星点设计-效应面法优化穿心莲提取工艺
杨涛
1,2
,盛欢欢,李岩,董贤伟,王长虹
3311,2*
,王峥涛
1,2
(1.上海中医药大学中药研究所,中药标准化教育部重点实验室,中药
新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点研究室,上海市复方中药重点实验室,上海201210;2.上海中药标准化研究中心,上海201210,3.新疆医科大学药学院药剂教研室,乌鲁木齐830054)
摘要:目的 采用星点设计-效应面法优化穿心莲的超声提取工艺。方法 以乙醇浓度、提取时间和溶媒比为自变量,以穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的收率和浸膏得率为因变量,通过对自变量的总评归一值进行多元线性回归和二项式拟合,采用效应面优化最佳的工艺条件。结果 确定超声提取工艺条件为乙醇浓度(X:70%~80%;提取时间(X:1)2)50~70min;溶媒比(X:10~12倍,工艺验证的总评归一预测値与实测值的偏差为-2.6%,二项式拟合的复相关系数r=3)0.9713。结论 采用星点设计-效应面法优选方法优化的穿心莲内酯提取工艺,方法简便、预测性良好。关键词:穿心莲;穿心莲内酯;提取工艺;星点设计;效应面法
中图分类号:R283 文献标志码:A 文章编号:1001-2494(2011)03-0208-06
OptimizationofExtractionProcessofAndrographispaniculatabyCentralCompositeDesign-ResponseSur-faceMethodology
YANGTao,SHENGHuan-huan,LIYan,DONGXian-wei,WANGChang-hong
1,2
3
3
1
1,2*
,WANGZheng-tao
1,2
(1.TheMOEKeyLaboratoryforStandardizationofChineseMedicinesandTheSATCMKeyLaboratoryforNewResourcesandQualityE-valuationofChineseMedicines,InstituteofChineseMateriaMedica,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,ShanghaiKeyLaboratoryofComplexPrescription,Shanghai201210,China;2.ShanghaiR&DCentreforStandardizationofChineseMedicines,Shanghai201203,China;3.DepartmentofPharmaceutics,CollegeofPharmacyofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE TooptimizetheprocessofextractingeffectiveconstituentsfromAndrographispaniculatabycentralcom-positedesign-responsesurfacemethodology.METHODS Ethanolconcentration,timeforultrasoundextractionandratioofsolventtorawmaterialwereselectedasindependentvariables.Theoveralldesirabilityoftheextractionratesofandrographolide,neoandrogra-pholide,anddehydroandrographolideandtheextractyieldsweresetasdependentvariables.Linearornonlinearmathematicmodelswereusedtoestimatetherelationshipbetweenindependentanddependentvariables.Responsesurfacemethodologywasusedtoopti-mizetheprocessofextraction.RESULTS Themultiplecorrelationcoefficientofbinomialfittingofthecomplexmodelwasashighas0.9713.Theoptimalconditionsofextractionprocessweredeterminedasfollows:Themateriamedicawasultrasoundextractedfor50-70minwith10-12foldsolventof70%-80%ethanol.Thedeviationbetweenobservedandpredictedvalueswas-2.6%.CONCLUSION Thecentralcompositedesign-responsesurfacemethodologyisconvenientandhighlypredictiveforoptimizingtheex-tractionprocessofAndrographispaniculata.
KEYWORDS:Andrographispaniculata;andrographolide;extractionprocess;centralcompositedesign;responsesurfacemethodology
穿心莲为爵床科属植物穿心莲[Andrographispaniculata(Burm.F.)Nees]的干燥地上部分,味苦,性寒。归心、肺、大肠、膀胱经。具有清热解毒、凉血、消肿、燥湿等作用,用于感冒发热、咽喉肿痛、口舌生疮、顿咳劳嗽、泄泻痢疾、热淋涩痛、痈肿疮疡、毒蛇咬伤的治疗
[1]
drographolide)、新穿心莲内酯(neoandrographolide)、脱水穿心莲内酯(dehydroandrographolide)含量最多
[2]
。穿心莲总内酯的提取方法较多,主要有超临
[3]
界CO2流体萃取法、热提取法和冷浸法
[5]
[4]
等。
星点设计(centralcompositedesign,CCD)具有实验次数少、实验精度高等特点
。它常结合效应
面法(responsesurfacemethodology)优化考察因素,
。穿心莲地上部分主要化学
成分为二萜内酯类化合物,其中穿心莲内酯(an-
基金项目:上海市科委纳米专项资助课题(0952nm05200);上海市教育委员会科研创新项目(11ZZ113)
作者简介:杨涛,男,博士研究生 研究方向:中药药效物质基础与质量标准研究 *通讯作者:王长虹,男,教授,博士生导师 研究方向:中药新制剂与体内过程研究 Tel:(021)51322511 Fax:(021)51322519 E-mail:[email protected]·208·
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从效应面上选择较佳的效应区,从而回推出自变量取值范围,即最佳实验条件。尽管效应对因素的真实效应面不可能完全用数学模型表达,但可以用某一数学模型近似进行模拟,依据该模型描绘的效应面进行条件优选,效应面法使用起来直观、方便、效果较好,近年国内也有其用于优化中药提取工艺的报道。本实验采用超声提取工艺对穿心莲进行提取,利用星点设计效应面法优化了该提取工艺条件,以穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和总浸膏的收率的总评归一值(overalldesira-bility,OD)为预测指标,二项式拟合的复相关系r=0.9713,并确定优化的超声提取工艺条件为乙醇浓度(X:70%~80%;提取时间(X:1)2)50~70min;溶剂倍数(X:10~12倍。实验表3)
明,星点设计效应面法优化对穿心莲超声提取工艺拟合效果好。
1 仪器与材料
Aglient1100高效液相色谱仪(包括自动进样器,DAD紫外可见检测器和色谱数据处理软件),分析天平(塞多利斯公司),EYELA旋转蒸发仪(东京理化公司),KQ-250DE型数据超声波清洗器。ODS分析色谱柱Ultrasphere-C4.6mm×2518柱(cm,5μm,BeckmanCoulter公司),FA2004电子天平(上海天平仪器厂),超纯水器(Millipore公司),KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
穿心莲内酯(批号110797-200307)和脱水穿心莲内酯(批号110854-200306)对照品(中国药品生物制品检定所);新穿心莲内酯(上海中药标准化研究中心,纯度≥98.5%)对照品。乙腈(色谱纯),超纯水(自制),穿心莲药材(购于上海康桥中药饮片有限公司)。2 方法与结果2.1 穿心莲内酯、新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯测定方法的建立
2.1.1 供试品溶液的制备 取穿心莲提取物10mg,精密称定,置10mL量瓶中,加75%乙醇溶解后,定容,摇匀,过0.45μm滤膜,取续滤液,作为供试品溶液。
2.1.2 对照品溶液的制备 取减压干燥至恒重的穿心莲内酯、新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品适量,精密称定,以甲醇分别制成每1L含534.0
246卷第期
[6-7]
mg穿心莲内酯、362.0mg新穿心莲内酯和324.0mg脱水穿心莲内酯的混合对照品贮备液。
2.1.3 色谱条件 色谱柱为反相碳十八柱,ODS
Ultrasphere(4.6mm×25cm,5μm);流动相A为0.2%冰醋酸水溶液,B为含0.1%冰醋酸的乙腈,分析时间55min,梯度洗脱条件为:0~20min,B:20%~25%;20~30min,B:25%~30%;30~40min,B:30%~40%;40~50min;B:40%~55%,50~55min;B:55%~80%。柱温:30℃;检测波长:190~400nm全波长,其中穿心莲内酯、新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯分别选取224,210,254nm作为检测波长;进样量:20μL。
2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取穿心莲内酯对照品534.0mg·L、新穿心莲内酯362.0mg·-1-1L和脱水穿心莲内酯324.0mg·L贮备液适量,加甲醇稀释成26.7~534.0mg·L、18.1~362.0mg·L和16.2~324.0mg·L的一系列对照品溶液,按“2.1.3”色谱条件进行测定。以峰面积积分值为纵坐标(y),以质量浓度为横坐标(ρ,mg·L)绘制标准曲线。标准曲线分别为:穿心莲内酯为y=40106ρ-101.8(r=0.9998);新穿心莲内酯为y=28597ρ-7.6268(r=1.0000);脱水穿心莲内酯为y=28368ρ-89.184(r=0.9998)。穿心莲内酯、新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的线性范围分别为:26.70~534.0、18.10~362.0和16.20~
-1
324.0mg·L。2.1.5 日内和日间精密度实验 将混合对照品溶液(穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯
-1
45.4、45.2和50.0mg·L)重复进样5次,按“2.1.3”项下的色谱条件进行测定,计算日内精密度。结果表明,穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯的RSD分别为1.16%、0.23%和0.60%。分别将3个质量浓度的混合对照品溶液在3d内连续进样分析,按“2.1.3”项下的色谱条件进行测定,计算日间精密度。穿心莲内酯在质量浓度26.7、
-1
144.2和534.0mg·L的RSD分别为0.76%、0.46%和0.18%;新穿心莲内酯在质量浓度为18.1、97.7和362.0mg·L的RSD分别为0.78%、1.44%和1.75%;脱水穿心莲内酯在质量
-1
浓度为16.2、87.5和324.0mg·L的RSD分别为0.66%、0.79%和1.22%。
2.1.6 稳定性 将混合对照品溶液(穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯质量浓度分别为
-1
45.44、45.2和50mg·L),分别在0,1,5,48,96,
r,bru,3
·209·
-1
-1
-1
-1
-1
-1
120h按“2.1.3”色谱条件测定样品峰面积。计算不同时间测得峰面积间的相对标准偏差以衡量样品溶液的稳定性。穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯的RSD分别为1.40%、1.31%和0.77%。结果表明,3种内酯均在120h内能稳定。2.1.7 重现性 取穿心莲内酯提取物3份,精密称定,照“2.1.1”项下方法处理,在“2.1.3”色谱条件下,测定3份样品中3种穿心莲内酯的含量,计算RSD值。结果穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯的RSD分别为0.91%、0.99%和1.34%,表明重现性良好。
2.1.8 加样回收率实验 分别精密称取3种穿心莲内酯对照品适量,加入已知含量的穿心莲内酯提取物中,按照“2.1.1”项下方法处理,在“2.1.3”色谱条件下进行含量测定,计算回收率。结果穿收莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内脂平均回收率分别为98.44%,100.22%,101.00%,RSD分别为1.03%、0.66%、0.69%(n=9)。2.1.9 醇提物浸膏得率的测定 将穿心莲提取物滤液,减压除去溶剂后,置60℃下减压干燥至恒重,置干燥器中冷却30min,迅速称定重量,计算醇提物的浸膏得率,并得到干燥的穿心莲内酯提取物,备用。
2.2 穿心莲内酯不同提取工艺比较研究
分别采用文献优化的回流提取法和浸渍法,以及超声法进行不同工艺比较研究。
回流提取法:称取100g穿心莲药材粗粉置1000mL圆底烧瓶中,加入8倍量的体积分数70%乙醇,在电热套中加热回流提取2次,每次3h,滤过,合并滤液后,减压除去溶剂,置60℃下减压干燥至恒重,置干燥器中冷却30min,迅速称定重量,计算醇提物的浸膏得率,并依照“2.1.3”项下方法测定穿心莲内酯的含量。
浸渍法:称取100g穿心莲药材粗粉,置1000mL三角瓶中,加入8倍量的体积分数70%乙醇,浸渍2d,滤过,药渣再加入10倍量的体积分数70%乙醇,再浸渍2d,滤过,合并滤液,减压除去溶剂,其后按回流提取法项下“置60℃下减压干燥……”方法操作,测定穿心莲内酯的含量。
超声法:称取100g穿心莲药材粗粉,置1000mL三角瓶中,加入8倍量的体积分数70%乙醇,超声法提取2次,每次30min,滤过,合并滤液后,减压除去溶剂,其后按回流提取法项下“置60℃下减压干燥……”方法操作,测定穿心莲内酯的含量。实
·210·
[4]
验结果见表1。
实验结果表明,采用超声提取法和冷浸法比回流提取法所得浸膏穿心莲内酯的含量要高,而冷浸法虽然在提取时不消耗能源,但浸渍时间较长,而采用超声提取法耗时较短,而且穿心莲内酯的含量也较高,因而,本实验采用星点设计法对超声提取工艺进行优化。2.3 星点实验设计及数据处理
2.3.1 星点实验设计 影响超声提取工艺的主要因素有乙醇浓度(X、提取时间(X、溶媒比(X1)2)3)和提取次数。而提取次数为非连续性数据,一般在考察时单独研究,在本实验中选取提取次数为3次。将以上3个因素作自变量,设定因素水平表,见表2。依据因素水平表,取穿心莲10g,加适宜浓度的乙醇超声提取,提取3次,滤过,取滤液,分别依照“2.1.3”和“2.1.9”项下的方法,分别测定3种穿心莲内酯的收率和总浸膏得率,结果见表3。另外,将表3中提取物穿心莲内酯(Y、脱水穿心莲内酯1)(Y和新穿心莲内酯(Y的收率(测得各内酯的重2)3)量/药材重量×100%)、浸膏收率(测得浸膏的重量/药材重量×100%,Y数值标准化为0~1间的4)归一值(desirability),并将归一值求算几何平均数,得总评归一值(overalldesirability,OD)。OD=(d1,d为指标数,对取值越小越好的效2,……,dn),n应和取值越大越好的效应采用Hassan方法分别进行数学转换求“归一值”d和d(Yminmax,dmin=max-Y)/(Y,dY/(Yimax-Ymin)max=(i-Ymin)max-Ymin)。另外,本实验要求所提取的穿心莲内酯、新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的收率越大越好,而总浸膏的含量越小越好,使各提取成分含量高而杂质含量少。
2.3.2 效应面法数据处理 采用Matlab7.8软件,以各总评归一值对自变量进行多元线性回归和二项式拟合,以方程的P
表1 不同提取工艺对穿心莲内酯提取效果的影响.n=2Tab.1 EffectsofextractionprocessesontheextractionratesofAndrographispaniculata.n=2
ExtractionprocessRefluxextractionMacerationextractionUltrasonicextraction
Crudedrugweight/g100100100
Extract/g20.0315.1014.71
AND1.395.926.27
Content/%DEH2.062.432.19
NEO4.343.654.78
[5]
1/n
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表2 星点设计因素与水平
Tab.2 Factorsandlevelsforcentralcompositedesign
Factor
Ethanolconcentration(X%1)/Extracttime(X/min2)Solventration(Xatio3)/r
Level
-1.73210105
-126.9022.687.12
0504010
173.1057.3312.89
1.732907015
表3 星点实验设计与结果.n=2
Tab.3 Arrangementandresultsofcentralcompositedesign.n=2
No.1
[***********]15~20
X126.973.126.973.126.973.126.973.[**************]
X222.722.857.357.322.622.757.357.[**************]
X37.17.17.17.112.912.912.912.[1**********]510
AND(Y1,%)0.661.490.521.700.801.821.352.150.401.401.181.381.060.641.52
DEH(Y2,%)0.20
0.360.130.410.210.450.360.530.020.370.270.340.280.210.43
NEO(Y3,%)0.12
0.400.070.470.180.510.190.600.040.430.280.330.300.380.49
Extractyield(Y4,%)15.54
12.6812.3514.8019.8017.6424.3616.9016.9113.6216.0019.7913.8711.0015.90
OD(Y)0.25
0.640.150.690.270.680.000.800.000.630.450.510.620.460.37
性方程:Y=1.586×10
-4
-3
-2
+1.002×10X4.314×l-
-2
数,并令其等于0,得出的工艺条件为:X328.96,1=X93.68,X36.83,很明显该条件已超出实2=-3=
际范围,不能作为最佳条件。因此,依据效应面和等高线图,将各效应面和等高线的区域进行重叠,得较优区域,再结合实际实验数据(OD值的范围在0.6~0.8较适合),选取穿心莲的提取较佳工艺范围为:乙醇浓度(X:70%~80%;提取时间(X:1)2)50~70min;溶剂倍数(X:10~12倍。3)
2.3.3 验证与放大实验 依据效应面法优化的工艺条件范围,选取乙醇浓度75%(X、提取时间501)min(X和溶媒比12倍(X的工艺条件,提取穿心2)3)莲3份(每份10g),进行工艺验证。结果表明,二项式拟合方程预测值与实测值的偏差为-2.6%[偏差=(预测值-实测值)/预测值×100%],这说明二项式拟合效果良好,可信度高,按此工艺得到的穿心莲提取物中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯的含量分别为11.1%、2.7%和2.9%,结果见表4。另取穿心莲100g,依照此法工艺提取,得穿心莲提取物的含量分别为:穿心莲内酯10.3%、脱水穿心莲内酯2.1%、新穿心莲内酯2.2%,总的提取物得率为14.9%,与用10g药材得到的结果比较,差别不大。
r,bru,3
·211·
10X6.479×10Xr=0.9127,RMSE=0.15,2-3(F=18.30,P
2
-4
-4
-3
X0.015X1-2--4
X5.049×101X2+
-5
2
X1X3--4
X3.753×102X3--3
2
X1.160×101+
X6.588×102+Xr=0.9740,RMSE=0.047,3(
F=10.26,P=0.0098,预测相关系数为-75.5911)。根据统计软件对各项系数进行的t检验结果,删除P>0.5的项后,再进行二项式方程拟合,达到简化模型目的。所得方程为:Y=1.477-0.021X0.189X1.540×102-3+10
-4
-4
X3.917×1X2+
-3
X1.591×101X3+
-4
X+8.134×10
2
2
X(r=
23
0.9713,RMSE=0.060,F=18.95,P=0.0003,预测相关系数0.8914)。从拟合方程的相关系数可见,多元线性回归方程的相关系数较低,表示自变量与因变量之间线性相关性较差,所以不宜用线性模型,而多元二项式拟合方程相关系数较高,拟合效果较好。另外,固定3个自变量之一为中值,以拟合的目标函数为数学模型,绘制因变量的曲面和等高线图见图1~3。根据二项式分别对X1,X2,X3求偏导
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3 讨 论
据报道,采用体积分数75%和65%乙醇浸渍工
·212·
艺及体积分数55%乙醇渗漉工艺所得穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量较高,而可能受温度的影
月第463
,,
表4 放大实施验证实验结果.n=3,x ±s
Tab.4 Resultsofverificationtest.n=3, x±s
Item
Yieldofandrographolide/%Yieldofneoandrographolide/%Yieldofdehydroandrographolide/%YieldofExtract/%OD
ObservedvaluePredictedvalueDeviation1.74±0.090.46±0.02
0.41±0.0215.64±0.700.6859
----0.6679
-----2.60%
理,这对于提取工艺最佳范围选择是重要的参考。通过对工艺验证发现OD的预测值与实测值的偏差为-2.6%,而且提取物中内酯类成分收率较高,而
浸膏得率也并不是太高,这正符合实验预期。因此,采用星点设计-效应面法选择的穿心莲超声提取工艺方法简便,拟合结果合理、可靠。
REFERENCES
[1] Ch.P(2005)VolI(中国药典2005年版.一部)[S].2005:
189.[2] HEEN,ZHAOF.Studyprogressandpharmacologicalactionof
andrographitis[J].GuidJTraditChinMed(中医药导报),2007,13(5):107-108.[3] GEFH,LINXX,HUANXF,etal.Studyonextractionofac-tiveingredientsfromAndrographispanicuatausingtheorthogonal
experimentwithsupercrificalcarbondioxide[J].JChinMedMat(中药材),2002,25(2):101-102.[4] ZHANGJQ,ZHANGL,WANGH,etal.Studyonextraction
processofAndrographispaniculata[J].FoodDrug(食品与药品),2005,7(1A):37-40.[5] GANLC,HOUX,BIYQ,etal.Optimizedpreparationoftan-shinonesⅡA-loadednanoparticlesbycentralcompositedesign
andresponsesurfacemethod[J].ChinPharmJ(中国药学杂志),2007,42(10):758-760.[6] WUQ,WANGYR,WUH.Optimizationofcellulasehydrolysis
extractionprocessofFoliumginsengbycentralcompositedesign/responsesurfacemethodology[J].ChinJExpTraditMedForm(中国实验方剂学杂志),2006,12(4):5-8.[7] SUNL,WANGYR.Optimalextractionofeffectiveconstituents
fromRadixpolygalaebasedoncentralcompositedesign/responsesurfacemethodology[J].ChinTraditPatMed(中成药),2006,28(3):328-331.
(收稿日期:2010-08-09)
响,采用回流提取法所得提取物中穿心莲内酯含量欠佳
[3]
。因而对超声提取穿心莲的工艺值得研究。
在考察提取工艺时,能使穿心莲提取物的总浸膏得
率量达到最少,而又能使3种内酯的成分含量高,是比较理想的提取结果。通过采用星点设计效应面法优化提取工艺所得二项式拟合的复相关系数r=0.9713,预测相关系数为0.8914,表明拟合实验结果良好,对工艺的优化结果可信度较高。
另外,在数据处理时,根据二项式方程分别对X1、X2和X3求偏导数,并令其等于0解出的最佳的水平组合为:X.96,X68,X1=3282=-93.3=36.83,这样的工艺条件明显不符合实际。这主要是由于在选取考察提取结果时要求提取物浸膏量收率少,而内酯类成分收率高有关,使得各因素对OD值的影响比较复杂,二项式的极值也就可能超出范围。另外,总评归一值的范围应为[0,1],效应面中出现大于1的值均是二项式拟合结果,与实际并不一致。而且在实际研究中发现,OD值在0.6~0.8比较合
第三届全国妇产科药学大会第一轮征文通知
妇产科领域面对的是妇女、胎儿、新生儿,用药的科学性、先进性及实用性尤为重要。为进一步提高妇产科诊疗质量及安全性,实现合理用药,为临床医生和患者提供全程、专业的药学服务,中国药学会医院药学专业委员会组织的“临床治疗进展与临床药学学术研讨会”系列活动之一———“第三届全国妇产科药学大会”,拟于2011年9月在北京举办。
此次会议主题是:围孕期和妊娠期用药及安全性评价。现面向全国医院药师、临床医生、研究开发及医药相关领域人员征稿。
1 征文范围 ①孕产妇的合理用药、用药咨询策略与分析;②避孕药物与妇女生殖健康;③妊娠期糖尿病治疗药物的有效性及安全性评价;④妊娠期高血压疾病的药物治疗相关研究;⑤妇产科药物新剂型研究与开发;⑥围孕期用药的安全性评价及调研;⑦多囊卵巢综合征相关代谢综合征的药物治疗;⑧体外受精-胚胎移植的激素替代治疗及安全性评价;⑨产科抗菌药物合理应用;⑩妇产科药学学科建设的思考与体会;1中药在产科的合理应用及安全性评价。
2 征文要求 ①未在公开发行期刊或全国性学术会议上发表或交流过的论文,文责自负;②论著不超过3500字,综述不超过5000字,并附300字以内的中英文摘要;③请用宋体、4号字、1.5倍行距编辑稿件,格式按《中国药学杂志》2011年第一期稿约;④请用E-mail传递或邮寄稿件;⑤请注意字迹清楚,数据准确;注明作者姓名、职称、单位、地址、邮编、联系电话。合格论文将录入大会论文集;⑥投稿截止日期2011年8月22日(以邮戳为准),稿件及信封请注明“妇药会征文”字样;⑦收到您提交的论文后,会议筹备组将回复电子邮件或以其他形式确认。论文录用与否,一律不退稿,请自留底稿。
联系人:蔡婧、钟燕;电话:010-58699019/20-8006,58699025,58699392;传真:010-58699035;E-mail:[email protected]。
[本刊讯]
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星点设计-效应面法优化穿心莲提取工艺
杨涛
1,2
,盛欢欢,李岩,董贤伟,王长虹
3311,2*
,王峥涛
1,2
(1.上海中医药大学中药研究所,中药标准化教育部重点实验室,中药
新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点研究室,上海市复方中药重点实验室,上海201210;2.上海中药标准化研究中心,上海201210,3.新疆医科大学药学院药剂教研室,乌鲁木齐830054)
摘要:目的 采用星点设计-效应面法优化穿心莲的超声提取工艺。方法 以乙醇浓度、提取时间和溶媒比为自变量,以穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的收率和浸膏得率为因变量,通过对自变量的总评归一值进行多元线性回归和二项式拟合,采用效应面优化最佳的工艺条件。结果 确定超声提取工艺条件为乙醇浓度(X:70%~80%;提取时间(X:1)2)50~70min;溶媒比(X:10~12倍,工艺验证的总评归一预测値与实测值的偏差为-2.6%,二项式拟合的复相关系数r=3)0.9713。结论 采用星点设计-效应面法优选方法优化的穿心莲内酯提取工艺,方法简便、预测性良好。关键词:穿心莲;穿心莲内酯;提取工艺;星点设计;效应面法
中图分类号:R283 文献标志码:A 文章编号:1001-2494(2011)03-0208-06
OptimizationofExtractionProcessofAndrographispaniculatabyCentralCompositeDesign-ResponseSur-faceMethodology
YANGTao,SHENGHuan-huan,LIYan,DONGXian-wei,WANGChang-hong
1,2
3
3
1
1,2*
,WANGZheng-tao
1,2
(1.TheMOEKeyLaboratoryforStandardizationofChineseMedicinesandTheSATCMKeyLaboratoryforNewResourcesandQualityE-valuationofChineseMedicines,InstituteofChineseMateriaMedica,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,ShanghaiKeyLaboratoryofComplexPrescription,Shanghai201210,China;2.ShanghaiR&DCentreforStandardizationofChineseMedicines,Shanghai201203,China;3.DepartmentofPharmaceutics,CollegeofPharmacyofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE TooptimizetheprocessofextractingeffectiveconstituentsfromAndrographispaniculatabycentralcom-positedesign-responsesurfacemethodology.METHODS Ethanolconcentration,timeforultrasoundextractionandratioofsolventtorawmaterialwereselectedasindependentvariables.Theoveralldesirabilityoftheextractionratesofandrographolide,neoandrogra-pholide,anddehydroandrographolideandtheextractyieldsweresetasdependentvariables.Linearornonlinearmathematicmodelswereusedtoestimatetherelationshipbetweenindependentanddependentvariables.Responsesurfacemethodologywasusedtoopti-mizetheprocessofextraction.RESULTS Themultiplecorrelationcoefficientofbinomialfittingofthecomplexmodelwasashighas0.9713.Theoptimalconditionsofextractionprocessweredeterminedasfollows:Themateriamedicawasultrasoundextractedfor50-70minwith10-12foldsolventof70%-80%ethanol.Thedeviationbetweenobservedandpredictedvalueswas-2.6%.CONCLUSION Thecentralcompositedesign-responsesurfacemethodologyisconvenientandhighlypredictiveforoptimizingtheex-tractionprocessofAndrographispaniculata.
KEYWORDS:Andrographispaniculata;andrographolide;extractionprocess;centralcompositedesign;responsesurfacemethodology
穿心莲为爵床科属植物穿心莲[Andrographispaniculata(Burm.F.)Nees]的干燥地上部分,味苦,性寒。归心、肺、大肠、膀胱经。具有清热解毒、凉血、消肿、燥湿等作用,用于感冒发热、咽喉肿痛、口舌生疮、顿咳劳嗽、泄泻痢疾、热淋涩痛、痈肿疮疡、毒蛇咬伤的治疗
[1]
drographolide)、新穿心莲内酯(neoandrographolide)、脱水穿心莲内酯(dehydroandrographolide)含量最多
[2]
。穿心莲总内酯的提取方法较多,主要有超临
[3]
界CO2流体萃取法、热提取法和冷浸法
[5]
[4]
等。
星点设计(centralcompositedesign,CCD)具有实验次数少、实验精度高等特点
。它常结合效应
面法(responsesurfacemethodology)优化考察因素,
。穿心莲地上部分主要化学
成分为二萜内酯类化合物,其中穿心莲内酯(an-
基金项目:上海市科委纳米专项资助课题(0952nm05200);上海市教育委员会科研创新项目(11ZZ113)
作者简介:杨涛,男,博士研究生 研究方向:中药药效物质基础与质量标准研究 *通讯作者:王长虹,男,教授,博士生导师 研究方向:中药新制剂与体内过程研究 Tel:(021)51322511 Fax:(021)51322519 E-mail:[email protected]·208·
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从效应面上选择较佳的效应区,从而回推出自变量取值范围,即最佳实验条件。尽管效应对因素的真实效应面不可能完全用数学模型表达,但可以用某一数学模型近似进行模拟,依据该模型描绘的效应面进行条件优选,效应面法使用起来直观、方便、效果较好,近年国内也有其用于优化中药提取工艺的报道。本实验采用超声提取工艺对穿心莲进行提取,利用星点设计效应面法优化了该提取工艺条件,以穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和总浸膏的收率的总评归一值(overalldesira-bility,OD)为预测指标,二项式拟合的复相关系r=0.9713,并确定优化的超声提取工艺条件为乙醇浓度(X:70%~80%;提取时间(X:1)2)50~70min;溶剂倍数(X:10~12倍。实验表3)
明,星点设计效应面法优化对穿心莲超声提取工艺拟合效果好。
1 仪器与材料
Aglient1100高效液相色谱仪(包括自动进样器,DAD紫外可见检测器和色谱数据处理软件),分析天平(塞多利斯公司),EYELA旋转蒸发仪(东京理化公司),KQ-250DE型数据超声波清洗器。ODS分析色谱柱Ultrasphere-C4.6mm×2518柱(cm,5μm,BeckmanCoulter公司),FA2004电子天平(上海天平仪器厂),超纯水器(Millipore公司),KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
穿心莲内酯(批号110797-200307)和脱水穿心莲内酯(批号110854-200306)对照品(中国药品生物制品检定所);新穿心莲内酯(上海中药标准化研究中心,纯度≥98.5%)对照品。乙腈(色谱纯),超纯水(自制),穿心莲药材(购于上海康桥中药饮片有限公司)。2 方法与结果2.1 穿心莲内酯、新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯测定方法的建立
2.1.1 供试品溶液的制备 取穿心莲提取物10mg,精密称定,置10mL量瓶中,加75%乙醇溶解后,定容,摇匀,过0.45μm滤膜,取续滤液,作为供试品溶液。
2.1.2 对照品溶液的制备 取减压干燥至恒重的穿心莲内酯、新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯对照品适量,精密称定,以甲醇分别制成每1L含534.0
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mg穿心莲内酯、362.0mg新穿心莲内酯和324.0mg脱水穿心莲内酯的混合对照品贮备液。
2.1.3 色谱条件 色谱柱为反相碳十八柱,ODS
Ultrasphere(4.6mm×25cm,5μm);流动相A为0.2%冰醋酸水溶液,B为含0.1%冰醋酸的乙腈,分析时间55min,梯度洗脱条件为:0~20min,B:20%~25%;20~30min,B:25%~30%;30~40min,B:30%~40%;40~50min;B:40%~55%,50~55min;B:55%~80%。柱温:30℃;检测波长:190~400nm全波长,其中穿心莲内酯、新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯分别选取224,210,254nm作为检测波长;进样量:20μL。
2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取穿心莲内酯对照品534.0mg·L、新穿心莲内酯362.0mg·-1-1L和脱水穿心莲内酯324.0mg·L贮备液适量,加甲醇稀释成26.7~534.0mg·L、18.1~362.0mg·L和16.2~324.0mg·L的一系列对照品溶液,按“2.1.3”色谱条件进行测定。以峰面积积分值为纵坐标(y),以质量浓度为横坐标(ρ,mg·L)绘制标准曲线。标准曲线分别为:穿心莲内酯为y=40106ρ-101.8(r=0.9998);新穿心莲内酯为y=28597ρ-7.6268(r=1.0000);脱水穿心莲内酯为y=28368ρ-89.184(r=0.9998)。穿心莲内酯、新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的线性范围分别为:26.70~534.0、18.10~362.0和16.20~
-1
324.0mg·L。2.1.5 日内和日间精密度实验 将混合对照品溶液(穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯
-1
45.4、45.2和50.0mg·L)重复进样5次,按“2.1.3”项下的色谱条件进行测定,计算日内精密度。结果表明,穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯的RSD分别为1.16%、0.23%和0.60%。分别将3个质量浓度的混合对照品溶液在3d内连续进样分析,按“2.1.3”项下的色谱条件进行测定,计算日间精密度。穿心莲内酯在质量浓度26.7、
-1
144.2和534.0mg·L的RSD分别为0.76%、0.46%和0.18%;新穿心莲内酯在质量浓度为18.1、97.7和362.0mg·L的RSD分别为0.78%、1.44%和1.75%;脱水穿心莲内酯在质量
-1
浓度为16.2、87.5和324.0mg·L的RSD分别为0.66%、0.79%和1.22%。
2.1.6 稳定性 将混合对照品溶液(穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯质量浓度分别为
-1
45.44、45.2和50mg·L),分别在0,1,5,48,96,
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-1
-1
-1
-1
-1
-1
120h按“2.1.3”色谱条件测定样品峰面积。计算不同时间测得峰面积间的相对标准偏差以衡量样品溶液的稳定性。穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯的RSD分别为1.40%、1.31%和0.77%。结果表明,3种内酯均在120h内能稳定。2.1.7 重现性 取穿心莲内酯提取物3份,精密称定,照“2.1.1”项下方法处理,在“2.1.3”色谱条件下,测定3份样品中3种穿心莲内酯的含量,计算RSD值。结果穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯的RSD分别为0.91%、0.99%和1.34%,表明重现性良好。
2.1.8 加样回收率实验 分别精密称取3种穿心莲内酯对照品适量,加入已知含量的穿心莲内酯提取物中,按照“2.1.1”项下方法处理,在“2.1.3”色谱条件下进行含量测定,计算回收率。结果穿收莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内脂平均回收率分别为98.44%,100.22%,101.00%,RSD分别为1.03%、0.66%、0.69%(n=9)。2.1.9 醇提物浸膏得率的测定 将穿心莲提取物滤液,减压除去溶剂后,置60℃下减压干燥至恒重,置干燥器中冷却30min,迅速称定重量,计算醇提物的浸膏得率,并得到干燥的穿心莲内酯提取物,备用。
2.2 穿心莲内酯不同提取工艺比较研究
分别采用文献优化的回流提取法和浸渍法,以及超声法进行不同工艺比较研究。
回流提取法:称取100g穿心莲药材粗粉置1000mL圆底烧瓶中,加入8倍量的体积分数70%乙醇,在电热套中加热回流提取2次,每次3h,滤过,合并滤液后,减压除去溶剂,置60℃下减压干燥至恒重,置干燥器中冷却30min,迅速称定重量,计算醇提物的浸膏得率,并依照“2.1.3”项下方法测定穿心莲内酯的含量。
浸渍法:称取100g穿心莲药材粗粉,置1000mL三角瓶中,加入8倍量的体积分数70%乙醇,浸渍2d,滤过,药渣再加入10倍量的体积分数70%乙醇,再浸渍2d,滤过,合并滤液,减压除去溶剂,其后按回流提取法项下“置60℃下减压干燥……”方法操作,测定穿心莲内酯的含量。
超声法:称取100g穿心莲药材粗粉,置1000mL三角瓶中,加入8倍量的体积分数70%乙醇,超声法提取2次,每次30min,滤过,合并滤液后,减压除去溶剂,其后按回流提取法项下“置60℃下减压干燥……”方法操作,测定穿心莲内酯的含量。实
·210·
[4]
验结果见表1。
实验结果表明,采用超声提取法和冷浸法比回流提取法所得浸膏穿心莲内酯的含量要高,而冷浸法虽然在提取时不消耗能源,但浸渍时间较长,而采用超声提取法耗时较短,而且穿心莲内酯的含量也较高,因而,本实验采用星点设计法对超声提取工艺进行优化。2.3 星点实验设计及数据处理
2.3.1 星点实验设计 影响超声提取工艺的主要因素有乙醇浓度(X、提取时间(X、溶媒比(X1)2)3)和提取次数。而提取次数为非连续性数据,一般在考察时单独研究,在本实验中选取提取次数为3次。将以上3个因素作自变量,设定因素水平表,见表2。依据因素水平表,取穿心莲10g,加适宜浓度的乙醇超声提取,提取3次,滤过,取滤液,分别依照“2.1.3”和“2.1.9”项下的方法,分别测定3种穿心莲内酯的收率和总浸膏得率,结果见表3。另外,将表3中提取物穿心莲内酯(Y、脱水穿心莲内酯1)(Y和新穿心莲内酯(Y的收率(测得各内酯的重2)3)量/药材重量×100%)、浸膏收率(测得浸膏的重量/药材重量×100%,Y数值标准化为0~1间的4)归一值(desirability),并将归一值求算几何平均数,得总评归一值(overalldesirability,OD)。OD=(d1,d为指标数,对取值越小越好的效2,……,dn),n应和取值越大越好的效应采用Hassan方法分别进行数学转换求“归一值”d和d(Yminmax,dmin=max-Y)/(Y,dY/(Yimax-Ymin)max=(i-Ymin)max-Ymin)。另外,本实验要求所提取的穿心莲内酯、新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的收率越大越好,而总浸膏的含量越小越好,使各提取成分含量高而杂质含量少。
2.3.2 效应面法数据处理 采用Matlab7.8软件,以各总评归一值对自变量进行多元线性回归和二项式拟合,以方程的P
表1 不同提取工艺对穿心莲内酯提取效果的影响.n=2Tab.1 EffectsofextractionprocessesontheextractionratesofAndrographispaniculata.n=2
ExtractionprocessRefluxextractionMacerationextractionUltrasonicextraction
Crudedrugweight/g100100100
Extract/g20.0315.1014.71
AND1.395.926.27
Content/%DEH2.062.432.19
NEO4.343.654.78
[5]
1/n
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表2 星点设计因素与水平
Tab.2 Factorsandlevelsforcentralcompositedesign
Factor
Ethanolconcentration(X%1)/Extracttime(X/min2)Solventration(Xatio3)/r
Level
-1.73210105
-126.9022.687.12
0504010
173.1057.3312.89
1.732907015
表3 星点实验设计与结果.n=2
Tab.3 Arrangementandresultsofcentralcompositedesign.n=2
No.1
[***********]15~20
X126.973.126.973.126.973.126.973.[**************]
X222.722.857.357.322.622.757.357.[**************]
X37.17.17.17.112.912.912.912.[1**********]510
AND(Y1,%)0.661.490.521.700.801.821.352.150.401.401.181.381.060.641.52
DEH(Y2,%)0.20
0.360.130.410.210.450.360.530.020.370.270.340.280.210.43
NEO(Y3,%)0.12
0.400.070.470.180.510.190.600.040.430.280.330.300.380.49
Extractyield(Y4,%)15.54
12.6812.3514.8019.8017.6424.3616.9016.9113.6216.0019.7913.8711.0015.90
OD(Y)0.25
0.640.150.690.270.680.000.800.000.630.450.510.620.460.37
性方程:Y=1.586×10
-4
-3
-2
+1.002×10X4.314×l-
-2
数,并令其等于0,得出的工艺条件为:X328.96,1=X93.68,X36.83,很明显该条件已超出实2=-3=
际范围,不能作为最佳条件。因此,依据效应面和等高线图,将各效应面和等高线的区域进行重叠,得较优区域,再结合实际实验数据(OD值的范围在0.6~0.8较适合),选取穿心莲的提取较佳工艺范围为:乙醇浓度(X:70%~80%;提取时间(X:1)2)50~70min;溶剂倍数(X:10~12倍。3)
2.3.3 验证与放大实验 依据效应面法优化的工艺条件范围,选取乙醇浓度75%(X、提取时间501)min(X和溶媒比12倍(X的工艺条件,提取穿心2)3)莲3份(每份10g),进行工艺验证。结果表明,二项式拟合方程预测值与实测值的偏差为-2.6%[偏差=(预测值-实测值)/预测值×100%],这说明二项式拟合效果良好,可信度高,按此工艺得到的穿心莲提取物中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯和新穿心莲内酯的含量分别为11.1%、2.7%和2.9%,结果见表4。另取穿心莲100g,依照此法工艺提取,得穿心莲提取物的含量分别为:穿心莲内酯10.3%、脱水穿心莲内酯2.1%、新穿心莲内酯2.2%,总的提取物得率为14.9%,与用10g药材得到的结果比较,差别不大。
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10X6.479×10Xr=0.9127,RMSE=0.15,2-3(F=18.30,P
2
-4
-4
-3
X0.015X1-2--4
X5.049×101X2+
-5
2
X1X3--4
X3.753×102X3--3
2
X1.160×101+
X6.588×102+Xr=0.9740,RMSE=0.047,3(
F=10.26,P=0.0098,预测相关系数为-75.5911)。根据统计软件对各项系数进行的t检验结果,删除P>0.5的项后,再进行二项式方程拟合,达到简化模型目的。所得方程为:Y=1.477-0.021X0.189X1.540×102-3+10
-4
-4
X3.917×1X2+
-3
X1.591×101X3+
-4
X+8.134×10
2
2
X(r=
23
0.9713,RMSE=0.060,F=18.95,P=0.0003,预测相关系数0.8914)。从拟合方程的相关系数可见,多元线性回归方程的相关系数较低,表示自变量与因变量之间线性相关性较差,所以不宜用线性模型,而多元二项式拟合方程相关系数较高,拟合效果较好。另外,固定3个自变量之一为中值,以拟合的目标函数为数学模型,绘制因变量的曲面和等高线图见图1~3。根据二项式分别对X1,X2,X3求偏导
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3 讨 论
据报道,采用体积分数75%和65%乙醇浸渍工
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艺及体积分数55%乙醇渗漉工艺所得穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量较高,而可能受温度的影
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表4 放大实施验证实验结果.n=3,x ±s
Tab.4 Resultsofverificationtest.n=3, x±s
Item
Yieldofandrographolide/%Yieldofneoandrographolide/%Yieldofdehydroandrographolide/%YieldofExtract/%OD
ObservedvaluePredictedvalueDeviation1.74±0.090.46±0.02
0.41±0.0215.64±0.700.6859
----0.6679
-----2.60%
理,这对于提取工艺最佳范围选择是重要的参考。通过对工艺验证发现OD的预测值与实测值的偏差为-2.6%,而且提取物中内酯类成分收率较高,而
浸膏得率也并不是太高,这正符合实验预期。因此,采用星点设计-效应面法选择的穿心莲超声提取工艺方法简便,拟合结果合理、可靠。
REFERENCES
[1] Ch.P(2005)VolI(中国药典2005年版.一部)[S].2005:
189.[2] HEEN,ZHAOF.Studyprogressandpharmacologicalactionof
andrographitis[J].GuidJTraditChinMed(中医药导报),2007,13(5):107-108.[3] GEFH,LINXX,HUANXF,etal.Studyonextractionofac-tiveingredientsfromAndrographispanicuatausingtheorthogonal
experimentwithsupercrificalcarbondioxide[J].JChinMedMat(中药材),2002,25(2):101-102.[4] ZHANGJQ,ZHANGL,WANGH,etal.Studyonextraction
processofAndrographispaniculata[J].FoodDrug(食品与药品),2005,7(1A):37-40.[5] GANLC,HOUX,BIYQ,etal.Optimizedpreparationoftan-shinonesⅡA-loadednanoparticlesbycentralcompositedesign
andresponsesurfacemethod[J].ChinPharmJ(中国药学杂志),2007,42(10):758-760.[6] WUQ,WANGYR,WUH.Optimizationofcellulasehydrolysis
extractionprocessofFoliumginsengbycentralcompositedesign/responsesurfacemethodology[J].ChinJExpTraditMedForm(中国实验方剂学杂志),2006,12(4):5-8.[7] SUNL,WANGYR.Optimalextractionofeffectiveconstituents
fromRadixpolygalaebasedoncentralcompositedesign/responsesurfacemethodology[J].ChinTraditPatMed(中成药),2006,28(3):328-331.
(收稿日期:2010-08-09)
响,采用回流提取法所得提取物中穿心莲内酯含量欠佳
[3]
。因而对超声提取穿心莲的工艺值得研究。
在考察提取工艺时,能使穿心莲提取物的总浸膏得
率量达到最少,而又能使3种内酯的成分含量高,是比较理想的提取结果。通过采用星点设计效应面法优化提取工艺所得二项式拟合的复相关系数r=0.9713,预测相关系数为0.8914,表明拟合实验结果良好,对工艺的优化结果可信度较高。
另外,在数据处理时,根据二项式方程分别对X1、X2和X3求偏导数,并令其等于0解出的最佳的水平组合为:X.96,X68,X1=3282=-93.3=36.83,这样的工艺条件明显不符合实际。这主要是由于在选取考察提取结果时要求提取物浸膏量收率少,而内酯类成分收率高有关,使得各因素对OD值的影响比较复杂,二项式的极值也就可能超出范围。另外,总评归一值的范围应为[0,1],效应面中出现大于1的值均是二项式拟合结果,与实际并不一致。而且在实际研究中发现,OD值在0.6~0.8比较合
第三届全国妇产科药学大会第一轮征文通知
妇产科领域面对的是妇女、胎儿、新生儿,用药的科学性、先进性及实用性尤为重要。为进一步提高妇产科诊疗质量及安全性,实现合理用药,为临床医生和患者提供全程、专业的药学服务,中国药学会医院药学专业委员会组织的“临床治疗进展与临床药学学术研讨会”系列活动之一———“第三届全国妇产科药学大会”,拟于2011年9月在北京举办。
此次会议主题是:围孕期和妊娠期用药及安全性评价。现面向全国医院药师、临床医生、研究开发及医药相关领域人员征稿。
1 征文范围 ①孕产妇的合理用药、用药咨询策略与分析;②避孕药物与妇女生殖健康;③妊娠期糖尿病治疗药物的有效性及安全性评价;④妊娠期高血压疾病的药物治疗相关研究;⑤妇产科药物新剂型研究与开发;⑥围孕期用药的安全性评价及调研;⑦多囊卵巢综合征相关代谢综合征的药物治疗;⑧体外受精-胚胎移植的激素替代治疗及安全性评价;⑨产科抗菌药物合理应用;⑩妇产科药学学科建设的思考与体会;1中药在产科的合理应用及安全性评价。
2 征文要求 ①未在公开发行期刊或全国性学术会议上发表或交流过的论文,文责自负;②论著不超过3500字,综述不超过5000字,并附300字以内的中英文摘要;③请用宋体、4号字、1.5倍行距编辑稿件,格式按《中国药学杂志》2011年第一期稿约;④请用E-mail传递或邮寄稿件;⑤请注意字迹清楚,数据准确;注明作者姓名、职称、单位、地址、邮编、联系电话。合格论文将录入大会论文集;⑥投稿截止日期2011年8月22日(以邮戳为准),稿件及信封请注明“妇药会征文”字样;⑦收到您提交的论文后,会议筹备组将回复电子邮件或以其他形式确认。论文录用与否,一律不退稿,请自留底稿。
联系人:蔡婧、钟燕;电话:010-58699019/20-8006,58699025,58699392;传真:010-58699035;E-mail:[email protected]。
[本刊讯]
246卷第期
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