北京化工大学 分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备
一、实验目的
（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。
（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。
（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。
二、实验原理
质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。
碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部
分的大肠杆菌染色体DNA则无法完全复原而与SDSD-K+所含复合物一起沉淀下来，可离心去除，上清液所含质粒则可以乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)将其沉淀下来。
三、实验方法
1.仪器用具:
a. 无菌操作台(laminar flow)
b. 台式型离心机(microcentrifuge)
c. 微量吸管(pipetman)
d. 真空干燥机(speed vac)
e． 漩涡混合器
f． 琼脂糖凝胶电泳仪
2.材料:
实验前一天，将含质粒的大肠杆菌接种至含ampicillin (50 μg/ml)的LB培养液中，并在37 oC下振荡培养过夜。
3.药品及试剂:
a. Solution I: 25mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM glucose b. Solution II: 0.2M NaOH, 1% SDS (使用前以10 N NaOH与10% SDS稀释配制) c. Solution III: 3M醋酸钾溶液(KAc, pH 5.2)
d. RNase A: 1mg/ml
e. TE buffer: 10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
f. 100% 乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)
g. LB(Luria-Bertani)培养液: 10g tryptone, 5g yeaste extract, 10g NaCl in 1L h．酚/氯仿（1：1）溶液
i．1 x TAE电泳缓冲液：40 mM Tris-乙酸, 1mM EDTA（pH 8.0）
j .DNA marker：DL2000
4.实验步驟:
1) 将过夜菌液分別倒入1.5ml微量离心管中以10,000 rpm离心1分钟后，倒去上清液。
2) 沉淀菌体加入50 μl Solution I，用漩涡混合器剧烈振荡使菌体完全悬浮，置于冰上5分钟。
3) 加入100 μl Solution II，盖上管盖后将管子反复上下摇动3次，不可剧烈振荡，置于冰上5分钟。
4) 加入75 μl Solution III，亦温和摇匀，置于冰上5分钟。
5）加等体积酚：氯仿(1:1)225 μl混匀。
6) 以12,000 rpm 离心5分钟，小心吸取上清液至另一微量离心管中。
7) 加入2倍体积100% 酒精，混合均匀，置于冰上20分钟。
8) 以12,000 rpm 离心8分钟，倒掉上清液，加入70% 酒精清洗一次，置于真空干燥机中10分钟。
9) 加入15ul灭菌水，溶解DNA。
10）电泳检测（琼脂糖凝胶电泳），取5μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖,电泳半小时,电压80伏。
11）电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果。
四、注意事项
1．细菌培养过程要求无菌操作。抗菌素等不能高温灭菌，应使用细菌滤器过滤后使用。细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和Eppendorf离心管等有关用具和某些试剂须经高压灭菌处理。接触过细菌的器具用后应消毒灭菌再洗净。
2．制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡，以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。同时也应防止DNase引起DNA的降解。
3．酚氯仿有强腐蚀性，使用时要格外小心，不要弄到手上，必要时带手套。
4．加入乙酸钾溶液后，可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。
5．用酚/氯仿混合液除去蛋白效果比单度作用酚或氯仿更好。为充分除去残余的蛋白质，可以进行多次抽提，直至两相间无絮状蛋白沉淀。
6．提取的各步操作尽量在低温条件下进行（冰裕上）。
7．电泳时，电泳缓冲液要没过凝胶。
8. 在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：
共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋
开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子
线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子
质粒DNA的形态不一，电泳时在凝胶中的迁移率不同。超螺旋的质粒DNA一般迁移最快、开环（缺口）质粒DNA迁移最慢，线化DNA位于两者之间。本实验采用绿色荧光蛋白（GFP）对DNA进行染色，电泳显示有些脱尾，绿色荧光部分有一大片，可能是把染料直接加到质粒DNA中所致，所以我又将胶用EB（溴化乙锭）染色，紫外线照射下呈桔红色荧光，可由上图清除看到质粒DNA所在位置。
(a)松弛线性的DNA；(b)松弛开环的OC构型；(c)超螺旋的SC构型
实验二 PCR反应
一、实验目的
1、学习PCR 反应的基本原理与实验技术。
2、了解引物设计的一般要求。
二、实验原理
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片断的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片断，从而免除基因重组和分子克隆等一系列繁琐操作。由于这种方法操作简单、实用性强、灵敏度高并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。
PCR进行的基本条件是：
（1） 以DNA为模板（在RT-PCR中模板是RNA）；
（2） 以寡聚核苷酸为引物；
（3） 需要4种dNTP 作为底物；
（4） 有 Taq DNA 聚合酶。
PCR 每一个循环由三个步骤组成：
（1） 变性 加热模板DNA，使其解离成单链；
（2） 退火 降低温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板DNA 所需扩增序
列结合；
（3） 延伸 在适宜温度下，DNA 聚合酶利用dNTP 使引物3’端向前延伸，合成与模板碱基
序列完全互补的DNA链。
每一个循环产物可作为下一个循环的模板，因此通过35-45个循环后，目标片断的扩增可达106-107倍。
本实验扩增的片段约1.3kb，故需用LA TaqTM 扩增长片段。
三、 实验方法
1、仪器用具：
a．PCR 扩增仪
b．琼脂糖凝胶电泳仪
2、药品及试剂
a．LA TaqTM（5U/μl）购于Takara
b.10×反应缓冲液：0.67mol/l，pH = 8.8 Tris-HCl,0.067mol/l MgCl2，0.166mol/l
2SO4
c.dNTP(2.5mM)
d.引物P1，P2
3、实验步骤
4）（NH
1）PCR扩增体系
在150μl离心管中按体积有大到小加入下列试剂，最后加酶：
模板 0.5μl
引物P1 0.5μl
引物P2 0.5μl
dNTP 3 μl
10×buffer 2.5μl
LA Taq 0.5μl ddH2O 17.5μl
Total 25 μl
2）扩增程序
预变性 94℃ 5min
变性 94℃ 30s
退火 43℃ 30s
延伸 72℃ 2min
末端延伸 72℃ 10min
保存 16℃ 8h 30个循环
3）PCR产物电泳检测 反应结束后，取5μl PCR 产物用1% 的琼脂糖凝聚电泳检测，用GLP在紫外灯下检测。
四、注意事项
1、在加入各试剂时要先加体积大的试剂，再加体积小的试剂，并充分混合。
2、加Taq酶时要拿管的上部，避免用手触摸酶的部分。
3、PCR的影响因素：
（1）模板 单、双链 DNA 都可作为PCR的模板，若起始材料是RNA，需先通过逆转录反应得到一条cDNA。虽然PCR 可以用极度微量的样品甚至是来自于单一细胞的DNA，但为了保证反应
4得特异性，一般宜用ng级的克隆DNA，μg水平的染色体DNA 或10拷贝数量的待扩增片断来作
起始材料。原料可以是粗制制品，但不能混有蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制剂以及任何能结合DNA 的蛋白质。
（2） 引物 引物是决定PCR结果的关键。5’引物应与靶序列正链5’端序列相同，与负链3’端互补，3’端引物与正链3’端序列互补。较好的引物在结构和组成上应满足以下条件：①作PCR 引物的寡核苷酸至少应含有16个核苷酸，最好长达20-24个核苷酸，4种碱基分布较均匀，（G+C）含量约占50%。这种寡核苷酸在聚合反应温度（72℃）下不会形成稳定的杂合体。②引物不应有发夹结构，即不含有4个碱基对以上的回文序列。③ 两引物之间不应有大于4个碱基对的同源序列。④引物与靶序列的Tm(变性温度)不能低于55℃。
（3） 反应温度和时间 PCR 涉及变性、退火、延伸三个不同温度和时间。通常变性温度和时间为95℃，45秒至少1分钟，过高温度或持续时间过长会降低Taq DNA 聚合酶活性和破
坏dNTP 分子。退火温度可选择比变性温度（Tm）低2-3℃，变性温度按Tm=4（G+C）%+2（A+T）% 计算，在Tm值允许的范围内，较高的退火温度有利于提高PCR 特异性，退火时间一般为1-1.5 分钟。延伸温度为72℃，时间则与待扩增片断长度有关，一般1kb以内片断延伸时间为1分钟，如扩增片断较长可适当增加时间。
（4） Taq DNA 聚合酶 目前有两种Taq DNA 聚合酶供应：从噬热水生菌中提取的天然酶和
TM大肠杆菌合成的基因工程酶（Ampli Taq）。两种酶都有依赖于聚合作用的5’-3’外切酶
活性，但均缺乏3’-5’外切酶活性。在PCR 中，它们可以相互替代，催化典型的PCR 所需酶量为1-2.5单位。酶量偏少则PCR 产物相应减少，酶量过高则会增加非特异性反应。
（5） dNTP 浓度 dNTP在饱和浓度（200μmol/l）下使用。由于dNTP 溶液有较强酸性，配制时可用1 mol/l NaOH 溶液将其贮存液（50mmol/l）的pH 调至7.0-7.5。分装小管子-20℃保存。过多冻溶会使其降解。
（6） PCR 缓冲溶液 在反应体系中二价阳离子的存在至关重要，镁离子优于锰离子，而该离子无效。它对引物与模板的结合、产物特异性、错误率、引物二聚体的生成及酶的活性等方面有较大影响，镁离子浓度一般在0.5-2.5 mmol/l之间。每当首次使用靶序列和引物的一
2+种新组合时，尤其是调整Mg浓度至最佳。
实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备
一、 实验目的
（1）了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义。
（2）学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
二、 实验原理
质粒DNA需经过转化过程（Transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA的目的。进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（Calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞內。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4 °C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后給予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
三、实验方法
1.仪器用具：
a.37 °C恒温箱
b. spectrophotometer
c. 冰浴
d. 冷冻离心机
2.药品与试剂：
a．LB培养基
NaCl 10g/L
酵母提取物 5g/L
胰蛋白胨 10g/L
b．CaCl2溶液：1mol/L
3.实验步骤:
1）从新活化的E.coli DH5α菌平板挑取一个单菌落，接种于5 ml含LB液体培养基试管中，37℃摇菌培养12h左右至对数生长期；
2）将该菌悬液以1：50接种量转接于含有100ml LB液体培养基的三角瓶，37℃剧烈摇菌培养3-4h，至OD600达0.3-0.4；
3）将40ml细菌培养物无菌条件下转移至预冷的1.5 ml离心管中，冰浴30 min； 4）4℃，4000rpm离心10 min，弃上清，收集菌体沉淀；
5）加入700μl冰冷的0.1 mol/L-1 CaCl2重悬细胞，冰浴30 min；
6）4℃，4000rpm离心10 min，弃上清，收集菌体沉淀；
7）最后用300μl 0.1 mol/L-1 CaCl2重悬菌体沉淀，再加100μl 10 % 甘油，混匀后分
装速冻，-80℃贮存备用。（液氮）
四、注意事项
1、实验中凡涉及溶液的移取、分装等需敞开实验器皿的操作，均应在无菌超净台中进行，以防污染。
2、衡量受体菌生长情况的A600值和细胞数之间的关系随菌株的不同而不同，因此，不同菌株
的合适A600值是不同的。
3、悬浮菌体时不要剧烈推打枪头，要轻轻的悬浮菌体。
实验四 连接及重组质粒的转化
一、实验目的
1、了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义。
2、学习将外源质粒DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。
二、实验原理
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和
--甲基化酶的突变株，常用RM符合表示。受体细胞经过一些特殊方法（如：点击法，CaCl2，
RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。在一定条件下，将外源DNA分子与感受态细胞混合保温，使外源DNA分子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养即可筛选出转化体（即带有异源DNA分子的受体细胞 transformant）。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2 处理受体菌使其处于感受态，然后与
pMD18-T载体共保温，实现转化。
pMD18-T Vector
是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体。这种载体是由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3'端添加 "T" 而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个 "A" 的特性，所以使用这两种制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
该载体携带有抗氨苄青霉素基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉素的特性，同时还能进行蓝白斑筛选，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
三、实验方法
1.仪器用具：
a.37 °C恒温箱
b. 分光光度计
c. 冰浴
d. 冷冻离心机
2.材料：
DH5α
3．实验步骤：
(1) 连接体系
pMD18-T vector 0.1 μl
目的基因 1.5 μl
Mix ligation 2.5 μl
ddH2O 0.9 μl
16℃连接2-3h。
(2) 取出-70℃冻存的DH5α感受态细胞，置冰上使其缓慢融化，轻弹管壁使细胞混合均
匀；
(3) 开盖前将连接产物离心至管底，于冰上吸取5 μl连接物加入到100μl感受态细胞
中；
(4) 此时要避免过多的吸吹、移液，轻轻混匀细胞 (用手轻轻弹管壁3、4下)，立即置
冰上20 min；
(5) 将管置42℃恒温水浴中热激90s，立即放回冰上2 min；
(6) 加入800 μl无附加抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃预表达培养1.5 （~150rpm）h；
(7) 吸取200 μl菌液涂布于LB/Amp/IPTG/X-Gal平板上，37℃保温培养约16-24 h，观
察菌落生长情况，利用蓝白斑初筛重组转化体。
(8) 第2天早上取出此2 plates，观察并记录菌落数目，以计算所制备感受态细胞的转
化效率。
转化细胞效率（transformation efficiency）= 第2 plate菌数 × 50（稀释倍数） × 105（由pg換算回μg）
四、注意事项
为提高转化率：实验中要注意以下几个重要因素：
①细胞生长状态和密度
不要用已经过多次转接，及贮存在4°C的培养菌液；细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为最佳（可通过测定培养液的A600控制），密度不足或过高均会使
转化率下降。
②转化的质粒DNA的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主要是共价闭环DNA（即cccDNA，又称超螺旋DNA），转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大则会使转化率下降。
③试剂的质量
所用的试剂，如CaCl2等，应是高质量的，且最好分装保存于干燥的暗处。
④防止染菌和其他外源DNA 污染
所用器皿，如离心管、分装用的eppendorf 管等，一定要干净，最好是新的。整个实验过程中要注意无菌操作，少量其他试剂或DNA的污染都会影响转化率，或是转进了杂DNA。
实验五 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、实验目的
1、 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
2、 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
二、实验原理
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
SDS－PAGE 是在要走电泳的样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的样品处理液，SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后，要在沸水浴中煮3～5 min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质－SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。
制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，例如通常使用的15％的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是104～105，即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶，而分子量大于105的蛋白质则难以通过凝胶孔径，这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质，需要使用低浓度如10％或7.5%的凝胶（孔径较大）；而对于分离较小的蛋白质，使用的较高浓度凝胶（孔径较小）可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶（约1 cm），并在浓缩上插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶，由于浓缩胶具有较大的孔径（丙烯酰胺浓度通常为3～5％），各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常pH值较低（通常pH =
6.8），用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的
Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。电极缓冲液的pH = 8.3，用Tris、SDS和甘氨酸配制。配胶的缓冲液用Tris、SDS和HCl配制。
样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl、甘氨酸阴离子以及蛋白质－SDS复合物，在浓缩胶的pH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl－的电泳迁移率最
－－大。在电场的作用下，Cl最初的迁移速度最快，这样在Cl后面形成低离子浓度区域，即低
－电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl后面的离子在较高的电场强度作用下会－
加速移动。达到稳定状态后，Cl－和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质－SDS复合物
－由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl的界面附近而被浓缩成很窄的区带（可以被浓缩三百
倍），所以在浓缩胶中Cl－是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。
当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的pH值（通常pH = 8.8）较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质－SDS复合物，甘氨酸和Cl－的界面很快超过蛋白质－SDS复合物。这时蛋白质－SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置。当指示剂到达凝胶底部时，停止电泳，从平板中取出凝胶。在适当的染色液中（如通常使用的考马斯亮蓝）染色几个小时，而后过夜脱色。脱色液去除凝胶中未与蛋白结合的背底染料，这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋白质区带。通常凝胶制备需要1～1.5小时，电泳在25～30mA下通常需要3小时，染色2～3小时，过夜脱色。通常使用的垂直平板电泳可以同时进行多个样品的电泳。
Ornstein和Davis设计的高pH碱性不连续系统，有其独特的特点。根据Henderson-Hasselbalch公式：
α
1－α
式中的“α”是缓冲液中各种分子的离解度。由上式可以看出：① 浓缩胶的pH（6.8）pH=pKa+lg小于慢离子甘氨酸的pKa（9.8）3个pH左右，所以 α≈ 0.001，即在浓缩胶中甘氨酸只有0.1％离解，因此在电场中迁移很慢，是慢离子。② 快离子Cl－由于几乎全部离解，电泳迁移率最大，不受pH变化的影响。③ 分离胶的pH（8.8）小于慢离子的pKa 一个pH左右，α≈ 0.1，所以在分离胶中甘氨酸离解加大，电泳迁移率加大，就赶到蛋白质带的前面。
此外还可以总结出该系统的特点有：④ 电极缓冲液中共轭碱Tris的pKa小于分离胶的
，以pH约１个pH，使其缓冲能力大。⑤电极缓冲液的pH为8.3，相近于Tris的pKa（8.1）
便获得最大的缓冲能力。
在同一凝胶上对一系列已SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定，
，并知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离（或迁移率）
对各自分子量的对数（log Mr）作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离（或迁移率），通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。
纯化的蛋白质通常在SDSSDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，
电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。
影响电泳分离的因素很多，下面简单讨论一些主要的影响因素：
1. 待分离生物大分子的性质
待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。
2. 缓冲液的性质
缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响，溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.02－0.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。
3. 电场强度
电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功（W）为：
W=I2.R.t
上式中：I为电流强度，R为电阻，t为电泳时间。
电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响： ①样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；②产生对流，引起待分离物的混合；③如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；④引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。
4. 电渗
液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。
5. 支持介质的筛孔
支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。
三、 实验方法
1、试剂
制备分离胶（pH 8.8）
凝胶浓度 8% 10% 12.5%
30:0.8% w/v丙烯酰胺:双丙烯酰胺
1.0M Tris-Cl pH 8.8
20% SDS
dH2O
混合，灌胶前加入APS和TEMED
10% APS 2 ml 3 ml 2.5 ml 3 ml 3.1 ml 3 ml 38 μl 38 μl 38 μl 2.43 ml 1.9 ml 1.3 ml 36 μl 36 μl 36 μl
TEMED 5 μl 5 μl 5 μl
总体积
7.5 ml 7.5 ml 7.5 ml
制备浓缩胶（pH 6.8）
积层胶浓度 4% 6%
30:0.8% w/v 丙烯酰胺:双丙烯酰胺
1M Tris-Cl pH6.8
20% SDS
dH2O
混合，灌胶前加入APS和TEMED
10% APS 660 μl 1 ml 630 μl 630 μl 25 μl 25 μl 3.6 ml 3.6 ml μl 25 μl 25
TEMED 5 μl 5 μl
总体积 5 ml 5 ml
3×SDS上样缓冲液配制：187.5 mM Tris-HCL（pH 6.8，置于25℃）,6% w/v SDS，30% glycerol,150 mM DTT,0.03% 溴酚蓝
1×转移缓冲液配制：25 mM Tris碱，0.2 M甘氨酸，20%甲醇（pH 8.5）
2、 器材
a.垂直板电泳槽，
b.直流稳压电源（电压300－600V，电流50－100mA），
c.烧杯（25，50，100ml），
d.细长头的滴管，
e.微量注射器（10µL或者50µL），
f.玻璃板（13*13cm）
3实验步骤
①擦净玻璃杯，用凡士林将密封胶条涂上凡士林，不要太多。
②将分离胶和浓缩胶的成分除了过硫酸铵和TEMED两样，其余全加好，灌胶前再加。用滴管将配制好的溶液缓慢加入到装配好的板中至凝胶高度为6 cm左右，预留1.5 cm高度配制积层胶。每板凝胶溶液上灌入去离子水，放置1小时左右至聚合完全。
③使用Whatman 3 mm滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液，如上配制积层胶。用10 ml注射器将积层胶加入板中至顶端，小心插入梳子，注意不要产生气泡。凝胶聚合1小时左右。 ④凝胶电泳前，拔去梳子，每孔均用1×电泳缓冲液清洗。上、下层电泳槽中加入1×电泳缓冲液，上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端1 - 2 cm。
⑤准备样品液：样品（40 – 60 μg总蛋白或10 – 20 μg核蛋白）与3×上样缓冲液2:1混合，煮沸3分钟。
⑥将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准（使用生物素标记的分子量标准可以方便地在化学发光检测样品目的蛋白的同时也检测到相应的分子量标准，能更直观地判断目的蛋白大小）。分别上样，标准加进第一个孔中。
⑦电泳：样品首先在60V恒定电压下电泳至染料接近分离胶顶端。然后150恒定电压电泳至溴酚蓝刚出胶底部。凝胶电泳于4℃。
⑧染色 将凝胶放入0.05%考马斯亮蓝R250（内含20％磺基水杨酸）染色液中，使染色液没过胶板，染色30min左右。
⑨脱色 用7％乙酸浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去。如用50℃水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间。脱色液经活性炭脱色后，可反复使用。
四、注意事项
(1) 制备凝胶应选用高纯度的试剂，否则会影响凝胶聚合与电泳效果。
Acr和Bis是制备凝胶的关键试剂，如含有丙烯酸或其它杂质，则造成凝胶聚合时间延长，聚合不均匀或不聚合，应将它们分别纯化后方能使用。
Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，实验表明对小鼠的半致死剂量为170mg/1kg，操作时应戴手套和口罩，纯化应在通风橱内进行。
Acr和Bis的贮液在保存过程中，由于水解的作用而形成丙烯酸和NH3，虽然溶液放在棕色
试剂瓶中，4℃贮存能部分防止水解，但也只能贮存1－2个月，可测pH值（4.9－5.2）来检查试剂是否失效。
(2) 由于与凝胶聚合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；拨胶时凝胶板易断裂，为防止此现象，所用器材均应严格的清洗。硅橡胶条的凹槽、样品模槽板及电泳槽用泡沫海绵蘸取洗洁净仔细清洗。玻璃板浸泡在重铬酸钾洗液3－4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗净，再用泡沫海绵蘸取洗洁净反复清洗，最后用蒸馏水冲洗，直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。
(3) 安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力或用一旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。样品槽模板梳齿应平整光滑。
(4) 用琼脂封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。
(5) 凝胶完全聚合后，必须放置30min 至1h，使其充分老化后才能轻轻取出样品模槽板，
切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。
（6） 为防止电泳后区带拖尾，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的样品可用透析法或凝胶过滤法脱盐。最大加样量不得超过100µg蛋白／100℃µL
（7）在不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶聚合后进行，洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后，不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。
（8） 电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。
（9）电泳后，应分别收集上下贮槽的电泳缓冲液，在冰箱贮存，可用2－3次。为保证电泳结果满意，虽好使用新稀释的缓冲液。
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2011年度分子生物学实验行课时间表
时间：5月2日~6月5日
上午 （8:00-12:00）
周一
周二
周三
周四
周五 生物技术
周六
周日 生物工程实验班
下午 生物工（13：00-17：00） 程 晚间 生物工（17：30-22：30） 程
制药工
程 制药工程
2011年度分子生物学实验实验课程表
周次
12（5月2日 — 8日） 13（5月9日 — 15日） 14（5月16日 — 22日）
质粒提取 凝胶电泳和PCR
凝胶电泳，PCR产物回收和连接
内容
任课教师 王文雅 王雅琴 刘长霞 吕杰 罗施中
助研 王艳 封晓霞 孙继国 武淑娇 魏鹏
15（5月23日 — 5月29日） 大肠杆菌感受态的制备和转化 16（5月30日—6月 5日）蛋白电泳
北京化工大学 分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备
一、实验目的
（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。
（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。
（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。
二、实验原理
质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。
碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部
分的大肠杆菌染色体DNA则无法完全复原而与SDSD-K+所含复合物一起沉淀下来，可离心去除，上清液所含质粒则可以乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)将其沉淀下来。
三、实验方法
1.仪器用具:
a. 无菌操作台(laminar flow)
b. 台式型离心机(microcentrifuge)
c. 微量吸管(pipetman)
d. 真空干燥机(speed vac)
e． 漩涡混合器
f． 琼脂糖凝胶电泳仪
2.材料:
实验前一天，将含质粒的大肠杆菌接种至含ampicillin (50 μg/ml)的LB培养液中，并在37 oC下振荡培养过夜。
3.药品及试剂:
a. Solution I: 25mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM glucose b. Solution II: 0.2M NaOH, 1% SDS (使用前以10 N NaOH与10% SDS稀释配制) c. Solution III: 3M醋酸钾溶液(KAc, pH 5.2)
d. RNase A: 1mg/ml
e. TE buffer: 10mM Tris-HCl(pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0)
f. 100% 乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)
g. LB(Luria-Bertani)培养液: 10g tryptone, 5g yeaste extract, 10g NaCl in 1L h．酚/氯仿（1：1）溶液
i．1 x TAE电泳缓冲液：40 mM Tris-乙酸, 1mM EDTA（pH 8.0）
j .DNA marker：DL2000
4.实验步驟:
1) 将过夜菌液分別倒入1.5ml微量离心管中以10,000 rpm离心1分钟后，倒去上清液。
2) 沉淀菌体加入50 μl Solution I，用漩涡混合器剧烈振荡使菌体完全悬浮，置于冰上5分钟。
3) 加入100 μl Solution II，盖上管盖后将管子反复上下摇动3次，不可剧烈振荡，置于冰上5分钟。
4) 加入75 μl Solution III，亦温和摇匀，置于冰上5分钟。
5）加等体积酚：氯仿(1:1)225 μl混匀。
6) 以12,000 rpm 离心5分钟，小心吸取上清液至另一微量离心管中。
7) 加入2倍体积100% 酒精，混合均匀，置于冰上20分钟。
8) 以12,000 rpm 离心8分钟，倒掉上清液，加入70% 酒精清洗一次，置于真空干燥机中10分钟。
9) 加入15ul灭菌水，溶解DNA。
10）电泳检测（琼脂糖凝胶电泳），取5μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖,电泳半小时,电压80伏。
11）电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果。
四、注意事项
1．细菌培养过程要求无菌操作。抗菌素等不能高温灭菌，应使用细菌滤器过滤后使用。细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和Eppendorf离心管等有关用具和某些试剂须经高压灭菌处理。接触过细菌的器具用后应消毒灭菌再洗净。
2．制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡，以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。同时也应防止DNase引起DNA的降解。
3．酚氯仿有强腐蚀性，使用时要格外小心，不要弄到手上，必要时带手套。
4．加入乙酸钾溶液后，可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。
5．用酚/氯仿混合液除去蛋白效果比单度作用酚或氯仿更好。为充分除去残余的蛋白质，可以进行多次抽提，直至两相间无絮状蛋白沉淀。
6．提取的各步操作尽量在低温条件下进行（冰裕上）。
7．电泳时，电泳缓冲液要没过凝胶。
8. 在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：
共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋
开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子
线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子
质粒DNA的形态不一，电泳时在凝胶中的迁移率不同。超螺旋的质粒DNA一般迁移最快、开环（缺口）质粒DNA迁移最慢，线化DNA位于两者之间。本实验采用绿色荧光蛋白（GFP）对DNA进行染色，电泳显示有些脱尾，绿色荧光部分有一大片，可能是把染料直接加到质粒DNA中所致，所以我又将胶用EB（溴化乙锭）染色，紫外线照射下呈桔红色荧光，可由上图清除看到质粒DNA所在位置。
(a)松弛线性的DNA；(b)松弛开环的OC构型；(c)超螺旋的SC构型
实验二 PCR反应
一、实验目的
1、学习PCR 反应的基本原理与实验技术。
2、了解引物设计的一般要求。
二、实验原理
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）是体外酶促合成特异DNA片断的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片断，从而免除基因重组和分子克隆等一系列繁琐操作。由于这种方法操作简单、实用性强、灵敏度高并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用。
PCR进行的基本条件是：
（1） 以DNA为模板（在RT-PCR中模板是RNA）；
（2） 以寡聚核苷酸为引物；
（3） 需要4种dNTP 作为底物；
（4） 有 Taq DNA 聚合酶。
PCR 每一个循环由三个步骤组成：
（1） 变性 加热模板DNA，使其解离成单链；
（2） 退火 降低温度，使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板DNA 所需扩增序
列结合；
（3） 延伸 在适宜温度下，DNA 聚合酶利用dNTP 使引物3’端向前延伸，合成与模板碱基
序列完全互补的DNA链。
每一个循环产物可作为下一个循环的模板，因此通过35-45个循环后，目标片断的扩增可达106-107倍。
本实验扩增的片段约1.3kb，故需用LA TaqTM 扩增长片段。
三、 实验方法
1、仪器用具：
a．PCR 扩增仪
b．琼脂糖凝胶电泳仪
2、药品及试剂
a．LA TaqTM（5U/μl）购于Takara
b.10×反应缓冲液：0.67mol/l，pH = 8.8 Tris-HCl,0.067mol/l MgCl2，0.166mol/l
2SO4
c.dNTP(2.5mM)
d.引物P1，P2
3、实验步骤
4）（NH
1）PCR扩增体系
在150μl离心管中按体积有大到小加入下列试剂，最后加酶：
模板 0.5μl
引物P1 0.5μl
引物P2 0.5μl
dNTP 3 μl
10×buffer 2.5μl
LA Taq 0.5μl ddH2O 17.5μl
Total 25 μl
2）扩增程序
预变性 94℃ 5min
变性 94℃ 30s
退火 43℃ 30s
延伸 72℃ 2min
末端延伸 72℃ 10min
保存 16℃ 8h 30个循环
3）PCR产物电泳检测 反应结束后，取5μl PCR 产物用1% 的琼脂糖凝聚电泳检测，用GLP在紫外灯下检测。
四、注意事项
1、在加入各试剂时要先加体积大的试剂，再加体积小的试剂，并充分混合。
2、加Taq酶时要拿管的上部，避免用手触摸酶的部分。
3、PCR的影响因素：
（1）模板 单、双链 DNA 都可作为PCR的模板，若起始材料是RNA，需先通过逆转录反应得到一条cDNA。虽然PCR 可以用极度微量的样品甚至是来自于单一细胞的DNA，但为了保证反应
4得特异性，一般宜用ng级的克隆DNA，μg水平的染色体DNA 或10拷贝数量的待扩增片断来作
起始材料。原料可以是粗制制品，但不能混有蛋白酶、核酸酶、Taq DNA 聚合酶抑制剂以及任何能结合DNA 的蛋白质。
（2） 引物 引物是决定PCR结果的关键。5’引物应与靶序列正链5’端序列相同，与负链3’端互补，3’端引物与正链3’端序列互补。较好的引物在结构和组成上应满足以下条件：①作PCR 引物的寡核苷酸至少应含有16个核苷酸，最好长达20-24个核苷酸，4种碱基分布较均匀，（G+C）含量约占50%。这种寡核苷酸在聚合反应温度（72℃）下不会形成稳定的杂合体。②引物不应有发夹结构，即不含有4个碱基对以上的回文序列。③ 两引物之间不应有大于4个碱基对的同源序列。④引物与靶序列的Tm(变性温度)不能低于55℃。
（3） 反应温度和时间 PCR 涉及变性、退火、延伸三个不同温度和时间。通常变性温度和时间为95℃，45秒至少1分钟，过高温度或持续时间过长会降低Taq DNA 聚合酶活性和破
坏dNTP 分子。退火温度可选择比变性温度（Tm）低2-3℃，变性温度按Tm=4（G+C）%+2（A+T）% 计算，在Tm值允许的范围内，较高的退火温度有利于提高PCR 特异性，退火时间一般为1-1.5 分钟。延伸温度为72℃，时间则与待扩增片断长度有关，一般1kb以内片断延伸时间为1分钟，如扩增片断较长可适当增加时间。
（4） Taq DNA 聚合酶 目前有两种Taq DNA 聚合酶供应：从噬热水生菌中提取的天然酶和
TM大肠杆菌合成的基因工程酶（Ampli Taq）。两种酶都有依赖于聚合作用的5’-3’外切酶
活性，但均缺乏3’-5’外切酶活性。在PCR 中，它们可以相互替代，催化典型的PCR 所需酶量为1-2.5单位。酶量偏少则PCR 产物相应减少，酶量过高则会增加非特异性反应。
（5） dNTP 浓度 dNTP在饱和浓度（200μmol/l）下使用。由于dNTP 溶液有较强酸性，配制时可用1 mol/l NaOH 溶液将其贮存液（50mmol/l）的pH 调至7.0-7.5。分装小管子-20℃保存。过多冻溶会使其降解。
（6） PCR 缓冲溶液 在反应体系中二价阳离子的存在至关重要，镁离子优于锰离子，而该离子无效。它对引物与模板的结合、产物特异性、错误率、引物二聚体的生成及酶的活性等方面有较大影响，镁离子浓度一般在0.5-2.5 mmol/l之间。每当首次使用靶序列和引物的一
2+种新组合时，尤其是调整Mg浓度至最佳。
实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备
一、 实验目的
（1）了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义。
（2）学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
二、 实验原理
质粒DNA需经过转化过程（Transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA的目的。进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（Calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞內。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4 °C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后給予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
三、实验方法
1.仪器用具：
a.37 °C恒温箱
b. spectrophotometer
c. 冰浴
d. 冷冻离心机
2.药品与试剂：
a．LB培养基
NaCl 10g/L
酵母提取物 5g/L
胰蛋白胨 10g/L
b．CaCl2溶液：1mol/L
3.实验步骤:
1）从新活化的E.coli DH5α菌平板挑取一个单菌落，接种于5 ml含LB液体培养基试管中，37℃摇菌培养12h左右至对数生长期；
2）将该菌悬液以1：50接种量转接于含有100ml LB液体培养基的三角瓶，37℃剧烈摇菌培养3-4h，至OD600达0.3-0.4；
3）将40ml细菌培养物无菌条件下转移至预冷的1.5 ml离心管中，冰浴30 min； 4）4℃，4000rpm离心10 min，弃上清，收集菌体沉淀；
5）加入700μl冰冷的0.1 mol/L-1 CaCl2重悬细胞，冰浴30 min；
6）4℃，4000rpm离心10 min，弃上清，收集菌体沉淀；
7）最后用300μl 0.1 mol/L-1 CaCl2重悬菌体沉淀，再加100μl 10 % 甘油，混匀后分
装速冻，-80℃贮存备用。（液氮）
四、注意事项
1、实验中凡涉及溶液的移取、分装等需敞开实验器皿的操作，均应在无菌超净台中进行，以防污染。
2、衡量受体菌生长情况的A600值和细胞数之间的关系随菌株的不同而不同，因此，不同菌株
的合适A600值是不同的。
3、悬浮菌体时不要剧烈推打枪头，要轻轻的悬浮菌体。
实验四 连接及重组质粒的转化
一、实验目的
1、了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义。
2、学习将外源质粒DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。
二、实验原理
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和
--甲基化酶的突变株，常用RM符合表示。受体细胞经过一些特殊方法（如：点击法，CaCl2，
RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。在一定条件下，将外源DNA分子与感受态细胞混合保温，使外源DNA分子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养即可筛选出转化体（即带有异源DNA分子的受体细胞 transformant）。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2 处理受体菌使其处于感受态，然后与
pMD18-T载体共保温，实现转化。
pMD18-T Vector
是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体。这种载体是由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点，用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3'端添加 "T" 而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个 "A" 的特性，所以使用这两种制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
该载体携带有抗氨苄青霉素基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉素的特性，同时还能进行蓝白斑筛选，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
三、实验方法
1.仪器用具：
a.37 °C恒温箱
b. 分光光度计
c. 冰浴
d. 冷冻离心机
2.材料：
DH5α
3．实验步骤：
(1) 连接体系
pMD18-T vector 0.1 μl
目的基因 1.5 μl
Mix ligation 2.5 μl
ddH2O 0.9 μl
16℃连接2-3h。
(2) 取出-70℃冻存的DH5α感受态细胞，置冰上使其缓慢融化，轻弹管壁使细胞混合均
匀；
(3) 开盖前将连接产物离心至管底，于冰上吸取5 μl连接物加入到100μl感受态细胞
中；
(4) 此时要避免过多的吸吹、移液，轻轻混匀细胞 (用手轻轻弹管壁3、4下)，立即置
冰上20 min；
(5) 将管置42℃恒温水浴中热激90s，立即放回冰上2 min；
(6) 加入800 μl无附加抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃预表达培养1.5 （~150rpm）h；
(7) 吸取200 μl菌液涂布于LB/Amp/IPTG/X-Gal平板上，37℃保温培养约16-24 h，观
察菌落生长情况，利用蓝白斑初筛重组转化体。
(8) 第2天早上取出此2 plates，观察并记录菌落数目，以计算所制备感受态细胞的转
化效率。
转化细胞效率（transformation efficiency）= 第2 plate菌数 × 50（稀释倍数） × 105（由pg換算回μg）
四、注意事项
为提高转化率：实验中要注意以下几个重要因素：
①细胞生长状态和密度
不要用已经过多次转接，及贮存在4°C的培养菌液；细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为最佳（可通过测定培养液的A600控制），密度不足或过高均会使
转化率下降。
②转化的质粒DNA的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主要是共价闭环DNA（即cccDNA，又称超螺旋DNA），转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大则会使转化率下降。
③试剂的质量
所用的试剂，如CaCl2等，应是高质量的，且最好分装保存于干燥的暗处。
④防止染菌和其他外源DNA 污染
所用器皿，如离心管、分装用的eppendorf 管等，一定要干净，最好是新的。整个实验过程中要注意无菌操作，少量其他试剂或DNA的污染都会影响转化率，或是转进了杂DNA。
实验五 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
一、实验目的
1、 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
2、 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
二、实验原理
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
SDS－PAGE 是在要走电泳的样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的样品处理液，SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂β-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后，要在沸水浴中煮3～5 min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质－SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。
制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，例如通常使用的15％的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是104～105，即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶，而分子量大于105的蛋白质则难以通过凝胶孔径，这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质，需要使用低浓度如10％或7.5%的凝胶（孔径较大）；而对于分离较小的蛋白质，使用的较高浓度凝胶（孔径较小）可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶（约1 cm），并在浓缩上插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶，由于浓缩胶具有较大的孔径（丙烯酰胺浓度通常为3～5％），各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常pH值较低（通常pH =
6.8），用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的
Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。电极缓冲液的pH = 8.3，用Tris、SDS和甘氨酸配制。配胶的缓冲液用Tris、SDS和HCl配制。
样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl、甘氨酸阴离子以及蛋白质－SDS复合物，在浓缩胶的pH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl－的电泳迁移率最
－－大。在电场的作用下，Cl最初的迁移速度最快，这样在Cl后面形成低离子浓度区域，即低
－电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl后面的离子在较高的电场强度作用下会－
加速移动。达到稳定状态后，Cl－和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质－SDS复合物
－由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl的界面附近而被浓缩成很窄的区带（可以被浓缩三百
倍），所以在浓缩胶中Cl－是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。
当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的pH值（通常pH = 8.8）较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质－SDS复合物，甘氨酸和Cl－的界面很快超过蛋白质－SDS复合物。这时蛋白质－SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置。当指示剂到达凝胶底部时，停止电泳，从平板中取出凝胶。在适当的染色液中（如通常使用的考马斯亮蓝）染色几个小时，而后过夜脱色。脱色液去除凝胶中未与蛋白结合的背底染料，这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋白质区带。通常凝胶制备需要1～1.5小时，电泳在25～30mA下通常需要3小时，染色2～3小时，过夜脱色。通常使用的垂直平板电泳可以同时进行多个样品的电泳。
Ornstein和Davis设计的高pH碱性不连续系统，有其独特的特点。根据Henderson-Hasselbalch公式：
α
1－α
式中的“α”是缓冲液中各种分子的离解度。由上式可以看出：① 浓缩胶的pH（6.8）pH=pKa+lg小于慢离子甘氨酸的pKa（9.8）3个pH左右，所以 α≈ 0.001，即在浓缩胶中甘氨酸只有0.1％离解，因此在电场中迁移很慢，是慢离子。② 快离子Cl－由于几乎全部离解，电泳迁移率最大，不受pH变化的影响。③ 分离胶的pH（8.8）小于慢离子的pKa 一个pH左右，α≈ 0.1，所以在分离胶中甘氨酸离解加大，电泳迁移率加大，就赶到蛋白质带的前面。
此外还可以总结出该系统的特点有：④ 电极缓冲液中共轭碱Tris的pKa小于分离胶的
，以pH约１个pH，使其缓冲能力大。⑤电极缓冲液的pH为8.3，相近于Tris的pKa（8.1）
便获得最大的缓冲能力。
在同一凝胶上对一系列已SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定，
，并知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离（或迁移率）
对各自分子量的对数（log Mr）作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离（或迁移率），通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。
纯化的蛋白质通常在SDSSDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，
电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。
影响电泳分离的因素很多，下面简单讨论一些主要的影响因素：
1. 待分离生物大分子的性质
待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。
2. 缓冲液的性质
缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响，溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.02－0.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。
3. 电场强度
电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功（W）为：
W=I2.R.t
上式中：I为电流强度，R为电阻，t为电泳时间。
电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响： ①样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；②产生对流，引起待分离物的混合；③如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；④引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。
4. 电渗
液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。
5. 支持介质的筛孔
支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。
三、 实验方法
1、试剂
制备分离胶（pH 8.8）
凝胶浓度 8% 10% 12.5%
30:0.8% w/v丙烯酰胺:双丙烯酰胺
1.0M Tris-Cl pH 8.8
20% SDS
dH2O
混合，灌胶前加入APS和TEMED
10% APS 2 ml 3 ml 2.5 ml 3 ml 3.1 ml 3 ml 38 μl 38 μl 38 μl 2.43 ml 1.9 ml 1.3 ml 36 μl 36 μl 36 μl
TEMED 5 μl 5 μl 5 μl
总体积
7.5 ml 7.5 ml 7.5 ml
制备浓缩胶（pH 6.8）
积层胶浓度 4% 6%
30:0.8% w/v 丙烯酰胺:双丙烯酰胺
1M Tris-Cl pH6.8
20% SDS
dH2O
混合，灌胶前加入APS和TEMED
10% APS 660 μl 1 ml 630 μl 630 μl 25 μl 25 μl 3.6 ml 3.6 ml μl 25 μl 25
TEMED 5 μl 5 μl
总体积 5 ml 5 ml
3×SDS上样缓冲液配制：187.5 mM Tris-HCL（pH 6.8，置于25℃）,6% w/v SDS，30% glycerol,150 mM DTT,0.03% 溴酚蓝
1×转移缓冲液配制：25 mM Tris碱，0.2 M甘氨酸，20%甲醇（pH 8.5）
2、 器材
a.垂直板电泳槽，
b.直流稳压电源（电压300－600V，电流50－100mA），
c.烧杯（25，50，100ml），
d.细长头的滴管，
e.微量注射器（10µL或者50µL），
f.玻璃板（13*13cm）
3实验步骤
①擦净玻璃杯，用凡士林将密封胶条涂上凡士林，不要太多。
②将分离胶和浓缩胶的成分除了过硫酸铵和TEMED两样，其余全加好，灌胶前再加。用滴管将配制好的溶液缓慢加入到装配好的板中至凝胶高度为6 cm左右，预留1.5 cm高度配制积层胶。每板凝胶溶液上灌入去离子水，放置1小时左右至聚合完全。
③使用Whatman 3 mm滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液，如上配制积层胶。用10 ml注射器将积层胶加入板中至顶端，小心插入梳子，注意不要产生气泡。凝胶聚合1小时左右。 ④凝胶电泳前，拔去梳子，每孔均用1×电泳缓冲液清洗。上、下层电泳槽中加入1×电泳缓冲液，上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端1 - 2 cm。
⑤准备样品液：样品（40 – 60 μg总蛋白或10 – 20 μg核蛋白）与3×上样缓冲液2:1混合，煮沸3分钟。
⑥将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准（使用生物素标记的分子量标准可以方便地在化学发光检测样品目的蛋白的同时也检测到相应的分子量标准，能更直观地判断目的蛋白大小）。分别上样，标准加进第一个孔中。
⑦电泳：样品首先在60V恒定电压下电泳至染料接近分离胶顶端。然后150恒定电压电泳至溴酚蓝刚出胶底部。凝胶电泳于4℃。
⑧染色 将凝胶放入0.05%考马斯亮蓝R250（内含20％磺基水杨酸）染色液中，使染色液没过胶板，染色30min左右。
⑨脱色 用7％乙酸浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去。如用50℃水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间。脱色液经活性炭脱色后，可反复使用。
四、注意事项
(1) 制备凝胶应选用高纯度的试剂，否则会影响凝胶聚合与电泳效果。
Acr和Bis是制备凝胶的关键试剂，如含有丙烯酸或其它杂质，则造成凝胶聚合时间延长，聚合不均匀或不聚合，应将它们分别纯化后方能使用。
Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，实验表明对小鼠的半致死剂量为170mg/1kg，操作时应戴手套和口罩，纯化应在通风橱内进行。
Acr和Bis的贮液在保存过程中，由于水解的作用而形成丙烯酸和NH3，虽然溶液放在棕色
试剂瓶中，4℃贮存能部分防止水解，但也只能贮存1－2个月，可测pH值（4.9－5.2）来检查试剂是否失效。
(2) 由于与凝胶聚合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净，在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离，产生气泡或滑胶；拨胶时凝胶板易断裂，为防止此现象，所用器材均应严格的清洗。硅橡胶条的凹槽、样品模槽板及电泳槽用泡沫海绵蘸取洗洁净仔细清洗。玻璃板浸泡在重铬酸钾洗液3－4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗净，再用泡沫海绵蘸取洗洁净反复清洗，最后用蒸馏水冲洗，直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。
(3) 安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时，位置要端正，均匀用力或用一旋紧固定螺丝，以免缓冲液渗漏。样品槽模板梳齿应平整光滑。
(4) 用琼脂封底及灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。
(5) 凝胶完全聚合后，必须放置30min 至1h，使其充分老化后才能轻轻取出样品模槽板，
切勿破坏加样凹槽底部的平整，以免电泳后区带扭曲。
（6） 为防止电泳后区带拖尾，样品中盐离子强度应尽量低，含盐量高的样品可用透析法或凝胶过滤法脱盐。最大加样量不得超过100µg蛋白／100℃µL
（7）在不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶聚合后进行，洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后，不能进行预电泳，以充分利用浓缩胶的浓缩效应。
（8） 电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。
（9）电泳后，应分别收集上下贮槽的电泳缓冲液，在冰箱贮存，可用2－3次。为保证电泳结果满意，虽好使用新稀释的缓冲液。
21
2011年度分子生物学实验行课时间表
时间：5月2日~6月5日
上午 （8:00-12:00）
周一
周二
周三
周四
周五 生物技术
周六
周日 生物工程实验班
下午 生物工（13：00-17：00） 程 晚间 生物工（17：30-22：30） 程
制药工
程 制药工程
2011年度分子生物学实验实验课程表
周次
12（5月2日 — 8日） 13（5月9日 — 15日） 14（5月16日 — 22日）
质粒提取 凝胶电泳和PCR
凝胶电泳，PCR产物回收和连接
内容
任课教师 王文雅 王雅琴 刘长霞 吕杰 罗施中
助研 王艳 封晓霞 孙继国 武淑娇 魏鹏
15（5月23日 — 5月29日） 大肠杆菌感受态的制备和转化 16（5月30日—6月 5日）蛋白电泳