实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定
【目的】
验证核酸的三大组成成分。熟悉组织中核酸的提取与鉴定的基本操作方法。 【原理】
动物组织细胞中的核糖核酸（RNA ）与脱氧核糖核酸（DNA ）大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。被三氯醋酸沉淀的核蛋白，先用95%的乙醇加热去除附着在沉淀上的脂类杂质，再用1.7mol/L NaCl溶液提取出核酸的钠盐，然后加入乙醇即可使核酸钠盐沉淀析出。
RNA 与DNA 均可被硫酸水解产生磷酸、含氮碱基(嘌呤与嘧啶) 及戊糖（RNA 为核糖，DNA 为脱氧核糖）。此三类物质分别可按照下述原理鉴定。
1. 磷酸 磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸，磷钼酸中的钼在有还原剂（硫酸亚铁）存在时可被还原成蓝色的钼蓝。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。
2. 嘌呤碱 根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。 3. 戊糖 根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛，后者能与3，5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。
CH 3
CHO
H OH H OH H OH 2OH
核糖
CH 3
-H 2O
O
CHO
O
O
3，5-二羟甲苯
H 3C
糠醛
绿色化合物
OH
脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。
CHO H H H OH H OH 2OH
脱氧核糖
-H 2O
CHO H H H H O 2OH
ω-羟基-γ-酮基戊醛
二苯胺
蓝色化合物
【器材】
剪刀、镊子、玻棒、滤纸、试管、试管架、蒸发皿、匀浆器、离心机、沸水浴箱。 【试剂 1. 生理盐水。
2. 0.12 mol/L三氯醋酸溶液。 3. 95% 乙醇。 4. 10% NaCl溶液
NaCl 10g溶于蒸馏水中，加至100ml 。 5. 0.92 mol/L H2SO 4
取浓H 2SO 4（比重1.84，含量98%）5ml 加入蒸馏水中，加水至100ml 。 6. 钼酸铵试剂
钼酸铵3g ，溶于70ml 蒸馏水中，逐渐加入浓 H2SO 4 14ml ，冷却后再加至100ml ，混匀备用。
7. 硫酸亚铁试剂
硫酸亚铁10.6g ，硫脲5g ，加蒸馏水溶解并加水至500ml ，冰箱内保存备用。 8. 浓氨水。
9. 0.29mol/L AgNO3
取AgNO 3 5g 加蒸馏水溶解并稀释至100ml ，于棕色瓶避光保存。 10. 3,5二羟甲苯试剂
取浓盐酸100ml ，加入FeCl 3·6H 2O 100mg 及二羟甲苯100mg 混匀溶解后，置于棕色瓶中。临用前配制，冰箱保存。（市售3,5二羟甲苯不能直接使用，必须用苯重结晶1～2次，并用活性碳脱色后方可使用）。
11. 二苯胺试剂
取1g 纯的二苯胺溶于100ml 冰乙酸中，加入2.75ml 浓硫酸，盛于棕色瓶中，临用前配制。
【操作】
1. 核酸的提取与分离：
（1）将新鲜猪肝剪碎置于匀浆器中，加入等量的生理盐水，制成匀浆。
（2）将5ml 肝匀浆置于离心管内，立即加入0.12mol/L三氯醋酸5ml ，用玻棒搅匀，静置8分钟后离心。
（3）倾去上清液，加95% 乙醇5ml ，用玻棒搅匀，再用带有长玻管的木塞塞紧离心管口，在水浴中煮沸2分钟，冷却后离心。
（4）将离心管倒置于滤纸上，使滤纸吸干乙醇。沉淀中再加入10% NaCl溶液4ml ，置于沸水浴中加热8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出冷却后再离心。
（5）将上清液倾入另一离心管内，再离心一次，去除可能存在的微量残渣。将上清液倒入烧杯内。
（6）取等量的在水浴中冷却过的95% 乙醇逐滴加入小烧杯内，即可见白色沉淀逐渐析出。静置10分钟后，将小烧杯中沉淀物移入离心管内离心，弃去上清液即得到核酸钠的白色沉淀。
2. 核酸的水解
在含有核酸钠的离心管内加入0.92mol/L的H 2SO 4 4ml ，用玻棒搅匀，再用带有长玻管的软木塞塞紧管口，在沸水浴中加热15分钟。
3. 核酸组成成分的鉴定
（1）磷酸的鉴定：按下表操作。
表3-3 核酸中磷的鉴定
加入物（滴） 核酸水解液 0.92mol/L H2SO 4溶液
钼酸铵试剂 硫酸亚铁试剂
测定管 5滴 － 3滴 10滴
（2）嘌呤碱的鉴定：按下表操作。
表3-4 嘌呤碱的鉴定
加入物（滴） 核酸水解液 0.92mol/L H2SO 4溶液
浓氨水 0.29mol/L AgNO3
测定管 10滴 －
数滴（使呈碱性）
5滴
对照管 － 10滴 数滴（使呈碱性）
5滴 对照管 － 5滴 3滴 10滴
观察加入AgNO 3后有何变化。静置15分钟后，再比较两管的沉淀. （3）核糖的鉴定：按下表操作。
表3-5 核糖的鉴定
加入物（滴） 核酸水解液 0.92mol/L H2SO 4溶液 3，5-二羟甲基试剂
测定管 4滴 － 6滴
对照管 － 4滴 6滴
混匀，放沸水浴中加热10分钟，观察两管颜色有何不同。
（4）脱氧核糖的鉴定：按下表操作。
表3-6 脱氧核糖的鉴定
加入物（滴） 核酸水解液 0.92mol/L H2SO 4溶液
二苯胺试剂
测定管 10滴 － 15滴
对照管 － 10滴 15滴
混匀，放沸水浴中加热10分钟，观察两管有何不同。 【结果及分析】
观察各测定管颜色及沉淀的生成情况，并与对照管相比有何不同，并解释其原理。 【思考题】
1. RNA 与DNA 的组成成分有何异同？ 2. DNA 二级结构有何特点？
实验四 肝组织中核酸的提取和鉴定
【目的】
验证核酸的三大组成成分。熟悉组织中核酸的提取与鉴定的基本操作方法。 【原理】
动物组织细胞中的核糖核酸（RNA ）与脱氧核糖核酸（DNA ）大部分与蛋白质结合而形成核蛋白。被三氯醋酸沉淀的核蛋白，先用95%的乙醇加热去除附着在沉淀上的脂类杂质，再用1.7mol/L NaCl溶液提取出核酸的钠盐，然后加入乙醇即可使核酸钠盐沉淀析出。
RNA 与DNA 均可被硫酸水解产生磷酸、含氮碱基(嘌呤与嘧啶) 及戊糖（RNA 为核糖，DNA 为脱氧核糖）。此三类物质分别可按照下述原理鉴定。
1. 磷酸 磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸，磷钼酸中的钼在有还原剂（硫酸亚铁）存在时可被还原成蓝色的钼蓝。根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在。
2. 嘌呤碱 根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定。 3. 戊糖 根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛，后者能与3，5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定。
CH 3
CHO
H OH H OH H OH 2OH
核糖
CH 3
-H 2O
O
CHO
O
O
3，5-二羟甲苯
H 3C
糠醛
绿色化合物
OH
脱氧核糖在浓酸中生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，它和二苯胺作用生成蓝色化合物。
CHO H H H OH H OH 2OH
脱氧核糖
-H 2O
CHO H H H H O 2OH
ω-羟基-γ-酮基戊醛
二苯胺
蓝色化合物
【器材】
剪刀、镊子、玻棒、滤纸、试管、试管架、蒸发皿、匀浆器、离心机、沸水浴箱。 【试剂 1. 生理盐水。
2. 0.12 mol/L三氯醋酸溶液。 3. 95% 乙醇。 4. 10% NaCl溶液
NaCl 10g溶于蒸馏水中，加至100ml 。 5. 0.92 mol/L H2SO 4
取浓H 2SO 4（比重1.84，含量98%）5ml 加入蒸馏水中，加水至100ml 。 6. 钼酸铵试剂
钼酸铵3g ，溶于70ml 蒸馏水中，逐渐加入浓 H2SO 4 14ml ，冷却后再加至100ml ，混匀备用。
7. 硫酸亚铁试剂
硫酸亚铁10.6g ，硫脲5g ，加蒸馏水溶解并加水至500ml ，冰箱内保存备用。 8. 浓氨水。
9. 0.29mol/L AgNO3
取AgNO 3 5g 加蒸馏水溶解并稀释至100ml ，于棕色瓶避光保存。 10. 3,5二羟甲苯试剂
取浓盐酸100ml ，加入FeCl 3·6H 2O 100mg 及二羟甲苯100mg 混匀溶解后，置于棕色瓶中。临用前配制，冰箱保存。（市售3,5二羟甲苯不能直接使用，必须用苯重结晶1～2次，并用活性碳脱色后方可使用）。
11. 二苯胺试剂
取1g 纯的二苯胺溶于100ml 冰乙酸中，加入2.75ml 浓硫酸，盛于棕色瓶中，临用前配制。
【操作】
1. 核酸的提取与分离：
（1）将新鲜猪肝剪碎置于匀浆器中，加入等量的生理盐水，制成匀浆。
（2）将5ml 肝匀浆置于离心管内，立即加入0.12mol/L三氯醋酸5ml ，用玻棒搅匀，静置8分钟后离心。
（3）倾去上清液，加95% 乙醇5ml ，用玻棒搅匀，再用带有长玻管的木塞塞紧离心管口，在水浴中煮沸2分钟，冷却后离心。
（4）将离心管倒置于滤纸上，使滤纸吸干乙醇。沉淀中再加入10% NaCl溶液4ml ，置于沸水浴中加热8分钟，并用玻棒不断搅拌，取出冷却后再离心。
（5）将上清液倾入另一离心管内，再离心一次，去除可能存在的微量残渣。将上清液倒入烧杯内。
（6）取等量的在水浴中冷却过的95% 乙醇逐滴加入小烧杯内，即可见白色沉淀逐渐析出。静置10分钟后，将小烧杯中沉淀物移入离心管内离心，弃去上清液即得到核酸钠的白色沉淀。
2. 核酸的水解
在含有核酸钠的离心管内加入0.92mol/L的H 2SO 4 4ml ，用玻棒搅匀，再用带有长玻管的软木塞塞紧管口，在沸水浴中加热15分钟。
3. 核酸组成成分的鉴定
（1）磷酸的鉴定：按下表操作。
表3-3 核酸中磷的鉴定
加入物（滴） 核酸水解液 0.92mol/L H2SO 4溶液
钼酸铵试剂 硫酸亚铁试剂
测定管 5滴 － 3滴 10滴
（2）嘌呤碱的鉴定：按下表操作。
表3-4 嘌呤碱的鉴定
加入物（滴） 核酸水解液 0.92mol/L H2SO 4溶液
浓氨水 0.29mol/L AgNO3
测定管 10滴 －
数滴（使呈碱性）
5滴
对照管 － 10滴 数滴（使呈碱性）
5滴 对照管 － 5滴 3滴 10滴
观察加入AgNO 3后有何变化。静置15分钟后，再比较两管的沉淀. （3）核糖的鉴定：按下表操作。
表3-5 核糖的鉴定
加入物（滴） 核酸水解液 0.92mol/L H2SO 4溶液 3，5-二羟甲基试剂
测定管 4滴 － 6滴
对照管 － 4滴 6滴
混匀，放沸水浴中加热10分钟，观察两管颜色有何不同。
（4）脱氧核糖的鉴定：按下表操作。
表3-6 脱氧核糖的鉴定
加入物（滴） 核酸水解液 0.92mol/L H2SO 4溶液
二苯胺试剂
测定管 10滴 － 15滴
对照管 － 10滴 15滴
混匀，放沸水浴中加热10分钟，观察两管有何不同。 【结果及分析】
观察各测定管颜色及沉淀的生成情况，并与对照管相比有何不同，并解释其原理。 【思考题】
1. RNA 与DNA 的组成成分有何异同？ 2. DNA 二级结构有何特点？