2009NO.11
・130.
SerialNo.212
ChinaBrewing
AnalysisandExamination
荧光法及化学发光法在保健食品抗氧化体外实验中的应用
文镜,刘璇,赵建
(北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,应用文理学院保健食品功能检测中心,北京100191)摘要:保健食品体外抗氧化能力评价实验具有简便、快捷的特点。发射光谱法是目前常用的保健食品体外抗氧化能力检测方法。本文对发射光谱法中的荧光法及化学发光法各自原理、特点、仪器、检测方法、应用范围进行了分析比较,并举例说明了这2种方法在保健食品抗氧化体外实验中的应用特点。
关键词:保健食品;抗氧化;体外实验;荧光法;化学发光法中图分类号:TS207.3
文献标识码:A
文章编号:0254-5071(2009)11—0130卸13
Applicationoffluorescenceandchemiluminescenceindeterminationofanti-oxidation
capabilitvofhealthfoodinvilroexperiments
WENJing,LIU
Xuan,ZHAOJian
of
(BeijingKeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandFunctionalFoods,CenterofFunctionalInspection
HealthFood,CollegeofArts&Science,BeijingUnionUnive恬ity,Beijing100191.China)
Absmlec.Thedeterminationexperimentofanti-oxidationcapabilityofhealthfoodinvitroWaSsimpleand订yiscommonlyused
to
easy.The
methodofemissionspectrome一
methods
evaluatinghealthfood
anti-oxidationcapability.Theprinciples,characteristics,instruments,detectionandtheappli-
cationsoffluorescence
andchemiluminescencemethodswerecomparedinthispaper.
Keywords:healthfood;anti-oxidation;invitro;fluorescence;chemiluminescence
近年来的研究证明,老化和各种生活习惯病的发生过程都与活性氧有关【n。因此,抗氧化食品的研究和利用不仅成为当前保健食品研发的一个重点方向,而且受到人民群众的关注。而抗氧化功能评价方法的建立与正确运用就成为抗氧化保健食品研究中不可或缺的必要条件。
保健食品及其原料的体外抗氧化能力评价实验具有简便、快捷的特点,适用于对大批量材料的筛选[21、对不同样品抗氧化能力的比较【目以及在保健食品抗氧化功能评价中对体内实验的补充问。国际上当前比较流行的几种天然产物体外抗氧化能力评价方法主要运用了吸收光谱法和发射光谱法。其中2,2’.连氮.双.(3.乙基苯并噻唑.6一磺酸).二铵盐法(ABTS法)、l,I.二苯代苦基苯肼法(DDPH法)、铁离子还原\抗氧化能力测定法(FRAP法)等都属于吸收光谱法。而氧自由基吸收能力测定法(o.RAC法)和化学发光法(CL法)属于发射光谱法。这2种方法因其具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便、工作曲线线性范围宽等优点,不仅在保健食品研究领域得到应用,而且还广泛应用于生命科学、医学、药理学、有机和无机化学等领域151。1荧光与化学发光
当紫外光或波长较短的可见光照射到某些物质时,这些物质的分子吸收入射光后,经过10母铲10%,能发射较长波长的光,而当光源停止照射时,这种光线随之消失。这种
在激发光诱导下产生的光称为荧光,能发出荧光的物质称为荧光物质。荧光物质的原子、分子或离子接受外界能量,便由基态跃迁到激发态,先通过无辐射跃迁过渡到较低的激发态,再以发射跃迁的形式回到基态,由此产生的光谱称为荧光发射光谱。常见的有原子荧光发射光谱、分子荧光发射光谱嘲。
荧光是发射光,荧光物质经过光源激发后产生荧光,如L.苯丙氨酸在激发光照射下产生较弱荧光,在有自由基的作用下能产生更强的荧光;罗丹明6G、丁基罗丹明B及人工合成的荧光素(SodiumFlurescein)等均能产生特征荧光。荧光法就是通过测定物质分子或原子产生的荧光进行分析的方法。荧光分析可应用于物质的定性和定量,由于物质的结构不同,所能吸收的紫外.可见光波长不同,所发射的荧光波长也不同,利用这个性质可以鉴别物质。对于同一种物质的稀溶液,其产生的荧光强度与浓度呈线性关系,利用这个性质可以定量测量嗍。
化学发光是在没有任何光、热或电能的激发下,只利用自身化学反应而产生的光辐射。化学发光分析就是利用化学反应所产生的发光现象对组份进行分析的方法。化学发光反应所发出的光强度决定于化学发光反应速度,而反应速度又决定于反应分子的浓度,因此通过检测化学发光强度可以直接测定反应物的浓度。通常情况下,发光强度与反应物分子浓度成正比,借助化学发光强度的测量,可以
收稿日期:2009-06.13
基金项目:北京市教委重点实验室引导基金项目(21202543503)
作者简介:文镜(1952-),男,教授,主要从事保健食品功能学评价机理和方法学研究工作。
万方数据
中国酿造
2009年第”期分析与检测
对反应物进行定量分析。化学发光需要有发光物质,常用的发光效率较高的发光物质有鲁米诺(1umin01)、光泽精(1ucigenin)、洛粉碱等【n”】。化学发光与荧光的主要区别是激发能不同,而其光谱是十分相似的。由于化学发光的光强度随反应剂的消耗而变化,因此与荧光法不同,荧光法的光强度与时间无关,而化学发光的光强度随时间逐渐减少。
2荧光法的特点
主要优点:(1)灵敏度高,检出限低。荧光法检出限一
般为104朗一10"69/L,甚至更低。通常较吸收光谱分析法高
2"4个数量级。(2)选择性强。荧光分析法的光谱比较简单,特征性强,而且有激发光谱和发射光谱,选择的余地大。如果某几种物质的激发光谱相似,就可以从其发射光谱的差异进行鉴别和分析;相反如果发射光谱相似,可以从激发光谱的差异进行鉴别和分析。(3)荧光法提供比较多的物理参数。可提供包括激发光谱、发射光谱和三维光谱以及荧光强度、荧光效率、荧光寿命等多种物理参数。这些参数反映了分子的各种特性,能从不同角度提供研究对象的分子信息嘲。
主要缺点:许多物质本身不会发射荧光,可以用加入某种试剂使某些非荧光物质转化为荧光物质来进行分析,但能够有此反应的物质数量有限。荧光分析的灵敏度高,测定时对环境因素较为敏感,干扰因素较多(如温度、酸度以及污染物等都会对荧光分析产生干扰)。另外,尽管荧光法可以自动化、标准化,但需要使用价格昂贵的分析仪器。
3化学发光法的特点
主要优点:(1)灵敏度高、检测限低、线性范围宽。由于不需要外来光源,从而减少或消除瑞利散射和拉曼散射,避免了背景光和杂散光的干扰,降低了噪音的影响,大大提高了信噪比,所以具有很高的灵敏度;线性范围达3--6个数量级;检测限达10-培mol或更低。(2)仪器简便,便于实现自动化分析。(3)方便快捷,每次测定只需几分钟。(4)安全方便,无放射性损害。
主要缺点:传统的化学发光分析有分立式取样和流动注射式2种方式,速度和进样量均很难精确控制,对微升级的样品尤为困难,另外也无法实现在线分析。另外重现性和选择性差。4仪器
目前,测定荧光强度的仪器有荧光计和荧光分光光度计。通常都是由激发光源、单色器(或滤光片)、试样池、检测器和放大显示系统构成。
荧光分光光度计是用于检测荧光光谱的一种仪器。由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经单色器转变为单色光后照射到样品池中,激发样品中的荧光物质发出
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总第212期
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荧光,荧光经过滤和反射后,被光电倍增管所接收,然后以图或数字的形式显示出来。其能够提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数。通过对这些参数的测定,不但可以做一般的定性、定量分析,而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化,从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190nm--650nm,发射波长扫描范围是200nm~800nm。
不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征,这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱,因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中,当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,耳PlF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外.可见分光光度法类似,荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
对于化学发光分析来说,由于激发能来源于化学反应,无须专门的激发光源以及相应的单色器和聚焦透镜等,所以仪器设备简单、廉价、易微型化。一般由试样室、光检测室、放大器和信号输出装置等组成。
智能流动注射化学发光仪集流动注射(F认)和化学
发光分析(CL)于一体,是一种智能、自动、灵敏、快速、准确的现代痕量分析仪器,已用于实际样品检测。因其不需均匀混合,也不需达到化学平衡,因此大大提高了化学发光分析速度,易于实现自动化。流动注射化学发光分析仪的整个分析过程为一个动态过程,从进样到报告测试结果全部由微机控制,克服了经典方法中人为误差对分析结果的影响。
因为化学发光分析的测定大多是在相同条件下,沿用同一个化学发光反应进行的,所以选择性较差。液相色谱化学发光检测仪将高灵敏度的化学发光检测技术与高效能、高分辨力的高效液相色谱分离技术相结合,提高了化学发光法的选择性。
目前常见的荧光分光光度计有日本岛津生产的RF.5301PC荧光分光光度计、武汉中西生产的M173455荧光分光光度计、美国Thermo公司生产的Aminco
Bowman
Series2型荧光分光光度计等。化学发光检测仪器有美国贝克曼库尔特有限公司生产的LD400化学发光检测仪、瑞士生产的Sirius管式化学发光分析仪等。5检测方法
运用发射光谱法进行保健食品及原料体外抗氧化性研究,具体实验方法有很多变化,但主要检测方法为荧光法和化学发光法。
荧光法是以荧光物质作为氧化底物,其本身在一定的激发波长下可以发出荧光,在自由基攻击下荧光特性消失
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ChinaBrewing
and或增强,当有抗氧化物质存在时,抗氧化物质可以清除溶液中的自由基,使其荧光消失程度减弱或者使其荧光增强程度降低,总之都是引起荧光强度变化。通过测定自由基形成前后荧光底物的荧光强度变化,测定自由基的产生量,通过计算自由基清除率(%)来评价受试样的抗氧化能力。抗氧化能力指数(ORAC)法是CAO等建立在Glazer实验基础上的一种检测抗氧化能力的方法。检测过程中,使用藻红蛋白作为氧化底物,2,2.偶氮二(2.脒基丙烷)
二盐酸盐(2,2’-azobis(2一amidino—propane)dihydrochlo—
fide,AAPH)或者Cu2+.H20:作为羟基自由基发生物。反应中藻红蛋白在一定光波激发下可发射荧光,当有自由基或氧化剂被加入时,荧光逐渐减弱;而当有抗氧化性物质加入时,荧光减弱被抑SlitB-41。后来采用人工合成荧光素
SodiumFluorescein(37,6'-dihydrox-ysp
iro[isobenzofuran-l
【3H】,97[9H】.xanthen].3一one,FL)替代藻红蛋白。ORAC法测量的是抗氧化物质的直接清除自由基能力,结果采用抗氧化剂作用下的荧光衰退曲线下面积(areaunderthe
curve,AUC)与荧光自然衰退曲线下面积的差作为衡量抗
氧化能力指标。
化学发光法是发光物质在一定条件下被自由基攻击使其氧化而发光,启动化学发光后立即用记录仪对每秒发光强度积分,记录化学发光动力学曲线。当有抗氧化性物质存在时,发光强度下降,通过计算抗氧化性物质抑制发光的程度(抑制率%)来评价其抗氧化能力。其中,以辣根过氧化物酶.鲁米诺一氢过氧化物酶体系为基础的方法是最重要的测定方法。在该法中,鲁米诺被氢过氧化物酶氧化,导致鲁米诺自由基的生成;同时由于自由基进一步反应会使其发光,而当抗氧化性物质存在并发生反应的时候,光的强度将被减弱,由此根据光强度被减弱的程度来评价抗氧化性物质的抗氧化能力【B嘲。6荧光法在保健食品抗氧化体外实验中的应用
目前荧光法不仪在保健食品抗氧化研究体外实验中得到比较广泛的应用,而且已经取得大量的科研成果和数据。张爱梅等【19】采用罗丹明6G—Co也H20:体系荧光法对14种常见蔬菜进行抗氧化活性测定。通过比较,证明菠菜、油菜、韭菜、香菜、雪里蕻这5种绿叶蔬菜具有较好的抗氧化能力,而且发现这些具有较强抗氧化性蔬菜的共同特点是町食用部分都带有绿叶,这为人们寻找抗氧化性天然可食植物提供一条更快捷的参考途径。在该实验中充分利用了荧光法重现性好(相对标准偏差RSD为1.63%)、快捷(只需15min)、样品前处理简单(水提取)等优点,对大量蔬菜的抗氧化活性进行比较、筛选。是抗氧化研究体外实验中成功应用荧光法对大批量样品进行筛选的一个成功实例。
D矗valos
A等嗍使用抗氧化能力指数(ORAC)法对多
个样品进行测定,包括不同品种的红酒、玫瑰花、类黄酮、
万方数据
AnalysisExamination
肉桂酸、膳食补充品等。结果显示全部样品都具有~定抗氧化能力,并且抗氧化剂浓度和曲线下面积呈现较好的线性关系。另外发现化合物的结构决定了其抗氧化能力。此项研究也很好地利用了荧光法简单、快速、灵敏、准确的特点,在体外对大量样品进行抗氧化能力比较分析中取得了很好的结果。
7化学发光法在保健食品抗氧化体外实验中的应用
近年来化学发光法在保健食品抗氧化体外实验中的应用也十分广泛。取得了不少研究成果和科学数据。
段玉清等【2l】对莲房原花青素(LSPC)进行体内抗氧化研究,结果表明LSPc能提高大鼠机体抗氧化能力,抑制脂质过氧化作用的发生,并能增加皮肤中的胶元蛋白含量。邓乾春等[221用体外实验结果对体内实验结果进行了进一步补充。他们采用多个化学发光体系,研究了测定莲房原花青素(LSPC)的体外抗氧化活性及其对DNA损伤的保护作用。结果表明LSPC具有较好的体外清除活性氧和保护DNA损伤的活性。此研究是成功运用化学发光体外试验结果对体内实验结果进行进一步补充的典型实例。
王建国等闭成功利用流动.化学发光法比较了VC、绿原酸、没食子酸3种物质的抗氧化活性并探讨了用该方法检测抗氧化样品的作用机理。
侯冬岩等嗍通过流动注射化学发光法分析比较了万寿菊花、叶、茎的抗氧化性能。还将化学发光法分析结果与万寿菊花、叶、茎中的黄酮含量进行了分析比较,发现万寿菊花、叶、茎中的黄酮含量与对其抗氧化性的大小有良好的相关性。8总结
荧光法和化学发光法在保健食品抗氧化体外实验研究中已经得到广泛的应用。通过这些成功应用实例可以看到研究者主要利用了荧光法和化学发光法简便、快捷、灵敏度高的特点。在对大批量材料的筛选、对不同样品抗氧化能力的比较以及对保健食品抗氧化功能评价体内实验结果进一步补充方面取得了良好的研究结果,提供了大量有价值的科学数据。但是也应该注意到,由于体外实验的局限性,如果仅用体外实验结果去评价某一个保健食品的抗氧化功能其结果是缺乏说服力的。因此需要在保健食品抗氧化体外实验研究中正确、合理应用这两种方法。随着电子计算机技术和分析仪器的不断发展创新,荧光法和化学发光法在保健食品抗氧化研究体外实验中必将发挥更大作用。参考文献:
【1】OUB,HAMPSCH-WOODILLM,PRIORRL.Developmentandvalida-
tionofanimprovedoxygenradicalabSol'banoecapacityassay
usingfluo-
resctin觞thefluor鹤ccntprobe【J】.JA掣kFoodChem,2001,49:
4619.4626.
分析与检测
中国酿造
2009年第11期总第212期
・13》
黄酒中丁二酸的分离、纯化和鉴定
陈磊,黄雪松幸
(暨南大学食品科学与工程系,广东广州510632)
摘要:采用AB.8大孔树脂和反相C。。柱色谱分离获得了黄酒中的1个较强极性的物质,经红外光谱显示该物质含有C=O键和C.O键,并有-CHr存在;核磁共振谱图显示含有-COOH和.CH2-幕团,其比例为l:1:GC.MS证实了该物质的纯度较高,基峰质荷比为55,M+I
峰的质荷比为119,含有-COOH+(m/芦--45)和亚稳态离子峰c娼+(re/z=27)的碎片,综合解析后推断该物质为丁二酸,为黄洒酿造过程
中微生物发酵所产生,对黄酒的风味和功能都具有重要影响。关键词:黄酒:丁二酸;分离纯化中图分类号:0657.7
文献标识码:A
文章编号:0254—5071(2009)11一0133—03
Isolation,purifica五Oilandidentificationofmccinicacidinricewine
CHEN
Lei,HUANGXuesong・
Universi04Guangzhou510632,China)
(DepartmentofFoodScienceandEngineering,Jinan
ricewinewagisolatedusingAB・8
Abs嘲:A
componentwithhigherpolarityinmacroporous
r鼯inand
RPCI8column
chromatograph.Its
structure
wasdeterminedbyspectralanalysis.TheresultsofinfraredspectrumshowedthatitcontainsC=OandC-Ofunctiongroups,aswellas—CHr.Therc-suitofNMRindicatedthattherewe佗-COOHandCHr,andtheirproportionWas1:1.ItspurityWasprovedtobe11ighbyGC-MS,andm/zofbase
peakandm/z
ofM+lWere55and119,respectively.Italsohadionpeaksof-COOH+(m/z=45)andC2Hf(m/z=27).Based
as
ontheseremits,the
colll.
poundwas
function
inferred
succinicacid,whichisproducedbymicroorganisminriewwine
fermentationandplays
an
important
roleintheflavorand
officewine.
Keywords:ricewine;succinicacid;isolation
andpurification
黄酒是我国历史上最古老的酒种,与啤酒、红酒并称为世界三大古酒,含有丰富的营养素与多种活性物质fl】。由
收稿日期:2009-06.25
于黄酒丰富的原料及独特的酿造工艺,酒液中含有丰富而复杂的成分,除乙醇和水外,还有各种糖、糊精、有机酸、氨
作者简介:陈磊(1983-),男,山东邹平人,在读硕士研究生,主要从事功能活性成分方向的研究;黄雪松・,教授,通讯作者。
【2】刘小兵.生物活性物质的抗氧化能力评价方法及其研究进展叨.中国
食品卫生杂志.2008.20(5):44JD444.
【3】文镜,贺素华,杨育颖,唐秀华.保健食品清除自由基作用的体外测定
方法和原理【J].食品科学2004,25(1).
【4】徐清萍,钟桂芳,盂君.抗氧化荆抗氧化方法研究进展田.食品工程,
20072:23—25.
【14】MARQUELEFD,MAMBRO
V
MDI,GEORGElllS
extracts
R.Assessment
oftheantioxidantactivitiesofBraziliantopical
ofpropolisaloneandin
pharmaceuticalformulations【J】.JPharmaceutBiomedAnal,
2005,39(3.4):455462.
【15】吕晓玲,孔德莉。姚秀玲,等.采用荧光化学发光法研究甜菜红色素的
抗氧化作用【J】.食品与发酵工业,2006,32(10):70-73.
15】魏立娜.荧光分光光度计的结构与应用【J】.生命科学仪器2007,5(7):
63.64.
【16】王世永,李小定,吴谋成.露光化学发光法研究吴茱荚精油的抗氧化作
用【J】.食品科技2008,2:206.208.
【17】赫春香,卢丽男,曹,璨,等.荧光动力学分析新方法测定超氧自由基
【6】杨根元.实用仪器分析【l叼.北京:北京大学出版社2001.
【7】王崔平.荧光法测定羟基自由基及中草药抗氧化性【J】.德州学院学报,
200723(4):04,14,24.
【18】张爱梅,臧运波.罗丹明6(3批H20:体系荧光法测定常见蔬菜的抗
氧化活性m.食品科学0004,25(I):149-152.
【19】DdvalosA'GOmezd20rdovesC,Bartolom*B.Extendingapplicabilityof
theoxygenradicalabsorbanceAgricFood
抑制刺的抗氧活性们.辽宁师范大学学报:自然科学版2005,01:75.77.
【81张爱梅,减运波.丁基罗丹明&Fe2+.Hp:体系荧光法测定茶叶的抗氧化活性【J】.分析科学学报,2005,21(4):435-437.
【9】李超,刘树元,李嫒嫒,等.化学发光分析法的发展与应用阴.分析测试技术与仪器,2006,12(6):75-81.
【1o】吴风武,何治柯,罗庆尧,等.化学发光分析新进展们.分析测试学报,
2000,19(1):8l・88.
【ll】续洁琨,姚新生,栗原博.抗氧化能力指数(ORAC)测定原理及应用
叨.中国药理学通报,2006,22(8):lOl5-1021.
【12】李明静,王金中,刘绣华.鲁米诺.过氧化氢一铜Ⅱ化学发光法测定儿
茶素阴.分析化学2001,5(29):613.
【13】CAOG,ALESSIoHM,CIr11。ERRG.Oxygen・radicalabsorb狃cc
paeityassayfor303.311.
Ca-
capacity(ORAC—fluorescein)assay【J】.J
Chem,2004,52(I):48-54.
[20】段玉清,谢笔钧.莲房原花青素体内抗氧化研究叨.营养学报,2003(3):
87-89.
【2l】邓乾春,陈春艳,田斌强,等.化学发光法研究莲房原花青素的体外抗
氧化活性和对DNA损伤的保护作用【J】.天然产物研究与开发2007(4):22—26.
【22】王建国,汪敬武.流动.化学发光法比较三种物质的抗氧化活性明.
食品科技。2007(7):148.150.
【23】侯冬岩,回瑞华,刘晓嫒,等.万寿菊花、叶、茎中黄酮的含量及抗氧化
性能的分析【J】.鞍山师范学院学报.2008,10“):15.18.
antioxidants【J】.Free
RadicalBie
Med’1993,14:
万方数据
2009NO.11
・130.
SerialNo.212
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AnalysisandExamination
荧光法及化学发光法在保健食品抗氧化体外实验中的应用
文镜,刘璇,赵建
(北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,应用文理学院保健食品功能检测中心,北京100191)摘要:保健食品体外抗氧化能力评价实验具有简便、快捷的特点。发射光谱法是目前常用的保健食品体外抗氧化能力检测方法。本文对发射光谱法中的荧光法及化学发光法各自原理、特点、仪器、检测方法、应用范围进行了分析比较,并举例说明了这2种方法在保健食品抗氧化体外实验中的应用特点。
关键词:保健食品;抗氧化;体外实验;荧光法;化学发光法中图分类号:TS207.3
文献标识码:A
文章编号:0254-5071(2009)11—0130卸13
Applicationoffluorescenceandchemiluminescenceindeterminationofanti-oxidation
capabilitvofhealthfoodinvilroexperiments
WENJing,LIU
Xuan,ZHAOJian
of
(BeijingKeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandFunctionalFoods,CenterofFunctionalInspection
HealthFood,CollegeofArts&Science,BeijingUnionUnive恬ity,Beijing100191.China)
Absmlec.Thedeterminationexperimentofanti-oxidationcapabilityofhealthfoodinvitroWaSsimpleand订yiscommonlyused
to
easy.The
methodofemissionspectrome一
methods
evaluatinghealthfood
anti-oxidationcapability.Theprinciples,characteristics,instruments,detectionandtheappli-
cationsoffluorescence
andchemiluminescencemethodswerecomparedinthispaper.
Keywords:healthfood;anti-oxidation;invitro;fluorescence;chemiluminescence
近年来的研究证明,老化和各种生活习惯病的发生过程都与活性氧有关【n。因此,抗氧化食品的研究和利用不仅成为当前保健食品研发的一个重点方向,而且受到人民群众的关注。而抗氧化功能评价方法的建立与正确运用就成为抗氧化保健食品研究中不可或缺的必要条件。
保健食品及其原料的体外抗氧化能力评价实验具有简便、快捷的特点,适用于对大批量材料的筛选[21、对不同样品抗氧化能力的比较【目以及在保健食品抗氧化功能评价中对体内实验的补充问。国际上当前比较流行的几种天然产物体外抗氧化能力评价方法主要运用了吸收光谱法和发射光谱法。其中2,2’.连氮.双.(3.乙基苯并噻唑.6一磺酸).二铵盐法(ABTS法)、l,I.二苯代苦基苯肼法(DDPH法)、铁离子还原\抗氧化能力测定法(FRAP法)等都属于吸收光谱法。而氧自由基吸收能力测定法(o.RAC法)和化学发光法(CL法)属于发射光谱法。这2种方法因其具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便、工作曲线线性范围宽等优点,不仅在保健食品研究领域得到应用,而且还广泛应用于生命科学、医学、药理学、有机和无机化学等领域151。1荧光与化学发光
当紫外光或波长较短的可见光照射到某些物质时,这些物质的分子吸收入射光后,经过10母铲10%,能发射较长波长的光,而当光源停止照射时,这种光线随之消失。这种
在激发光诱导下产生的光称为荧光,能发出荧光的物质称为荧光物质。荧光物质的原子、分子或离子接受外界能量,便由基态跃迁到激发态,先通过无辐射跃迁过渡到较低的激发态,再以发射跃迁的形式回到基态,由此产生的光谱称为荧光发射光谱。常见的有原子荧光发射光谱、分子荧光发射光谱嘲。
荧光是发射光,荧光物质经过光源激发后产生荧光,如L.苯丙氨酸在激发光照射下产生较弱荧光,在有自由基的作用下能产生更强的荧光;罗丹明6G、丁基罗丹明B及人工合成的荧光素(SodiumFlurescein)等均能产生特征荧光。荧光法就是通过测定物质分子或原子产生的荧光进行分析的方法。荧光分析可应用于物质的定性和定量,由于物质的结构不同,所能吸收的紫外.可见光波长不同,所发射的荧光波长也不同,利用这个性质可以鉴别物质。对于同一种物质的稀溶液,其产生的荧光强度与浓度呈线性关系,利用这个性质可以定量测量嗍。
化学发光是在没有任何光、热或电能的激发下,只利用自身化学反应而产生的光辐射。化学发光分析就是利用化学反应所产生的发光现象对组份进行分析的方法。化学发光反应所发出的光强度决定于化学发光反应速度,而反应速度又决定于反应分子的浓度,因此通过检测化学发光强度可以直接测定反应物的浓度。通常情况下,发光强度与反应物分子浓度成正比,借助化学发光强度的测量,可以
收稿日期:2009-06.13
基金项目:北京市教委重点实验室引导基金项目(21202543503)
作者简介:文镜(1952-),男,教授,主要从事保健食品功能学评价机理和方法学研究工作。
万方数据
中国酿造
2009年第”期分析与检测
对反应物进行定量分析。化学发光需要有发光物质,常用的发光效率较高的发光物质有鲁米诺(1umin01)、光泽精(1ucigenin)、洛粉碱等【n”】。化学发光与荧光的主要区别是激发能不同,而其光谱是十分相似的。由于化学发光的光强度随反应剂的消耗而变化,因此与荧光法不同,荧光法的光强度与时间无关,而化学发光的光强度随时间逐渐减少。
2荧光法的特点
主要优点:(1)灵敏度高,检出限低。荧光法检出限一
般为104朗一10"69/L,甚至更低。通常较吸收光谱分析法高
2"4个数量级。(2)选择性强。荧光分析法的光谱比较简单,特征性强,而且有激发光谱和发射光谱,选择的余地大。如果某几种物质的激发光谱相似,就可以从其发射光谱的差异进行鉴别和分析;相反如果发射光谱相似,可以从激发光谱的差异进行鉴别和分析。(3)荧光法提供比较多的物理参数。可提供包括激发光谱、发射光谱和三维光谱以及荧光强度、荧光效率、荧光寿命等多种物理参数。这些参数反映了分子的各种特性,能从不同角度提供研究对象的分子信息嘲。
主要缺点:许多物质本身不会发射荧光,可以用加入某种试剂使某些非荧光物质转化为荧光物质来进行分析,但能够有此反应的物质数量有限。荧光分析的灵敏度高,测定时对环境因素较为敏感,干扰因素较多(如温度、酸度以及污染物等都会对荧光分析产生干扰)。另外,尽管荧光法可以自动化、标准化,但需要使用价格昂贵的分析仪器。
3化学发光法的特点
主要优点:(1)灵敏度高、检测限低、线性范围宽。由于不需要外来光源,从而减少或消除瑞利散射和拉曼散射,避免了背景光和杂散光的干扰,降低了噪音的影响,大大提高了信噪比,所以具有很高的灵敏度;线性范围达3--6个数量级;检测限达10-培mol或更低。(2)仪器简便,便于实现自动化分析。(3)方便快捷,每次测定只需几分钟。(4)安全方便,无放射性损害。
主要缺点:传统的化学发光分析有分立式取样和流动注射式2种方式,速度和进样量均很难精确控制,对微升级的样品尤为困难,另外也无法实现在线分析。另外重现性和选择性差。4仪器
目前,测定荧光强度的仪器有荧光计和荧光分光光度计。通常都是由激发光源、单色器(或滤光片)、试样池、检测器和放大显示系统构成。
荧光分光光度计是用于检测荧光光谱的一种仪器。由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经单色器转变为单色光后照射到样品池中,激发样品中的荧光物质发出
万方数据
总第212期
・131・
荧光,荧光经过滤和反射后,被光电倍增管所接收,然后以图或数字的形式显示出来。其能够提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数。通过对这些参数的测定,不但可以做一般的定性、定量分析,而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化,从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190nm--650nm,发射波长扫描范围是200nm~800nm。
不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征,这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱,因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
在溶液中,当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,耳PlF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外.可见分光光度法类似,荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
对于化学发光分析来说,由于激发能来源于化学反应,无须专门的激发光源以及相应的单色器和聚焦透镜等,所以仪器设备简单、廉价、易微型化。一般由试样室、光检测室、放大器和信号输出装置等组成。
智能流动注射化学发光仪集流动注射(F认)和化学
发光分析(CL)于一体,是一种智能、自动、灵敏、快速、准确的现代痕量分析仪器,已用于实际样品检测。因其不需均匀混合,也不需达到化学平衡,因此大大提高了化学发光分析速度,易于实现自动化。流动注射化学发光分析仪的整个分析过程为一个动态过程,从进样到报告测试结果全部由微机控制,克服了经典方法中人为误差对分析结果的影响。
因为化学发光分析的测定大多是在相同条件下,沿用同一个化学发光反应进行的,所以选择性较差。液相色谱化学发光检测仪将高灵敏度的化学发光检测技术与高效能、高分辨力的高效液相色谱分离技术相结合,提高了化学发光法的选择性。
目前常见的荧光分光光度计有日本岛津生产的RF.5301PC荧光分光光度计、武汉中西生产的M173455荧光分光光度计、美国Thermo公司生产的Aminco
Bowman
Series2型荧光分光光度计等。化学发光检测仪器有美国贝克曼库尔特有限公司生产的LD400化学发光检测仪、瑞士生产的Sirius管式化学发光分析仪等。5检测方法
运用发射光谱法进行保健食品及原料体外抗氧化性研究,具体实验方法有很多变化,但主要检测方法为荧光法和化学发光法。
荧光法是以荧光物质作为氧化底物,其本身在一定的激发波长下可以发出荧光,在自由基攻击下荧光特性消失
2009NO.11
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SerialNo.212
ChinaBrewing
and或增强,当有抗氧化物质存在时,抗氧化物质可以清除溶液中的自由基,使其荧光消失程度减弱或者使其荧光增强程度降低,总之都是引起荧光强度变化。通过测定自由基形成前后荧光底物的荧光强度变化,测定自由基的产生量,通过计算自由基清除率(%)来评价受试样的抗氧化能力。抗氧化能力指数(ORAC)法是CAO等建立在Glazer实验基础上的一种检测抗氧化能力的方法。检测过程中,使用藻红蛋白作为氧化底物,2,2.偶氮二(2.脒基丙烷)
二盐酸盐(2,2’-azobis(2一amidino—propane)dihydrochlo—
fide,AAPH)或者Cu2+.H20:作为羟基自由基发生物。反应中藻红蛋白在一定光波激发下可发射荧光,当有自由基或氧化剂被加入时,荧光逐渐减弱;而当有抗氧化性物质加入时,荧光减弱被抑SlitB-41。后来采用人工合成荧光素
SodiumFluorescein(37,6'-dihydrox-ysp
iro[isobenzofuran-l
【3H】,97[9H】.xanthen].3一one,FL)替代藻红蛋白。ORAC法测量的是抗氧化物质的直接清除自由基能力,结果采用抗氧化剂作用下的荧光衰退曲线下面积(areaunderthe
curve,AUC)与荧光自然衰退曲线下面积的差作为衡量抗
氧化能力指标。
化学发光法是发光物质在一定条件下被自由基攻击使其氧化而发光,启动化学发光后立即用记录仪对每秒发光强度积分,记录化学发光动力学曲线。当有抗氧化性物质存在时,发光强度下降,通过计算抗氧化性物质抑制发光的程度(抑制率%)来评价其抗氧化能力。其中,以辣根过氧化物酶.鲁米诺一氢过氧化物酶体系为基础的方法是最重要的测定方法。在该法中,鲁米诺被氢过氧化物酶氧化,导致鲁米诺自由基的生成;同时由于自由基进一步反应会使其发光,而当抗氧化性物质存在并发生反应的时候,光的强度将被减弱,由此根据光强度被减弱的程度来评价抗氧化性物质的抗氧化能力【B嘲。6荧光法在保健食品抗氧化体外实验中的应用
目前荧光法不仪在保健食品抗氧化研究体外实验中得到比较广泛的应用,而且已经取得大量的科研成果和数据。张爱梅等【19】采用罗丹明6G—Co也H20:体系荧光法对14种常见蔬菜进行抗氧化活性测定。通过比较,证明菠菜、油菜、韭菜、香菜、雪里蕻这5种绿叶蔬菜具有较好的抗氧化能力,而且发现这些具有较强抗氧化性蔬菜的共同特点是町食用部分都带有绿叶,这为人们寻找抗氧化性天然可食植物提供一条更快捷的参考途径。在该实验中充分利用了荧光法重现性好(相对标准偏差RSD为1.63%)、快捷(只需15min)、样品前处理简单(水提取)等优点,对大量蔬菜的抗氧化活性进行比较、筛选。是抗氧化研究体外实验中成功应用荧光法对大批量样品进行筛选的一个成功实例。
D矗valos
A等嗍使用抗氧化能力指数(ORAC)法对多
个样品进行测定,包括不同品种的红酒、玫瑰花、类黄酮、
万方数据
AnalysisExamination
肉桂酸、膳食补充品等。结果显示全部样品都具有~定抗氧化能力,并且抗氧化剂浓度和曲线下面积呈现较好的线性关系。另外发现化合物的结构决定了其抗氧化能力。此项研究也很好地利用了荧光法简单、快速、灵敏、准确的特点,在体外对大量样品进行抗氧化能力比较分析中取得了很好的结果。
7化学发光法在保健食品抗氧化体外实验中的应用
近年来化学发光法在保健食品抗氧化体外实验中的应用也十分广泛。取得了不少研究成果和科学数据。
段玉清等【2l】对莲房原花青素(LSPC)进行体内抗氧化研究,结果表明LSPc能提高大鼠机体抗氧化能力,抑制脂质过氧化作用的发生,并能增加皮肤中的胶元蛋白含量。邓乾春等[221用体外实验结果对体内实验结果进行了进一步补充。他们采用多个化学发光体系,研究了测定莲房原花青素(LSPC)的体外抗氧化活性及其对DNA损伤的保护作用。结果表明LSPC具有较好的体外清除活性氧和保护DNA损伤的活性。此研究是成功运用化学发光体外试验结果对体内实验结果进行进一步补充的典型实例。
王建国等闭成功利用流动.化学发光法比较了VC、绿原酸、没食子酸3种物质的抗氧化活性并探讨了用该方法检测抗氧化样品的作用机理。
侯冬岩等嗍通过流动注射化学发光法分析比较了万寿菊花、叶、茎的抗氧化性能。还将化学发光法分析结果与万寿菊花、叶、茎中的黄酮含量进行了分析比较,发现万寿菊花、叶、茎中的黄酮含量与对其抗氧化性的大小有良好的相关性。8总结
荧光法和化学发光法在保健食品抗氧化体外实验研究中已经得到广泛的应用。通过这些成功应用实例可以看到研究者主要利用了荧光法和化学发光法简便、快捷、灵敏度高的特点。在对大批量材料的筛选、对不同样品抗氧化能力的比较以及对保健食品抗氧化功能评价体内实验结果进一步补充方面取得了良好的研究结果,提供了大量有价值的科学数据。但是也应该注意到,由于体外实验的局限性,如果仅用体外实验结果去评价某一个保健食品的抗氧化功能其结果是缺乏说服力的。因此需要在保健食品抗氧化体外实验研究中正确、合理应用这两种方法。随着电子计算机技术和分析仪器的不断发展创新,荧光法和化学发光法在保健食品抗氧化研究体外实验中必将发挥更大作用。参考文献:
【1】OUB,HAMPSCH-WOODILLM,PRIORRL.Developmentandvalida-
tionofanimprovedoxygenradicalabSol'banoecapacityassay
usingfluo-
resctin觞thefluor鹤ccntprobe【J】.JA掣kFoodChem,2001,49:
4619.4626.
分析与检测
中国酿造
2009年第11期总第212期
・13》
黄酒中丁二酸的分离、纯化和鉴定
陈磊,黄雪松幸
(暨南大学食品科学与工程系,广东广州510632)
摘要:采用AB.8大孔树脂和反相C。。柱色谱分离获得了黄酒中的1个较强极性的物质,经红外光谱显示该物质含有C=O键和C.O键,并有-CHr存在;核磁共振谱图显示含有-COOH和.CH2-幕团,其比例为l:1:GC.MS证实了该物质的纯度较高,基峰质荷比为55,M+I
峰的质荷比为119,含有-COOH+(m/芦--45)和亚稳态离子峰c娼+(re/z=27)的碎片,综合解析后推断该物质为丁二酸,为黄洒酿造过程
中微生物发酵所产生,对黄酒的风味和功能都具有重要影响。关键词:黄酒:丁二酸;分离纯化中图分类号:0657.7
文献标识码:A
文章编号:0254—5071(2009)11一0133—03
Isolation,purifica五Oilandidentificationofmccinicacidinricewine
CHEN
Lei,HUANGXuesong・
Universi04Guangzhou510632,China)
(DepartmentofFoodScienceandEngineering,Jinan
ricewinewagisolatedusingAB・8
Abs嘲:A
componentwithhigherpolarityinmacroporous
r鼯inand
RPCI8column
chromatograph.Its
structure
wasdeterminedbyspectralanalysis.TheresultsofinfraredspectrumshowedthatitcontainsC=OandC-Ofunctiongroups,aswellas—CHr.Therc-suitofNMRindicatedthattherewe佗-COOHandCHr,andtheirproportionWas1:1.ItspurityWasprovedtobe11ighbyGC-MS,andm/zofbase
peakandm/z
ofM+lWere55and119,respectively.Italsohadionpeaksof-COOH+(m/z=45)andC2Hf(m/z=27).Based
as
ontheseremits,the
colll.
poundwas
function
inferred
succinicacid,whichisproducedbymicroorganisminriewwine
fermentationandplays
an
important
roleintheflavorand
officewine.
Keywords:ricewine;succinicacid;isolation
andpurification
黄酒是我国历史上最古老的酒种,与啤酒、红酒并称为世界三大古酒,含有丰富的营养素与多种活性物质fl】。由
收稿日期:2009-06.25
于黄酒丰富的原料及独特的酿造工艺,酒液中含有丰富而复杂的成分,除乙醇和水外,还有各种糖、糊精、有机酸、氨
作者简介:陈磊(1983-),男,山东邹平人,在读硕士研究生,主要从事功能活性成分方向的研究;黄雪松・,教授,通讯作者。
【2】刘小兵.生物活性物质的抗氧化能力评价方法及其研究进展叨.中国
食品卫生杂志.2008.20(5):44JD444.
【3】文镜,贺素华,杨育颖,唐秀华.保健食品清除自由基作用的体外测定
方法和原理【J].食品科学2004,25(1).
【4】徐清萍,钟桂芳,盂君.抗氧化荆抗氧化方法研究进展田.食品工程,
20072:23—25.
【14】MARQUELEFD,MAMBRO
V
MDI,GEORGElllS
extracts
R.Assessment
oftheantioxidantactivitiesofBraziliantopical
ofpropolisaloneandin
pharmaceuticalformulations【J】.JPharmaceutBiomedAnal,
2005,39(3.4):455462.
【15】吕晓玲,孔德莉。姚秀玲,等.采用荧光化学发光法研究甜菜红色素的
抗氧化作用【J】.食品与发酵工业,2006,32(10):70-73.
15】魏立娜.荧光分光光度计的结构与应用【J】.生命科学仪器2007,5(7):
63.64.
【16】王世永,李小定,吴谋成.露光化学发光法研究吴茱荚精油的抗氧化作
用【J】.食品科技2008,2:206.208.
【17】赫春香,卢丽男,曹,璨,等.荧光动力学分析新方法测定超氧自由基
【6】杨根元.实用仪器分析【l叼.北京:北京大学出版社2001.
【7】王崔平.荧光法测定羟基自由基及中草药抗氧化性【J】.德州学院学报,
200723(4):04,14,24.
【18】张爱梅,臧运波.罗丹明6(3批H20:体系荧光法测定常见蔬菜的抗
氧化活性m.食品科学0004,25(I):149-152.
【19】DdvalosA'GOmezd20rdovesC,Bartolom*B.Extendingapplicabilityof
theoxygenradicalabsorbanceAgricFood
抑制刺的抗氧活性们.辽宁师范大学学报:自然科学版2005,01:75.77.
【81张爱梅,减运波.丁基罗丹明&Fe2+.Hp:体系荧光法测定茶叶的抗氧化活性【J】.分析科学学报,2005,21(4):435-437.
【9】李超,刘树元,李嫒嫒,等.化学发光分析法的发展与应用阴.分析测试技术与仪器,2006,12(6):75-81.
【1o】吴风武,何治柯,罗庆尧,等.化学发光分析新进展们.分析测试学报,
2000,19(1):8l・88.
【ll】续洁琨,姚新生,栗原博.抗氧化能力指数(ORAC)测定原理及应用
叨.中国药理学通报,2006,22(8):lOl5-1021.
【12】李明静,王金中,刘绣华.鲁米诺.过氧化氢一铜Ⅱ化学发光法测定儿
茶素阴.分析化学2001,5(29):613.
【13】CAOG,ALESSIoHM,CIr11。ERRG.Oxygen・radicalabsorb狃cc
paeityassayfor303.311.
Ca-
capacity(ORAC—fluorescein)assay【J】.J
Chem,2004,52(I):48-54.
[20】段玉清,谢笔钧.莲房原花青素体内抗氧化研究叨.营养学报,2003(3):
87-89.
【2l】邓乾春,陈春艳,田斌强,等.化学发光法研究莲房原花青素的体外抗
氧化活性和对DNA损伤的保护作用【J】.天然产物研究与开发2007(4):22—26.
【22】王建国,汪敬武.流动.化学发光法比较三种物质的抗氧化活性明.
食品科技。2007(7):148.150.
【23】侯冬岩,回瑞华,刘晓嫒,等.万寿菊花、叶、茎中黄酮的含量及抗氧化
性能的分析【J】.鞍山师范学院学报.2008,10“):15.18.
antioxidants【J】.Free
RadicalBie
Med’1993,14:
万方数据