现代生物工艺学
第一章：生物技术概论
1、生物技术的内涵与特征是什么？
答：凡是涉及生物的应用、工艺与工程及其基础的领域均应包含在生物技术的范畴。生物技术可以涵盖生物工程、生化工程、生物系统工程、工业微生物等。定义：利用生物体或生物活动过程来获得产品，并服务于人类的技术。
2、生物技术发展经历了哪几个阶段？
答：原始生物技术、非无菌条件下的生物技术、无菌条件下的生物技术、近代生物技术。
3、生物系统包括了哪几个系统？
答：微生物系统、酶系统、动物细胞系统。
4、微生物产物大致可分为哪几大类？
答：细胞本身：如用于发酵或酿造的酵母；生物转化产物：利用细胞或酶把底物或中间 体转化成产物，如甾体的生物转化；微生物的代谢产物：包括初级代谢产物和次级代谢产物。
5、现代生物技术在哪些领域有广泛的应用？
答：生物医药、初级代谢产物、次级代谢产物、酶、生物转化、农业、聚合物。
第二章：生产菌种来源、生物活性物质的筛选和菌种保藏
1、如何分离放线菌、细菌和真菌？
答：放线菌的分离：对分离源进行干热处理：土壤在120℃或100 ℃干热处理能够极大地减少分离平板上的丝状细菌和链霉菌。选择杀菌剂进行杀菌。在放线菌分离琼脂中加入重铬酸钾或放线菌酮，以抑制真菌、细菌的繁殖，从而得到放线菌。细菌的分离：选择合适的培养基和恰当的培养条件，是的需要分离的菌能充分生长，而尽可能多的抑制其他微生物的生长。真菌分离：直接分离：把从自然界获得的样品至于显微镜下观察真菌的生长，接种针加热灭菌后挑取一些孢子到培养基上。
2、生物活性物筛选方法有哪些？
答：配基结合分析、酶法分析、基于报告基因的分析、第二信使分析、酵母双杂交系统
3、菌种保藏的方法有哪些，各有何优缺点？
答：斜面包藏法、石蜡保藏法、载体保藏法、液体保藏法、冷冻保藏法、冷冻干燥保藏法。
第三章：新技术育种原理及其进展
1、微生物菌种的改良方法可分为哪两大类，每一类又包括哪些方法？
答：微生物菌种的改良方法，大致可以分为两类：传统的诱变育种和基因工程技术育种。传统诱变育种的主要方法是突变和筛选。基因工程技术的育种方法包括结构和调控基因的克隆、导入、敲除等。
2、突变株筛选方法有哪些？各有何特点？
答：随机筛选和理化性选择。随机筛选的缺点：效率不高。理性化筛选可以大大节省劳动力,提高筛选效率。
3、遗传学新技术包括了哪些内容？
答：基于基因组的菌株重建、代谢工程、组学技术、大规模平行信号测序、定向进化、分子育种技术、全基因组改组、组合生物合成。
第五章：代谢调控
1、代谢控制的类型有几种？
答：酶活调节（活化或钝化）与酶合成调节（诱导或阻遏）。
2、酶合成调节与酶活调节异同之处是什么？
答：相同点：细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准确控制代谢的正常进行。不同点：酶合成调节通过酶量的变化控制代谢速率而酶活调节控制酶活性，不涉及酶量变化。酶合成调节效果相对缓慢而酶活调节快速、精细。调节机制不同，酶合成调节是基因水平调节，调节控制酶合成，酶活调节是代谢调节，它调节酶活性。
3、简述诱导作用的机制。
答：编码一系列功能相关的酶的基因在染色体中紧密排列在一起，而且它们的表达与关闭是通过同一控制点协同进行的。
4、反馈调节有几种主要类型？简述其机制。
答：反馈抑制和反馈阻遏。反馈抑制是末端代谢产物抑制其合成途径中参与前几步反应的酶（通常是催化第一步反应酶）活性的作用；反馈阻遏是末端代谢产物阻止整个代谢途径酶的合成作用。
5、如何改变培养环境条件来限制末端代谢产物在细胞内部的积累？
答：控制培养基成分、加入生物合成途径的抑制剂、限制补给营养缺陷型突变株所需的生长因子、采用末端代谢产物的衍生物。
第六章：培养基
1、培养基的碳源、氮源主要包括哪些物质
答：碳源物质主要有糖类、脂类、有机酸和低碳醇等。氮源：凡是能被用来构成菌体物质中或代谢产物中氮素来源的营养物质。
2、培养基的营养要素有哪些？
答：碳源，氮源，机盐及微量元素，前体、生长因子、促进剂和抑制剂。
3、什么是培养基？有什么作用？常用培养基类型有哪些？配制培养基时应主要考虑哪些因素？
答：培养基是人工配置的提供微生物或其他细胞生长、繁殖代谢和合成产物所需要的营养物质和原料。培养基为微生物提供其生长及产物合成所需的营养物质和环境条件。培养基按其组成或物质的纯度、状态、用途可有不同的分类，按其组成物质的纯度可分为合成培养基和天然培养基（复合培养基）；按其组成物质的状态可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基；按其组成物质的用途可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。培养基成分的影响：在选择培养基的成分时，特别是有机氮源、碳源，要注意原料的来源、加工方法和有效成分的含量。灭菌的影响：在高温灭菌时培养基各成分之间会发生化学反应，培养基的某些成分被破坏，甚至产生有毒物质，使培养基颜色变深。
4、葡萄糖是较易被利用的碳源，培养基中葡萄糖过多时会产生哪些危害？
答：过多的葡萄糖会过分加速菌的呼吸，以致培养基中的溶氧不能满足需要，使一些中间代谢产物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，导致pH的下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。
5、利用淀粉作为主要碳源，有什么好处？
答：可克服葡萄糖代谢过快的弊病，同时淀粉来源丰富，价格也比较低廉。
6、利用脂类作为碳源，对生产工艺的控制有什么特殊要求？
答：当微生物利用脂肪作碳源时，要供给比糖代谢更多的氧。
7、什么是生理酸性物质和生理碱性物质？
答：生理酸性物质：经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源。生理碱性物质：经微生物生理作用（代谢）后能形成碱性物质的无机氮源。
第八章：培养技术与过程建模
1、Monod方程与米氏方程有何不同？
答：Monod方程与酶催化反应的米氏方程形式一样，但Monod方程完全是经验的，而米氏方程则是推导出来的。
2、影响停滞期长短的决定因素有哪些？
答：养分的变化、培养条件的改变、抑制剂的存在、种子生理期阶段。
3、微生物生长可分为几个阶段？次级代谢产物通常在什么阶段开始合成？
答：停滞期、加速期、对数期、减速期、静止期和死亡期。在静止期（稳定期）菌体次级代谢十分活跃，许多次级代谢产物在此期大量合成，菌的形态也发生较大的变化。
4、发酵操作方式可分为几种，试述各种培养方式的优缺点。为什么连续培养不能无限期地连续下去，请简述之？
答：分批培养、补料-分批培养、半连续培养、连续培养。分批培养优点：操作简单，周期短，染菌的机会减少，且生产过程、产品质量容易掌握；缺点：因其周期短，一般在1到3天，产率较低。补料-分批培养优点：它能在一种系统中维持很低的基质浓度，从而避免快速利用碳源的阻遏效应和能够按设备是通气能力去维持适当的发酵条件，并且能减缓代谢有害物的不利影响。缺点：一些微生物能利用甲醇、乙醇、乙酸、某些芳香族化合物等，但它们在较高浓度下会对菌体的生产产生抑制。半连续培养优点：补充了养分和前体而且稀释了代谢有害物，从而有利于产物的继续合成；缺点：（1）放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生产旺盛期的菌体。（2）定期补充和带放会使发酵液稀释，送去提炼的发酵液体体积更大。（3）发酵液被稀释后可能产生更多的代谢有害物，最终限制发酵产物的合成。（4）一些经代谢产生的前体可能丢失。（5）有利于非产生菌突变株的生长。连续培养优点：（1）省去了反复放料、清洗、装料、灭菌等步骤，避免了延迟期，提高设备的利用率和单位时间产量，只保持一个期的稳定状态。（2）发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制；（3）易于分期控制，可以在不同罐中控制不同的条件。缺点：（1）连续发酵对设备的密封性、培养液和空气的无菌度要求严格，目前使用的空气过滤器不能完全保证（长时间）100%的除菌效率；
（2）加入连续发酵罐的培养基与罐内发酵液的混合不均匀，即均匀度不够，就会使罐内各部分的微生物生长不一致，某部分微生物得不到充分的营养而引起操作不确定并降低产率。对于高黏度发酵液均匀度不够的情况更为严重。
5、分批培养中，各时期的细胞生长动力学特征是什么？
答：(1)、停滞(延迟)期：是微生物细胞适应新环境的过程。(2)、对数生长期：细胞浓度随培养时间呈指数增长，细胞浓度的变化率与细胞浓度成正比。在对数生长阶段，细胞的生长不受限制，因此比生长速率达到最大值μm。(3)、减速期：细胞的比生长速率和限制性基质的浓度S有如下关系：μ=μmS/(Km+S) (4)、静止期（稳定期）：细胞浓度达到最大，细胞增加速度与死亡速率相等 。(5)、衰亡期细胞死亡速率大于比生长速率。α> µ，dX/dt
6、补料分批培养与连续发酵过程的主要动力学特征各是什么？准稳态与稳态的区别主要在哪里？
答：补料分批培养：ds/dt=0,dx/dt=0, μ=D只进不出，直到培养液到定额为止；与连续培养不同，在该法培养中，μ、D随着培养时间的延长，由于体积的增加，μ和D以相同速度下降，而连续培养中，μ和D为定值。连续发酵：连续培养的最大特点是微生物细胞的生长速度、产物的代谢均处于恒定状态，可达到稳定、高速增微生物细胞或产生大量代谢产物的目的。μ=D.dx/dt=0,ds/dt=0,dp/dt=0补料分批培养：在基础培养基营养消耗完时，开始补料，随着营养的添加，一方面菌体增殖而增加菌体浓度；另一方面，发酵液体积增加又使菌体浓度被稀释；两方面的趋势最终接近平衡，这种状态称为“准恒定状态”。连续发酵：指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系
统内培养液的液量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态（基质浓度、产物浓度、pH、菌体浓度、比生长速率）下生长的微生物培养方式。
7．什么是菌体的比生长速率、产物的比形成速率以及比基质的消耗速率？什么是倍增时间、得率系数 ？
比速率：单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物（菌体）的量。细胞生长的比速率为μ：μ=(1/x)(dx/dt)。产物的比形成速率：单位质量细胞在单位时间生成产物的量。基质的消耗速率：生成的细胞量与底物消耗量之比，为对底物消耗得率。得率：是指被消耗的物质和所合成产物之间的量的关系。得率系数Y： 两种物质得失之间的计量比。倍增时间(td) ：微生物细胞浓度增加一倍所需要的时间，也叫增代时间.
8为什么说微生物分批培养是一种非稳态的过程？
答：分批培养中，由于底物的不断消耗和产物的积累，反应器内细胞所处的环境也随之不断变化，反应过程处于非稳定状态操作，并且某些反应产物可能存在对反应抑制作用，细胞不能始终在最优条件进行，致使随着反应过程的进行，分批反应效率逐渐降低。
第十一章：蛋白质组学及其在微生物学研究中的应用
1、典型的蛋白质组学研究常分为哪几个步骤？
答：（1）从生物学物质（如细胞、组织、体液等）提取蛋白质混合液；（2）分离蛋白质混合液；（3）将有意义的蛋白质消化成肽进行质谱分析；（4）将质谱获得的数据利用各种生物信息学工具进行分析。
2、在蛋白质分离中，凝胶技术和非凝胶技术各指的是哪些技术？各有什么特点？
答：凝胶技术指二维（双向）凝胶电泳技术。特点：克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。稳定的可以随意精确设定的pH梯度。尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。非凝胶技术：高效液相色谱法、毛细管电泳、液相等点聚焦和毛细管色谱。特点：自动化程度高、分辨率高，检测限低。
3、什么是生物质谱、软电离？如何应用生物质谱鉴定蛋白质？
答：生物质谱在fmol(10-15)乃至attomole(10-18)水平检测相对分子质量高达几十万的生物大分子的有机质谱技术。软电离指的主要是电子或激光等的外界能量不直接作用于样品分子，使得生物大分子结构破环较少，并可电离成为携带一个或多个电荷的质量较大的分子、离子。应用生物质谱鉴定蛋白质：肽质量指纹谱、串联质谱的肽序列标签、肽段的从头测序。
4、目前常用的蛋白质定量方法有哪几种？它们的基本原理是怎样的？
答：基于荧光染色技术的电泳定量法、基于稳定同位素技术的质谱定量法。基于荧光染色技术的电泳定量法：p207同位素标记法基本原理：将待比较的一对肽段样品中的一个进行同位素标记，另一个不标记，标记和未标记的同一肽段，其色谱行为一致的，进而可以利用它们的质量差异确定在质谱仪中的信号对，通过比较信号对之间相对强弱就可以准确地计算标记和未标记肽段的相对丰度。
第十二章：动物细胞培养
1、冻存保护剂分哪几类？各有什么特点？
答：可分为渗透型和非渗透型两类。渗透型冻存保护剂的特点：易与水分子结合，易穿透细胞膜进入细胞内部，从而降低细胞冰点，提高细胞质膜对水的通透性；冻存时，保护剂可促进细胞内水分渗出细胞外，从而减少胞内冰晶的形成；复苏时，促进细胞外水分进入细胞，缓解渗透性肿胀引起的损伤。甘油、二甲亚砜是最常见的渗透性保护剂。非渗透型冻存剂的特点：一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内部，但能溶于水，可稀释细胞外电解质的浓度，从而减少溶质损伤；这些大分子物质可结合水分子，降低细胞外自由水的含量，减少胞
外冰晶的形成。主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖等。
2、细胞低温保存存活率与冷却速率有何关系？
答：对于某一种细胞和某一确定的保存方案，对应最大的细胞存活率，确实存在着某种最佳冷却速率；而过快或过慢的冷却速率都会导致细胞受到损失，降低其存活率。
3、动物细胞培养基分为几类？各有何优缺点？
答：（1）天然培养基：优点：营养价值高。缺点：成分复杂，来源有限。（2）合成培养基：优点：合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。缺点：有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。（3）无血清培养基：优点：产品易于纯化，回收率高。缺点：黏度小，细胞易受搅拌等机械因素的影响。
4、动物细胞培养生物反应器主要有哪些？各有何特点？
答：（1）、机械搅拌式生物反应器:是最传统的微生物发酵装置,也可以用于动物细胞悬浮培养。（2）、气升式生物反应器：利用通入反应器的无菌空气的上升气流带动培养液进行循环，使供氧和混合两种作用融为一体的一类生物反应器。（3）、填充床生物反应器：填充床生物反应器是在反应器中填充一定材质的填充物，供细胞生长。营养液通过循环灌注的方式提供，并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可在反应器外通过循环的营养液携带，因而不会有气泡伤及细胞。（4）、中心灌流式反应器：反应器中央为一多孔状管道，称为中央分配管。分配管的外周包围着多层与其平行排列的中空纤维。（5）、波浪袋生物反应器：波浪袋生物反应器不同于其它生物反应器，其培养规模最大可达到100L，并可随意替换无菌培养袋。波浪袋生物反应器不是通过透气膜进行氧的传输，氧的传输以及氧与培养基的混合通过一个特殊的摇动装置产生波浪来实现。这种波浪活动并不产生气泡，通过波浪产生的表面与反应器顶部空气的接触进行氧的交换，同样将悬浮的细胞、微粒以及培养液进行混匀。
（6）、旋转式培养系统：优点：结构简单，投资少，技术熟练，重复性好，放大只需要简单地增加转瓶（管）数量。缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受限制。
5、昆虫细胞培养和哺乳动物细胞培养的主要区别在哪？昆虫细胞用培养基有什么独特性？ 答：昆虫细胞培养和哺乳动物培养在主要原理和方法上是相似的，主要的区别就在于所使用的培养基。昆虫细胞用培养基偏酸性。在pH6.2~6.9内，培养基用磷酸钠作缓冲体系，无需CO2。渗透压高。一般培养昆虫细胞的培养基的渗透压为340~390mOsmol/kg,而哺乳动物细胞用的培养基的渗透压为290~330mOsmol/kg。尽管培养基内的无机盐成分类似，不同的昆虫细胞所用的基础培养基内Na+/K+不同。
第十三章：植物细胞培养
1、植物细胞培养基由几大类组成？各有何作用？
答：（1）无机成分：N、P、K、Ca、S等浓度大于0.5mmol／L大量元素及Fe，B，Mn，Cu等
浓度小于0.5mmol／L微量元素。（2）有机成分：①含N物质：包括维生素和氨基酸等②碳源：2%—5%的葡萄糖或蔗糖③植物激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素等④天然复合物：水解蛋白类、酿酒副产品、胚乳液、果汁。（3）抗生素：一般情况下避免添加。
（4）凝胶成分：琼脂、琼脂糖、藻酸盐等，起支持作用。
2、以MS培养基为例，如何配制植物细胞培养基？应注意什么问题？
答：溶化琼脂（600-700ml）+蔗糖
溶解液→调pH（5.8）→定容（1L）→分装→包扎及灭菌 母液的量取→混合
3、提高次生代谢产物的途径有哪些？举例说明。
答：（1）筛选得到高产细胞系（株）。（2）培养条件（培养基成分 光 温度 ph 通气量和搅拌转速 前体饲喂 诱导子的应用）（3）毛状根培养技术。（4）冠瘿培养技术。
例子：利用发根农杆菌去感染植物，使双子叶植物从感染部位长出许多细长的毛状根这些毛状根在无激素培养基中培养可以迅速繁殖。利用根癌农杆菌感染植物可将其Ti质粒上的T-DNA 在转化过程中被转移到植物基因组中，若将能促进次生代谢产物合成的外源基因插入到T-DNA中，次生代谢产物也将随冠瘿瘤的增长而增长。
4、提高次生代谢产物的技术有哪些？举例说明。
答：（1）两步法培养技术。（2）两相培养技术。（3）固定化培养技术。
例子：在新疆紫草细胞培养中，紫草宁及其衍生物的大量合成发生在对树生长期的末期，通过二步培养方法，在产物合成阶段更换培养基，可使色素的产量达1.9/L以上。
5、什么是植物次生代谢产物？一般分为几大类？
答：次级代谢产物：是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，并非细胞生长所必需的。如生物碱、黄酮、挥发油、皂甙等。植物次生代谢物一般分为酚性化合物、萜类化合物、含氮有机物三大类。
6、植物细胞生物反应器的选型应考虑哪些方面？
7、配制培养基时，为什么要先配制母液？
答：方便配置其他培养基；保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取
8、为什么要严格保持细胞培养操作环境的无菌？
第十四章：下游加工过程概论
1、下游加工技术的定义。
答：发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程称为下游加工过程。
2、下游加工过程有什么特点和重要性？
答：特点：发酵产品在培养液中的浓度一般较低，溶液中欲提取物质的浓度越低，提取时所耗费的能量就越大，费用也就越高。（2）产品易失活，对热、酸、碱及有机试剂不稳定；（3）对最终产品的质量往往要求极高。（4）发酵液是复杂的多相体系，且粘度大，是非牛顿性流体；（5）发酵液中往往含有性质相近的杂质，分离难度大。重要性：在发酵产品的生产中，分离和精制过程所需的费用占成本的很大部分。对传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠檬酸)，分离和精制部分占总投资费用的60％，对重组DNA生产蛋白质、精制的费用可占整个生产费用的80％一90％。没有经济的下游技术，则不可能实现工业化生产。下游加工的成本是制约生产者提高经济效益的重要因素。下游加工工程研究的目的就是提高产品回收率，降低分离纯化成本。
3、生物物质分离纯化一般分哪几个阶段？各阶段主要采用的方法有哪些，目的是什么？ 答：分离纯化的一般流程：
（1）发酵液的预处理 方法：离心和过滤 目的：除去不溶性物
（2）产品的提取和浓缩 方法：萃取、吸附、沉淀、蒸发 目的：破碎细胞
（3）产品的精制（提纯）方法：层析、膜分离、离子交换、沉淀、电泳 目的：去除杂质
（4）产品的最后加工 方法：结晶、干燥、蒸馏 目的：产品的最终使用要求
4、分离纯化技术路线的选择原则有哪些？
答：（1）、尽可能简单、低耗、高效、快速。（2）、分离步骤尽可能少，每步收率尽可能高。
（3）、避免相同原理的分离技术多次重复出现。（4）、尽量减少新化合物进入待分离的溶液。
（5）、合理的分离步骤次序。原则是：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。
第十五章：发酵液的预处理和固液分离
1.为什么要进行发酵液预处理？
答：改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；尽可能使产物转入便于以后处理的相中；能够除去部分杂质。
2.絮凝和凝聚的定义和区别。常用的絮凝剂有哪些？
答：凝聚：在中性盐作用下，由于双电层排斥电位（即ξ电位）的降低，破坏胶体体系的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程称凝聚。絮凝：是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使细胞聚集形成粗大的絮凝团的过程。常用絮凝剂：人工高分子聚合物：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯，聚乙稀亚胺的衍生物、聚合铝盐、聚合铁盐。天然有机高分子絮凝剂：壳聚糖、葡聚糖、明胶、骨胶、糖蛋白，粘多糖，纤维素，核酸。
3、改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？其简要机理如何？
答：加热法、凝聚与絮凝法以及添加助滤剂法。加热法：就是把料液加热。凝聚与絮凝法：是在原料中添加电解质，以促使溶液中固体物发生凝聚和絮凝。添加助滤剂法：使发酵液内的胶体物质被吸附于助滤剂颗粒上。离心过滤机有转篮式离心过滤机、卧式刮刀离心机、活塞往复式卸料离心机、螺旋卸料离心机。
4.分离和过滤的主要设备有哪些?
答：过滤设备有传统的板框过滤机和旋转式真空过滤设备。分离设备有管式离心机、有排放喷嘴的蝶式离心机、间断排渣的蝶式离心机。
第十六章：细胞破碎与非选择性蛋白分离
1、细胞破碎的目的是什么？
答：细胞破碎的目的是使细胞内含物释放出来，转入液相中，以便于进行产物的分离纯化。
2、举出几种细胞破碎常用的方法？
答：高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎、酶溶法、化学渗透法。
3、比较非机械法与机械法的优缺点。
答：非机械法的优点：（1）对产物释出具有一定的选择性。（2）细胞外形保持完整。（3）核酸释出量少，浆液粘度小，便于进一步分离。缺点：（1）时间长，效率低。（2）化学试剂的毒性。（3）通用性差。机械法的优点：破碎细胞效率高。缺点：（1）能耗很高，能量利用率很低，并且产生高温和高的剪切力，易使不稳定产品变性失活。（2）非专一地释放产物，导致液相中成分复杂，给后续的分离提纯带来困难。（3）产生的细胞碎片微粒尺寸分布范围宽，大量细颗粒增加了固液分离的难度。
4、细胞破碎效果以什么来定量表征，如何定义，如何操作。
答：细胞破碎率。细胞破碎率：破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，S=[(N0-N)/N0] ×100操作：（1）直接计数法：平板计数、显微镜计数、观察计数（必要时配合染色技术）
（2）间接计数法：测定释放的蛋白或酶活力、测定导电率
第十七章：沉淀法
1、简述蛋白质表面的特性。
答：蛋白质是两性高分子电解质，主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。
2、蛋白质沉淀的主要方法有哪些？
答： 盐析、有机溶剂、重金属盐、有机酸类、超速离心
3、Cohn方程的形式及其中各参数的物理意义。
答：lgS=β－Ks I（S:蛋白质的溶解度,g/L；I:离子强；Ks：盐析常数，斜率，与温度和
pH无关，与盐和蛋白质的种类有关；β : 常数,截距,与盐的种类无关,与温度和pH蛋白质种类有关）
4、盐析的原理如何，影响因素有哪些.
答：原理：（1）高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱。（2）中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域是相互作用，使其沉淀。影响因素：溶质的种类、溶质的浓度、PH、温度。
5、盐析沉淀与等电法沉淀有什么不同。
答：盐析沉淀加入无机盐，等电点沉淀则是加入酸碱调节pH。
6、什么是有机溶剂沉淀法，它的机理如何，有什么特点，影响因素有哪些。
答：有机溶剂沉淀法：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。机理：（1）亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加。（2）水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了溶质分子表面原有水化层的厚度，导致溶质分子脱水凝聚。优点在于其分辨率高于盐析，加入的有机溶剂易除去，且有机溶剂密度低，利于沉淀物分离。其缺点主要是比盐析更易使蛋白变性，需低温操作。有机溶剂成本较高，而且易燃易爆。影响因素：温度、pH值、离子强度、样品浓度、金属离子的助沉作用。
第十八章：膜分离过程
1、何谓膜分离？主要有那几种膜分离方法？
答：膜分离：以选择性透膜为分离介质，通过在膜两边施加一个推动力（如浓度差、压力差或电位差等）时，使原料侧组分选择性地透过膜，以达到分离提纯的目的。膜分离方法：微滤、超滤、反渗透、透析、电透析、纳米过滤、亲和过滤、渗透汽化
2 各种膜分离技术的原理
答：（1）微滤和超滤都是利用膜的筛分性质，以压力差为传质推动力，主要用于 截留固体微粒和高分子溶质。
（2）反渗透是在透析膜浓度高的一侧施加大于渗透压的压力，利用膜的筛分性质，使。浓度较高的溶液进一步浓缩。
（3）纳滤是介于反渗透和超滤之间的一种压力驱动型膜分离技术。
（4）透析是最早发现、研究和应用的一种膜分离过程，它是利用多孔膜两侧溶液的浓度差使溶质从浓度高的一侧通过膜孔扩散到浓度低的一侧从而得到分离的过程。
（5）电渗析是利用分子的荷电性质和分子大小的差别进行分离的膜分离法，可用于小分子电解质的分离和溶液的脱盐。
（6）渗透汽化也称渗透蒸发，它是利用膜对液体混合物中组分的溶解和扩散性能的不同来实现其分离的新型膜分离过程 。
3 膜分离常用的材料有哪些？醋酸纤维膜的特点？
答：（1）膜分离常用的材料有：天然高分子材料 ，如醋酸纤维、硝酸纤维和再生纤维；合成高分子材料，如聚砜；无机材料；复合材料。（2）醋酸纤维膜的特点：优点：醋酸纤维的阻盐能力最强，常用于反渗透膜，也可作超滤膜和微滤膜；再生纤维素可用于制造透析膜和微滤膜。缺点：醋酸纤维膜最高使用温度和pH范围有限，在45-50 C，pH3-8。 4 表征膜的性能特征参数有哪些？
答：（1）孔径、孔径分布和孔隙率。（2）膜的截留能力。 5 什么是浓差极化模型？
答：浓差极化是指，当水透过膜并截留盐时，在膜表面会形成一个流速非常低的边界层， 边界层中的盐浓度比进水本体溶液盐浓度高，这种盐浓度在膜面增加的现象叫
做浓差极化。电极上有电流通过时，电极表面附近的反应物或产物浓度变化引起的极化。称为浓差极化
6 常见的膜组件有哪些？
答：膜组件的种类： 管式膜组件、 中空纤维式、平板膜组件、卷式膜组件
7膜分离技术的主要应用在哪些方面？
答：（1) 细胞培养基的除菌；（2)发酵液或培养液中细胞的收集和除去；（3)细胞破碎后碎片的除去；（4)目标产物部分纯化后的浓缩或滤除小分子溶质；（5)最终产品的浓缩和洗滤除盐；
（6)蛋白质的回收、浓缩和纯化；（7)制备用于调制生物产品和清洗产品容器的无热源水；
（8)膜生物反应器。
8、请比较说明微滤、超滤、纳滤和反渗透等四种常用膜分离技术的异同点。
答：同：都采用错流过滤方式。
微滤对于微滤而言，膜的截留特性是以膜的孔径来表征，通常孔径范围在0.1～1微米，故微滤膜能对大直径的菌体、悬浮固体等进行分离。可作为一般料液的澄清、保安过滤、空气除菌。
超滤对于超滤而言，膜的截留特性是以对标准有机物的截留分子量来表征，通常截留分子量范围在1000～300000，故超滤膜能对大分子有机物（如蛋白质、细菌）、胶体、悬浮固体等进行分离，广泛应用于料液的澄清、大分子有机物的分离纯化、除热源。
纳滤对于纳滤而言，膜的截留特性是以对标准NaCl、MgSO4、CaCl2溶液的截留率来表征，通常截留率范围在60～90%，相应截留分子量范围在100～1000，故纳滤膜能对小分子有机物等与水、无机盐进行分离，实现脱盐与浓缩的同时进行。
反渗透是利用反渗透膜只能透过溶剂（通常是水）而截留离子物质或小分子物质的选择透过性，以膜两侧静压为推动力，而实现的对液体混合物分离的膜过程。反渗透的截留对象是所有的离子，仅让水透过膜，对NaCl的截留率在98%以上，出水为无离子水。反渗透法能够去除可溶性的金属盐、有机物、细菌、胶体粒子、发热物质，也即能截留所有的离子，在生产纯净水、软化水、无离子水、产品浓缩、废水处理方面反渗透膜已经应用广泛。
第十九章：溶剂萃取,两水相萃取法
1、萃取分离的依据是什么？
答：依据：利用溶质组分在两个互不混溶的液相中竞争性溶解和分配性质上的差异进行分离。
2、物质溶解的规律是什么？
答：（1）碱类物质中可溶的是氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钡和氨水。
（2）所有硝酸盐都是可溶于水的。
（3）氯化物中不溶的有氯化银和氯化亚汞，其它是氯化物都是或溶的。
（4）硫酸盐有不溶于水的有硫酸钡和硫酸铅。
（5）磷酸盐、碳酸盐、硅酸盐、亚硫酸盐中。只有钾、钠、铵的磷酸盐、碳酸盐、硅酸盐、亚硫酸盐三种类型的盐可溶于水，其它盐是不溶于水的
（6）银盐只有硝酸银可溶。其余的银的氢硫酸盐、或碱都是不溶的。
（7）微溶的有硫酸银、硫酸亚汞、氢氧化钙和氯化铅；亚硫酸镁、硫酸钙、硅酸以及碳酸镁。
3、溶质的分配定律的生物意义和作用？
答：分配定律——是指在一定温度、压力下，溶质分布在两个互不相溶的溶剂里，达到平衡后，它在两相的浓度之比为一常数K，这个常数称为分配系数，即： K = C1/C2 = 萃取液浓度/萃余液浓度。作用：分配定律对利用吸收方法来分离气体混合物的工艺有指导作用，也可用来定量计算萃取分离时被提取物的质量或吸收一定量的物质所需的液体量。
4、萃取操作的基本内容和原理？
答：基本内容：将一定量萃取剂加入原料液中，然后加以搅拌使原料液与萃取剂充分混合，溶质通过相界面由原料液向萃取剂中扩散。搅拌停止后，两液相因密度不同而分层：一层以溶剂S为主，并溶有较多的溶质，称为萃取相，以E表示；另一层以原溶剂（稀释剂）B为主，且含有未被萃取完的溶质，称为萃余相，以R表示。若溶剂S和B为部分互溶，则萃取相中还含有少量的B，萃余相中亦含有少量的S。原理：利用化合物在两种互不相溶的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另一种溶剂中，加入某种可溶性的物质时，它能分别溶解于两种溶剂中。经过反复多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来。
5、多级错流和多级逆流萃取的区别？
答：区别：多级错流萃取每级均加新鲜溶剂，故溶剂消耗量大，得到的萃取液产物平均浓度较稀，但由于溶剂分别加入各级萃取器，萃取推动力大，萃取效果较好；多级逆流萃取料液走向和相反，只在最后一级中加入萃取剂，股和错流萃取相比，萃取剂消耗少，萃取液产物平均浓度高，产物收率最高。
6、什么是双水相萃取？双水相体系形成的原因是什么？
答：双水相萃取：是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。双水相体系形成的原因：（1）双水相体系的成因是聚合物之间的不相溶性，即聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，从而分为两相。一般认为，只要两种聚合物水溶液的水溶性有所差异，混合时就可发生相分离，并且水溶性差别越大，相分离的倾向越大。（2）加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也能形成两相。
7、双水相体系可分为哪几类？影响双水相萃取的因素有哪些？
答：双水相体系可分为：高聚物/高聚物双水相体系 、高聚物/无机盐双水相体系、 低分子有机物/无机盐双水相体系 、表面活性剂双水相体系。影响双水相萃取的因素：聚合物及其相对的分子量、温度、pH、离子环境
第二十章：离子交换法
1、离子交换树脂的结构由哪几部分组成？常用的离子交换树脂类型有哪些？
答：不溶性的三维空间网状骨架，固定在骨架上的不能自由移动的功能基团（活性基团）和功能基团所带的相反电荷的可交换离子（活性离子）。
常用的离子交换树脂：强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH, -OCH2COOH, C6H5OH等弱酸性基团；强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基(N(CH3)3或二甲基-ß-羟基乙基胺基；弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；
2、离子交换法的基本原理如何？
答：离子交换法：利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的离子依靠静电力吸附在吸附剂上然后利用合适的洗脱剂将吸附物从吸附剂上置换下来，进行浓缩富集，达到分离的目的。
3、离子交换树脂的选择有何要求？
答：离子交换树脂的选择：如强酸性物质应该选用弱碱性阴离子交换树脂；若产物为弱酸性物质则应选择强碱性阴离子交换树脂。同理，强碱性产物则应选用弱酸性阳离子交换树脂；弱碱性产物则选用强酸性阳离子交换树脂。大分子物质要选择交联度低些的树脂，小分子物质则选用交联度高的树脂。
第二十一章：吸附法与色层分离
1、吸附的本质是什么？
答：溶质从液相或气相转移到固相的现象。
2、 吸附的类型有哪些?作用力各是什么？
答：吸附的类型：物理吸附、化学吸附、交换吸附。作用力：物理吸附：分子间力（范德华力）。化学吸附：化学键力。交换吸附：静电引力
3、常用的吸附剂有哪些？
答：常用吸附剂：早期使用的吸附剂包括高岭土、氧化铝、酸性白土等无机吸附剂；以及离子交换树脂、活性炭、分子筛和纤维素。
4、吸附剂的主要性能参数及表征方法。
答：比表面积；颗粒度和孔结构：大孔 >100 nm；2nm
5、影响吸附过程的因素。
答：吸附剂的性质、吸附物的性质、溶液的pH、温度、其他组分。
6、大网格吸附剂的主要应用。
答：在食品工业上做糖浆脱色剂；污水处理；做色谱法的载体，野外采样保存剂；水中溶解度小的生化产品的吸附。
7、固定床和膨胀床的区别？
答：膨胀（扩散）床吸附的操作和固定床相似，也要经过平衡、进料、淋洗、洗脱等步骤。不同的是进料前必须实现稳定扩张，洗脱后为除去吸附介质上附着的少量残留杂质，还要进行清洗。
8什么是色谱分离技术？
答：色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 9、色谱分离技术的分类？
答：按两相状态气相色谱法、气固色谱法 气液色谱法 液相色谱法、 液固色谱法 液液色谱法；按固定相的几何形式柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法；按分离原理吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法。
10、离子交换层析的原理
答：离子交换层析：是以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，带电物质因电荷力作用而在固定相与流动相之间分配得以相互分离的技术。
11、凝胶色谱的分离原理及分类：
凝胶色谱的原理比较特殊，类似于分子筛。待分离组分在进入凝胶色谱后，会依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子量差异对各组分的分离。调整固定相使用的凝胶的交联度可以调整凝胶孔隙的大小；改变流动相的溶剂组成会改变固定相凝胶的溶涨状态，进而改变孔隙的大小，获得不同的分离效果。
12、反相和疏水作用层析分离法的原理
答：反相层析和疏水性作用层析都是基于物质分子的疏水基团与层析介质上的疏水基团相互作用在非极性的固定相和极性的流动相之间不断分配而得以分离的技术。
第二十二章：电泳分离法
1、电场电压高低可将电泳分为哪几种？分别有什么特点？
答：(1)常压(100～500 V)电泳 其电场强度为2～10 V／cm。分离时间较长，从数小时到
数十小时，适合于分离蛋白质等大分子物质。(2)高压(2000～10000 V)电泳 其电场强度为50～200V／cm，电泳时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。
2、以凝胶支持物分离血清时，电泳2h后，血清白蛋白在一定电场强度（10.0cm支持物上测得端电压为120V）下，泳动6cm，问其泳动度多大？
3、影响泳动度的主要因素有哪些？
答：电场强度、溶液PH值、溶液的离子强度、电渗、温度、支持物。
4、电泳中常用的支持物有哪些？
答：滤纸、醋酸纤维薄膜、淀粉、琼脂、聚丙烯酰胺凝胶。
5、醋酸纤维薄膜与滤纸相比有什么优点？
答：①分离效果好②快速省时。③灵敏度高，样品用量少。④应用面广。⑤易保存，易定量。
6、在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的DNA（ A:共价闭环DNA B:开环的双链环状DNAC：直线DNA ）其移动速度依次由慢到快是？
答：其移动速度依次由慢到快是：B开环的双链环状DNA 7、双向电泳的特点：
答：双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。
8、PAGE双向电泳中的两向电泳分别是什么电泳技术？
答：等电聚焦电泳与SDS-PAGE。
9、凝胶电泳与凝胶层析中的分子筛效应在分离中的效果是否相同？
答：这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。
第二十三章：蛋白质的分离与纯化
1、什么叫包涵体？包涵体形成有哪几种模式？包涵体表达形式在现代生物工艺中的下游处理过程有什么重要意义？
答：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内集聚形成的无活性的固体颗粒。包涵体的形成有两种模式：a是非天然单体蛋白形成的包涵体的模式；b是寡聚蛋白形成的包涵体的模式（较多）。包涵体表达形式赋予了现代生物工艺中的下游处理过程的一项新的内容，在一定程度上改变了传统分离纯化蛋白质的方法，给蛋白质的分离纯化带来了一项新的特点。
2、包涵体对分离纯化有哪些影响？
答：①可以很容易地与胞内可溶性蛋白杂质分离，蛋白质纯化较容易完成；②包涵体可以从匀浆液中以低速离心出来，以促溶剂（尿素、盐酸胍、SDS）溶解，在适当条件下（pH、离子强度与稀释）复性，产物经过一个变性复性过程，较易形成错误折叠和聚合体。③包涵体的形成虽然增加了提取的步骤，但包涵体中目的蛋白质的纯度较高，可达到20~80%，且重组蛋白以包涵体的形式表达能有效地抵御如大肠杆菌中蛋白酶对表达蛋白的降解。；④对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒害的蛋白，包涵体的形成无疑是最佳选择。
3、包涵体的分离纯化工艺包括哪些过程？
答：细菌收集→细菌破碎→包涵体分离→包涵体的洗涤→包涵体的溶解→变形蛋白的纯化→重组蛋白质的复性→天然蛋白的分离→产品的鉴定。
4、什么是重组蛋白的体外折叠？折叠过程包括哪几个步骤？重新折叠的方法有哪些？ 答：重组蛋白的体外折叠是指采用适当的条件使伸展的变性重组蛋白质重新折叠成可溶性的
具有生物活性的蛋白质。折叠过程可能包括：①分子内部疏水区域的聚集；②形成部分的二级结构作为后序折叠的骨架；③形成共价键（如二硫键）以稳定蛋白质构象。这三个步骤可穿插完成。重新折叠的方法：（1）稀释与透析方法 （2）色谱方法
第二十四章：结晶与干燥
1、什么是结晶，溶液结晶方法大致分为几类？
答：物质从液态（液体或熔融体）或气态形成晶体的过程叫结晶。溶液结晶方法大致分为三类：凝华结晶、溶液结晶（本章专指）、熔融结晶
3、根据溶解度随温度的变化特征，可将物质分为几种类型？
答：大部分物质的溶解度随温度的升高而迅速增大。如L-维生素C，L-精氨酸等。有些物质的溶解度随温度的升高以中等速度增加。如L-苏氨酸等。还有一类物质的溶解度随温度的升高只有微小增加。如L-异亮氨酸等。另外还有少量物质的溶解度随温度的升高反而下降。如Na2SO4，螺旋霉素等。
4、溶质从溶液中析出一般分为几个阶段？晶核生成机制和晶体生长机制如何？
答：溶质从溶液中析出一般可分为三个阶段：过饱和溶液的形成、晶核的生成和晶体的 成长阶段。
（1）成核的机制有3种：①初级均相成核：指溶液在较高过饱和度下自发生成晶核的过程。②初级非均相成核：指溶液在外来物的诱导下生成晶核的过程，可在较低的过饱和度下发生。③二次成核：含有晶体的溶液在晶体相互碰撞或晶体与搅拌器或器壁碰撞时所产生的微小晶体的诱导下发生的（生产较多采用）。
（2）晶体生长机制（二维生长学说）：认为晶体是由许多小立方体堆砌而成的，各小立方体可以认为是微小的粒子，也可以是原子、分子、离子或分子团。
5、什么是冷冻干燥？其原理如何？
答：冷冻干燥是指物质经低温完全冻结成固态，并在减压条件下使大量溶剂（一般是水）升华成蒸气，从而达到低温除去溶剂的过程。基本原理：是使冰冻物质中的水分或其他蒸气压较高的物质，在低温真空系统中进行升华而使样品本身干燥。
6、如何进行冷冻干燥除水？
答：三种方法：（1）低温冷凝除水（适用于实验实和大量生产）：在冷凝器中结冰，可以除去大量水分。（2）干燥剂除水（适用于100mL或以下较小量的干燥）：常用干燥剂有硫酸钙、氯化钙、Mg(ClO3)2、硅胶、五氧化二磷（最强、较贵且不能重复使用）和氢氧化钠（最弱）等。（3）抽气机直接除水：水蒸气喷射抽气机或油泵可以一同使用。需要较大的抽气泵，不太适合实验室研究之用。
7、制品的冷冻干燥过程主要包括几个阶段？如何操作？
答：（1）制品预处理：按一般经验通常要求制品的固体含量为4~10%较为适宜。为使制品有一定的固体量并保持制品的活性和溶解度可加入保护剂。（2）制品的预冷：预冷的目的是将溶液中的自由水固化，使干燥后产品与干燥前有相同的形态，防止抽真空干燥时起泡、浓缩和溶质移动等不可逆变化发生，减少因温度下降引起的物质可溶性降低和生命特性变化。
（3）升华干燥过程：升华过程是冷冻干燥的核心。干燥箱预冷（-20℃）→干燥箱及冷凝器抽真空（13Pa以下）→搁板加温，此时制品开始升华。（4）解吸干燥过程：制品升华结束时约残留有5~10%的水分，需要进一步干燥，此时干燥通常称为解吸干燥。干燥物物质的含水量是衡量干燥物质质量的重要标志。一般生物制品含水量通常要求在2%，特殊的物质如蛋白质应小于1%。（5）密封保存：冻干后的制品必须进行封口，以防水分侵入和污染。密封的样品宜在低温干燥的环境下储存。
8、什么是喷雾干燥，原理如何？喷雾干燥过程可分为哪几个阶段？
答：喷雾干燥是用雾化器将原料液分散成细小雾滴，并用热空气（或其他气体）与雾滴直接接触的方式进行干燥而获得粉状产品的一种干部燥过程。原理：喷雾干燥是利用不同的喷雾器，将悬浮液和粘滞的液体喷成雾状，形成具有较大表面积的分散微粒同热空气发生强烈的热质交换，迅速排除本身的水分，在几秒至几十秒内获得干燥。喷雾干燥过程可分为三个基本阶段：料液雾化为雾滴；雾滴与干燥介质接触、混合及流动，即干燥；干燥产品与干燥介质分离。
现代生物工艺学
第一章：生物技术概论
1、生物技术的内涵与特征是什么？
答：凡是涉及生物的应用、工艺与工程及其基础的领域均应包含在生物技术的范畴。生物技术可以涵盖生物工程、生化工程、生物系统工程、工业微生物等。定义：利用生物体或生物活动过程来获得产品，并服务于人类的技术。
2、生物技术发展经历了哪几个阶段？
答：原始生物技术、非无菌条件下的生物技术、无菌条件下的生物技术、近代生物技术。
3、生物系统包括了哪几个系统？
答：微生物系统、酶系统、动物细胞系统。
4、微生物产物大致可分为哪几大类？
答：细胞本身：如用于发酵或酿造的酵母；生物转化产物：利用细胞或酶把底物或中间 体转化成产物，如甾体的生物转化；微生物的代谢产物：包括初级代谢产物和次级代谢产物。
5、现代生物技术在哪些领域有广泛的应用？
答：生物医药、初级代谢产物、次级代谢产物、酶、生物转化、农业、聚合物。
第二章：生产菌种来源、生物活性物质的筛选和菌种保藏
1、如何分离放线菌、细菌和真菌？
答：放线菌的分离：对分离源进行干热处理：土壤在120℃或100 ℃干热处理能够极大地减少分离平板上的丝状细菌和链霉菌。选择杀菌剂进行杀菌。在放线菌分离琼脂中加入重铬酸钾或放线菌酮，以抑制真菌、细菌的繁殖，从而得到放线菌。细菌的分离：选择合适的培养基和恰当的培养条件，是的需要分离的菌能充分生长，而尽可能多的抑制其他微生物的生长。真菌分离：直接分离：把从自然界获得的样品至于显微镜下观察真菌的生长，接种针加热灭菌后挑取一些孢子到培养基上。
2、生物活性物筛选方法有哪些？
答：配基结合分析、酶法分析、基于报告基因的分析、第二信使分析、酵母双杂交系统
3、菌种保藏的方法有哪些，各有何优缺点？
答：斜面包藏法、石蜡保藏法、载体保藏法、液体保藏法、冷冻保藏法、冷冻干燥保藏法。
第三章：新技术育种原理及其进展
1、微生物菌种的改良方法可分为哪两大类，每一类又包括哪些方法？
答：微生物菌种的改良方法，大致可以分为两类：传统的诱变育种和基因工程技术育种。传统诱变育种的主要方法是突变和筛选。基因工程技术的育种方法包括结构和调控基因的克隆、导入、敲除等。
2、突变株筛选方法有哪些？各有何特点？
答：随机筛选和理化性选择。随机筛选的缺点：效率不高。理性化筛选可以大大节省劳动力,提高筛选效率。
3、遗传学新技术包括了哪些内容？
答：基于基因组的菌株重建、代谢工程、组学技术、大规模平行信号测序、定向进化、分子育种技术、全基因组改组、组合生物合成。
第五章：代谢调控
1、代谢控制的类型有几种？
答：酶活调节（活化或钝化）与酶合成调节（诱导或阻遏）。
2、酶合成调节与酶活调节异同之处是什么？
答：相同点：细胞内两种方式同时存在，密切配合，高效、准确控制代谢的正常进行。不同点：酶合成调节通过酶量的变化控制代谢速率而酶活调节控制酶活性，不涉及酶量变化。酶合成调节效果相对缓慢而酶活调节快速、精细。调节机制不同，酶合成调节是基因水平调节，调节控制酶合成，酶活调节是代谢调节，它调节酶活性。
3、简述诱导作用的机制。
答：编码一系列功能相关的酶的基因在染色体中紧密排列在一起，而且它们的表达与关闭是通过同一控制点协同进行的。
4、反馈调节有几种主要类型？简述其机制。
答：反馈抑制和反馈阻遏。反馈抑制是末端代谢产物抑制其合成途径中参与前几步反应的酶（通常是催化第一步反应酶）活性的作用；反馈阻遏是末端代谢产物阻止整个代谢途径酶的合成作用。
5、如何改变培养环境条件来限制末端代谢产物在细胞内部的积累？
答：控制培养基成分、加入生物合成途径的抑制剂、限制补给营养缺陷型突变株所需的生长因子、采用末端代谢产物的衍生物。
第六章：培养基
1、培养基的碳源、氮源主要包括哪些物质
答：碳源物质主要有糖类、脂类、有机酸和低碳醇等。氮源：凡是能被用来构成菌体物质中或代谢产物中氮素来源的营养物质。
2、培养基的营养要素有哪些？
答：碳源，氮源，机盐及微量元素，前体、生长因子、促进剂和抑制剂。
3、什么是培养基？有什么作用？常用培养基类型有哪些？配制培养基时应主要考虑哪些因素？
答：培养基是人工配置的提供微生物或其他细胞生长、繁殖代谢和合成产物所需要的营养物质和原料。培养基为微生物提供其生长及产物合成所需的营养物质和环境条件。培养基按其组成或物质的纯度、状态、用途可有不同的分类，按其组成物质的纯度可分为合成培养基和天然培养基（复合培养基）；按其组成物质的状态可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基；按其组成物质的用途可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。培养基成分的影响：在选择培养基的成分时，特别是有机氮源、碳源，要注意原料的来源、加工方法和有效成分的含量。灭菌的影响：在高温灭菌时培养基各成分之间会发生化学反应，培养基的某些成分被破坏，甚至产生有毒物质，使培养基颜色变深。
4、葡萄糖是较易被利用的碳源，培养基中葡萄糖过多时会产生哪些危害？
答：过多的葡萄糖会过分加速菌的呼吸，以致培养基中的溶氧不能满足需要，使一些中间代谢产物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，导致pH的下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。
5、利用淀粉作为主要碳源，有什么好处？
答：可克服葡萄糖代谢过快的弊病，同时淀粉来源丰富，价格也比较低廉。
6、利用脂类作为碳源，对生产工艺的控制有什么特殊要求？
答：当微生物利用脂肪作碳源时，要供给比糖代谢更多的氧。
7、什么是生理酸性物质和生理碱性物质？
答：生理酸性物质：经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源。生理碱性物质：经微生物生理作用（代谢）后能形成碱性物质的无机氮源。
第八章：培养技术与过程建模
1、Monod方程与米氏方程有何不同？
答：Monod方程与酶催化反应的米氏方程形式一样，但Monod方程完全是经验的，而米氏方程则是推导出来的。
2、影响停滞期长短的决定因素有哪些？
答：养分的变化、培养条件的改变、抑制剂的存在、种子生理期阶段。
3、微生物生长可分为几个阶段？次级代谢产物通常在什么阶段开始合成？
答：停滞期、加速期、对数期、减速期、静止期和死亡期。在静止期（稳定期）菌体次级代谢十分活跃，许多次级代谢产物在此期大量合成，菌的形态也发生较大的变化。
4、发酵操作方式可分为几种，试述各种培养方式的优缺点。为什么连续培养不能无限期地连续下去，请简述之？
答：分批培养、补料-分批培养、半连续培养、连续培养。分批培养优点：操作简单，周期短，染菌的机会减少，且生产过程、产品质量容易掌握；缺点：因其周期短，一般在1到3天，产率较低。补料-分批培养优点：它能在一种系统中维持很低的基质浓度，从而避免快速利用碳源的阻遏效应和能够按设备是通气能力去维持适当的发酵条件，并且能减缓代谢有害物的不利影响。缺点：一些微生物能利用甲醇、乙醇、乙酸、某些芳香族化合物等，但它们在较高浓度下会对菌体的生产产生抑制。半连续培养优点：补充了养分和前体而且稀释了代谢有害物，从而有利于产物的继续合成；缺点：（1）放掉发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生产旺盛期的菌体。（2）定期补充和带放会使发酵液稀释，送去提炼的发酵液体体积更大。（3）发酵液被稀释后可能产生更多的代谢有害物，最终限制发酵产物的合成。（4）一些经代谢产生的前体可能丢失。（5）有利于非产生菌突变株的生长。连续培养优点：（1）省去了反复放料、清洗、装料、灭菌等步骤，避免了延迟期，提高设备的利用率和单位时间产量，只保持一个期的稳定状态。（2）发酵中各参数趋于恒值，便于自动控制；（3）易于分期控制，可以在不同罐中控制不同的条件。缺点：（1）连续发酵对设备的密封性、培养液和空气的无菌度要求严格，目前使用的空气过滤器不能完全保证（长时间）100%的除菌效率；
（2）加入连续发酵罐的培养基与罐内发酵液的混合不均匀，即均匀度不够，就会使罐内各部分的微生物生长不一致，某部分微生物得不到充分的营养而引起操作不确定并降低产率。对于高黏度发酵液均匀度不够的情况更为严重。
5、分批培养中，各时期的细胞生长动力学特征是什么？
答：(1)、停滞(延迟)期：是微生物细胞适应新环境的过程。(2)、对数生长期：细胞浓度随培养时间呈指数增长，细胞浓度的变化率与细胞浓度成正比。在对数生长阶段，细胞的生长不受限制，因此比生长速率达到最大值μm。(3)、减速期：细胞的比生长速率和限制性基质的浓度S有如下关系：μ=μmS/(Km+S) (4)、静止期（稳定期）：细胞浓度达到最大，细胞增加速度与死亡速率相等 。(5)、衰亡期细胞死亡速率大于比生长速率。α> µ，dX/dt
6、补料分批培养与连续发酵过程的主要动力学特征各是什么？准稳态与稳态的区别主要在哪里？
答：补料分批培养：ds/dt=0,dx/dt=0, μ=D只进不出，直到培养液到定额为止；与连续培养不同，在该法培养中，μ、D随着培养时间的延长，由于体积的增加，μ和D以相同速度下降，而连续培养中，μ和D为定值。连续发酵：连续培养的最大特点是微生物细胞的生长速度、产物的代谢均处于恒定状态，可达到稳定、高速增微生物细胞或产生大量代谢产物的目的。μ=D.dx/dt=0,ds/dt=0,dp/dt=0补料分批培养：在基础培养基营养消耗完时，开始补料，随着营养的添加，一方面菌体增殖而增加菌体浓度；另一方面，发酵液体积增加又使菌体浓度被稀释；两方面的趋势最终接近平衡，这种状态称为“准恒定状态”。连续发酵：指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系
统内培养液的液量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态（基质浓度、产物浓度、pH、菌体浓度、比生长速率）下生长的微生物培养方式。
7．什么是菌体的比生长速率、产物的比形成速率以及比基质的消耗速率？什么是倍增时间、得率系数 ？
比速率：单位时间内单位菌体消耗基质或形成产物（菌体）的量。细胞生长的比速率为μ：μ=(1/x)(dx/dt)。产物的比形成速率：单位质量细胞在单位时间生成产物的量。基质的消耗速率：生成的细胞量与底物消耗量之比，为对底物消耗得率。得率：是指被消耗的物质和所合成产物之间的量的关系。得率系数Y： 两种物质得失之间的计量比。倍增时间(td) ：微生物细胞浓度增加一倍所需要的时间，也叫增代时间.
8为什么说微生物分批培养是一种非稳态的过程？
答：分批培养中，由于底物的不断消耗和产物的积累，反应器内细胞所处的环境也随之不断变化，反应过程处于非稳定状态操作，并且某些反应产物可能存在对反应抑制作用，细胞不能始终在最优条件进行，致使随着反应过程的进行，分批反应效率逐渐降低。
第十一章：蛋白质组学及其在微生物学研究中的应用
1、典型的蛋白质组学研究常分为哪几个步骤？
答：（1）从生物学物质（如细胞、组织、体液等）提取蛋白质混合液；（2）分离蛋白质混合液；（3）将有意义的蛋白质消化成肽进行质谱分析；（4）将质谱获得的数据利用各种生物信息学工具进行分析。
2、在蛋白质分离中，凝胶技术和非凝胶技术各指的是哪些技术？各有什么特点？
答：凝胶技术指二维（双向）凝胶电泳技术。特点：克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。稳定的可以随意精确设定的pH梯度。尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。非凝胶技术：高效液相色谱法、毛细管电泳、液相等点聚焦和毛细管色谱。特点：自动化程度高、分辨率高，检测限低。
3、什么是生物质谱、软电离？如何应用生物质谱鉴定蛋白质？
答：生物质谱在fmol(10-15)乃至attomole(10-18)水平检测相对分子质量高达几十万的生物大分子的有机质谱技术。软电离指的主要是电子或激光等的外界能量不直接作用于样品分子，使得生物大分子结构破环较少，并可电离成为携带一个或多个电荷的质量较大的分子、离子。应用生物质谱鉴定蛋白质：肽质量指纹谱、串联质谱的肽序列标签、肽段的从头测序。
4、目前常用的蛋白质定量方法有哪几种？它们的基本原理是怎样的？
答：基于荧光染色技术的电泳定量法、基于稳定同位素技术的质谱定量法。基于荧光染色技术的电泳定量法：p207同位素标记法基本原理：将待比较的一对肽段样品中的一个进行同位素标记，另一个不标记，标记和未标记的同一肽段，其色谱行为一致的，进而可以利用它们的质量差异确定在质谱仪中的信号对，通过比较信号对之间相对强弱就可以准确地计算标记和未标记肽段的相对丰度。
第十二章：动物细胞培养
1、冻存保护剂分哪几类？各有什么特点？
答：可分为渗透型和非渗透型两类。渗透型冻存保护剂的特点：易与水分子结合，易穿透细胞膜进入细胞内部，从而降低细胞冰点，提高细胞质膜对水的通透性；冻存时，保护剂可促进细胞内水分渗出细胞外，从而减少胞内冰晶的形成；复苏时，促进细胞外水分进入细胞，缓解渗透性肿胀引起的损伤。甘油、二甲亚砜是最常见的渗透性保护剂。非渗透型冻存剂的特点：一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内部，但能溶于水，可稀释细胞外电解质的浓度，从而减少溶质损伤；这些大分子物质可结合水分子，降低细胞外自由水的含量，减少胞
外冰晶的形成。主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖等。
2、细胞低温保存存活率与冷却速率有何关系？
答：对于某一种细胞和某一确定的保存方案，对应最大的细胞存活率，确实存在着某种最佳冷却速率；而过快或过慢的冷却速率都会导致细胞受到损失，降低其存活率。
3、动物细胞培养基分为几类？各有何优缺点？
答：（1）天然培养基：优点：营养价值高。缺点：成分复杂，来源有限。（2）合成培养基：优点：合成培养基成分已知，便于对实验条件的控制。缺点：有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分替代，因此，细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成分，以克服合成培养基的不足。（3）无血清培养基：优点：产品易于纯化，回收率高。缺点：黏度小，细胞易受搅拌等机械因素的影响。
4、动物细胞培养生物反应器主要有哪些？各有何特点？
答：（1）、机械搅拌式生物反应器:是最传统的微生物发酵装置,也可以用于动物细胞悬浮培养。（2）、气升式生物反应器：利用通入反应器的无菌空气的上升气流带动培养液进行循环，使供氧和混合两种作用融为一体的一类生物反应器。（3）、填充床生物反应器：填充床生物反应器是在反应器中填充一定材质的填充物，供细胞生长。营养液通过循环灌注的方式提供，并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可在反应器外通过循环的营养液携带，因而不会有气泡伤及细胞。（4）、中心灌流式反应器：反应器中央为一多孔状管道，称为中央分配管。分配管的外周包围着多层与其平行排列的中空纤维。（5）、波浪袋生物反应器：波浪袋生物反应器不同于其它生物反应器，其培养规模最大可达到100L，并可随意替换无菌培养袋。波浪袋生物反应器不是通过透气膜进行氧的传输，氧的传输以及氧与培养基的混合通过一个特殊的摇动装置产生波浪来实现。这种波浪活动并不产生气泡，通过波浪产生的表面与反应器顶部空气的接触进行氧的交换，同样将悬浮的细胞、微粒以及培养液进行混匀。
（6）、旋转式培养系统：优点：结构简单，投资少，技术熟练，重复性好，放大只需要简单地增加转瓶（管）数量。缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受限制。
5、昆虫细胞培养和哺乳动物细胞培养的主要区别在哪？昆虫细胞用培养基有什么独特性？ 答：昆虫细胞培养和哺乳动物培养在主要原理和方法上是相似的，主要的区别就在于所使用的培养基。昆虫细胞用培养基偏酸性。在pH6.2~6.9内，培养基用磷酸钠作缓冲体系，无需CO2。渗透压高。一般培养昆虫细胞的培养基的渗透压为340~390mOsmol/kg,而哺乳动物细胞用的培养基的渗透压为290~330mOsmol/kg。尽管培养基内的无机盐成分类似，不同的昆虫细胞所用的基础培养基内Na+/K+不同。
第十三章：植物细胞培养
1、植物细胞培养基由几大类组成？各有何作用？
答：（1）无机成分：N、P、K、Ca、S等浓度大于0.5mmol／L大量元素及Fe，B，Mn，Cu等
浓度小于0.5mmol／L微量元素。（2）有机成分：①含N物质：包括维生素和氨基酸等②碳源：2%—5%的葡萄糖或蔗糖③植物激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素等④天然复合物：水解蛋白类、酿酒副产品、胚乳液、果汁。（3）抗生素：一般情况下避免添加。
（4）凝胶成分：琼脂、琼脂糖、藻酸盐等，起支持作用。
2、以MS培养基为例，如何配制植物细胞培养基？应注意什么问题？
答：溶化琼脂（600-700ml）+蔗糖
溶解液→调pH（5.8）→定容（1L）→分装→包扎及灭菌 母液的量取→混合
3、提高次生代谢产物的途径有哪些？举例说明。
答：（1）筛选得到高产细胞系（株）。（2）培养条件（培养基成分 光 温度 ph 通气量和搅拌转速 前体饲喂 诱导子的应用）（3）毛状根培养技术。（4）冠瘿培养技术。
例子：利用发根农杆菌去感染植物，使双子叶植物从感染部位长出许多细长的毛状根这些毛状根在无激素培养基中培养可以迅速繁殖。利用根癌农杆菌感染植物可将其Ti质粒上的T-DNA 在转化过程中被转移到植物基因组中，若将能促进次生代谢产物合成的外源基因插入到T-DNA中，次生代谢产物也将随冠瘿瘤的增长而增长。
4、提高次生代谢产物的技术有哪些？举例说明。
答：（1）两步法培养技术。（2）两相培养技术。（3）固定化培养技术。
例子：在新疆紫草细胞培养中，紫草宁及其衍生物的大量合成发生在对树生长期的末期，通过二步培养方法，在产物合成阶段更换培养基，可使色素的产量达1.9/L以上。
5、什么是植物次生代谢产物？一般分为几大类？
答：次级代谢产物：是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，并非细胞生长所必需的。如生物碱、黄酮、挥发油、皂甙等。植物次生代谢物一般分为酚性化合物、萜类化合物、含氮有机物三大类。
6、植物细胞生物反应器的选型应考虑哪些方面？
7、配制培养基时，为什么要先配制母液？
答：方便配置其他培养基；保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取
8、为什么要严格保持细胞培养操作环境的无菌？
第十四章：下游加工过程概论
1、下游加工技术的定义。
答：发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程称为下游加工过程。
2、下游加工过程有什么特点和重要性？
答：特点：发酵产品在培养液中的浓度一般较低，溶液中欲提取物质的浓度越低，提取时所耗费的能量就越大，费用也就越高。（2）产品易失活，对热、酸、碱及有机试剂不稳定；（3）对最终产品的质量往往要求极高。（4）发酵液是复杂的多相体系，且粘度大，是非牛顿性流体；（5）发酵液中往往含有性质相近的杂质，分离难度大。重要性：在发酵产品的生产中，分离和精制过程所需的费用占成本的很大部分。对传统发酵工业(如抗生素、乙醇、柠檬酸)，分离和精制部分占总投资费用的60％，对重组DNA生产蛋白质、精制的费用可占整个生产费用的80％一90％。没有经济的下游技术，则不可能实现工业化生产。下游加工的成本是制约生产者提高经济效益的重要因素。下游加工工程研究的目的就是提高产品回收率，降低分离纯化成本。
3、生物物质分离纯化一般分哪几个阶段？各阶段主要采用的方法有哪些，目的是什么？ 答：分离纯化的一般流程：
（1）发酵液的预处理 方法：离心和过滤 目的：除去不溶性物
（2）产品的提取和浓缩 方法：萃取、吸附、沉淀、蒸发 目的：破碎细胞
（3）产品的精制（提纯）方法：层析、膜分离、离子交换、沉淀、电泳 目的：去除杂质
（4）产品的最后加工 方法：结晶、干燥、蒸馏 目的：产品的最终使用要求
4、分离纯化技术路线的选择原则有哪些？
答：（1）、尽可能简单、低耗、高效、快速。（2）、分离步骤尽可能少，每步收率尽可能高。
（3）、避免相同原理的分离技术多次重复出现。（4）、尽量减少新化合物进入待分离的溶液。
（5）、合理的分离步骤次序。原则是：先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。
第十五章：发酵液的预处理和固液分离
1.为什么要进行发酵液预处理？
答：改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；尽可能使产物转入便于以后处理的相中；能够除去部分杂质。
2.絮凝和凝聚的定义和区别。常用的絮凝剂有哪些？
答：凝聚：在中性盐作用下，由于双电层排斥电位（即ξ电位）的降低，破坏胶体体系的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程称凝聚。絮凝：是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使细胞聚集形成粗大的絮凝团的过程。常用絮凝剂：人工高分子聚合物：聚丙烯酰胺、聚苯乙烯，聚乙稀亚胺的衍生物、聚合铝盐、聚合铁盐。天然有机高分子絮凝剂：壳聚糖、葡聚糖、明胶、骨胶、糖蛋白，粘多糖，纤维素，核酸。
3、改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？其简要机理如何？
答：加热法、凝聚与絮凝法以及添加助滤剂法。加热法：就是把料液加热。凝聚与絮凝法：是在原料中添加电解质，以促使溶液中固体物发生凝聚和絮凝。添加助滤剂法：使发酵液内的胶体物质被吸附于助滤剂颗粒上。离心过滤机有转篮式离心过滤机、卧式刮刀离心机、活塞往复式卸料离心机、螺旋卸料离心机。
4.分离和过滤的主要设备有哪些?
答：过滤设备有传统的板框过滤机和旋转式真空过滤设备。分离设备有管式离心机、有排放喷嘴的蝶式离心机、间断排渣的蝶式离心机。
第十六章：细胞破碎与非选择性蛋白分离
1、细胞破碎的目的是什么？
答：细胞破碎的目的是使细胞内含物释放出来，转入液相中，以便于进行产物的分离纯化。
2、举出几种细胞破碎常用的方法？
答：高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎、酶溶法、化学渗透法。
3、比较非机械法与机械法的优缺点。
答：非机械法的优点：（1）对产物释出具有一定的选择性。（2）细胞外形保持完整。（3）核酸释出量少，浆液粘度小，便于进一步分离。缺点：（1）时间长，效率低。（2）化学试剂的毒性。（3）通用性差。机械法的优点：破碎细胞效率高。缺点：（1）能耗很高，能量利用率很低，并且产生高温和高的剪切力，易使不稳定产品变性失活。（2）非专一地释放产物，导致液相中成分复杂，给后续的分离提纯带来困难。（3）产生的细胞碎片微粒尺寸分布范围宽，大量细颗粒增加了固液分离的难度。
4、细胞破碎效果以什么来定量表征，如何定义，如何操作。
答：细胞破碎率。细胞破碎率：破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，S=[(N0-N)/N0] ×100操作：（1）直接计数法：平板计数、显微镜计数、观察计数（必要时配合染色技术）
（2）间接计数法：测定释放的蛋白或酶活力、测定导电率
第十七章：沉淀法
1、简述蛋白质表面的特性。
答：蛋白质是两性高分子电解质，主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。
2、蛋白质沉淀的主要方法有哪些？
答： 盐析、有机溶剂、重金属盐、有机酸类、超速离心
3、Cohn方程的形式及其中各参数的物理意义。
答：lgS=β－Ks I（S:蛋白质的溶解度,g/L；I:离子强；Ks：盐析常数，斜率，与温度和
pH无关，与盐和蛋白质的种类有关；β : 常数,截距,与盐的种类无关,与温度和pH蛋白质种类有关）
4、盐析的原理如何，影响因素有哪些.
答：原理：（1）高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱。（2）中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域是相互作用，使其沉淀。影响因素：溶质的种类、溶质的浓度、PH、温度。
5、盐析沉淀与等电法沉淀有什么不同。
答：盐析沉淀加入无机盐，等电点沉淀则是加入酸碱调节pH。
6、什么是有机溶剂沉淀法，它的机理如何，有什么特点，影响因素有哪些。
答：有机溶剂沉淀法：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。机理：（1）亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加。（2）水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了溶质分子表面原有水化层的厚度，导致溶质分子脱水凝聚。优点在于其分辨率高于盐析，加入的有机溶剂易除去，且有机溶剂密度低，利于沉淀物分离。其缺点主要是比盐析更易使蛋白变性，需低温操作。有机溶剂成本较高，而且易燃易爆。影响因素：温度、pH值、离子强度、样品浓度、金属离子的助沉作用。
第十八章：膜分离过程
1、何谓膜分离？主要有那几种膜分离方法？
答：膜分离：以选择性透膜为分离介质，通过在膜两边施加一个推动力（如浓度差、压力差或电位差等）时，使原料侧组分选择性地透过膜，以达到分离提纯的目的。膜分离方法：微滤、超滤、反渗透、透析、电透析、纳米过滤、亲和过滤、渗透汽化
2 各种膜分离技术的原理
答：（1）微滤和超滤都是利用膜的筛分性质，以压力差为传质推动力，主要用于 截留固体微粒和高分子溶质。
（2）反渗透是在透析膜浓度高的一侧施加大于渗透压的压力，利用膜的筛分性质，使。浓度较高的溶液进一步浓缩。
（3）纳滤是介于反渗透和超滤之间的一种压力驱动型膜分离技术。
（4）透析是最早发现、研究和应用的一种膜分离过程，它是利用多孔膜两侧溶液的浓度差使溶质从浓度高的一侧通过膜孔扩散到浓度低的一侧从而得到分离的过程。
（5）电渗析是利用分子的荷电性质和分子大小的差别进行分离的膜分离法，可用于小分子电解质的分离和溶液的脱盐。
（6）渗透汽化也称渗透蒸发，它是利用膜对液体混合物中组分的溶解和扩散性能的不同来实现其分离的新型膜分离过程 。
3 膜分离常用的材料有哪些？醋酸纤维膜的特点？
答：（1）膜分离常用的材料有：天然高分子材料 ，如醋酸纤维、硝酸纤维和再生纤维；合成高分子材料，如聚砜；无机材料；复合材料。（2）醋酸纤维膜的特点：优点：醋酸纤维的阻盐能力最强，常用于反渗透膜，也可作超滤膜和微滤膜；再生纤维素可用于制造透析膜和微滤膜。缺点：醋酸纤维膜最高使用温度和pH范围有限，在45-50 C，pH3-8。 4 表征膜的性能特征参数有哪些？
答：（1）孔径、孔径分布和孔隙率。（2）膜的截留能力。 5 什么是浓差极化模型？
答：浓差极化是指，当水透过膜并截留盐时，在膜表面会形成一个流速非常低的边界层， 边界层中的盐浓度比进水本体溶液盐浓度高，这种盐浓度在膜面增加的现象叫
做浓差极化。电极上有电流通过时，电极表面附近的反应物或产物浓度变化引起的极化。称为浓差极化
6 常见的膜组件有哪些？
答：膜组件的种类： 管式膜组件、 中空纤维式、平板膜组件、卷式膜组件
7膜分离技术的主要应用在哪些方面？
答：（1) 细胞培养基的除菌；（2)发酵液或培养液中细胞的收集和除去；（3)细胞破碎后碎片的除去；（4)目标产物部分纯化后的浓缩或滤除小分子溶质；（5)最终产品的浓缩和洗滤除盐；
（6)蛋白质的回收、浓缩和纯化；（7)制备用于调制生物产品和清洗产品容器的无热源水；
（8)膜生物反应器。
8、请比较说明微滤、超滤、纳滤和反渗透等四种常用膜分离技术的异同点。
答：同：都采用错流过滤方式。
微滤对于微滤而言，膜的截留特性是以膜的孔径来表征，通常孔径范围在0.1～1微米，故微滤膜能对大直径的菌体、悬浮固体等进行分离。可作为一般料液的澄清、保安过滤、空气除菌。
超滤对于超滤而言，膜的截留特性是以对标准有机物的截留分子量来表征，通常截留分子量范围在1000～300000，故超滤膜能对大分子有机物（如蛋白质、细菌）、胶体、悬浮固体等进行分离，广泛应用于料液的澄清、大分子有机物的分离纯化、除热源。
纳滤对于纳滤而言，膜的截留特性是以对标准NaCl、MgSO4、CaCl2溶液的截留率来表征，通常截留率范围在60～90%，相应截留分子量范围在100～1000，故纳滤膜能对小分子有机物等与水、无机盐进行分离，实现脱盐与浓缩的同时进行。
反渗透是利用反渗透膜只能透过溶剂（通常是水）而截留离子物质或小分子物质的选择透过性，以膜两侧静压为推动力，而实现的对液体混合物分离的膜过程。反渗透的截留对象是所有的离子，仅让水透过膜，对NaCl的截留率在98%以上，出水为无离子水。反渗透法能够去除可溶性的金属盐、有机物、细菌、胶体粒子、发热物质，也即能截留所有的离子，在生产纯净水、软化水、无离子水、产品浓缩、废水处理方面反渗透膜已经应用广泛。
第十九章：溶剂萃取,两水相萃取法
1、萃取分离的依据是什么？
答：依据：利用溶质组分在两个互不混溶的液相中竞争性溶解和分配性质上的差异进行分离。
2、物质溶解的规律是什么？
答：（1）碱类物质中可溶的是氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钡和氨水。
（2）所有硝酸盐都是可溶于水的。
（3）氯化物中不溶的有氯化银和氯化亚汞，其它是氯化物都是或溶的。
（4）硫酸盐有不溶于水的有硫酸钡和硫酸铅。
（5）磷酸盐、碳酸盐、硅酸盐、亚硫酸盐中。只有钾、钠、铵的磷酸盐、碳酸盐、硅酸盐、亚硫酸盐三种类型的盐可溶于水，其它盐是不溶于水的
（6）银盐只有硝酸银可溶。其余的银的氢硫酸盐、或碱都是不溶的。
（7）微溶的有硫酸银、硫酸亚汞、氢氧化钙和氯化铅；亚硫酸镁、硫酸钙、硅酸以及碳酸镁。
3、溶质的分配定律的生物意义和作用？
答：分配定律——是指在一定温度、压力下，溶质分布在两个互不相溶的溶剂里，达到平衡后，它在两相的浓度之比为一常数K，这个常数称为分配系数，即： K = C1/C2 = 萃取液浓度/萃余液浓度。作用：分配定律对利用吸收方法来分离气体混合物的工艺有指导作用，也可用来定量计算萃取分离时被提取物的质量或吸收一定量的物质所需的液体量。
4、萃取操作的基本内容和原理？
答：基本内容：将一定量萃取剂加入原料液中，然后加以搅拌使原料液与萃取剂充分混合，溶质通过相界面由原料液向萃取剂中扩散。搅拌停止后，两液相因密度不同而分层：一层以溶剂S为主，并溶有较多的溶质，称为萃取相，以E表示；另一层以原溶剂（稀释剂）B为主，且含有未被萃取完的溶质，称为萃余相，以R表示。若溶剂S和B为部分互溶，则萃取相中还含有少量的B，萃余相中亦含有少量的S。原理：利用化合物在两种互不相溶的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另一种溶剂中，加入某种可溶性的物质时，它能分别溶解于两种溶剂中。经过反复多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来。
5、多级错流和多级逆流萃取的区别？
答：区别：多级错流萃取每级均加新鲜溶剂，故溶剂消耗量大，得到的萃取液产物平均浓度较稀，但由于溶剂分别加入各级萃取器，萃取推动力大，萃取效果较好；多级逆流萃取料液走向和相反，只在最后一级中加入萃取剂，股和错流萃取相比，萃取剂消耗少，萃取液产物平均浓度高，产物收率最高。
6、什么是双水相萃取？双水相体系形成的原因是什么？
答：双水相萃取：是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。双水相体系形成的原因：（1）双水相体系的成因是聚合物之间的不相溶性，即聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，从而分为两相。一般认为，只要两种聚合物水溶液的水溶性有所差异，混合时就可发生相分离，并且水溶性差别越大，相分离的倾向越大。（2）加入盐分，由于盐析作用，聚合物与盐类溶液也能形成两相。
7、双水相体系可分为哪几类？影响双水相萃取的因素有哪些？
答：双水相体系可分为：高聚物/高聚物双水相体系 、高聚物/无机盐双水相体系、 低分子有机物/无机盐双水相体系 、表面活性剂双水相体系。影响双水相萃取的因素：聚合物及其相对的分子量、温度、pH、离子环境
第二十章：离子交换法
1、离子交换树脂的结构由哪几部分组成？常用的离子交换树脂类型有哪些？
答：不溶性的三维空间网状骨架，固定在骨架上的不能自由移动的功能基团（活性基团）和功能基团所带的相反电荷的可交换离子（活性离子）。
常用的离子交换树脂：强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH, -OCH2COOH, C6H5OH等弱酸性基团；强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基(N(CH3)3或二甲基-ß-羟基乙基胺基；弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；
2、离子交换法的基本原理如何？
答：离子交换法：利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的离子依靠静电力吸附在吸附剂上然后利用合适的洗脱剂将吸附物从吸附剂上置换下来，进行浓缩富集，达到分离的目的。
3、离子交换树脂的选择有何要求？
答：离子交换树脂的选择：如强酸性物质应该选用弱碱性阴离子交换树脂；若产物为弱酸性物质则应选择强碱性阴离子交换树脂。同理，强碱性产物则应选用弱酸性阳离子交换树脂；弱碱性产物则选用强酸性阳离子交换树脂。大分子物质要选择交联度低些的树脂，小分子物质则选用交联度高的树脂。
第二十一章：吸附法与色层分离
1、吸附的本质是什么？
答：溶质从液相或气相转移到固相的现象。
2、 吸附的类型有哪些?作用力各是什么？
答：吸附的类型：物理吸附、化学吸附、交换吸附。作用力：物理吸附：分子间力（范德华力）。化学吸附：化学键力。交换吸附：静电引力
3、常用的吸附剂有哪些？
答：常用吸附剂：早期使用的吸附剂包括高岭土、氧化铝、酸性白土等无机吸附剂；以及离子交换树脂、活性炭、分子筛和纤维素。
4、吸附剂的主要性能参数及表征方法。
答：比表面积；颗粒度和孔结构：大孔 >100 nm；2nm
5、影响吸附过程的因素。
答：吸附剂的性质、吸附物的性质、溶液的pH、温度、其他组分。
6、大网格吸附剂的主要应用。
答：在食品工业上做糖浆脱色剂；污水处理；做色谱法的载体，野外采样保存剂；水中溶解度小的生化产品的吸附。
7、固定床和膨胀床的区别？
答：膨胀（扩散）床吸附的操作和固定床相似，也要经过平衡、进料、淋洗、洗脱等步骤。不同的是进料前必须实现稳定扩张，洗脱后为除去吸附介质上附着的少量残留杂质，还要进行清洗。
8什么是色谱分离技术？
答：色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 9、色谱分离技术的分类？
答：按两相状态气相色谱法、气固色谱法 气液色谱法 液相色谱法、 液固色谱法 液液色谱法；按固定相的几何形式柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法；按分离原理吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法。
10、离子交换层析的原理
答：离子交换层析：是以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，带电物质因电荷力作用而在固定相与流动相之间分配得以相互分离的技术。
11、凝胶色谱的分离原理及分类：
凝胶色谱的原理比较特殊，类似于分子筛。待分离组分在进入凝胶色谱后，会依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子量差异对各组分的分离。调整固定相使用的凝胶的交联度可以调整凝胶孔隙的大小；改变流动相的溶剂组成会改变固定相凝胶的溶涨状态，进而改变孔隙的大小，获得不同的分离效果。
12、反相和疏水作用层析分离法的原理
答：反相层析和疏水性作用层析都是基于物质分子的疏水基团与层析介质上的疏水基团相互作用在非极性的固定相和极性的流动相之间不断分配而得以分离的技术。
第二十二章：电泳分离法
1、电场电压高低可将电泳分为哪几种？分别有什么特点？
答：(1)常压(100～500 V)电泳 其电场强度为2～10 V／cm。分离时间较长，从数小时到
数十小时，适合于分离蛋白质等大分子物质。(2)高压(2000～10000 V)电泳 其电场强度为50～200V／cm，电泳时间很短，有时只需几分钟。多用于分离氨基酸、多肽、核苷酸、糖类等小分子物质。
2、以凝胶支持物分离血清时，电泳2h后，血清白蛋白在一定电场强度（10.0cm支持物上测得端电压为120V）下，泳动6cm，问其泳动度多大？
3、影响泳动度的主要因素有哪些？
答：电场强度、溶液PH值、溶液的离子强度、电渗、温度、支持物。
4、电泳中常用的支持物有哪些？
答：滤纸、醋酸纤维薄膜、淀粉、琼脂、聚丙烯酰胺凝胶。
5、醋酸纤维薄膜与滤纸相比有什么优点？
答：①分离效果好②快速省时。③灵敏度高，样品用量少。④应用面广。⑤易保存，易定量。
6、在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的DNA（ A:共价闭环DNA B:开环的双链环状DNAC：直线DNA ）其移动速度依次由慢到快是？
答：其移动速度依次由慢到快是：B开环的双链环状DNA 7、双向电泳的特点：
答：双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。
8、PAGE双向电泳中的两向电泳分别是什么电泳技术？
答：等电聚焦电泳与SDS-PAGE。
9、凝胶电泳与凝胶层析中的分子筛效应在分离中的效果是否相同？
答：这种分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。
第二十三章：蛋白质的分离与纯化
1、什么叫包涵体？包涵体形成有哪几种模式？包涵体表达形式在现代生物工艺中的下游处理过程有什么重要意义？
答：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内集聚形成的无活性的固体颗粒。包涵体的形成有两种模式：a是非天然单体蛋白形成的包涵体的模式；b是寡聚蛋白形成的包涵体的模式（较多）。包涵体表达形式赋予了现代生物工艺中的下游处理过程的一项新的内容，在一定程度上改变了传统分离纯化蛋白质的方法，给蛋白质的分离纯化带来了一项新的特点。
2、包涵体对分离纯化有哪些影响？
答：①可以很容易地与胞内可溶性蛋白杂质分离，蛋白质纯化较容易完成；②包涵体可以从匀浆液中以低速离心出来，以促溶剂（尿素、盐酸胍、SDS）溶解，在适当条件下（pH、离子强度与稀释）复性，产物经过一个变性复性过程，较易形成错误折叠和聚合体。③包涵体的形成虽然增加了提取的步骤，但包涵体中目的蛋白质的纯度较高，可达到20~80%，且重组蛋白以包涵体的形式表达能有效地抵御如大肠杆菌中蛋白酶对表达蛋白的降解。；④对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒害的蛋白，包涵体的形成无疑是最佳选择。
3、包涵体的分离纯化工艺包括哪些过程？
答：细菌收集→细菌破碎→包涵体分离→包涵体的洗涤→包涵体的溶解→变形蛋白的纯化→重组蛋白质的复性→天然蛋白的分离→产品的鉴定。
4、什么是重组蛋白的体外折叠？折叠过程包括哪几个步骤？重新折叠的方法有哪些？ 答：重组蛋白的体外折叠是指采用适当的条件使伸展的变性重组蛋白质重新折叠成可溶性的
具有生物活性的蛋白质。折叠过程可能包括：①分子内部疏水区域的聚集；②形成部分的二级结构作为后序折叠的骨架；③形成共价键（如二硫键）以稳定蛋白质构象。这三个步骤可穿插完成。重新折叠的方法：（1）稀释与透析方法 （2）色谱方法
第二十四章：结晶与干燥
1、什么是结晶，溶液结晶方法大致分为几类？
答：物质从液态（液体或熔融体）或气态形成晶体的过程叫结晶。溶液结晶方法大致分为三类：凝华结晶、溶液结晶（本章专指）、熔融结晶
3、根据溶解度随温度的变化特征，可将物质分为几种类型？
答：大部分物质的溶解度随温度的升高而迅速增大。如L-维生素C，L-精氨酸等。有些物质的溶解度随温度的升高以中等速度增加。如L-苏氨酸等。还有一类物质的溶解度随温度的升高只有微小增加。如L-异亮氨酸等。另外还有少量物质的溶解度随温度的升高反而下降。如Na2SO4，螺旋霉素等。
4、溶质从溶液中析出一般分为几个阶段？晶核生成机制和晶体生长机制如何？
答：溶质从溶液中析出一般可分为三个阶段：过饱和溶液的形成、晶核的生成和晶体的 成长阶段。
（1）成核的机制有3种：①初级均相成核：指溶液在较高过饱和度下自发生成晶核的过程。②初级非均相成核：指溶液在外来物的诱导下生成晶核的过程，可在较低的过饱和度下发生。③二次成核：含有晶体的溶液在晶体相互碰撞或晶体与搅拌器或器壁碰撞时所产生的微小晶体的诱导下发生的（生产较多采用）。
（2）晶体生长机制（二维生长学说）：认为晶体是由许多小立方体堆砌而成的，各小立方体可以认为是微小的粒子，也可以是原子、分子、离子或分子团。
5、什么是冷冻干燥？其原理如何？
答：冷冻干燥是指物质经低温完全冻结成固态，并在减压条件下使大量溶剂（一般是水）升华成蒸气，从而达到低温除去溶剂的过程。基本原理：是使冰冻物质中的水分或其他蒸气压较高的物质，在低温真空系统中进行升华而使样品本身干燥。
6、如何进行冷冻干燥除水？
答：三种方法：（1）低温冷凝除水（适用于实验实和大量生产）：在冷凝器中结冰，可以除去大量水分。（2）干燥剂除水（适用于100mL或以下较小量的干燥）：常用干燥剂有硫酸钙、氯化钙、Mg(ClO3)2、硅胶、五氧化二磷（最强、较贵且不能重复使用）和氢氧化钠（最弱）等。（3）抽气机直接除水：水蒸气喷射抽气机或油泵可以一同使用。需要较大的抽气泵，不太适合实验室研究之用。
7、制品的冷冻干燥过程主要包括几个阶段？如何操作？
答：（1）制品预处理：按一般经验通常要求制品的固体含量为4~10%较为适宜。为使制品有一定的固体量并保持制品的活性和溶解度可加入保护剂。（2）制品的预冷：预冷的目的是将溶液中的自由水固化，使干燥后产品与干燥前有相同的形态，防止抽真空干燥时起泡、浓缩和溶质移动等不可逆变化发生，减少因温度下降引起的物质可溶性降低和生命特性变化。
（3）升华干燥过程：升华过程是冷冻干燥的核心。干燥箱预冷（-20℃）→干燥箱及冷凝器抽真空（13Pa以下）→搁板加温，此时制品开始升华。（4）解吸干燥过程：制品升华结束时约残留有5~10%的水分，需要进一步干燥，此时干燥通常称为解吸干燥。干燥物物质的含水量是衡量干燥物质质量的重要标志。一般生物制品含水量通常要求在2%，特殊的物质如蛋白质应小于1%。（5）密封保存：冻干后的制品必须进行封口，以防水分侵入和污染。密封的样品宜在低温干燥的环境下储存。
8、什么是喷雾干燥，原理如何？喷雾干燥过程可分为哪几个阶段？
答：喷雾干燥是用雾化器将原料液分散成细小雾滴，并用热空气（或其他气体）与雾滴直接接触的方式进行干燥而获得粉状产品的一种干部燥过程。原理：喷雾干燥是利用不同的喷雾器，将悬浮液和粘滞的液体喷成雾状，形成具有较大表面积的分散微粒同热空气发生强烈的热质交换，迅速排除本身的水分，在几秒至几十秒内获得干燥。喷雾干燥过程可分为三个基本阶段：料液雾化为雾滴；雾滴与干燥介质接触、混合及流动，即干燥；干燥产品与干燥介质分离。