＲ-1和CLＲ-2在多数降解纤维素的丝状真菌中存在且
保守。CLＲ-1对于clr-2的表达和纤维二糖的利用是必需的。缺失clr-2的Aspergillus nidulans菌株不能诱导纤维素酶基因的表达，且缺乏木聚糖酶活力。为提高T．reesei的纤维素降解能力，Ｒahman等将egl3和xyn3与β-葡萄糖苷酶I编码区进行同源重组，重组菌株的β-葡萄糖苷酶I的活力分别比出发菌株提高4．0、7．5倍。由此可知，通过对产酶菌种的纤维素酶基因进行启动子的调控，也可以有效地提高纤维素酶的表达量。陈科等研究了Erwinia chrysanthemi的纤维素酶基因。为提高纤维素酶celY基因在原核细胞中的分泌表达量，分别构建由脂蛋白启动子、T7启动子、果胶酶信号肽调控的多种表达载体。与由纤维素酶celY基因自身的启动子和信号肽调控的表达载体相比，发现由脂蛋白启动子、T7启动子、果胶酶信号肽调控的表达载体都在不同程度提高celY基因的分泌表达量。基因组改组(Genome shuffling)是微生物育种学中的一项新兴技术。这种技术的优点是可在微生物遗传背景未知的条件下改变遗传性状。它已被视为是一种快速提高细胞表型的新型基因工程方法，不仅用于改良菌种，而且用于提供复杂的表型信息。目前，这项技术已被应用到提高纤维素酶生产菌产酶能力的研究中，并初见成效。Cheng在研究Penicillium decumbens JU-A10菌种产酶时，经过2轮基因组改组，获得3个融合子GS2-15、GS2-21和GS2-22，相比于初始菌株，融合子菌株的FPA分别提高100%、109%和94%。当以玉米芯为培养基质时，培养44 h后相比于初始菌株FPA增长117%、142%和118%，结果证实通过基因组改组的方法可以使得菌株更早的大量产酶。Xu等利用基因组改组技术来增强T．viride产纤维素酶的能力，通过紫外(UV)照射、低能离子注入和常压非平衡放电等离子体(APNEDP)方法得到初始突变群体。突变群体进行反复原生质体融合后，获得菌株T．viride F161，其在秸秆中固态发酵培养后纤维素酶活是原始出发菌株的1．97倍。随着基因工程技术的发展，利用生物反应器生产纤维素酶，运用基因工程技术在分子水平上对纤维素酶基因进行分子改造，有望解决一些纤维素酶活性(热稳定性、pH、阻遏性等)低的应用缺陷。但是，通过基因工程方法构建的菌种多数存在着基因结构不稳定的缺陷，且目前大部分纤维素酶基因的表达水平还较低，纤维素酶基因工程的主要难题是如何实现不同组分的有效表达和提高表达量。这些都需要进一步的攻关。无论如何纤维素酶的基因工程研究，目前已得到足够的重视，并且有望在纤维素酶生产上起到革命性的作用。
6结语
纤维素酶作为一种高分子复合酶，具有复杂的空间结构且不易分离、纯化的特点。纤维素酶的生产历史较短、规模较小、酶活力也较低，生产工艺需要进一步研究和完善。选择优良的菌种是提高纤维素酶活力的关键，但还需要有适当的生产方法和培养条件才能充分发挥优良菌种的性能，得到较高的酶产量。早在20世纪70年代，国内外就对纤维素酶进行相关的研究。研究表明，大部分的纤维素酶是由细菌、真菌、放线菌等微生物发酵产生的。里氏木霉T．reesei(Hypocreajecoriha)是迄今为止研究的最为清楚的，并且通过菌种改造、发酵工艺的改进，T．reesei生产纤维素酶的能力得到很大的提高。目前，人们对真菌和细菌的纤维素酶研究较多，而对放线菌纤维素酶的研究很少，并且纤维素酶的产量和活性都偏低。今后，应加强菌种选育和发酵工艺等基础研究工作，分离和筛选出高效纤维素分解菌群，并且用分子生物学手段进一步优化菌种，提高酶活。国内外学者对提高纤维素酶活性的方法都在逐渐探索阶段，主要集中在微生物分离、选育、产酶条件优化以及一些已知纤维素酶基因的克隆和异源表达，虽在培养条件优化和菌种分子改造方面初有成效，但没有一种方法能快速提高酶产量，大幅提高酶活性。纤维素酶的广泛应用对解决食品短缺、缓解能源危机、减少环境污染、加快工业进程等方面有重要的现实意义。如何筛选纤维素酶高产菌株、提高现有菌种的产酶能力，需要科研工作者们进一步的研究。摸索适合不同菌种的产酶工艺、保持酶活的稳定性是进一步研究的主要内容。通过不断的努力攻关，纤维素酶的成本会不断降低，直至实现生物燃料的工业化生产。
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