中国生物防治ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌ２００７年５月
一种促进植物根系生长的极细链格孢菌
蛋白质分离、纯化和生物功能
赵明治１，杨秀芬２＊，张明１，袁京京２，邱德文２
（１．安徽农业大学生命科学学院，合肥２３００３６；２．中国农业科学院植物保护研究所，北京１０００８１）
摘要：通过硫酸铵沉淀、有机溶剂沉淀、离子交换和分子筛连用的方法，从极细链格孢菌ＪＨ５０５菌株中分离纯化到分子量约为３５ｋＤ的植物激发子。利用固相梯度凝胶双向电泳方法测定了该蛋白的等电点为４．２２。将该纯化蛋白稀释液浸泡小麦种子８ｈ，７ｄ后小麦根系琥珀酸脱氢酶活性提高６５．２７％，经蛋白处理的小麦根长比对照提高１３．１％。
关键词：蛋白纯化；激发子；极细链格孢菌；生物活性
中图分类号：￥４８２．８９１文献标识码：Ａ文章编号：１００５—９２６１（２００７）０２．０１７０．０４
ａＰｕｒｉ６ｃａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＧｒｏｗｔｈ．ａｃｔｉｖａｔｏｒ
ｆｒｏｍＡ／ｔｅｒｎａｒ／ａｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ
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（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ２３００３６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｎｅｗｐｌａｎｔａｃｔｉｖａｔｏｒｆｒｏｍＡｌｔｅｒｎａｒｉａｔｅｎｕｉｓｓｉｍａｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｐｈａｔｅｆｒａｃ－ｔｉｏｎａｔｉｏｎ，ｏｒｇａｎｉｃ
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利用激发子诱导植物获得系统抗性，是当前解决农产品化学污染、生态环境恶化、抗病育种不稳定的重要途径。激发子诱导植物产生获得性系统抗性，是研究植物与微生物相互作用、发掘新功能生物制剂的热点之一。蛋白类激发子广泛存在于微生物中，本研究室从多种植物病原真菌中发现了能诱导植物获得系统抗性的蛋白激发子，并称之为植物激活蛋白（ｐｌａｎｔｖａｔｏｒａｃｔｉ—ｐｒｏｔｅｉｎ）。该蛋白已申报中国发明专利，其有关基因已在ＧｅｎＢａｎｋ登陆（基因登录号为
收稿日期：２００６—１１—２１
基金项目：“９７３”项目（２００３ＣＢｌｌ４２０４）；北京市科技计划（Ｄ０７０６００５０４０４３１）
作者简介：赵明治，（１９８０一），男，硕士；＊通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉｕｆｅｎｙ９３＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ。１７０
第２期赵明治等：一种促进植物根系生长的极细链格孢菌蛋白质分离、纯化和生物功能
ＣＨ４４５３３５）。研究表明，该蛋白能诱导植物产生系统抗性，促进植物生长，改善作物品质，可发展为新型的多功能生物农药…。该蛋白对植物烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病等多种病毒病的抑制效果在７５％以上。这一蛋白处理种子能够加快黄瓜种子的萌发，促进幼根的生长［２』。作者从极细链格孢菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ）中分离、纯化该激发子蛋白，并测定了纯化蛋白对植物根系生长的促进作用。现将结果报道如下。
１材料与方法
１．１菌株及种子
极细链格孢菌ＪＨ５０５由本实验室保藏，小麦种子中抗ＣＡ００４５由中国农业科学院作物研究所陈惠民老师惠赠。
１．２试剂和仪器
固相梯度凝胶条、ＨｉｔｒａｐＤＥＡＥＦＦｌｍｌ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５１０／３００低分子量标准蛋白（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、丙稀酰胺、甲叉双丙稀酰胺、ｒｉｆｆｓ（Ａｍｒｅｓｃｏ），其余试剂均为国产分析纯。高速离心机（Ｓｏｒｖａｌｌ公司）；凝胶电泳仪（Ｂｉｏ．ｒａｄ）；分光光度计ｕＶ．２５５０（岛津公司）；ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ高效蛋白纯化仪、ＥｔｔａｎＩＰＧｐｈｏｒＩＩＩｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃＦｏｃｕｓｉｎｇＳｙｓｔｅｍ等电聚焦仪（Ａｍｅｒｓｈａｍ）；超滤管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）；恒温水浴、真空干燥器、磁力搅拌器均为国产。
１．３菌体培养与粗蛋白的提取
挑取少量ＪＨ５０５菌丝体在ＰＤＡ固体培养基上２８％活化培养２ｄ后，转接于ＰＤＡ液体培养基中，在２８℃、１８０ｒ／ｍｉｎ条件下，恒温振荡培养２ｄ，利用真空抽滤器抽滤菌丝体成菌饼并用双蒸水洗涤３次后，于一８０。Ｃ保存备用。粗蛋白的提取按邱德文Ｈｊ方法进行。获得蛋白粗提液用阴离子交换低盐缓冲液透析过夜。
１．４离子交换层析
用低盐缓冲液（２０ｍｍｏｌ／ＬＭＥＳ缓冲液，ｐＨ６．０）平衡阴离子柱Ｉ－ＩｉｔｒａｐＤＥＡＥＦＦ后，以低盐缓
ＭＥＳ，２ｍｍｏｌ／Ｌ冲液上样，上样体积为５ｍｌ，上样速度为ｌｍｌ／ｍｉｎ。然后用高盐缓冲液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣＩ，ｐＨ６．ｏ）进行步阶梯度洗脱，流速ｌｍｌ／ｍｉｎ，步阶梯度的３个梯度是１０％、２０％和１００％，分别收集各洗脱峰。超滤浓缩后，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳检测目的蛋白含量并进行生物活性检测。１．５分子筛凝胶层析
目的蛋白峰经超滤管浓缩后用分子筛柱ＨｉｔｒａｐＳｕｐｅｒｄｅｘ７５进行分离，流动相为Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ超纯水，流速ｌｍｌ／ｍｉｎ，收集各蛋白峰，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ检测目的蛋白含量和纯度。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳分离胶１２％，浓缩胶５％，将获得的各洗脱峰电泳后分别用考马斯亮蓝Ｇ．２５和银染方法进行染色。１．６蛋白等电点的测定
采用固相梯度凝胶法测定。用等电聚焦仪，线性梯度预制干胶条型号为１３ｃｍ，ｐＨ３～１０，等电聚焦条件根据ＧＥ公司操作手册进行。第二向ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳胶浓度为１２％，５ｍＡ电泳１５ｍｉｎ后３０ｍＡ恒流电泳至溴酚蓝电泳至下边沿０．５ｃｍ处，将胶用考马斯亮蓝染色后，ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２ＤＰｌａｔｉｎｕｍ软件进行分析，计算等电点。
１．７纯化蛋白生物活性测定
将小麦种子分别浸在纯化蛋白稀释液（浓度３、２和１ｐｇ／１１１１）中，以蒸馏水浸种作对照。每处理３０粒种子，浸种８ｈ后将种子均匀摆放在直径９ｃｍ培养皿中于２８％光照培养，定期定量加
１７１
中国生物防治第２３卷
蒸馏水以保持湿度。培养７ｄ后测量各处理小麦的主根长并测定根系琥珀酸脱氢酶活性，酶活力测定方法按照氯化三苯基四氮唑（ｒＩ’１１Ｃ）法ｂｊ。
２结果与分析
２．１激发子蛋白的分离纯化及电泳检测
粗蛋白样品经ＤＥＡＥ柱层析分离，获得洗脱峰，电泳检测发现目的蛋白可以被０．４ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ洗脱，根据迁移率作图获得目的蛋白的分子量约为３５ｋＤ（图１、２）。进一步用分子筛对目的蛋白进行纯化，主峰经电泳检测显示为单一条带（图３、４），将主峰浓缩进行生物活性测定。
Ｍ．低分子量标准蛋白；１．含有目的组分的蛋白样品
图２目的蛋白组分的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳图
Ｍ．低分子量标准蛋白；１．含有目的组分的蛋白样品
图３含有目的蛋白的组分过ＨｉｔｒａＳｕｐｅｒｄｅｘ７５柱洗脱图圈４含有目的蛋白组分的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳图２．２蛋白的双向电泳及等电点的测定
利用凝胶扫描仪对染色后的凝胶进行扫
描并根据目的蛋白点在凝胶上的相对位置进
行等电点的计算。经过计算，目的蛋白的等电
点ｐＩ约为４．２２（图５）。
２．３纯化蛋白对小麦根系生长和琥珀酸脱氢
酶的影响
纯化蛋白对小麦根长有明显的促进作用
（图６，不同小写字母表示差异显著，Ｐ＜
０．０５），激发子浓度为３、２和１弘ｇ／ＩＩｌｌ时，小麦
根长比对照分别提高１３．１％、１２．１％和８．６％，不同浓度间无显著差异。从琥珀酸脱氢酶活力看，不同浓度纯化蛋白均能显著提高小麦根系酶活力，其中蛋白浓度为３ｂｔｇ／ｍｌ时，活力比对照
１７２Ｍ．低分子量标准蛋白；图中箭头所指为目的蛋白图５纯化蛋白双向电泳图
第２期赵明治等：一种促进植物根系生长的极细链格孢菌蛋白质分离、纯化和生物功能
图６不同浓度蛋白溶液对小麦根长的影晌图７不同浓度激发子对小麦根系琥珀酸脱氢酶活性的影响提高６５．２７％（图７）。从小麦的生长情况看，经过处理的小麦虽然在种子萌发初期以及小麦苗高与对照无显著差异，但根长有显著增加。
３讨论
ｅｌｉｃｉｔｏｒ是指来源于病原菌或植物细胞壁可驱动植物产生多重防御反应的化合物，如寡糖、糖肽／糖蛋白、多肽／蛋白质和脂类【４Ｊ。病原菌的激发子与植物的细胞表面或亚细胞表面组分中的受体结合，启动级联信号系统，调控防卫基因的表达，最终表现对病原菌的抗病性Ｌ５，６Ｊ。本试验纯化的３５ｋＤ蛋白经生物测定证明具有蛋白激发子功能，该蛋白纯化技术方法的建立为进一步分析该蛋白的生物学功能以及基因克隆和工程菌株的构建奠定了基础。
目前对蛋白等电点的测定方法主要有毛细管电泳、固相梯度等电聚焦（ＩＰＧＥＦ）和根据已知氨基酸序列通过生物信息学的方法计算理论等电点的方法。本文采用的固相梯度等电聚焦比传统的ＩＥＦ具有更高的分辨率，其分辨率可达０．００１ｐＨ，是目前分辨率最高的电泳方法之一【７Ｊ。几次重复试验证明，等电点结果比较稳定、可靠。
根系是植物重要的器官，不仅具有吸收水分和矿质元素的功能，而且也是氨基酸、激素的合成场所。根系琥珀酸脱氢酶与根系吸收、合成、代谢能力有密切的关系，也是决定植物生长和产量提高的重要指标之一。本文通过测定植物根系琥珀酸脱氢酶证明了纯化蛋白的生物功能。为了更进一步分析蛋白的功能，今后尚需研究蛋白与植物的相互作用、诱导植物抗病性，为新型生物农药的创制奠定理论基础。
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１７３
一种促进植物根系生长的极细链格孢菌蛋白质分离、纯化和
生物功能
作者：
作者单位：赵明治， 杨秀芬， 张明， 袁京京， 邱德文， ZHAO Ming-zhi， YANG Xiu-fen， ZHANGMing， YUAN Jing-jing， QIU De-wen赵明治,张明,ZHAO Ming-zhi,ZHANG Ming(安徽农业大学生命科学学院,合肥,230036)， 杨
秀芬,袁京京,邱德文,YANG Xiu-fen,YUAN Jing-jing,QIU De-wen(中国农业科学院植物保护
研究所,北京,100081)
中国生物防治
CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICAL CONTROL
2007，23(2)
13次刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
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PeaT1是一种从极细链格孢菌中分离纯化的激活蛋白，具有促进植物生长、提高植物抗性的作用。为了阐明PeaT1多效机制是否取决于分子内部可能存在的功能域，本文分析了PeaT1的结构域，构建了PeaT1及其三个缺失突变体表达载体，分别诱导表达目的蛋白，以期分析PeaT1结构域对其生物学效应和蛋白特性的影响。主要研究结果如下：
1.peaT1及其缺失突变体表达载体的构建
通过提取极细链格孢菌的总RNA，反转录成cDNA，进而扩增获得了peaT1基因。利用生物信息学对PeaT1蛋白进行了初步分析，得知其有两个结构域：NAC(49-108位AA)和UBA/TS-N(162-206位AA)。用PCR方法扩增了3个缺失基因片段：peaT1-△CD99、peaT1-△ND49和peaT1-△ND108，将这三个片段分别与pET-28a连接构建了三个缺失突变体的融合表达载体。
2.PeaT1及其三个缺失突变体蛋白的表达和纯化
将peaT1和三个缺失基因片段的表达载体转入E.coliBL21(DE3)细胞，经IPTG诱导进行表达，获得了PeaT1及其缺失突变体蛋白。用蛋白纯化系统(AKTAExplorer10.0)对表达蛋白进行His·Tag亲和层析和脱盐处理，通过生物质谱技术获得了PeaT1的标准分子量为26.319kD，与理论蛋白的分子量26.259kD相符。
3.PeaT1及其突变体蛋白的功能比较与分析
三个缺失突变体与PeaT1蛋白一样，对小麦生长和抗病性都有显著的促进作用，而各表达蛋白之间的生物活性没有显著差异。结合生物信息学分析和前人研究结果推测：PeaT1蛋白NAC保守区域的作用机理，可能是其充当分子伴侣的作用，促进蛋白的正确折叠，以及其通过OB结合域的方式与TBP等转录因子结合，通过转录共激发子的作用促进下游某些基因的转录来促进植物生长，提高抗性；UBA/TS-N保守区域，与翻译延伸因子EF1B(EF-Ts)相似，可能更多的是担当一种翻译共激发子来诱导植株生长和增强植物抗逆。由此推测，PeaT1的2个结构域可能具有独立或类似的生物功能。
4.稳定同位素标记技术研究
PeaT1及其突变体蛋白诱导日本晴蛋白的差异表达分别用15N和14N培养基培养日本晴幼苗，在相同的生长环境下，用PeaT1及其突变体蛋白处理15N标记的水稻(14N标记水稻作为对照)。通过质谱测定获得了近百种上调表达的蛋白，确定了PeaT1和3个缺失基因片段编码的蛋白均能引起水稻日本晴蛋白的差异表达。通过对33种差异蛋白的功能分析，得知它们与植物叶绿体光系统Ⅰ、光系统Ⅱ和翻译起始因子相关，为激活蛋白作用机理的研究提供了理论基础。
5.PeaT1及其三个突变体蛋白的热稳定性分析
对表达的PeaT1和三个突变体蛋白的耐热性进行了分析，结果显示它们都具有很好的热稳定性。通过氨基酸组成特性、三级结构的作用力分析了蛋白的耐热机制。分析显示，PeaT1及其突变体蛋白的氨基酸组成具有如下共同特征：含有较多的带电氨基酸形成盐桥；含有较多疏水氨基酸形成强大的疏水作用力；含有较多的Ala、Glu使蛋白更容易形成α－螺旋。含有极少的Gin、Asn、Trp和Cys等，避免它们分别因为脱氨、氧化和二硫键断裂等而致使蛋白不稳定。
通过热稳定性分析结果，结合PeaT1蛋白的二级结构预测，推测NAC和UBA/TS－N两个结构域在空间是以相对独立而非聚集的形式存在。
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PeaT1是从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中提取出的一种植物蛋白激发子,具有促进植物生长,增强作物抗逆性的功能.由于该蛋白具有无残留、无毒副作用的优点,因此具有发展为生物农药的应用前景.在100 L发酵罐中利用分批补料技术对PeaT1工程菌进行高密度发酵,通过AKTA蛋白纯化仪对发酵产物进行了亲和纯化,并检测了纯化所得蛋白对水稻在15℃低温下生长的影响.发酵最终菌体密度达80 g/L,每升菌液纯化得到蛋白90 mg,纯化所得蛋白能够促进水稻低温下的生长,具有激发子活性.
6.学位论文 任秀艳 Harpins蛋白诱导植物生长和防卫的信号传导交叉调控及植物互作因子的研究 2007
Harpins是由革兰氏阴性植物病原细菌产生的一类蛋白类激发子,外源施用后,可以诱导多种植物抗病、抗虫、抗旱、促进植物生长.这些效应在不同Harpins处理的植物上都有所发现,它们是来自于Eriwinia amylovora的HrpNEa、Pseudomonas syringae pv.syringae的HrpZPss、P.syringae
pv.phaseolicola的HrpZpsph和Xanthomonas oryzae的HpaG。但是,对于Harpins如何行使自身的多重功能,目前还不清楚。本研究着重对以下几个方面进行了研究。
1.脱落酸和乙烯信号互作对HrpNEa诱导拟南芥根生长的调控作用
HrpNEa是由引起蔷薇科植物火疫病的病原细菌Erwinia amylovora产生的一种Harpin蛋白。HrpNEa处理植物可以激发乙烯和脱落酸分别诱导植物生长和抗旱。本文报道了脱落酸和乙烯两种激素同时应用时调节HrpNEa在拟南芥根生长中的促进作用。我们首先研究了野生型拟南芥Col-0和Ler-0从种子萌发结束到胚根伸出后,HrpNEa对根生长的作用,结果发现,与水和EVP处理相比,HrpNEa处理后明显促进了根的初期生长。在处理12 h和24 h后,HrpNEa的作用更明显。EVP同水处理一样不影响根的生长。用HrpNEa溶液浸泡处理野生型拟南芥种子在促进脱落酸和乙烯水平升高的同时促进根的生长。这些反应通过抑制剂AgNO3或1-MCP抑制野生型种子对乙烯的感知及NDGA和AOA抑制野生型种子对ABA和乙烯合成而受到限制。HrpNEa处理拟南芥突变体etr1-1,ein5-1和ABA不敏感突变体abi2-1后,对根生长始终都没有影响。我们的结果建立了一个在HrpNEa的作用下,脱落酸和乙烯信号和促进根系生长之间的机械联系。然而,当在叶片上施用HrpNEa时,在促进植物生长过程中,乙烯信号是在没有脱落酸信号的情况下起作用的,这表明,HrpNEa在植物叶片和根中的信号机制是不同的。
2.HpaGXoo转基因表达诱导植物生长和抗病性
根据前人的报道,外源施用harpins时,可以启动SAR通路包括SA积累、EDSI和NDR1的调控、PR基因的表达及NPR1对PR基因表达的调控,其中HCD与抗病性同步发生、但没有必然的因果关系。HpaCXoo是水稻白叶枯病菌X.oryzae pv.oryzae的基因hpaGXoo编码的一种harpin蛋白,同其它harpins蛋白一样可以在非寄主植物上诱导产生过敏反应以及其它多种效应。我们将编码HpaGXoo的基因hpaGXoo与花椰菜花叶病毒35S启动子的融合基因单元通过真空花絮渗透法转入拟南芥,获得表达HpaGXoo的拟南芥(HpaGXoo-expressing Arabidopsis,HATA1)转基因系。对转基因系进行了以下分子验证：通过PCR方法,确定了hpaGXoo基因在拟南芥基因组中的稳定整合；用RT-PCR方法证明了hpaGXoo基因在拟南芥中可以转录；从转基因拟南芥中提取的HpaGXoo具有在烟草上诱导HR的能力；同时根据SDS-PAGE电泳,转基因表达的HpaGXoo大小没有改变(15.6 kD)。这些结果表明,hpaGXoo基因在拟南芥体内可以正常翻译为有活性的、完整的HpaGXoo分子。另外,我们选择了具有一定代表性的细菌菌株P.syringae pv.tomato DC3000,对转基因拟南芥的不同株系进行抗病性实验,结果发现不同的转基因株系都获得了对该细菌的抗性,但抗性水平有所差别。同时我们对抗病防卫反应基因NPR1、PR-1和RP36的表达进行了测定,发现在转基因株系中,防卫反应相关基因都有一定的表达。但是,所有的转基因株系都没有HCD的发生,而外源喷施野生型拟南芥发生了明显的Micro-HR。根据这些结果,我们认为HpaGXoo在拟南芥中转基因表达可以诱导抗病防卫基因的表达,诱导对细菌的抗病性,但不能诱发HCD。另外,是否带有信号肽对hpaGXoo基因在植物体内表达后所诱导的促生长和抗病没有影响。
3.HpaGXooc及其功能片段对田间水稻产量的影响
对水稻细菌性条斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola)的HpaGXooc进行改造,产生了9个不同的功能片段,其中HpaG10-42促进水稻生长、诱导水稻抗病性的效应最强。本研究在3个地区对9个水稻品种进行了田间小区实验,发现HpaG10-42蛋白提高水稻产量的效应显著地优于HpaGXooc全长蛋白。根据水稻生长期确定处理时间,测定了两种蛋白18种浓度组合的田间效应。分别在苗期,返青后期,分蘖期和始穗期喷施不同组合的蛋白溶液,调查两种类型水稻产量。正交分析表明,功能片段HpaG10-42的6μg/ml的浓度组合的效果最好,但是HpaG10-42在最小剂量的施用效果仍显著高于HpaGXooc最高剂量的施用效果。
果不大,但都比全长蛋白的效果好。HpaG10-42促进水稻产量增加效果好于常规农事操作和HpaGXooc处理。而HpaG10-42对9个不同水稻品种产量的影响存在很大差别,而和品种类型无关。本研究结果为有效应用病原代谢物的有益功能片段来改良大田粮食作物,提供了范例。
4.HpaGXoo蛋白表达及抗体制备
HpaGXoo在植物上可以诱导产生多种效应,但是对于该蛋白在植物上是如何起作用,在什么部位起作用,目前还不清楚。已有人报道了harpins在植物细胞中的作用部位,但对不同harpins的研究结果不尽相同。为了下一步研究HpaGXoo在植物中的作用部位,构建了可用于HpaGXoo蛋白纯化的高效表达载体,并制备了抗血清。利用PCR方法从水稻白叶枯病菌中扩增得到 hpaGXoo基因,连接pET30a(+)载体,获得了重组质粒pET30a(+)：:hpaGXoo,该载体上保留了蛋白质纯化所需的His tag编码序列。转化宿主菌BL21(DE3)产生表达菌株BLHR4。表达菌株经IPTG诱导培养,进行SDS-PAGE电泳,产生分子量为21.6 KD大小的组氨酸标记的融合蛋白条带。利用HisTrap HP Kit试剂盒对HpaGXoo蛋白进行了纯化。SDS-PAGE结果表明,体外表达融合组氨酸的HpaGXoo经过Ni柱纯化同样得到21.6 KD大小的单一条带。以牛血清蛋白(BSA)为标准,经凝胶成像系统BioImage软件测定,蛋白提取液中目的蛋白的浓度约为0.5-1.0mg/ml,每升菌液可提纯蛋白约2-4 mg。该纯化蛋白在烟草上引起典型的过敏性反应。我们将浓度为1 mg/ml纯化的蛋白新西兰家兔进行免疫,获得了HpaGXoo蛋白的多克隆抗体,间接ELISA方法测定抗血清的效价,结果效价达到1:16,000以上,能够满足以后的实验需要.同时利用Western blot对蛋白与抗体之间的特异性结合进行了验证,结果表明,不论是粗蛋白还是纯化蛋白在相应的位置上都有很强的杂交信号,而空载体提取物在相应的位置没有任何信号。为了验证转基因植物中表达的HpaGXoo蛋白与抗血清之间是否特异性结合,我们提取了植物中表达的HpaGXoo蛋白,并对其进行了杂交分析,结果表明,转基因植物中表达的HpaGXoo蛋白和原核表达的一样可以和抗血清特异性识别并产生较强的杂交信号,由于该蛋白原核表达融合了His-tag,故比植物中表达的蛋白条带大,因此杂交信号不在一条直线上。
5.HpaGXoo蛋白互作因子的筛选
本研究使用酵母双杂交系统,以HpaGXoo为诱饵,对拟南芥cDNA文库进行筛选。根据营养缺陷型和β-半乳糖苷酶活性初步筛选到6个阳性克隆,测序并在Genbank中进行序列比对,结果表明它们分别编码拟南芥中的核黄素合酶(Riboflavin synthase,RS)、液泡膜嵌入蛋白(Tonoplast intrinsic protein2,TIP2)、成束类阿拉伯半乳聚糖蛋白(Fasciculin-like arabinogalactan-protein,FLA8)、质膜嵌入蛋白(Plasma membraneintrinsic
protein,PIP1)、核转运因子(Nuclear transport factor 2,NTF2)和碳酸酐酶(Carbonic anhydrase 2,CA2)蛋白,而且序列同源性达到100％。总结：本研究结果表明,harpins诱导植物生长和抗病的过程中,乙烯和脱落酸信号传导通路参与了这些反应的调控。植物与HpaGXoo互作的因子可能通过不同的机制在这些信号传导过程中起作用。对这些问题的研究,有助于深入了解harpins诱导植物多种反应的机制。
本研究的创新点：(1)解析ABA和乙烯信号的互作对HrpNEa诱导拟南芥根生长的调控作用；(2)构建了带有His-tag的HpaGXoo表达载体并纯化出有活性的蛋白质；(3)筛选到了与HpaGXoo互作的植物因子,对其功能进行初步预测。不足之处：由于时间关系,没能对HpaGXoo在植物上的作用部位及筛选出的互作因子的功能做进一步研究。
引证文献(13条)
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术(英文版) 2008(1)
中国生物防治ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌ２００７年５月
一种促进植物根系生长的极细链格孢菌
蛋白质分离、纯化和生物功能
赵明治１，杨秀芬２＊，张明１，袁京京２，邱德文２
（１．安徽农业大学生命科学学院，合肥２３００３６；２．中国农业科学院植物保护研究所，北京１０００８１）
摘要：通过硫酸铵沉淀、有机溶剂沉淀、离子交换和分子筛连用的方法，从极细链格孢菌ＪＨ５０５菌株中分离纯化到分子量约为３５ｋＤ的植物激发子。利用固相梯度凝胶双向电泳方法测定了该蛋白的等电点为４．２２。将该纯化蛋白稀释液浸泡小麦种子８ｈ，７ｄ后小麦根系琥珀酸脱氢酶活性提高６５．２７％，经蛋白处理的小麦根长比对照提高１３．１％。
关键词：蛋白纯化；激发子；极细链格孢菌；生物活性
中图分类号：￥４８２．８９１文献标识码：Ａ文章编号：１００５—９２６１（２００７）０２．０１７０．０４
ａＰｕｒｉ６ｃａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＧｒｏｗｔｈ．ａｃｔｉｖａｔｏｒ
ｆｒｏｍＡ／ｔｅｒｎａｒ／ａｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ
ＺＨＡＯＭｉｎｇ—ｚｈｉ，ＹＡＮＧＸｉｕ－ｆｅｎ，ＺＨＡＮＧＭｉｎｇ，ＹＵＡＮＪｉｎｇ－ｊｉｎｇ，ＱＩＵＤｅ－ｗｅｎ
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ２３００３６，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｎｅｗｐｌａｎｔａｃｔｉｖａｔｏｒｆｒｏｍＡｌｔｅｒｎａｒｉａｔｅｎｕｉｓｓｉｍａｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｐｈａｔｅｆｒａｃ－ｔｉｏｎａｔｉｏｎ，ｏｒｇａｎｉｃ
ｔｅｉｎｅｘｈｉｂｉｔｅｄａｓｏｌｖｅｎｔ，ａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｏｎｓｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅｐｒｏ—ｗａｓｓｉｎｇｌｅｂａｎｄＳＤＳ－ＰＡＧＥｗｉｔｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｏｆ３５ｋＤ．Ｉｔｓｐ１ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ
ａｔａｓ４．２２ｕｓｉｎｇｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅｄｒｙｓｔｒｉｐ
ｔｒａｔｉｏｎｓｆｏｒ８ｈｇｅｌ．Ｔｈｅｗｈｅａｔｓｅｅｄｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｅｌｉｃｉｔｏｒｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎ—ａｎｄｔｈｅ
ａｓｕｃｃｉｎａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｗａｓｍｅａｓｉｌｒｅｄａｆｔｅｒ７ｄｇｒｏｗｔｈ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＯｉｌｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｈａｓｒｅｍａｒｋａｂｌｅｅｆｆｅｃｔｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｓｕｃｃｉｎａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｗｈｉｃｈｗａｓ６５．２７％ｈｉｇｈｅｒ
ｍａｉｎｒｏｏｔｗａｓｉｍｐｒｏｖｅｄ１３．１％ｃｏｍｐａｒｉｎｇｔｏｔｈｅｃｏｎｔｒ０１．ｔｈａｎｔｈａｔｏｆｃｏｎｔｒ０１．Ａｌｓｏ．ｔｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｒｏｔｅｉｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｐｌａｎｔａｃｔｉｖａｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎ；Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ；ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
利用激发子诱导植物获得系统抗性，是当前解决农产品化学污染、生态环境恶化、抗病育种不稳定的重要途径。激发子诱导植物产生获得性系统抗性，是研究植物与微生物相互作用、发掘新功能生物制剂的热点之一。蛋白类激发子广泛存在于微生物中，本研究室从多种植物病原真菌中发现了能诱导植物获得系统抗性的蛋白激发子，并称之为植物激活蛋白（ｐｌａｎｔｖａｔｏｒａｃｔｉ—ｐｒｏｔｅｉｎ）。该蛋白已申报中国发明专利，其有关基因已在ＧｅｎＢａｎｋ登陆（基因登录号为
收稿日期：２００６—１１—２１
基金项目：“９７３”项目（２００３ＣＢｌｌ４２０４）；北京市科技计划（Ｄ０７０６００５０４０４３１）
作者简介：赵明治，（１９８０一），男，硕士；＊通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉｕｆｅｎｙ９３＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ。１７０
第２期赵明治等：一种促进植物根系生长的极细链格孢菌蛋白质分离、纯化和生物功能
ＣＨ４４５３３５）。研究表明，该蛋白能诱导植物产生系统抗性，促进植物生长，改善作物品质，可发展为新型的多功能生物农药…。该蛋白对植物烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病等多种病毒病的抑制效果在７５％以上。这一蛋白处理种子能够加快黄瓜种子的萌发，促进幼根的生长［２』。作者从极细链格孢菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｔｅｎｕｉｓｓｉｍａ）中分离、纯化该激发子蛋白，并测定了纯化蛋白对植物根系生长的促进作用。现将结果报道如下。
１材料与方法
１．１菌株及种子
极细链格孢菌ＪＨ５０５由本实验室保藏，小麦种子中抗ＣＡ００４５由中国农业科学院作物研究所陈惠民老师惠赠。
１．２试剂和仪器
固相梯度凝胶条、ＨｉｔｒａｐＤＥＡＥＦＦｌｍｌ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５１０／３００低分子量标准蛋白（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、丙稀酰胺、甲叉双丙稀酰胺、ｒｉｆｆｓ（Ａｍｒｅｓｃｏ），其余试剂均为国产分析纯。高速离心机（Ｓｏｒｖａｌｌ公司）；凝胶电泳仪（Ｂｉｏ．ｒａｄ）；分光光度计ｕＶ．２５５０（岛津公司）；ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ高效蛋白纯化仪、ＥｔｔａｎＩＰＧｐｈｏｒＩＩＩｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃＦｏｃｕｓｉｎｇＳｙｓｔｅｍ等电聚焦仪（Ａｍｅｒｓｈａｍ）；超滤管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）；恒温水浴、真空干燥器、磁力搅拌器均为国产。
１．３菌体培养与粗蛋白的提取
挑取少量ＪＨ５０５菌丝体在ＰＤＡ固体培养基上２８％活化培养２ｄ后，转接于ＰＤＡ液体培养基中，在２８℃、１８０ｒ／ｍｉｎ条件下，恒温振荡培养２ｄ，利用真空抽滤器抽滤菌丝体成菌饼并用双蒸水洗涤３次后，于一８０。Ｃ保存备用。粗蛋白的提取按邱德文Ｈｊ方法进行。获得蛋白粗提液用阴离子交换低盐缓冲液透析过夜。
１．４离子交换层析
用低盐缓冲液（２０ｍｍｏｌ／ＬＭＥＳ缓冲液，ｐＨ６．０）平衡阴离子柱Ｉ－ＩｉｔｒａｐＤＥＡＥＦＦ后，以低盐缓
ＭＥＳ，２ｍｍｏｌ／Ｌ冲液上样，上样体积为５ｍｌ，上样速度为ｌｍｌ／ｍｉｎ。然后用高盐缓冲液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣＩ，ｐＨ６．ｏ）进行步阶梯度洗脱，流速ｌｍｌ／ｍｉｎ，步阶梯度的３个梯度是１０％、２０％和１００％，分别收集各洗脱峰。超滤浓缩后，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳检测目的蛋白含量并进行生物活性检测。１．５分子筛凝胶层析
目的蛋白峰经超滤管浓缩后用分子筛柱ＨｉｔｒａｐＳｕｐｅｒｄｅｘ７５进行分离，流动相为Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ超纯水，流速ｌｍｌ／ｍｉｎ，收集各蛋白峰，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ检测目的蛋白含量和纯度。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳分离胶１２％，浓缩胶５％，将获得的各洗脱峰电泳后分别用考马斯亮蓝Ｇ．２５和银染方法进行染色。１．６蛋白等电点的测定
采用固相梯度凝胶法测定。用等电聚焦仪，线性梯度预制干胶条型号为１３ｃｍ，ｐＨ３～１０，等电聚焦条件根据ＧＥ公司操作手册进行。第二向ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳胶浓度为１２％，５ｍＡ电泳１５ｍｉｎ后３０ｍＡ恒流电泳至溴酚蓝电泳至下边沿０．５ｃｍ处，将胶用考马斯亮蓝染色后，ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ２ＤＰｌａｔｉｎｕｍ软件进行分析，计算等电点。
１．７纯化蛋白生物活性测定
将小麦种子分别浸在纯化蛋白稀释液（浓度３、２和１ｐｇ／１１１１）中，以蒸馏水浸种作对照。每处理３０粒种子，浸种８ｈ后将种子均匀摆放在直径９ｃｍ培养皿中于２８％光照培养，定期定量加
１７１
中国生物防治第２３卷
蒸馏水以保持湿度。培养７ｄ后测量各处理小麦的主根长并测定根系琥珀酸脱氢酶活性，酶活力测定方法按照氯化三苯基四氮唑（ｒＩ’１１Ｃ）法ｂｊ。
２结果与分析
２．１激发子蛋白的分离纯化及电泳检测
粗蛋白样品经ＤＥＡＥ柱层析分离，获得洗脱峰，电泳检测发现目的蛋白可以被０．４ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ洗脱，根据迁移率作图获得目的蛋白的分子量约为３５ｋＤ（图１、２）。进一步用分子筛对目的蛋白进行纯化，主峰经电泳检测显示为单一条带（图３、４），将主峰浓缩进行生物活性测定。
Ｍ．低分子量标准蛋白；１．含有目的组分的蛋白样品
图２目的蛋白组分的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳图
Ｍ．低分子量标准蛋白；１．含有目的组分的蛋白样品
图３含有目的蛋白的组分过ＨｉｔｒａＳｕｐｅｒｄｅｘ７５柱洗脱图圈４含有目的蛋白组分的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳图２．２蛋白的双向电泳及等电点的测定
利用凝胶扫描仪对染色后的凝胶进行扫
描并根据目的蛋白点在凝胶上的相对位置进
行等电点的计算。经过计算，目的蛋白的等电
点ｐＩ约为４．２２（图５）。
２．３纯化蛋白对小麦根系生长和琥珀酸脱氢
酶的影响
纯化蛋白对小麦根长有明显的促进作用
（图６，不同小写字母表示差异显著，Ｐ＜
０．０５），激发子浓度为３、２和１弘ｇ／ＩＩｌｌ时，小麦
根长比对照分别提高１３．１％、１２．１％和８．６％，不同浓度间无显著差异。从琥珀酸脱氢酶活力看，不同浓度纯化蛋白均能显著提高小麦根系酶活力，其中蛋白浓度为３ｂｔｇ／ｍｌ时，活力比对照
１７２Ｍ．低分子量标准蛋白；图中箭头所指为目的蛋白图５纯化蛋白双向电泳图
第２期赵明治等：一种促进植物根系生长的极细链格孢菌蛋白质分离、纯化和生物功能
图６不同浓度蛋白溶液对小麦根长的影晌图７不同浓度激发子对小麦根系琥珀酸脱氢酶活性的影响提高６５．２７％（图７）。从小麦的生长情况看，经过处理的小麦虽然在种子萌发初期以及小麦苗高与对照无显著差异，但根长有显著增加。
３讨论
ｅｌｉｃｉｔｏｒ是指来源于病原菌或植物细胞壁可驱动植物产生多重防御反应的化合物，如寡糖、糖肽／糖蛋白、多肽／蛋白质和脂类【４Ｊ。病原菌的激发子与植物的细胞表面或亚细胞表面组分中的受体结合，启动级联信号系统，调控防卫基因的表达，最终表现对病原菌的抗病性Ｌ５，６Ｊ。本试验纯化的３５ｋＤ蛋白经生物测定证明具有蛋白激发子功能，该蛋白纯化技术方法的建立为进一步分析该蛋白的生物学功能以及基因克隆和工程菌株的构建奠定了基础。
目前对蛋白等电点的测定方法主要有毛细管电泳、固相梯度等电聚焦（ＩＰＧＥＦ）和根据已知氨基酸序列通过生物信息学的方法计算理论等电点的方法。本文采用的固相梯度等电聚焦比传统的ＩＥＦ具有更高的分辨率，其分辨率可达０．００１ｐＨ，是目前分辨率最高的电泳方法之一【７Ｊ。几次重复试验证明，等电点结果比较稳定、可靠。
根系是植物重要的器官，不仅具有吸收水分和矿质元素的功能，而且也是氨基酸、激素的合成场所。根系琥珀酸脱氢酶与根系吸收、合成、代谢能力有密切的关系，也是决定植物生长和产量提高的重要指标之一。本文通过测定植物根系琥珀酸脱氢酶证明了纯化蛋白的生物功能。为了更进一步分析蛋白的功能，今后尚需研究蛋白与植物的相互作用、诱导植物抗病性，为新型生物农药的创制奠定理论基础。
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１７３
一种促进植物根系生长的极细链格孢菌蛋白质分离、纯化和
生物功能
作者：
作者单位：赵明治， 杨秀芬， 张明， 袁京京， 邱德文， ZHAO Ming-zhi， YANG Xiu-fen， ZHANGMing， YUAN Jing-jing， QIU De-wen赵明治,张明,ZHAO Ming-zhi,ZHANG Ming(安徽农业大学生命科学学院,合肥,230036)， 杨
秀芬,袁京京,邱德文,YANG Xiu-fen,YUAN Jing-jing,QIU De-wen(中国农业科学院植物保护
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中国生物防治
CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICAL CONTROL
2007，23(2)
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相似文献(6条)
1.学位论文 武广衍 新型真菌源激活蛋白的分离纯化及生物功能的研究 2008
激活蛋白(Activator Protein)是一类源于真菌的新型蛋白激发子，前期研究发现该蛋白激发子具有诱导植物抗性和促进植物生长的作用。激活蛋白是一类新型的生物农药，具有广谱高效、多功能和无残留的特点。本文研究了病原真菌的培养与激活蛋白的纯化、对植物生长及其生理活性的影响。测定了不同浓度激活蛋白处理对作物生理特性的影响及其经激活蛋白处理后，植物的纤维素酶活性，过氧化氢和脯氨酸的含量，从而研究其作用机理，为进一步的商业化生产起到一定的作用。
1、病原真菌的培养与激活蛋白的纯化本实验室保存的稻瘟菌在液体PDA培养基中振荡培养后，抽提蛋白，利用硫酸铵沉淀法将粗蛋白沉淀，后利用酒精沉淀蛋白一次，利用FPLC高效蛋白纯化系统进行蛋白纯化，通过离子交换层析、疏水层析和分子筛连用的方法获得了纯化的该蛋白。实验证明，用pH7.5的MES缓冲液条件下获得的初步纯化的该蛋白。将上述蛋白样品过分子筛后获得的单峰为纯化蛋白。利用固相梯度凝胶电泳获得该蛋白的等电点，实验证明该蛋白的等电点为4.314±0.035，是一种酸性蛋白。
2、为探讨真菌源激活蛋白在促进作物生长方面的效果，研究了不同浓度激活蛋白处理对多种作物的影响。试验结果表明，用2～3 μg/mL的新型激活蛋白浸泡棉种6h，能显著提高种子的发芽势和发芽率。番茄和丝瓜种子分别用1μg/ml的蛋白浸种6h，能显著提高种子的发芽率。黄瓜种子用500倍和1000倍液都能显著提高种子的发芽率。为探讨真菌源激活蛋白对大田作物的效果，研究了不同浓度激活蛋白处理对油桃、大蒜、冬枣的影响。结果表明，用1000-1500倍液在大田中就可有良好的效果。
3、为探讨真菌源激活蛋白在促进植物生长和增产方面的作用机理，研究了不同浓度激活蛋白处理对大豆幼苗生理特性的影响。结果表明，经1、2、5 μg/mL激活蛋白处理后第7d，大豆幼苗根系活力比对照分别增加了44.2％、54.5％和19.8％，硝酸还原酶活性比对照分别增加了61.33％、138.37％和53.2％。
4、研究表明，稻瘟菌激活蛋白可明显提高丝瓜、番茄等发芽率，促进种子发芽整齐，同时对促进植物幼苗生长、健壮也有明显的作用。经激活蛋白处理后，植物的纤维素酶活性增强，过氧化氢和脯氨酸的含量提高，这些酶和活性物质在促进植物生长抗逆方面能发挥重要作用。
2.学位论文 詹海燕 疫霉激发子的分离纯化和激发素基因的克隆与表达 2006
能与植物原生质膜上高度特异的蛋白受体结合从而诱导植物产生防卫反应的分子统称激发子，其中从一些真菌菌丝细胞壁或培养滤液中提取的激发子尤其受关注。真菌激发子可被用于研究植物过敏反应的机理，其编码基因有可能被用于转基因操作从而获得具有抗病性能的植物材料。本论文以一分离自长春花叶片的疫霉为材料，开展了激发子的蛋白纯化，基因分离和原核表达等研究，主要研究结果如下：
1.从疫霉培养液中通过沸水浴、硫酸铵沉淀、非变性电泳、割胶电洗脱等纯化步骤，分离得到一种分子量约为31kD的耐高温的胞外分泌型蛋白。此蛋白在低浓度下能引起烟草叶片发生过敏反应；处理烟草悬浮细胞12hr后有44.6％的细胞死亡，24hr后有96.1％的细胞死亡，表明此蛋白具有激发子活性。此蛋白的N-端氨基酸序列与一些已报道的疫霉激发子高度同源，但其分子量与已报道的疫霉激发子有明显差异，有可能是一种新的疫霉激发子。
2.真菌核糖体RNA编码基因的ITS(internaltranscribedspacer)序列在种内保守性强，但在种间变异丰富，被广泛用于亲缘关系较近的分类群的系统发育研究。本实验利用rDNA-ITS序列对所用疫霉进行分子鉴定，序列同源性比对结果显示其rDNA-ITS序列与烟草疫霉的同源性高达99％以上，据此推测所用疫霉可能属于烟草疫霉。
3.以已知的Phytophthoranicotiana激发素编码基因序列设计引物，以本文所用疫霉的RNA为模板，通过RT-PCR获得了激发素编码基因，同时获得了一个第63和223碱基发生了突变的序列，此突变体的第63碱基G突变为A，但编码的第21位氨基酸未变，仍是丝氨酸；然而第223碱基由A突变成G则导致第75位氨基酸由苏氨酸变成了丙氨酸。第75位氨基酸在激发素诱导烟草过敏反应中的作用还未见报道。将此激发素基因及其突变体分别转入pGEX-4T-1原核表达载体，转化大肠杆菌，经IPTG诱导都能产生特异产物，表达产物的分子量均为36kD，恰好是激发素与GST分子量之和，表明两种表达产物是融合蛋白。这两种融合蛋白在低浓度下接种烟草叶片和处理烟草悬浮细胞，均能诱导烟草细胞死亡，处理悬浮细胞12hr后细胞死亡率均达到31％以上，处理
3.期刊论文 纪春艳.李云锋.王振中.JI Chun-yan.LI Yun-feng.WANG Zhen-zhong 稻瘟菌糖蛋白激发子CSBⅠ纯化过程的优化 -华中农业大学学报2007,26(1)
利用蛋白纯化系统AKTA Purifier 100对来源于稻瘟菌(Magnaporthe grisea)ZC13菌株97-151a菌丝细胞壁的糖蛋白激发子CSBⅠ进行纯化过程的优化.离子交换层析条件的选择结果表明;弱阴离子柱DE-AE-Sepharose FF和Tris-HCl缓冲体系的洗脱效果较好.新的步骤是:选用YM30膜超滤,省略ConA-Sepharose 4B亲和层析,粗激发子过凝胶柱Sephacryl S-100,阴离子柱DEAE-Sepharose FF.获得的活性峰D3,即为纯化的CSBⅠ.随着激发子的逐步纯化,其诱导不同水稻品系叶片中的POD比活相应显著升高(P＜0.01),CSBⅠ的诱导活性最高.该纯化方法简便,重现性稳定.提高了纯化效率.
4.学位论文 李明勇 极细链格孢菌激活蛋白PeaT1结构域分析与功能研究 2008
PeaT1是一种从极细链格孢菌中分离纯化的激活蛋白，具有促进植物生长、提高植物抗性的作用。为了阐明PeaT1多效机制是否取决于分子内部可能存在的功能域，本文分析了PeaT1的结构域，构建了PeaT1及其三个缺失突变体表达载体，分别诱导表达目的蛋白，以期分析PeaT1结构域对其生物学效应和蛋白特性的影响。主要研究结果如下：
1.peaT1及其缺失突变体表达载体的构建
通过提取极细链格孢菌的总RNA，反转录成cDNA，进而扩增获得了peaT1基因。利用生物信息学对PeaT1蛋白进行了初步分析，得知其有两个结构域：NAC(49-108位AA)和UBA/TS-N(162-206位AA)。用PCR方法扩增了3个缺失基因片段：peaT1-△CD99、peaT1-△ND49和peaT1-△ND108，将这三个片段分别与pET-28a连接构建了三个缺失突变体的融合表达载体。
2.PeaT1及其三个缺失突变体蛋白的表达和纯化
将peaT1和三个缺失基因片段的表达载体转入E.coliBL21(DE3)细胞，经IPTG诱导进行表达，获得了PeaT1及其缺失突变体蛋白。用蛋白纯化系统(AKTAExplorer10.0)对表达蛋白进行His·Tag亲和层析和脱盐处理，通过生物质谱技术获得了PeaT1的标准分子量为26.319kD，与理论蛋白的分子量26.259kD相符。
3.PeaT1及其突变体蛋白的功能比较与分析
三个缺失突变体与PeaT1蛋白一样，对小麦生长和抗病性都有显著的促进作用，而各表达蛋白之间的生物活性没有显著差异。结合生物信息学分析和前人研究结果推测：PeaT1蛋白NAC保守区域的作用机理，可能是其充当分子伴侣的作用，促进蛋白的正确折叠，以及其通过OB结合域的方式与TBP等转录因子结合，通过转录共激发子的作用促进下游某些基因的转录来促进植物生长，提高抗性；UBA/TS-N保守区域，与翻译延伸因子EF1B(EF-Ts)相似，可能更多的是担当一种翻译共激发子来诱导植株生长和增强植物抗逆。由此推测，PeaT1的2个结构域可能具有独立或类似的生物功能。
4.稳定同位素标记技术研究
PeaT1及其突变体蛋白诱导日本晴蛋白的差异表达分别用15N和14N培养基培养日本晴幼苗，在相同的生长环境下，用PeaT1及其突变体蛋白处理15N标记的水稻(14N标记水稻作为对照)。通过质谱测定获得了近百种上调表达的蛋白，确定了PeaT1和3个缺失基因片段编码的蛋白均能引起水稻日本晴蛋白的差异表达。通过对33种差异蛋白的功能分析，得知它们与植物叶绿体光系统Ⅰ、光系统Ⅱ和翻译起始因子相关，为激活蛋白作用机理的研究提供了理论基础。
5.PeaT1及其三个突变体蛋白的热稳定性分析
对表达的PeaT1和三个突变体蛋白的耐热性进行了分析，结果显示它们都具有很好的热稳定性。通过氨基酸组成特性、三级结构的作用力分析了蛋白的耐热机制。分析显示，PeaT1及其突变体蛋白的氨基酸组成具有如下共同特征：含有较多的带电氨基酸形成盐桥；含有较多疏水氨基酸形成强大的疏水作用力；含有较多的Ala、Glu使蛋白更容易形成α－螺旋。含有极少的Gin、Asn、Trp和Cys等，避免它们分别因为脱氨、氧化和二硫键断裂等而致使蛋白不稳定。
通过热稳定性分析结果，结合PeaT1蛋白的二级结构预测，推测NAC和UBA/TS－N两个结构域在空间是以相对独立而非聚集的形式存在。
5.期刊论文 刘权.李广悦.曾洪梅.杨秀芬.邱德文.Liu Quan.Li Guangyue.Zeng Hongmei.Yang Xiufen.Qiu Dewen 蛋白激发子PeaT1的高密度发酵及生理功能检测 -生物技术通报2009,
PeaT1是从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中提取出的一种植物蛋白激发子,具有促进植物生长,增强作物抗逆性的功能.由于该蛋白具有无残留、无毒副作用的优点,因此具有发展为生物农药的应用前景.在100 L发酵罐中利用分批补料技术对PeaT1工程菌进行高密度发酵,通过AKTA蛋白纯化仪对发酵产物进行了亲和纯化,并检测了纯化所得蛋白对水稻在15℃低温下生长的影响.发酵最终菌体密度达80 g/L,每升菌液纯化得到蛋白90 mg,纯化所得蛋白能够促进水稻低温下的生长,具有激发子活性.
6.学位论文 任秀艳 Harpins蛋白诱导植物生长和防卫的信号传导交叉调控及植物互作因子的研究 2007
Harpins是由革兰氏阴性植物病原细菌产生的一类蛋白类激发子,外源施用后,可以诱导多种植物抗病、抗虫、抗旱、促进植物生长.这些效应在不同Harpins处理的植物上都有所发现,它们是来自于Eriwinia amylovora的HrpNEa、Pseudomonas syringae pv.syringae的HrpZPss、P.syringae
pv.phaseolicola的HrpZpsph和Xanthomonas oryzae的HpaG。但是,对于Harpins如何行使自身的多重功能,目前还不清楚。本研究着重对以下几个方面进行了研究。
1.脱落酸和乙烯信号互作对HrpNEa诱导拟南芥根生长的调控作用
HrpNEa是由引起蔷薇科植物火疫病的病原细菌Erwinia amylovora产生的一种Harpin蛋白。HrpNEa处理植物可以激发乙烯和脱落酸分别诱导植物生长和抗旱。本文报道了脱落酸和乙烯两种激素同时应用时调节HrpNEa在拟南芥根生长中的促进作用。我们首先研究了野生型拟南芥Col-0和Ler-0从种子萌发结束到胚根伸出后,HrpNEa对根生长的作用,结果发现,与水和EVP处理相比,HrpNEa处理后明显促进了根的初期生长。在处理12 h和24 h后,HrpNEa的作用更明显。EVP同水处理一样不影响根的生长。用HrpNEa溶液浸泡处理野生型拟南芥种子在促进脱落酸和乙烯水平升高的同时促进根的生长。这些反应通过抑制剂AgNO3或1-MCP抑制野生型种子对乙烯的感知及NDGA和AOA抑制野生型种子对ABA和乙烯合成而受到限制。HrpNEa处理拟南芥突变体etr1-1,ein5-1和ABA不敏感突变体abi2-1后,对根生长始终都没有影响。我们的结果建立了一个在HrpNEa的作用下,脱落酸和乙烯信号和促进根系生长之间的机械联系。然而,当在叶片上施用HrpNEa时,在促进植物生长过程中,乙烯信号是在没有脱落酸信号的情况下起作用的,这表明,HrpNEa在植物叶片和根中的信号机制是不同的。
2.HpaGXoo转基因表达诱导植物生长和抗病性
根据前人的报道,外源施用harpins时,可以启动SAR通路包括SA积累、EDSI和NDR1的调控、PR基因的表达及NPR1对PR基因表达的调控,其中HCD与抗病性同步发生、但没有必然的因果关系。HpaCXoo是水稻白叶枯病菌X.oryzae pv.oryzae的基因hpaGXoo编码的一种harpin蛋白,同其它harpins蛋白一样可以在非寄主植物上诱导产生过敏反应以及其它多种效应。我们将编码HpaGXoo的基因hpaGXoo与花椰菜花叶病毒35S启动子的融合基因单元通过真空花絮渗透法转入拟南芥,获得表达HpaGXoo的拟南芥(HpaGXoo-expressing Arabidopsis,HATA1)转基因系。对转基因系进行了以下分子验证：通过PCR方法,确定了hpaGXoo基因在拟南芥基因组中的稳定整合；用RT-PCR方法证明了hpaGXoo基因在拟南芥中可以转录；从转基因拟南芥中提取的HpaGXoo具有在烟草上诱导HR的能力；同时根据SDS-PAGE电泳,转基因表达的HpaGXoo大小没有改变(15.6 kD)。这些结果表明,hpaGXoo基因在拟南芥体内可以正常翻译为有活性的、完整的HpaGXoo分子。另外,我们选择了具有一定代表性的细菌菌株P.syringae pv.tomato DC3000,对转基因拟南芥的不同株系进行抗病性实验,结果发现不同的转基因株系都获得了对该细菌的抗性,但抗性水平有所差别。同时我们对抗病防卫反应基因NPR1、PR-1和RP36的表达进行了测定,发现在转基因株系中,防卫反应相关基因都有一定的表达。但是,所有的转基因株系都没有HCD的发生,而外源喷施野生型拟南芥发生了明显的Micro-HR。根据这些结果,我们认为HpaGXoo在拟南芥中转基因表达可以诱导抗病防卫基因的表达,诱导对细菌的抗病性,但不能诱发HCD。另外,是否带有信号肽对hpaGXoo基因在植物体内表达后所诱导的促生长和抗病没有影响。
3.HpaGXooc及其功能片段对田间水稻产量的影响
对水稻细菌性条斑病菌(X.oryzae pv.oryzicola)的HpaGXooc进行改造,产生了9个不同的功能片段,其中HpaG10-42促进水稻生长、诱导水稻抗病性的效应最强。本研究在3个地区对9个水稻品种进行了田间小区实验,发现HpaG10-42蛋白提高水稻产量的效应显著地优于HpaGXooc全长蛋白。根据水稻生长期确定处理时间,测定了两种蛋白18种浓度组合的田间效应。分别在苗期,返青后期,分蘖期和始穗期喷施不同组合的蛋白溶液,调查两种类型水稻产量。正交分析表明,功能片段HpaG10-42的6μg/ml的浓度组合的效果最好,但是HpaG10-42在最小剂量的施用效果仍显著高于HpaGXooc最高剂量的施用效果。
果不大,但都比全长蛋白的效果好。HpaG10-42促进水稻产量增加效果好于常规农事操作和HpaGXooc处理。而HpaG10-42对9个不同水稻品种产量的影响存在很大差别,而和品种类型无关。本研究结果为有效应用病原代谢物的有益功能片段来改良大田粮食作物,提供了范例。
4.HpaGXoo蛋白表达及抗体制备
HpaGXoo在植物上可以诱导产生多种效应,但是对于该蛋白在植物上是如何起作用,在什么部位起作用,目前还不清楚。已有人报道了harpins在植物细胞中的作用部位,但对不同harpins的研究结果不尽相同。为了下一步研究HpaGXoo在植物中的作用部位,构建了可用于HpaGXoo蛋白纯化的高效表达载体,并制备了抗血清。利用PCR方法从水稻白叶枯病菌中扩增得到 hpaGXoo基因,连接pET30a(+)载体,获得了重组质粒pET30a(+)：:hpaGXoo,该载体上保留了蛋白质纯化所需的His tag编码序列。转化宿主菌BL21(DE3)产生表达菌株BLHR4。表达菌株经IPTG诱导培养,进行SDS-PAGE电泳,产生分子量为21.6 KD大小的组氨酸标记的融合蛋白条带。利用HisTrap HP Kit试剂盒对HpaGXoo蛋白进行了纯化。SDS-PAGE结果表明,体外表达融合组氨酸的HpaGXoo经过Ni柱纯化同样得到21.6 KD大小的单一条带。以牛血清蛋白(BSA)为标准,经凝胶成像系统BioImage软件测定,蛋白提取液中目的蛋白的浓度约为0.5-1.0mg/ml,每升菌液可提纯蛋白约2-4 mg。该纯化蛋白在烟草上引起典型的过敏性反应。我们将浓度为1 mg/ml纯化的蛋白新西兰家兔进行免疫,获得了HpaGXoo蛋白的多克隆抗体,间接ELISA方法测定抗血清的效价,结果效价达到1:16,000以上,能够满足以后的实验需要.同时利用Western blot对蛋白与抗体之间的特异性结合进行了验证,结果表明,不论是粗蛋白还是纯化蛋白在相应的位置上都有很强的杂交信号,而空载体提取物在相应的位置没有任何信号。为了验证转基因植物中表达的HpaGXoo蛋白与抗血清之间是否特异性结合,我们提取了植物中表达的HpaGXoo蛋白,并对其进行了杂交分析,结果表明,转基因植物中表达的HpaGXoo蛋白和原核表达的一样可以和抗血清特异性识别并产生较强的杂交信号,由于该蛋白原核表达融合了His-tag,故比植物中表达的蛋白条带大,因此杂交信号不在一条直线上。
5.HpaGXoo蛋白互作因子的筛选
本研究使用酵母双杂交系统,以HpaGXoo为诱饵,对拟南芥cDNA文库进行筛选。根据营养缺陷型和β-半乳糖苷酶活性初步筛选到6个阳性克隆,测序并在Genbank中进行序列比对,结果表明它们分别编码拟南芥中的核黄素合酶(Riboflavin synthase,RS)、液泡膜嵌入蛋白(Tonoplast intrinsic protein2,TIP2)、成束类阿拉伯半乳聚糖蛋白(Fasciculin-like arabinogalactan-protein,FLA8)、质膜嵌入蛋白(Plasma membraneintrinsic
protein,PIP1)、核转运因子(Nuclear transport factor 2,NTF2)和碳酸酐酶(Carbonic anhydrase 2,CA2)蛋白,而且序列同源性达到100％。总结：本研究结果表明,harpins诱导植物生长和抗病的过程中,乙烯和脱落酸信号传导通路参与了这些反应的调控。植物与HpaGXoo互作的因子可能通过不同的机制在这些信号传导过程中起作用。对这些问题的研究,有助于深入了解harpins诱导植物多种反应的机制。
本研究的创新点：(1)解析ABA和乙烯信号的互作对HrpNEa诱导拟南芥根生长的调控作用；(2)构建了带有His-tag的HpaGXoo表达载体并纯化出有活性的蛋白质；(3)筛选到了与HpaGXoo互作的植物因子,对其功能进行初步预测。不足之处：由于时间关系,没能对HpaGXoo在植物上的作用部位及筛选出的互作因子的功能做进一步研究。
引证文献(13条)
1.刘权.李广悦.曾洪梅.杨秀芬.邱德文 蛋白激发子PeaT1的高密度发酵及生理功能检测[期刊论文]-生物技术通报2009(8)
2.刘权.李广悦.曾洪梅.杨秀芬.邱德文 微生物蛋白激发子PeaT1的获得及诱导水稻抗旱性的初步研究[期刊论文]-中国农业科技导报 2009(3)
3.冯飞.梁佳勇.纪春艳.曾洪梅.邱德文 蛋白激发子产生菌链格孢(Alternaria spp.)JH505菌株分子系统学研究[期刊论文]-湖北农业科学 2009(5)
4.金鑫.杨秀芬.邱德文.曾洪梅.袁京京.孙东园 提高蛋白激发子产量的培养基及发酵条件的优化[期刊论文]-微生物学杂志 2009(2)
5.冯飞.梁佳勇.纪春艳.曾红梅.邱德文 链格孢菌(Alternaria tenuissima)cDNA酵母表达文库的构建[期刊论文]-中国农学通报 2009(12)
6.冯飞.谢振文.曾慕衡 一种蛋白激发子产生菌细极链格孢菌的生物学特性研究[期刊论文]-安徽农业科学 2009(9)
7.刘延锋.曾洪梅.玉山江.杨秀芬.毛建军.邱德文 极细链格孢菌peaT1基因在毕赤酵母中的表达与功能分析[期刊论文]-生物工程学报 2009(3)
8.李杰.邱德文.杨秀芬.曾洪梅.袁京京.朱建兰 极细链格孢菌66 kDa激活蛋白的纯化及诱导烟草抗TMV的功能[期刊论文]-河北农业大学学报 2008(6)
9.刘延锋.邱德文.曾洪梅.杨秀芬 极细链格孢菌蛋白激发子Peat1在酵母双杂交系统中转录激活活性检测[期刊论文]-安徽农业科学 2008(20)
10.李明勇.邱德文.曾洪梅.杨秀芬 Peat1蛋白及其3个缺失突变体的表达与热稳定性分析[期刊论文]-安徽农业科学 2008(20)
11.张云华.邱德文.张立军.杨秀芬.曾洪梅.袁京京 灰葡萄孢菌激活蛋白PEBC2的生物功能[期刊论文]-植物保护学报 2008(2)
12.刘延锋.邱德文.曾洪梅.杨秀芬 极细链格孢菌蛋白激发子PeaT1在酵母双杂交系统中转录激活活性的检测[期刊论文]-农业科学与技术(英文版) 2008(1)
术(英文版) 2008(1)