荧光分析法
一、概述
有些物质的分子或原子吸收了相应的能量被激发至较高能量的激发态后，在返回基态的过程中伴随着光的辐射，这种现象称为分子或原子发光。荧光或磷光分析一般是指分子吸收光能而发光的分析；因吸收化学反应或生物体释放的能量激发而发光的分析称为化学或生物化学发光分析。由于物质结构的不同，所吸收的能量和发射光的波长就有所不同，据此可进行定性分析；同一种物质，在相同条件下，浓度不同，发光强度不同，据此可进行定量分析。荧光分析和化学发光分析均具有较高的选择性和灵敏度，通常其灵敏度比分子吸光光度法高２～３个数量级。
二、荧光分析的基本原理
1．荧光的产生
荧光的波长，可以与其吸收的激发光波长相同，称之为共振荧光。由于物质吸收了一定波长的光能后，先在其内部进行了无辐射跃迁的能量转移后，再以光的形式释放出来。所以多数情况下，荧光的波长比激发光波长长。这种现象称为斯托克斯位移，斯托克斯位移越大，激发光对荧光的干扰越小，当它们相差大于２０nm时，就可以很好的进行荧光测定。物质对光能的吸收、转移、辐射的情况，如图所示。
光能的吸收、转移、发射示意图
从图中可以看出，物质吸收了光能后，分子中的某些电子从基态的最低振动能级跃迁至较高的电子能级中的某些振动能级后，由于分子间的相互碰撞，消耗了一定的能量(无辐射跃迁)而降落至第一电子激发态的最高振动能级，然后通过振动松弛(无辐射跃迁)跃迁到第一电子激发态的最低振动能级。由此最低振动能级再降落至基态中的某些不同振动能级的同时，发射出比其吸收的波长稍长的光辐射，即荧光。有的物质分子吸收光能并降落至第一电子激发态的最低振动能级后，不继续降落至基态，而是通过再一次无辐射跃迁至一中间的亚稳态(称为系间跨跃)，分子在该亚稳态稍事停留、通过无辐射跃迁至此激发态的最低振动能级后，再发出光辐射而回到基态的各振动能级，这种辐射称之为磷光。当某些分子跃迁至亚稳状态后，通过热激活作用可再回到第一电子激发态的各个振动能级，然后由该激发态的最低振动能级返回基态而发射荧光，这种荧光称为迟滞荧光。荧光和磷光的区别在于其发光途径不同，磷光的能量比荧光低，波长比荧光的长，从激发到发光，磷光所需途径长、时间长，有时在入射光源关闭后，还能看到磷光，其发射时间约在照射后的10—4～10秒之间，而荧光在关闭光源后随即消失，其发射时间约在照射后的10—8～10—14秒之间。
2．激发光谱与荧光光谱
图11－9 硫酸奎宁的激发光谱（a）及荧光光谱（b）
用不同波长的激发光对物质进行扫描，来测定其发射荧光的强度，然后以荧光强度对激发光波长作图，得到荧光物质的激发光谱，即其表观吸收光谱。激发光谱中最高峰的波长、能使荧光物质发射最强的荧光，为该物质的最大激发波长。荧光的产生是由第一电子激发态的最低振动能级开始的，而与分子被激发至哪一能级无关。如果固定激发光的波长和强度不变，对分子发射的荧光波长扫描，依次测定其荧光强度，以荧光强度对相应的荧光波长作图，得到荧光物质的发射光谱，简称荧光光谱。荧光光谱的波长和形状与激发光的波长无关，但荧光强度与其有关。荧光光谱中最高峰的波长，为该物质的最大发射波长，如图（11－9）所示。一般来讲，测定激发光谱时，是将物质的发射波长固定为最大发射波长；测定其荧光光谱时，是将其激发波长固定为最大激发波长。
3．荧光强度与溶液浓度的关系
荧光是由物质吸光后而发出的辐射，因此，溶液的荧光强度与该溶液的吸光度及荧光物质发射的荧光效率有关。溶液被入射光激发后，可以在溶液的各个方向观察到荧光，但由于激发光部分可透过溶液，所以，一般应在与激发光垂直方向观测荧光，如图（11－10）所示。
图11—10溶液的荧光
图中入射光强度为I0，透过光强度为It，则溶液的荧光强度Ｆ为： Ｆ＝Φ(I0－It)式中Φ为荧光的量子效率。
=10-εｂＣ
则Ｆ＝Φ(I0－I0·10-εｂＣ)= ΦI0(1-10-εｂＣ)= ΦI0(1-e-2。303εｂＣ)
当溶液浓度很稀，Ａ=εｂＣ≤0.05时，e-2。303εｂＣ＝１－2.303εｂＣ，
则：Ｆ＝2.303ΦI0εｂＣ
对于一定的物质来讲，当入射光波长和强度固定、液层厚度ｂ固定时，
（11—11）式可进一步简化为：
Ｆ ＝Ｋ·Ｃ
式（11—12）为荧光分析的定量关系式。该式只有当溶液浓度很稀，Ａ≤0.05时才成立，否则，荧光强度与溶液浓度不呈线性关系。在浓溶液中，荧光强度往往不随溶液浓度增大而增大，反而由于所谓“自吸收”现象而导致荧光减弱。
三、荧光分析仪器
荧光分析仪器与一般的光度计有类似之处，都是由光源、单色器、样品池及检测系统四大部件所组成，如图所示。
荧光分析仪器结构图
荧光分析仪器常用的光源有高压汞蒸气灯及氙孤灯，前者发射的为非连续光谱，后者发射的为２５０～７００nm的连续光谱。为了能分别测定激发光谱和发射光谱、选择合适的激发和发射光、除去干扰光，荧光分析仪器具备两个单色器，即激发光单色器和发射光单色器。荧光光度计是用滤光片作单色器，而荧光分光光度计大都用光栅、有的采用石英棱镜与光栅复合分光，也有的用干涉滤光片作为简化的分光系统。荧光分析所用的样品池，通常为低荧光材料的石英制成的散射光较少的方形池，四面透明，清洗或握执时，应注意任何一面都不能污染。荧光光度计是检测荧光信号，必须避开激发光的影响，因此，检测器与激发光应有一定的角度，通常为直角。
四、定量分析方法
1．标准曲线法
配制一系列标准溶液，在同一条件下，分别测定它们和试液的荧光强度，以荧光强度对标准溶液的浓度绘制标准曲线，由试液的荧光强度对照标准曲线求得其含量。绘制标准曲线时，常采用标准系列中较浓的标准溶液为基准，将该溶液的荧光强度调至１００或５０，将试剂空白的读数调至０，或扣除空白的荧光值。
2.比较法
取已知量的纯荧光物质配制与试液浓度CＸ相近的标准溶液CS，在相同条件下分别测得它们的荧光强度FX和FS，若试剂空白的荧光强度为F0，按下式计算试液的浓度：
荧光分析法
一、概述
有些物质的分子或原子吸收了相应的能量被激发至较高能量的激发态后，在返回基态的过程中伴随着光的辐射，这种现象称为分子或原子发光。荧光或磷光分析一般是指分子吸收光能而发光的分析；因吸收化学反应或生物体释放的能量激发而发光的分析称为化学或生物化学发光分析。由于物质结构的不同，所吸收的能量和发射光的波长就有所不同，据此可进行定性分析；同一种物质，在相同条件下，浓度不同，发光强度不同，据此可进行定量分析。荧光分析和化学发光分析均具有较高的选择性和灵敏度，通常其灵敏度比分子吸光光度法高２～３个数量级。
二、荧光分析的基本原理
1．荧光的产生
荧光的波长，可以与其吸收的激发光波长相同，称之为共振荧光。由于物质吸收了一定波长的光能后，先在其内部进行了无辐射跃迁的能量转移后，再以光的形式释放出来。所以多数情况下，荧光的波长比激发光波长长。这种现象称为斯托克斯位移，斯托克斯位移越大，激发光对荧光的干扰越小，当它们相差大于２０nm时，就可以很好的进行荧光测定。物质对光能的吸收、转移、辐射的情况，如图所示。
光能的吸收、转移、发射示意图
从图中可以看出，物质吸收了光能后，分子中的某些电子从基态的最低振动能级跃迁至较高的电子能级中的某些振动能级后，由于分子间的相互碰撞，消耗了一定的能量(无辐射跃迁)而降落至第一电子激发态的最高振动能级，然后通过振动松弛(无辐射跃迁)跃迁到第一电子激发态的最低振动能级。由此最低振动能级再降落至基态中的某些不同振动能级的同时，发射出比其吸收的波长稍长的光辐射，即荧光。有的物质分子吸收光能并降落至第一电子激发态的最低振动能级后，不继续降落至基态，而是通过再一次无辐射跃迁至一中间的亚稳态(称为系间跨跃)，分子在该亚稳态稍事停留、通过无辐射跃迁至此激发态的最低振动能级后，再发出光辐射而回到基态的各振动能级，这种辐射称之为磷光。当某些分子跃迁至亚稳状态后，通过热激活作用可再回到第一电子激发态的各个振动能级，然后由该激发态的最低振动能级返回基态而发射荧光，这种荧光称为迟滞荧光。荧光和磷光的区别在于其发光途径不同，磷光的能量比荧光低，波长比荧光的长，从激发到发光，磷光所需途径长、时间长，有时在入射光源关闭后，还能看到磷光，其发射时间约在照射后的10—4～10秒之间，而荧光在关闭光源后随即消失，其发射时间约在照射后的10—8～10—14秒之间。
2．激发光谱与荧光光谱
图11－9 硫酸奎宁的激发光谱（a）及荧光光谱（b）
用不同波长的激发光对物质进行扫描，来测定其发射荧光的强度，然后以荧光强度对激发光波长作图，得到荧光物质的激发光谱，即其表观吸收光谱。激发光谱中最高峰的波长、能使荧光物质发射最强的荧光，为该物质的最大激发波长。荧光的产生是由第一电子激发态的最低振动能级开始的，而与分子被激发至哪一能级无关。如果固定激发光的波长和强度不变，对分子发射的荧光波长扫描，依次测定其荧光强度，以荧光强度对相应的荧光波长作图，得到荧光物质的发射光谱，简称荧光光谱。荧光光谱的波长和形状与激发光的波长无关，但荧光强度与其有关。荧光光谱中最高峰的波长，为该物质的最大发射波长，如图（11－9）所示。一般来讲，测定激发光谱时，是将物质的发射波长固定为最大发射波长；测定其荧光光谱时，是将其激发波长固定为最大激发波长。
3．荧光强度与溶液浓度的关系
荧光是由物质吸光后而发出的辐射，因此，溶液的荧光强度与该溶液的吸光度及荧光物质发射的荧光效率有关。溶液被入射光激发后，可以在溶液的各个方向观察到荧光，但由于激发光部分可透过溶液，所以，一般应在与激发光垂直方向观测荧光，如图（11－10）所示。
图11—10溶液的荧光
图中入射光强度为I0，透过光强度为It，则溶液的荧光强度Ｆ为： Ｆ＝Φ(I0－It)式中Φ为荧光的量子效率。
=10-εｂＣ
则Ｆ＝Φ(I0－I0·10-εｂＣ)= ΦI0(1-10-εｂＣ)= ΦI0(1-e-2。303εｂＣ)
当溶液浓度很稀，Ａ=εｂＣ≤0.05时，e-2。303εｂＣ＝１－2.303εｂＣ，
则：Ｆ＝2.303ΦI0εｂＣ
对于一定的物质来讲，当入射光波长和强度固定、液层厚度ｂ固定时，
（11—11）式可进一步简化为：
Ｆ ＝Ｋ·Ｃ
式（11—12）为荧光分析的定量关系式。该式只有当溶液浓度很稀，Ａ≤0.05时才成立，否则，荧光强度与溶液浓度不呈线性关系。在浓溶液中，荧光强度往往不随溶液浓度增大而增大，反而由于所谓“自吸收”现象而导致荧光减弱。
三、荧光分析仪器
荧光分析仪器与一般的光度计有类似之处，都是由光源、单色器、样品池及检测系统四大部件所组成，如图所示。
荧光分析仪器结构图
荧光分析仪器常用的光源有高压汞蒸气灯及氙孤灯，前者发射的为非连续光谱，后者发射的为２５０～７００nm的连续光谱。为了能分别测定激发光谱和发射光谱、选择合适的激发和发射光、除去干扰光，荧光分析仪器具备两个单色器，即激发光单色器和发射光单色器。荧光光度计是用滤光片作单色器，而荧光分光光度计大都用光栅、有的采用石英棱镜与光栅复合分光，也有的用干涉滤光片作为简化的分光系统。荧光分析所用的样品池，通常为低荧光材料的石英制成的散射光较少的方形池，四面透明，清洗或握执时，应注意任何一面都不能污染。荧光光度计是检测荧光信号，必须避开激发光的影响，因此，检测器与激发光应有一定的角度，通常为直角。
四、定量分析方法
1．标准曲线法
配制一系列标准溶液，在同一条件下，分别测定它们和试液的荧光强度，以荧光强度对标准溶液的浓度绘制标准曲线，由试液的荧光强度对照标准曲线求得其含量。绘制标准曲线时，常采用标准系列中较浓的标准溶液为基准，将该溶液的荧光强度调至１００或５０，将试剂空白的读数调至０，或扣除空白的荧光值。
2.比较法
取已知量的纯荧光物质配制与试液浓度CＸ相近的标准溶液CS，在相同条件下分别测得它们的荧光强度FX和FS，若试剂空白的荧光强度为F0，按下式计算试液的浓度：