第一章 绪论 生物技术药物分类1.重组DNA技术制造的多肽、蛋白类药物2.基因药物，包括基因治疗药、基因疫苗、反义药物、核酶3.来自动、植物、微生物的天然药物4.合成与半合成的生物药物
按照医学用途分类：1.治疗药物，治疗疾病是生物药物的主要功能。2.诊断药物，具有速度快、灵敏度高、特异性强的特点。3.预防药物，对于许多传染性疾病来说，预防比治疗更重要。 生物技术药物的特性
1.分子结构复杂2.具有种属特异性3.治疗针对性强，疗效高4.稳定性差5.基因稳定性6.免疫原性
7.体内t1/2短8.受体效应9.多效性和网络性效应10.检验的特殊性
2.高投入3.长周期4.高风险5.高收益
基因工程制药：（1）基因工程药物品种的开发；（2）基因工程疫苗；（3）（5）应用基因工程技术建立新药的筛选模型；（6）应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物；（7）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用；（8）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。
现代生物技术的发展趋势主要体现在下列几个方面：①基因操作技术日新月异，不断完善。②新技术、新方法一经产生便迅速地通过商业渠道出售专项技术，并在市场上加以应用。③基因工程药物和疫苗的研究和开发突发猛进。④新的生物治疗制剂的产业化前景十分光明，21世纪整个医药工业将面临全面的更新改造。⑤转基因植物和动物取得重大突破⑥现代生物技术在农业上的广泛应用将给农业和畜牧业生产带来新的飞跃。⑦阐明生物体基因组及其编码蛋白质的结构与功能是当今生命科学发展的一个主流方向，⑧基因治疗取得重大进展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。⑨蛋白质工程是基因工程的发展，它将分子生物学、结构生物学、计算机技术结合起来，形成一门高度综合的学科。⑩信息技术的飞跃发展渗透到生命科学领域中，形成形成引人注目、用途广泛的生物信息学。
第二章 基因工程制药
基因工程技术生产药物的优点：（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽。（2）可以提供足够数量的生理活性物质以供研究。（3）可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质。（4）可以通过基因工程和蛋白质工程对内源生理活性物质进行改造。（5）可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性
基因工程制药基本环节 上游阶段：制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞
下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装 目的基因的常用制备方法
化学合成法 ：较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。再按相应的密码子推导出DNA的核甘酸序列。用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 人工化学合成基因的限制有： ⒈不能合成太长的基因⒉遗传密码的简并使选择密码子困难，⒊费用高。
RT—PCR法（反转录PCR法）：mRNA经逆转录合成cDNA第一条链，不需合成第二条链，在特异引物协助下，用PCR法进行扩增，特异合成目的cDNA链，用于重组,克隆.
逆转录法 ：逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。⒈ mRNA的纯化⒉ cDNA第一链的合成⒊ cDNA第二链的合成⒋ cDNA的克隆⒌ 将重组体导入宿主细胞：⒍ cDNA文库的鉴定：抗性基因失活法、噬菌斑颜色改变法⒎ 目的cDNA克隆的分离和鉴定：核酸探针杂交法、免疫反应鉴定法
重组DNA导入宿主细胞 导入大肠杆菌：CaCl2法；转染法 导入酵母：电转化法；化学转化法；原生质转化法 重组DNA导入哺乳动物细胞：显微注射法；DEAE葡聚糖转染法；DNA-磷酸钙转染法；阳性脂质体介导法；电穿孔法；细胞融合法；病毒感染法
重组子的筛选与鉴定
遗传标记筛选法：
培养基，成功导入的菌落显示为蓝斑)；营养缺陷型筛选法；噬菌斑筛选法
核DNA印迹法；RNA印迹法
限制性内切酶图谱法：琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量，含有目的基因的为阳性克隆 DNA序列测定法
目的基因表达产物测定法 大肠杆菌中的基因表达 载体 ：是基因工程的目的和基本手段，是选用合适的载体把供体DNA（外源基因）运载到受体细胞内，从而复制扩增大量的目的DNA分子或转录表达为相应的产物。 基因工程载体分为：克隆载体,转录载体,表达载体;DNA(克隆载体）→DNA(转录载体）→RNA→蛋白质→（表达载体）
原核细胞的基因组特点：①染色质为环状双股DNA分子 ②具有操纵子结构 ③结构基因多为单拷贝 ④特定区域分布特异DNA顺序，因此外源DNA分子可以插入原核细胞DNA复制体系的特定区段 基因克隆载体1）定义：基因克隆载体是一类能够承载外源基因并将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA分子。2）目前经常使用的载体，有质粒和病毒两类。各种不同的载体，尽管分子量大小、结构和用途上存在着较大的差异，但是作为载体，它们应该具备一些共同的特性。 基因工程克隆载体的特点：①具有复制子②有单一限制内切酶切位点或多克隆位点③有选择性遗传标记如抗药基因④拷贝数高⑤生物安全性好 质粒的分类⒈按复制型式①严紧型 ②松弛型⒉按基因转移性①传递性质粒 ②非传递性质粒⒊按遗传性状产物分类:①抗生素抗性②限制酶、修饰酶系统 ⒈真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件⑪载体能够独立复制。载体本身是一个复制子，具有复制起点。⑫应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。⑬应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。⑭应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。⑮应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。⑯所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。
⒉影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素⑪外源基因的拷贝数：外源基因是克隆到载体上的，因此载体在宿主菌种的拷贝数就直接关系到外源基因的拷贝数。⑫外源基因的表达效率①启动子的强弱②核糖体接合位点的有效性③SD序列和起始密码ATG的间距④密码子组成⑬表达产物的稳定性：①组建融合基因，产生融合蛋白；②利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物搬动到胞浆周质的空隙中；③采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白质中二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性；④采用蛋白酶缺陷型大肠杆菌，有可能减弱表达产物的降解。⑭细胞代谢负荷：⑮工程菌的培养条件。
外源基因在大肠杆菌中的表达方式
胞内表达：非融合蛋白表达：蛋白质接近天然状态，易被降解，易形成包涵体。有原核多肽基因 融合蛋白表达：表达效率高；产物稳定；可以切除原核多肽，获得天然外源蛋白
分泌表达：有信号肽基因，形成周质表达或细胞外表达
大肠杆菌 酵母 哺乳动物
多肽 、 蛋白质或融合蛋多肽 、 蛋白质或糖基产物 完整糖基化蛋白 白质 化蛋白质
产生部位 菌体内 菌体内或分泌出细胞 分泌出细胞
培养方式 容易，部分可获得高产 容易，可高产 较难成本高，可高产
提纯 一般 菌体内稍复杂 简单
产物活性 对原核较好，真核稍差 真核的接近天然 几乎可为天然产物
潜在危险性 不大 不大 需注意有致癌因素 酵母表达体系的影响因素：外源基因的结构，表达形式及信号肽的选择：启动子，转化子的拷贝数，诱导条件，外源蛋白的降解。 菌体的生长与能量的关系（乙酸调节）提高pH。降低温度，分批培养中选择不同的碳源，连续培养
在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。 “严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。 质粒不稳定 分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变 常见分裂不稳定的两个因素：⑪含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率（质粒丢失率）；
⑫这两种菌（含质粒菌和不含质粒菌）比生长速率差异的大小。
提高质粒稳定性的方法1.合适的宿主：宿主菌2.合适的载体:质粒拷贝数3.选择压力：抗生素4.分阶段控制培养：⑪先使菌体生长至一定密度； ⑫再诱导外源基因的表达5.控制培养条件：温度、pH值、培养基组分、溶氧6.固定化：卡拉胶 高密度发酵：培养液中工程菌的菌体浓度在50g DCW/L（细胞干重/L）以上，最高200g DCW/L 高密度发酵特点 ：菌体高密度，总表达量高；生物反应器体积小；单位体积生产能力高；生产周期短，分离成本小
影响高密度发酵的因素培养基，溶氧浓度，pH值，温度，代谢副产物 实现高密度发酵的方法1.发酵条件的改进（1）培养基的选择：（2）建立流加式培养方式；（3）提高供氧能力2.构建产乙酸能力低的工程化宿主菌（1）阻断乙酸生产的主要途径：（2）对碳代谢流进行分流：（3）限制进入糖酵解途径的碳代谢流；（4）引入血红蛋白基因。3.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 基因重组蛋白的主要分离技术：离心、沉淀(等电点沉淀法、盐析法)、膜分离、双水相萃取 基因重组蛋白的主要纯化技术：离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析、反相色谱和疏水色谱 细胞破碎，固液分离，浓缩与初步纯化，高度纯化直至得到纯品，成品加工
选择分离纯化工艺的依据：起始物料特点，产物特性，杂质种类性质，产品质量要求（体外80%，体内95%)
第三章 动物细胞工程制药
缺点:培养条件高、成本贵、产量低。优点:分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。 动物细胞的生理特点（⒈） 动物细胞的分裂周期长：（⒉）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。（⒊）正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。原代培养；（4)动物细胞对周围环境十分敏感：对理化因素敏感，(⒌)动物细胞对培养基要求高：必需氨基酸（12种）、维生素（8种）、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。(⒍)动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。
生产用动物细胞1.原代细胞：费钱费力，少用2.传代细胞系：安全，特点： 2n核型，贴壁依赖，接触抑制，有限传代(50代)3.转化细胞系：自发转化或人为转化，失去了正常细胞的特点，可=无限增殖传代，适宜大规模工业培养4.工程细胞系：融合细胞系(仙台病毒融合法、聚乙二醇融合法、电融合法)；基因工程细胞系
病毒载体：牛痘病毒。腺病毒和逆转录病毒载体，杆状病毒载体-昆虫细胞系统
①双链DNA，易重组②插入7～8kb DNA不影响正常病毒粒子的形成。③多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；④多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20%～30%；⑤用光学显微镜可看到多角体，以此作为标记物选阳性克隆。⑥如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源基因
基因工程细胞主要的筛选系统（抗性作用，荧光作用）
导入方式（融合法，化学法，物理法，病毒法）
细胞库的建立：原始细胞库(MCR)→生产用细胞库(MWCR，又称工作细胞库，主细胞库→生产细胞库) ★ 动物细胞的大规模培养方法
1.悬浮培养：适用于非贴壁依赖细胞或兼性贴壁细胞。优点：操作简便，培养条件均一，传质传氧较好，容易扩大培养，可以借鉴细菌培养的经验。缺点：细胞培养密度较低。2.贴壁培养3.贴壁-悬浮培养：微载体培养：用于培养贴壁细胞。多孔载体培养：可用于悬浮细胞及贴壁细胞。包埋和微囊化培养
动物细胞培养的操作方式1.分批式操作2.半连续式操作3.灌流式操作 动物细胞生物反应器的类型⒈搅拌罐式生物反应器⒉气升式生物反应器⒊中空纤维式生物反应器⒋透析袋或膜式生物反应器⒌固定床或流化床式生物反应器 理想的动物细胞生物反应器的基本要求1.生物反应器的材料无毒2.生物反应器的结构：满足传质、传热、混合的功能3.密封良好，避免污染4.自动检测、调节控制精度高5.长期连续运转 6.容器内
8.设备成本低
2.生产周期大大缩短。3、易于操作管理，大大减轻劳动强度。
4、产物浓度较高，杂质少；产物易于分离纯化，产品质量高。缺点：与微生物比较，植物细胞培养还具有对剪切力敏感，生产周期长等缺点，此外，许多植物细胞的生长和代谢需要一定的光照。 植物培养细胞的生理特性：1、抵抗剪切力差；2、需用抗生素；3、生长的中期及对数期凝聚4、培养过程需不断的供氧；5、产量较低6、培养过程具有结构与功能全能性。
不同时期的植物细胞：延迟期（细胞数量、 干重近乎恒定， 细胞壁厚度达最大；高RNA含量；高蛋白质合成能力；高聚核糖体含量；有丝分裂加速；增加细胞的细胞质部分），加速期（常数：干重 增加：细胞数、DNA和蛋白质浓度减少：有丝分裂活性、RNA含量和蛋白质合成能力），对数期（增加细胞干鲜重及RNA酶活性；蛋白质合成能力完全减退；变化：聚核糖体浓度向有利于单核 糖体和寡核糖体形成的方向减少），稳定期（有机化合物浓度高，细胞高液泡化、 极度脆弱、 高度分化） 细胞生长素：用来诱导细胞的分裂，愈伤组织形成及根的分化。细胞分裂素：促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。高生低分：刺激细胞分裂。低生高分：刺激细胞生长
影响植物次级代谢产物生产和累积的因素：外植体，培养条件的影响：1.培养环境的内在因素温度，光（光照时间，光强，光质），通气（O2），pH和渗透压 2.两步培养法（生长培养基和生产培养基：乙酸调节） 3.培养环境的外部因素培养罐类型，通气，搅拌和培养方法 植物细胞大规模培养生物反应器的类型（1）.机械搅拌式生物反应器（2）.鼓泡塔生物反应器（3）.气升式生物反应器（4）.转鼓式生物反应器（⒌）固定化细胞生物反应器。. 各种生物反应器的性能比较 1.机械搅拌式培养系统 ：根据植物细胞的特性，机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的。搅拌装置要减少剪切力，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；为便于取样观察，一般还设计有取样口。优点：易于控制温度、 pH、溶氧及营养物质浓度，混合均匀。3.气升式培养系统考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的轴封处容易泄漏造成污染。因此，发展出空气提升式生物反应器，它是最适合培养植物细胞的反应器之一。优点：低剪切力，较好的混合，较高的氧传递效果。无运动部件，不易染菌，操作费用低。改善营养供应：增加培养细胞与培养液的接触面；避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；缺点:高密度培养时混合不均匀。5.固定化细胞生物反应器：定义：指固定在载体（惰性基质）上，在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。采用固相培养，细胞有一定程度的分化发育，从而刺激调控代谢物合成的基因表达，促进次级代谢产物的产生。方法：吸附法（共价交联，表面固定化，膜固定化）；包埋法（多孔载体，凝胶包埋）；植物细胞固定化培养优点：1.可保护细胞免受剪切。2.细胞可长时间重复使用，更换培养基带走代谢物。3.易于实现细胞的高密度培养。4.细胞间接触良好，易于分化，有利于次级代谢产物的合成。5.减少细胞的遗传不稳定性。6.易于实现连续化操作。缺点：固定化培养的植物细胞其代谢产物必须分泌到细胞外，多数植物细胞次级代谢产物存在于细胞内或分泌到液泡中。
植物细胞制药的进展与展望：一、诱导子在植物细胞工程研究中的应用（有目的代谢产物调控及生物合成） 二、前体饲喂（增加次级代谢产物率） 三、两相法培养（创造一个次级代谢产物的 储存单元）减轻产物本身对细胞代谢的抑制作用；保护产物免受酶或酸对产物的影响；降低生产成本 四、转基因技术在次级代谢产物生产中的应用（冠瘿组织和毛状根培养技术） 五、植物生物转化技术（植物细胞悬浮培养, 固定化细胞培养, 毛状根培养以及酶都可通过生物转化产生有用化合物.）
第六章 酶工程制药
酶工程优点：工艺简单、效率高、生产成本低、环境污染小、产品收率高、纯度好。
酶的特性 酶是由活细胞产生的具有特殊催化功能的一类蛋白质。 特点：①催化效率高②专一性强③反应条件温和④催化活性受到调节和控制 酶工程：是酶学和工程学相互渗透结合发展而形成一门新的技术学科。酶工程是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。 酶工程的研究内容：（1）.酶的分离、纯化、大规模生产和应用（2）.酶和细胞的固定化及酶反应器的研究（传感器，检测器）（3）.酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶）的研究（4）.酶的分子改造与修饰，结构与功能的关系的研究（5）.有机相中酶反应的研究（6）.酶的抑制剂、激活剂的研究（7）.抗体酶、核酸酶的研究（8）.模拟酶及酶分子的人工设计研究
酶和细胞的固定化
固定化酶的定义：固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，是经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂，属于修饰酶。酶的固定化：是指制备固定化酶的过程。
固定化酶的特点具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。优点：①可多次使用。②反应后，酶、底物、产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。③反应条件易控制，可实现转化反应的连续化和自动控制。④酶的利用效率高。⑤比水溶性酶更适合于多酶反应。缺点：①固定化时，酶活力有损失。②初始投资较大。③只能用于可溶性底物，而且分子量要小。④胞内酶必须经过酶的分离纯化过程。⑤与完整菌体相比不适宜多酶反应，特别时需要辅助因子的反应。 固定化酶(细胞)的制备 酶固定化方法：载体结合法(物理吸附法、离子结合法、共价结合法)交联法(常用戊二醛剂)、包埋
法(网格型、微囊型)④选择性热变性法
吸附法 固定化方法 包埋法 共价结合法 交联法 物理吸附法 离子吸附法
制备难易 易 易 较难 难 较难
结合程度 弱 中等 强 强 强
活力回收 高，酶易流失 高 高 低 中等
费用 低 低 低 高 中等
底物专一性 不变 不变 不变 可变 可变
载体：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、氨基酸共聚物等
⒈固定化细胞的定义将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。细胞的固定化，避免了冗繁的酶纯化手续，更有利于多酶反应。用于固定化的细胞可以是活跃生长的细胞，也可以是死细胞和静止细胞。
⒉固定化细胞的特点有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。优点：①无须进行酶的分离纯化②保持酶的原始状态，酶回收率高③细胞内酶比固定化酶稳定性高④细胞内酶辅助因子可自动再生⑤细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应⑥抗污染能力强缺点：①利用的仅是胞内酶，酶多副产物多②细胞膜、细胞壁和载体都存在扩散限制作用③载体形成的空隙大小影响高分子底物的通透性固定化细胞的制备技术 ⑪载体结合法。⑫包埋法（⑬交联法 ⑭无载体法
固定化酶(细胞)的性质：酶活力大都下降，酶学特性的变化：最适温度一般会升高，最适pH 变化（载体带﹣，PH上升）（产物酸性，PH上升），固定化后专一性会下降，米氏常数 Km增大，最大反应速度变化不大。 固定化细胞的性质：有活性升高的现象；稳定性的增加；最适温度和最适pH常保持不变
一、反应器的类型和特点⒈间歇式搅拌罐反应器（BSTR）用于游离酶,反应后随即放料,不回收游离酶。⒉连续流动搅拌罐反应器(CSTR)连续进料、连续出料⒊填充床反应器（PBR）固定化酶填充于床层内。反应器内的流体的流动形态为平推流（活塞流）流形。又称平推流反应器（PFR）底物以恒定流速通过反应床。⒋流化床反应器（FBR）底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态，达到混合的目的。流速使固定化酶颗粒不下沉又不溢出。⒌循环反应器（PCR）部分反应液流出和新加入底物流入液混合，在进入反应床进行循环。⒍连续流动搅拌罐-超滤膜反应器（CSTR/UF, CSTR/UFR）连续流动搅拌罐的出口处装有超滤膜，产物和未反应的底物可通过，酶被截留反复使用。
二、反应器的选择依据 ： （⒈）根据固定化酶的形状来选择：（⒉）根据底物的物理性质来选择：
（⒊）根据反应的动力学特性来选择：（⒋）根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择： 模拟酶：人造的具有酶性质的催化剂（分子模拟立体结构，化学结构）与天然酶相比：模拟酶具有更高的热稳定性和酸碱稳定性，同时催化效率更高，适应性更强。
模拟酶的分类1.主-客体酶模型：2.胶束模拟酶 3.肽酶：4.半合成酶：5.印迹酶：（1）分子印迹技术：如果以一个分子充当模板，其周围用聚合物交联，当模板分子除去后，此聚合物就留下了与
（1）增加疏水性底物或产物的溶解性。（2）热力学平衡向合成方向移动，如酯合成、肽合成（蛋白水解酶）。（3）可抑制有水参与的副反应，如酸酐的水解等。（4）酶不溶于有机介质，易于回收再利用。（5）容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物。（6）酶的热稳定性提高，pH的适应性扩大。（7）无微生物污染。（8）能测定某些在水介质中不能测定的常数。（9）固定化酶方法简单，可以只沉积在载体表面。（10）酶在非水介质中可以催化某些在水中不能进行的反应（改变溶剂能控制底物的特异性、区域选择性、立体选择性），如脂肪酶水相催化酯的水解，有机相中催化酯化、转酯、氨解等。
2.有机相酶反应的溶剂体系（1）水-水溶性溶剂均相体系：乙醇、丙酮、甘油（2）水-水不溶性溶剂两相体系：三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚（3）反向胶束（油包水酶）（4）单相有机溶剂体系：酶分子周围有一层水分子膜（必需水）维持酶催化反应构象。
3.水和溶剂对有机溶剂中酶的影响（1）酶活力：最适含水量。（2）酶选择性：对固定的底物有些酶选择性会因所处的溶剂不同而变化。（3）酶的稳定性：有机溶剂中酶的热稳定性随系统水含量增加而下降，水是酶热失活的必须参加者。
4.有机相的酶工程（1）酶的固定化：载体吸附法和凝胶包埋法，提高扩散效果，增加稳定性，利于回收和连续化生产（2）酶的化学修饰和表面活性剂包埋：增加酶表面疏水性，改善脂溶性和稳定性，提高催化效率。
三、抗体酶：具有催化能力的抗体（免疫球蛋白）
第四章 抗体工程制药
抗原：凡是能够刺激机体的免疫系统产生抗体或效应淋巴细胞，并且能够和相应的抗体或效应细胞发生特异性结合反应的物质，就叫做抗原。(免疫原性，反应原性）
抗体：指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
免疫：机体识别自身成分和异己物质，排除异物以维持内环境稳定的一种生理反应，通常对机体有利，但有时也可能损害机体。（免疫防御，稳定，监视）
免疫系统：机体执行免疫应答及免疫功能的一个重要系统
免疫系统的构成：1.免疫组织和器官：中枢（骨髓，胸腺），外周（淋巴结，脾，粘膜）2.免疫细胞：固有免疫（生物体与生俱来的防御机制，可对入侵的病原体迅速作出应答，产生非特异抗感染免疫作用）的组成细胞（吞噬，树突状，NK，嗜酸、碱性粒细胞）。适应性免疫应答细胞（体内抗原特异性T/B淋巴细胞接受抗原刺激后，自身活化、增殖、分化为效应细胞，产生一系列生物学效应的全过程。）T\B淋巴细胞。3.免疫分子 免疫球蛋白、补体、细胞因子等 多克隆抗体：天然抗原分子中常含有多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生的抗体中含有针对多种不同抗原表位的免疫球蛋白，称为多克隆抗体。（优点：作用全面，具有抗体的各种功能；来源广泛，制备容易。缺点：特异性不高，易发生交叉反应，从而限制了其应用）
单克隆抗体：（优点：特异性高，结构均一，纯度高，效价高。缺点是其鼠源性对人具有较强的免疫原性，反复使用可产生人抗鼠的免疫应答。）
基因工程抗体：
利用DNA重组技术，将编码人源抗体的基因克隆到特定的表达系统中，进行体外表达而得的的人-鼠嵌合抗体或人源化抗体（优点：均一性、特异性好，克服其鼠源性的不足。缺点：
特定抗原对动物进行免疫，淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合并进行杂交瘤细胞的选择性培养，阳性克隆的筛选及克隆化培养，杂交瘤细胞及抗体性状的鉴定，大量制备单克隆抗体，单克隆抗体的纯化
抗原和免疫：抗原的制备(通常和佐剂混合，增强免疫应答)、免疫动物(体内/体外免疫方法；动物的选择：一般采用与骨髓瘤供体细胞同一品系的动物)
细胞的融合：制备脾细胞悬液，制备骨髓瘤细胞悬液：对数生长期细胞，融合：在PEG溶液中加入DMSO，可以提高细胞接触的紧密性，提高融合率
HAT培养基筛选杂交瘤细胞（融合后细胞→HAT培养基→HT培养基→正常培养基）
杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测）仅少数杂交瘤细胞可以分泌预期抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)、间接免疫荧光法、放射免疫测定法、流式细胞仪法
杂交瘤细胞的克隆：有限稀释法、软琼脂培养法。
杂交瘤细胞的鉴定：杂交瘤细胞进行染色体分析，分泌抗体稳定性分析，外源因子检查。 单克隆抗体的大量制备：体内接种法(皮下接种、腹腔接种)；体外培养法
单克隆抗体的纯化：小鼠腹水的处理和抗体捕获，凝胶过滤，阴离子交换层析，亲和层析，疏水性(V区)、恒定区(C区)和铰链区(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶) VL 、VH区各有3个超变区(也称互补决定区，CDR1-3)，共同组成Ig的抗原识别部位，形成与抗原决定簇互补的表位。可变区中的其它部分变化较小，称为骨架区(FR)。C区决定Ig分子的异种抗原性，主要发挥抗体分子的效应功能。
基因工程抗体
基因工程抗体的特点：1.最大程度降低抗体的鼠源性，降低甚至消除人体对抗体的排斥反2.分子较小，在组织中的透过率增大，穿透力强，更易到达病灶的核心部位3.可以根据治疗的需要，制备多种用途的新型抗体4.可以采用原核细胞、真核细胞或动植物等多种表达5.系统大量生产，显著降低成本
人一鼠嵌合抗体：人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。优点：保持了鼠源性单抗的抗原结合特异性，但对人的免疫原性大幅度下降。效应功能部分可选择并按需进行改造。缺点：分子质量大，不易渗透到实体瘤等目的组织。不容易大量表达，生产成本高。 改形抗体：把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改形抗体，也就是人源化抗体。(优点：进一步减少抗体中鼠源部分的比例,降低了人抗鼠抗体反应。缺点：抗体亲和力下降，甚至失去活性.构建方法复杂，费时费力)
小分子抗体（优点：可以用细菌发酵生产，成本低；分子小，穿透力强；不含Fc，没有Fc带来的效应；在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。）
Fab抗体：由重链V区及CH1功能区与完整的轻链以二硫键连接而成。1/3
Fv抗体：由VH与VL非共价结合而成。1/6
单链抗体(ScFv)：在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，即单链抗体。 单域抗体：即为VH或VL，约为完整分子的1/12。
1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性
一、放射性同位素标记的抗体治疗药物（优点:1.有利于克服肿瘤表面抗原的异质性2.对肿瘤细胞的杀伤不依赖于抗原抗体结合后的吸收作用3.分子量小，穿透力强。缺点：来源困难，且需要放射性保护和污物处理）二、抗癌药物偶联的抗体药物（特异性强）三、毒素偶联的抗体药物（特异性，稳定性，渗透性好，免疫原性低，可大量制备）
第七章 发酵工程制药
发酵：现代发酵工业上泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程，或更确切地说，发酵是用生物催化剂使培养物质转化成产品的生物化学反应
发酵工程技术：主要包括提供高性能生产菌种的菌种选育技术、实现低成本大规模生产产品的发酵技术和最终获得合格产品的分离提取技术。
发酵工程的基本过程：上游工程：菌种选育、中试； 发酵生产：中心环节； 下游工程：产物分离
纯化鉴定、副产物回收、废物处理
发酵方式：
一、分批(间歇)发酵：物料一次投入反应器中，灭菌、接种、发酵。特点： 一次性；发酵过程中，营养不断减少，微生物不断增殖，环境非稳态；微生物生长的四个时期明显。应用广泛，需改善（在线检测，计算机控制）。 二、补料分批发酵 ：补加新鲜培养基。特点：可以解除底物抑制、产物抑制或克服微生物过度生长；提高有用产物的转化率；应用广泛，用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业； 三、连续发酵：恒化器、恒浊器，连续进料出料平衡，保持恒定的发酵液密度。易实现自动化生产，如啤酒，乙醇的发酵。优点：操作稳定；利于机械、自动化；提高设备的利用率；减少灭菌次数；
缺点：易染菌；微生物易变异；对产品类型的适应性不广；对设备及附件要求高。 （1）提供必要的营养成分（2）配制合适的浓度（3）主成分与其他成分的配比（4）控制合适的pH。
培养基的主要成分（1）碳源(糖类，脂肪，有机酸，碳氢化合物)：主要功能： ① 提供能源；② 菌体成分；③ 产物碳架。（2）氮源：(无机氮源，有机氮源)主要功能：①构成细胞物质。②构成产物。
（3）无机盐及微量元素：主要功能：①构成菌体成分（S）②激活酶（Mg2+）③辅酶或辅基的组成部分④参与能量转移反应⑤调节渗透压、pH、氧化还原电位。（4）特殊生长因子：主要功能：①构成辅酶 ②促进生命活动。（5）水： 水是物质溶解和生化反应的基础。功能：①机体的重要组成成分；②参加一些代谢反应；③良好溶剂（介质）和热导体；
二、温度的影响及其控制
1.影响发酵温度变化的因素（1）生物热：生长，呼吸，繁殖（2）搅拌热：摩擦（3）蒸发热：（4）辐射热：罐内外温差
2.温度的选择与控制（1）最适温度：生长温度，生产温度,变温发酵，(2）温度控制:一般不需加热，冷却水（冷冻盐水）通过夹层循环冷却。
三、融氧的影响及其控制
四、pH的影响及其控制
pH对发酵的影响：最适生长pH（3～6） 最适生产pH 常用的控制方法有：①调整生理碱性和酸性盐类的比例；②选择不同C、N的种类和比例；③添加缓冲剂。补料控制
发酵过程的影响及控制：
菌体浓度——通过控制培养液中营养基质的浓度(基础培养基各成分要有适当配比；通过中间补料调整培养基成分)
营养物质：碳源、氮源——用含有两种碳/氮源的培养基进行控制；磷酸盐——对初级代谢产物及次级代谢产物的控制；补料的控制
温度 ——在发酵不同阶段，采用不同温度；针对不同条件，采用不同温度
pH值——调节培养基组分，增加缓冲体系；补料；补加酸碱
溶氧 ——调节搅拌转速和通气率；控制菌体浓度，使细菌比生长速率略高于临界值
CO2 ——控制通气量；控制搅拌速度；控制补料工艺 泡沫 ——机械消沫；消泡剂消沫
染菌 ——设备无渗漏；管道系统无渗漏；空气净化系统正常（种子，空气，设备，灭菌）
发酵液的处理与纯化：固液分离技术（离心分离，过滤分离，沉淀分离等工艺）细胞破壁技术（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶等）蛋白质纯化技术（沉淀法、色谱分离法和超滤法等）产品的包装处理技术（真空干燥和冰冻干事燥等）。
青霉素制备流程 菌种，孢子制备，种子制备，发酵（加入前体），发酵液预处理及种子加滤，提取及精制，成品检验，成品包装
第一章 绪论 生物技术药物分类1.重组DNA技术制造的多肽、蛋白类药物2.基因药物，包括基因治疗药、基因疫苗、反义药物、核酶3.来自动、植物、微生物的天然药物4.合成与半合成的生物药物
按照医学用途分类：1.治疗药物，治疗疾病是生物药物的主要功能。2.诊断药物，具有速度快、灵敏度高、特异性强的特点。3.预防药物，对于许多传染性疾病来说，预防比治疗更重要。 生物技术药物的特性
1.分子结构复杂2.具有种属特异性3.治疗针对性强，疗效高4.稳定性差5.基因稳定性6.免疫原性
7.体内t1/2短8.受体效应9.多效性和网络性效应10.检验的特殊性
2.高投入3.长周期4.高风险5.高收益
基因工程制药：（1）基因工程药物品种的开发；（2）基因工程疫苗；（3）（5）应用基因工程技术建立新药的筛选模型；（6）应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物；（7）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用；（8）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。
现代生物技术的发展趋势主要体现在下列几个方面：①基因操作技术日新月异，不断完善。②新技术、新方法一经产生便迅速地通过商业渠道出售专项技术，并在市场上加以应用。③基因工程药物和疫苗的研究和开发突发猛进。④新的生物治疗制剂的产业化前景十分光明，21世纪整个医药工业将面临全面的更新改造。⑤转基因植物和动物取得重大突破⑥现代生物技术在农业上的广泛应用将给农业和畜牧业生产带来新的飞跃。⑦阐明生物体基因组及其编码蛋白质的结构与功能是当今生命科学发展的一个主流方向，⑧基因治疗取得重大进展，有可能革新整个疾病的预防和治疗领域。⑨蛋白质工程是基因工程的发展，它将分子生物学、结构生物学、计算机技术结合起来，形成一门高度综合的学科。⑩信息技术的飞跃发展渗透到生命科学领域中，形成形成引人注目、用途广泛的生物信息学。
第二章 基因工程制药
基因工程技术生产药物的优点：（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽。（2）可以提供足够数量的生理活性物质以供研究。（3）可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质。（4）可以通过基因工程和蛋白质工程对内源生理活性物质进行改造。（5）可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
基因工程药物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；异体蛋白具有免疫原性
基因工程制药基本环节 上游阶段：制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞
下游阶段：培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装 目的基因的常用制备方法
化学合成法 ：较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。再按相应的密码子推导出DNA的核甘酸序列。用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 人工化学合成基因的限制有： ⒈不能合成太长的基因⒉遗传密码的简并使选择密码子困难，⒊费用高。
RT—PCR法（反转录PCR法）：mRNA经逆转录合成cDNA第一条链，不需合成第二条链，在特异引物协助下，用PCR法进行扩增，特异合成目的cDNA链，用于重组,克隆.
逆转录法 ：逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。⒈ mRNA的纯化⒉ cDNA第一链的合成⒊ cDNA第二链的合成⒋ cDNA的克隆⒌ 将重组体导入宿主细胞：⒍ cDNA文库的鉴定：抗性基因失活法、噬菌斑颜色改变法⒎ 目的cDNA克隆的分离和鉴定：核酸探针杂交法、免疫反应鉴定法
重组DNA导入宿主细胞 导入大肠杆菌：CaCl2法；转染法 导入酵母：电转化法；化学转化法；原生质转化法 重组DNA导入哺乳动物细胞：显微注射法；DEAE葡聚糖转染法；DNA-磷酸钙转染法；阳性脂质体介导法；电穿孔法；细胞融合法；病毒感染法
重组子的筛选与鉴定
遗传标记筛选法：
培养基，成功导入的菌落显示为蓝斑)；营养缺陷型筛选法；噬菌斑筛选法
核DNA印迹法；RNA印迹法
限制性内切酶图谱法：琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量，含有目的基因的为阳性克隆 DNA序列测定法
目的基因表达产物测定法 大肠杆菌中的基因表达 载体 ：是基因工程的目的和基本手段，是选用合适的载体把供体DNA（外源基因）运载到受体细胞内，从而复制扩增大量的目的DNA分子或转录表达为相应的产物。 基因工程载体分为：克隆载体,转录载体,表达载体;DNA(克隆载体）→DNA(转录载体）→RNA→蛋白质→（表达载体）
原核细胞的基因组特点：①染色质为环状双股DNA分子 ②具有操纵子结构 ③结构基因多为单拷贝 ④特定区域分布特异DNA顺序，因此外源DNA分子可以插入原核细胞DNA复制体系的特定区段 基因克隆载体1）定义：基因克隆载体是一类能够承载外源基因并将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA分子。2）目前经常使用的载体，有质粒和病毒两类。各种不同的载体，尽管分子量大小、结构和用途上存在着较大的差异，但是作为载体，它们应该具备一些共同的特性。 基因工程克隆载体的特点：①具有复制子②有单一限制内切酶切位点或多克隆位点③有选择性遗传标记如抗药基因④拷贝数高⑤生物安全性好 质粒的分类⒈按复制型式①严紧型 ②松弛型⒉按基因转移性①传递性质粒 ②非传递性质粒⒊按遗传性状产物分类:①抗生素抗性②限制酶、修饰酶系统 ⒈真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件⑪载体能够独立复制。载体本身是一个复制子，具有复制起点。⑫应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。⑬应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。⑭应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。⑮应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。⑯所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。
⒉影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素⑪外源基因的拷贝数：外源基因是克隆到载体上的，因此载体在宿主菌种的拷贝数就直接关系到外源基因的拷贝数。⑫外源基因的表达效率①启动子的强弱②核糖体接合位点的有效性③SD序列和起始密码ATG的间距④密码子组成⑬表达产物的稳定性：①组建融合基因，产生融合蛋白；②利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物搬动到胞浆周质的空隙中；③采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白质中二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性；④采用蛋白酶缺陷型大肠杆菌，有可能减弱表达产物的降解。⑭细胞代谢负荷：⑮工程菌的培养条件。
外源基因在大肠杆菌中的表达方式
胞内表达：非融合蛋白表达：蛋白质接近天然状态，易被降解，易形成包涵体。有原核多肽基因 融合蛋白表达：表达效率高；产物稳定；可以切除原核多肽，获得天然外源蛋白
分泌表达：有信号肽基因，形成周质表达或细胞外表达
大肠杆菌 酵母 哺乳动物
多肽 、 蛋白质或融合蛋多肽 、 蛋白质或糖基产物 完整糖基化蛋白 白质 化蛋白质
产生部位 菌体内 菌体内或分泌出细胞 分泌出细胞
培养方式 容易，部分可获得高产 容易，可高产 较难成本高，可高产
提纯 一般 菌体内稍复杂 简单
产物活性 对原核较好，真核稍差 真核的接近天然 几乎可为天然产物
潜在危险性 不大 不大 需注意有致癌因素 酵母表达体系的影响因素：外源基因的结构，表达形式及信号肽的选择：启动子，转化子的拷贝数，诱导条件，外源蛋白的降解。 菌体的生长与能量的关系（乙酸调节）提高pH。降低温度，分批培养中选择不同的碳源，连续培养
在基础培养基中加入氨基酸（小分子前体）能使菌体比生长率提高，蛋白合成增加。基因工程菌质粒的表达需与宿主细胞竞争共同的前体和催化结构，致工程菌生长速率降低。这与工程菌大量前体被利用引起前体不足，从而产生“严紧反应”有关。 “严紧反应”是当氨酰tRNA不足时,核糖体在密码子上停留,并合成被称为魔点的ppGpp的结果。 质粒不稳定 分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变 常见分裂不稳定的两个因素：⑪含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率（质粒丢失率）；
⑫这两种菌（含质粒菌和不含质粒菌）比生长速率差异的大小。
提高质粒稳定性的方法1.合适的宿主：宿主菌2.合适的载体:质粒拷贝数3.选择压力：抗生素4.分阶段控制培养：⑪先使菌体生长至一定密度； ⑫再诱导外源基因的表达5.控制培养条件：温度、pH值、培养基组分、溶氧6.固定化：卡拉胶 高密度发酵：培养液中工程菌的菌体浓度在50g DCW/L（细胞干重/L）以上，最高200g DCW/L 高密度发酵特点 ：菌体高密度，总表达量高；生物反应器体积小；单位体积生产能力高；生产周期短，分离成本小
影响高密度发酵的因素培养基，溶氧浓度，pH值，温度，代谢副产物 实现高密度发酵的方法1.发酵条件的改进（1）培养基的选择：（2）建立流加式培养方式；（3）提高供氧能力2.构建产乙酸能力低的工程化宿主菌（1）阻断乙酸生产的主要途径：（2）对碳代谢流进行分流：（3）限制进入糖酵解途径的碳代谢流；（4）引入血红蛋白基因。3.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 基因重组蛋白的主要分离技术：离心、沉淀(等电点沉淀法、盐析法)、膜分离、双水相萃取 基因重组蛋白的主要纯化技术：离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析、反相色谱和疏水色谱 细胞破碎，固液分离，浓缩与初步纯化，高度纯化直至得到纯品，成品加工
选择分离纯化工艺的依据：起始物料特点，产物特性，杂质种类性质，产品质量要求（体外80%，体内95%)
第三章 动物细胞工程制药
缺点:培养条件高、成本贵、产量低。优点:分泌胞外、纯化方便、翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。 动物细胞的生理特点（⒈） 动物细胞的分裂周期长：（⒉）细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。（⒊）正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。原代培养；（4)动物细胞对周围环境十分敏感：对理化因素敏感，(⒌)动物细胞对培养基要求高：必需氨基酸（12种）、维生素（8种）、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。(⒍)动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同。
生产用动物细胞1.原代细胞：费钱费力，少用2.传代细胞系：安全，特点： 2n核型，贴壁依赖，接触抑制，有限传代(50代)3.转化细胞系：自发转化或人为转化，失去了正常细胞的特点，可=无限增殖传代，适宜大规模工业培养4.工程细胞系：融合细胞系(仙台病毒融合法、聚乙二醇融合法、电融合法)；基因工程细胞系
病毒载体：牛痘病毒。腺病毒和逆转录病毒载体，杆状病毒载体-昆虫细胞系统
①双链DNA，易重组②插入7～8kb DNA不影响正常病毒粒子的形成。③多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；④多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20%～30%；⑤用光学显微镜可看到多角体，以此作为标记物选阳性克隆。⑥如用家蚕杆状病毒，还可在蚕体表达外源基因
基因工程细胞主要的筛选系统（抗性作用，荧光作用）
导入方式（融合法，化学法，物理法，病毒法）
细胞库的建立：原始细胞库(MCR)→生产用细胞库(MWCR，又称工作细胞库，主细胞库→生产细胞库) ★ 动物细胞的大规模培养方法
1.悬浮培养：适用于非贴壁依赖细胞或兼性贴壁细胞。优点：操作简便，培养条件均一，传质传氧较好，容易扩大培养，可以借鉴细菌培养的经验。缺点：细胞培养密度较低。2.贴壁培养3.贴壁-悬浮培养：微载体培养：用于培养贴壁细胞。多孔载体培养：可用于悬浮细胞及贴壁细胞。包埋和微囊化培养
动物细胞培养的操作方式1.分批式操作2.半连续式操作3.灌流式操作 动物细胞生物反应器的类型⒈搅拌罐式生物反应器⒉气升式生物反应器⒊中空纤维式生物反应器⒋透析袋或膜式生物反应器⒌固定床或流化床式生物反应器 理想的动物细胞生物反应器的基本要求1.生物反应器的材料无毒2.生物反应器的结构：满足传质、传热、混合的功能3.密封良好，避免污染4.自动检测、调节控制精度高5.长期连续运转 6.容器内
8.设备成本低
2.生产周期大大缩短。3、易于操作管理，大大减轻劳动强度。
4、产物浓度较高，杂质少；产物易于分离纯化，产品质量高。缺点：与微生物比较，植物细胞培养还具有对剪切力敏感，生产周期长等缺点，此外，许多植物细胞的生长和代谢需要一定的光照。 植物培养细胞的生理特性：1、抵抗剪切力差；2、需用抗生素；3、生长的中期及对数期凝聚4、培养过程需不断的供氧；5、产量较低6、培养过程具有结构与功能全能性。
不同时期的植物细胞：延迟期（细胞数量、 干重近乎恒定， 细胞壁厚度达最大；高RNA含量；高蛋白质合成能力；高聚核糖体含量；有丝分裂加速；增加细胞的细胞质部分），加速期（常数：干重 增加：细胞数、DNA和蛋白质浓度减少：有丝分裂活性、RNA含量和蛋白质合成能力），对数期（增加细胞干鲜重及RNA酶活性；蛋白质合成能力完全减退；变化：聚核糖体浓度向有利于单核 糖体和寡核糖体形成的方向减少），稳定期（有机化合物浓度高，细胞高液泡化、 极度脆弱、 高度分化） 细胞生长素：用来诱导细胞的分裂，愈伤组织形成及根的分化。细胞分裂素：促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。高生低分：刺激细胞分裂。低生高分：刺激细胞生长
影响植物次级代谢产物生产和累积的因素：外植体，培养条件的影响：1.培养环境的内在因素温度，光（光照时间，光强，光质），通气（O2），pH和渗透压 2.两步培养法（生长培养基和生产培养基：乙酸调节） 3.培养环境的外部因素培养罐类型，通气，搅拌和培养方法 植物细胞大规模培养生物反应器的类型（1）.机械搅拌式生物反应器（2）.鼓泡塔生物反应器（3）.气升式生物反应器（4）.转鼓式生物反应器（⒌）固定化细胞生物反应器。. 各种生物反应器的性能比较 1.机械搅拌式培养系统 ：根据植物细胞的特性，机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计的。搅拌装置要减少剪切力，一般改叶轮式为螺旋式；因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；为便于取样观察，一般还设计有取样口。优点：易于控制温度、 pH、溶氧及营养物质浓度，混合均匀。3.气升式培养系统考虑到机械搅拌式反应器的剪切作用难以避免，同时搅拌器转动的轴封处容易泄漏造成污染。因此，发展出空气提升式生物反应器，它是最适合培养植物细胞的反应器之一。优点：低剪切力，较好的混合，较高的氧传递效果。无运动部件，不易染菌，操作费用低。改善营养供应：增加培养细胞与培养液的接触面；避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；缺点:高密度培养时混合不均匀。5.固定化细胞生物反应器：定义：指固定在载体（惰性基质）上，在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。采用固相培养，细胞有一定程度的分化发育，从而刺激调控代谢物合成的基因表达，促进次级代谢产物的产生。方法：吸附法（共价交联，表面固定化，膜固定化）；包埋法（多孔载体，凝胶包埋）；植物细胞固定化培养优点：1.可保护细胞免受剪切。2.细胞可长时间重复使用，更换培养基带走代谢物。3.易于实现细胞的高密度培养。4.细胞间接触良好，易于分化，有利于次级代谢产物的合成。5.减少细胞的遗传不稳定性。6.易于实现连续化操作。缺点：固定化培养的植物细胞其代谢产物必须分泌到细胞外，多数植物细胞次级代谢产物存在于细胞内或分泌到液泡中。
植物细胞制药的进展与展望：一、诱导子在植物细胞工程研究中的应用（有目的代谢产物调控及生物合成） 二、前体饲喂（增加次级代谢产物率） 三、两相法培养（创造一个次级代谢产物的 储存单元）减轻产物本身对细胞代谢的抑制作用；保护产物免受酶或酸对产物的影响；降低生产成本 四、转基因技术在次级代谢产物生产中的应用（冠瘿组织和毛状根培养技术） 五、植物生物转化技术（植物细胞悬浮培养, 固定化细胞培养, 毛状根培养以及酶都可通过生物转化产生有用化合物.）
第六章 酶工程制药
酶工程优点：工艺简单、效率高、生产成本低、环境污染小、产品收率高、纯度好。
酶的特性 酶是由活细胞产生的具有特殊催化功能的一类蛋白质。 特点：①催化效率高②专一性强③反应条件温和④催化活性受到调节和控制 酶工程：是酶学和工程学相互渗透结合发展而形成一门新的技术学科。酶工程是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。 酶工程的研究内容：（1）.酶的分离、纯化、大规模生产和应用（2）.酶和细胞的固定化及酶反应器的研究（传感器，检测器）（3）.酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶）的研究（4）.酶的分子改造与修饰，结构与功能的关系的研究（5）.有机相中酶反应的研究（6）.酶的抑制剂、激活剂的研究（7）.抗体酶、核酸酶的研究（8）.模拟酶及酶分子的人工设计研究
酶和细胞的固定化
固定化酶的定义：固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，是经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂，属于修饰酶。酶的固定化：是指制备固定化酶的过程。
固定化酶的特点具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。优点：①可多次使用。②反应后，酶、底物、产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。③反应条件易控制，可实现转化反应的连续化和自动控制。④酶的利用效率高。⑤比水溶性酶更适合于多酶反应。缺点：①固定化时，酶活力有损失。②初始投资较大。③只能用于可溶性底物，而且分子量要小。④胞内酶必须经过酶的分离纯化过程。⑤与完整菌体相比不适宜多酶反应，特别时需要辅助因子的反应。 固定化酶(细胞)的制备 酶固定化方法：载体结合法(物理吸附法、离子结合法、共价结合法)交联法(常用戊二醛剂)、包埋
法(网格型、微囊型)④选择性热变性法
吸附法 固定化方法 包埋法 共价结合法 交联法 物理吸附法 离子吸附法
制备难易 易 易 较难 难 较难
结合程度 弱 中等 强 强 强
活力回收 高，酶易流失 高 高 低 中等
费用 低 低 低 高 中等
底物专一性 不变 不变 不变 可变 可变
载体：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、氨基酸共聚物等
⒈固定化细胞的定义将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。细胞的固定化，避免了冗繁的酶纯化手续，更有利于多酶反应。用于固定化的细胞可以是活跃生长的细胞，也可以是死细胞和静止细胞。
⒉固定化细胞的特点有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。优点：①无须进行酶的分离纯化②保持酶的原始状态，酶回收率高③细胞内酶比固定化酶稳定性高④细胞内酶辅助因子可自动再生⑤细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应⑥抗污染能力强缺点：①利用的仅是胞内酶，酶多副产物多②细胞膜、细胞壁和载体都存在扩散限制作用③载体形成的空隙大小影响高分子底物的通透性固定化细胞的制备技术 ⑪载体结合法。⑫包埋法（⑬交联法 ⑭无载体法
固定化酶(细胞)的性质：酶活力大都下降，酶学特性的变化：最适温度一般会升高，最适pH 变化（载体带﹣，PH上升）（产物酸性，PH上升），固定化后专一性会下降，米氏常数 Km增大，最大反应速度变化不大。 固定化细胞的性质：有活性升高的现象；稳定性的增加；最适温度和最适pH常保持不变
一、反应器的类型和特点⒈间歇式搅拌罐反应器（BSTR）用于游离酶,反应后随即放料,不回收游离酶。⒉连续流动搅拌罐反应器(CSTR)连续进料、连续出料⒊填充床反应器（PBR）固定化酶填充于床层内。反应器内的流体的流动形态为平推流（活塞流）流形。又称平推流反应器（PFR）底物以恒定流速通过反应床。⒋流化床反应器（FBR）底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态，达到混合的目的。流速使固定化酶颗粒不下沉又不溢出。⒌循环反应器（PCR）部分反应液流出和新加入底物流入液混合，在进入反应床进行循环。⒍连续流动搅拌罐-超滤膜反应器（CSTR/UF, CSTR/UFR）连续流动搅拌罐的出口处装有超滤膜，产物和未反应的底物可通过，酶被截留反复使用。
二、反应器的选择依据 ： （⒈）根据固定化酶的形状来选择：（⒉）根据底物的物理性质来选择：
（⒊）根据反应的动力学特性来选择：（⒋）根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择： 模拟酶：人造的具有酶性质的催化剂（分子模拟立体结构，化学结构）与天然酶相比：模拟酶具有更高的热稳定性和酸碱稳定性，同时催化效率更高，适应性更强。
模拟酶的分类1.主-客体酶模型：2.胶束模拟酶 3.肽酶：4.半合成酶：5.印迹酶：（1）分子印迹技术：如果以一个分子充当模板，其周围用聚合物交联，当模板分子除去后，此聚合物就留下了与
（1）增加疏水性底物或产物的溶解性。（2）热力学平衡向合成方向移动，如酯合成、肽合成（蛋白水解酶）。（3）可抑制有水参与的副反应，如酸酐的水解等。（4）酶不溶于有机介质，易于回收再利用。（5）容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物。（6）酶的热稳定性提高，pH的适应性扩大。（7）无微生物污染。（8）能测定某些在水介质中不能测定的常数。（9）固定化酶方法简单，可以只沉积在载体表面。（10）酶在非水介质中可以催化某些在水中不能进行的反应（改变溶剂能控制底物的特异性、区域选择性、立体选择性），如脂肪酶水相催化酯的水解，有机相中催化酯化、转酯、氨解等。
2.有机相酶反应的溶剂体系（1）水-水溶性溶剂均相体系：乙醇、丙酮、甘油（2）水-水不溶性溶剂两相体系：三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚（3）反向胶束（油包水酶）（4）单相有机溶剂体系：酶分子周围有一层水分子膜（必需水）维持酶催化反应构象。
3.水和溶剂对有机溶剂中酶的影响（1）酶活力：最适含水量。（2）酶选择性：对固定的底物有些酶选择性会因所处的溶剂不同而变化。（3）酶的稳定性：有机溶剂中酶的热稳定性随系统水含量增加而下降，水是酶热失活的必须参加者。
4.有机相的酶工程（1）酶的固定化：载体吸附法和凝胶包埋法，提高扩散效果，增加稳定性，利于回收和连续化生产（2）酶的化学修饰和表面活性剂包埋：增加酶表面疏水性，改善脂溶性和稳定性，提高催化效率。
三、抗体酶：具有催化能力的抗体（免疫球蛋白）
第四章 抗体工程制药
抗原：凡是能够刺激机体的免疫系统产生抗体或效应淋巴细胞，并且能够和相应的抗体或效应细胞发生特异性结合反应的物质，就叫做抗原。(免疫原性，反应原性）
抗体：指能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。
免疫：机体识别自身成分和异己物质，排除异物以维持内环境稳定的一种生理反应，通常对机体有利，但有时也可能损害机体。（免疫防御，稳定，监视）
免疫系统：机体执行免疫应答及免疫功能的一个重要系统
免疫系统的构成：1.免疫组织和器官：中枢（骨髓，胸腺），外周（淋巴结，脾，粘膜）2.免疫细胞：固有免疫（生物体与生俱来的防御机制，可对入侵的病原体迅速作出应答，产生非特异抗感染免疫作用）的组成细胞（吞噬，树突状，NK，嗜酸、碱性粒细胞）。适应性免疫应答细胞（体内抗原特异性T/B淋巴细胞接受抗原刺激后，自身活化、增殖、分化为效应细胞，产生一系列生物学效应的全过程。）T\B淋巴细胞。3.免疫分子 免疫球蛋白、补体、细胞因子等 多克隆抗体：天然抗原分子中常含有多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生的抗体中含有针对多种不同抗原表位的免疫球蛋白，称为多克隆抗体。（优点：作用全面，具有抗体的各种功能；来源广泛，制备容易。缺点：特异性不高，易发生交叉反应，从而限制了其应用）
单克隆抗体：（优点：特异性高，结构均一，纯度高，效价高。缺点是其鼠源性对人具有较强的免疫原性，反复使用可产生人抗鼠的免疫应答。）
基因工程抗体：
利用DNA重组技术，将编码人源抗体的基因克隆到特定的表达系统中，进行体外表达而得的的人-鼠嵌合抗体或人源化抗体（优点：均一性、特异性好，克服其鼠源性的不足。缺点：
特定抗原对动物进行免疫，淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合并进行杂交瘤细胞的选择性培养，阳性克隆的筛选及克隆化培养，杂交瘤细胞及抗体性状的鉴定，大量制备单克隆抗体，单克隆抗体的纯化
抗原和免疫：抗原的制备(通常和佐剂混合，增强免疫应答)、免疫动物(体内/体外免疫方法；动物的选择：一般采用与骨髓瘤供体细胞同一品系的动物)
细胞的融合：制备脾细胞悬液，制备骨髓瘤细胞悬液：对数生长期细胞，融合：在PEG溶液中加入DMSO，可以提高细胞接触的紧密性，提高融合率
HAT培养基筛选杂交瘤细胞（融合后细胞→HAT培养基→HT培养基→正常培养基）
杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测）仅少数杂交瘤细胞可以分泌预期抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)、间接免疫荧光法、放射免疫测定法、流式细胞仪法
杂交瘤细胞的克隆：有限稀释法、软琼脂培养法。
杂交瘤细胞的鉴定：杂交瘤细胞进行染色体分析，分泌抗体稳定性分析，外源因子检查。 单克隆抗体的大量制备：体内接种法(皮下接种、腹腔接种)；体外培养法
单克隆抗体的纯化：小鼠腹水的处理和抗体捕获，凝胶过滤，阴离子交换层析，亲和层析，疏水性(V区)、恒定区(C区)和铰链区(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶) VL 、VH区各有3个超变区(也称互补决定区，CDR1-3)，共同组成Ig的抗原识别部位，形成与抗原决定簇互补的表位。可变区中的其它部分变化较小，称为骨架区(FR)。C区决定Ig分子的异种抗原性，主要发挥抗体分子的效应功能。
基因工程抗体
基因工程抗体的特点：1.最大程度降低抗体的鼠源性，降低甚至消除人体对抗体的排斥反2.分子较小，在组织中的透过率增大，穿透力强，更易到达病灶的核心部位3.可以根据治疗的需要，制备多种用途的新型抗体4.可以采用原核细胞、真核细胞或动植物等多种表达5.系统大量生产，显著降低成本
人一鼠嵌合抗体：人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。优点：保持了鼠源性单抗的抗原结合特异性，但对人的免疫原性大幅度下降。效应功能部分可选择并按需进行改造。缺点：分子质量大，不易渗透到实体瘤等目的组织。不容易大量表达，生产成本高。 改形抗体：把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改形抗体，也就是人源化抗体。(优点：进一步减少抗体中鼠源部分的比例,降低了人抗鼠抗体反应。缺点：抗体亲和力下降，甚至失去活性.构建方法复杂，费时费力)
小分子抗体（优点：可以用细菌发酵生产，成本低；分子小，穿透力强；不含Fc，没有Fc带来的效应；在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。）
Fab抗体：由重链V区及CH1功能区与完整的轻链以二硫键连接而成。1/3
Fv抗体：由VH与VL非共价结合而成。1/6
单链抗体(ScFv)：在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，即单链抗体。 单域抗体：即为VH或VL，约为完整分子的1/12。
1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性
一、放射性同位素标记的抗体治疗药物（优点:1.有利于克服肿瘤表面抗原的异质性2.对肿瘤细胞的杀伤不依赖于抗原抗体结合后的吸收作用3.分子量小，穿透力强。缺点：来源困难，且需要放射性保护和污物处理）二、抗癌药物偶联的抗体药物（特异性强）三、毒素偶联的抗体药物（特异性，稳定性，渗透性好，免疫原性低，可大量制备）
第七章 发酵工程制药
发酵：现代发酵工业上泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程，或更确切地说，发酵是用生物催化剂使培养物质转化成产品的生物化学反应
发酵工程技术：主要包括提供高性能生产菌种的菌种选育技术、实现低成本大规模生产产品的发酵技术和最终获得合格产品的分离提取技术。
发酵工程的基本过程：上游工程：菌种选育、中试； 发酵生产：中心环节； 下游工程：产物分离
纯化鉴定、副产物回收、废物处理
发酵方式：
一、分批(间歇)发酵：物料一次投入反应器中，灭菌、接种、发酵。特点： 一次性；发酵过程中，营养不断减少，微生物不断增殖，环境非稳态；微生物生长的四个时期明显。应用广泛，需改善（在线检测，计算机控制）。 二、补料分批发酵 ：补加新鲜培养基。特点：可以解除底物抑制、产物抑制或克服微生物过度生长；提高有用产物的转化率；应用广泛，用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业； 三、连续发酵：恒化器、恒浊器，连续进料出料平衡，保持恒定的发酵液密度。易实现自动化生产，如啤酒，乙醇的发酵。优点：操作稳定；利于机械、自动化；提高设备的利用率；减少灭菌次数；
缺点：易染菌；微生物易变异；对产品类型的适应性不广；对设备及附件要求高。 （1）提供必要的营养成分（2）配制合适的浓度（3）主成分与其他成分的配比（4）控制合适的pH。
培养基的主要成分（1）碳源(糖类，脂肪，有机酸，碳氢化合物)：主要功能： ① 提供能源；② 菌体成分；③ 产物碳架。（2）氮源：(无机氮源，有机氮源)主要功能：①构成细胞物质。②构成产物。
（3）无机盐及微量元素：主要功能：①构成菌体成分（S）②激活酶（Mg2+）③辅酶或辅基的组成部分④参与能量转移反应⑤调节渗透压、pH、氧化还原电位。（4）特殊生长因子：主要功能：①构成辅酶 ②促进生命活动。（5）水： 水是物质溶解和生化反应的基础。功能：①机体的重要组成成分；②参加一些代谢反应；③良好溶剂（介质）和热导体；
二、温度的影响及其控制
1.影响发酵温度变化的因素（1）生物热：生长，呼吸，繁殖（2）搅拌热：摩擦（3）蒸发热：（4）辐射热：罐内外温差
2.温度的选择与控制（1）最适温度：生长温度，生产温度,变温发酵，(2）温度控制:一般不需加热，冷却水（冷冻盐水）通过夹层循环冷却。
三、融氧的影响及其控制
四、pH的影响及其控制
pH对发酵的影响：最适生长pH（3～6） 最适生产pH 常用的控制方法有：①调整生理碱性和酸性盐类的比例；②选择不同C、N的种类和比例；③添加缓冲剂。补料控制
发酵过程的影响及控制：
菌体浓度——通过控制培养液中营养基质的浓度(基础培养基各成分要有适当配比；通过中间补料调整培养基成分)
营养物质：碳源、氮源——用含有两种碳/氮源的培养基进行控制；磷酸盐——对初级代谢产物及次级代谢产物的控制；补料的控制
温度 ——在发酵不同阶段，采用不同温度；针对不同条件，采用不同温度
pH值——调节培养基组分，增加缓冲体系；补料；补加酸碱
溶氧 ——调节搅拌转速和通气率；控制菌体浓度，使细菌比生长速率略高于临界值
CO2 ——控制通气量；控制搅拌速度；控制补料工艺 泡沫 ——机械消沫；消泡剂消沫
染菌 ——设备无渗漏；管道系统无渗漏；空气净化系统正常（种子，空气，设备，灭菌）
发酵液的处理与纯化：固液分离技术（离心分离，过滤分离，沉淀分离等工艺）细胞破壁技术（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶等）蛋白质纯化技术（沉淀法、色谱分离法和超滤法等）产品的包装处理技术（真空干燥和冰冻干事燥等）。
青霉素制备流程 菌种，孢子制备，种子制备，发酵（加入前体），发酵液预处理及种子加滤，提取及精制，成品检验，成品包装