实验八、紫外吸收法检测DNA 的浓度与纯度
一、实验目的
学会利用紫外分光光度计测定样品的吸光度，从而测出DNA 的浓度与纯度。
二、实验原理
DNA 的吸收峰在260nm ，蛋白质的吸收峰在280nm 。
1 μg/ml标准DNA 样品A 260=0.02，因此，A 260=1时，双链DNA 含
量为50μg/ml；单链DNA 与RNA 含量为40μg/ml；寡聚核苷酸的含量为30μg/ml。
一般来说，纯净的DNA 其A 260/A280的比值约为1.8，大于1.8表明
样品中RNA 污染严重，小于1.6说明有蛋白质或苯酚污染；纯净的RNA A260/A280的比值约为2.0，在样品中若含有蛋白质，会使A 260/A280的比值下降。
三、实验材料
紫外分光光度计、比色皿、移液枪、实验七中获得的质粒DNA
四、实验步骤
1、选取合适的按键。
待测定样品为dsDNA （如PCR 产物），按下键“7/dsDNA”。
待测定样品为ssDNA （如反转录合成的第一链cDNA 产物），按下键“8/ssDNA”。
待测定样品为RNA ，按下键“9/RNA”。
待测定样品为Oligo （如PCR 引物），按下键“6/Oligo”。
2、将空白对照置入样品孔。
注意：空白对照是空白液，并非所有情况都是水。例如，用Tris 溶液溶解DNA 样品，则要用Tris 液做空白对照。
3、按下 “Blank ”键。仪器记录空白对照，设置为0.000A 。
4、将样品置入样品孔，按下“Sample ”键，仪器显示样品的吸光度和浓度值，以及其他相关参考比值。
五、实验结果与分析
A 260/A280=1.118，DNA 浓度86.45。
A 260/A280小于1.6，说明蛋白质或苯酚污染严重，这可能是在制备质粒
DNA 时加入的酚/氯仿不足，或加入酚/氯仿后没有混合均匀等原因。 DNA 浓度偏低，可能是实验的多次弃上清过程中存在损耗。
六、思考题
问：利用紫外-可见分光光度计测得的结果比实际浓度偏高还是偏低？为什么？
答：核酸在波长 260 nm处有最高吸收峰。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能区分DNA 和RNA ，只能用来鉴定核酸的纯度和含量，故结果偏高。
实验八、紫外吸收法检测DNA 的浓度与纯度
一、实验目的
学会利用紫外分光光度计测定样品的吸光度，从而测出DNA 的浓度与纯度。
二、实验原理
DNA 的吸收峰在260nm ，蛋白质的吸收峰在280nm 。
1 μg/ml标准DNA 样品A 260=0.02，因此，A 260=1时，双链DNA 含
量为50μg/ml；单链DNA 与RNA 含量为40μg/ml；寡聚核苷酸的含量为30μg/ml。
一般来说，纯净的DNA 其A 260/A280的比值约为1.8，大于1.8表明
样品中RNA 污染严重，小于1.6说明有蛋白质或苯酚污染；纯净的RNA A260/A280的比值约为2.0，在样品中若含有蛋白质，会使A 260/A280的比值下降。
三、实验材料
紫外分光光度计、比色皿、移液枪、实验七中获得的质粒DNA
四、实验步骤
1、选取合适的按键。
待测定样品为dsDNA （如PCR 产物），按下键“7/dsDNA”。
待测定样品为ssDNA （如反转录合成的第一链cDNA 产物），按下键“8/ssDNA”。
待测定样品为RNA ，按下键“9/RNA”。
待测定样品为Oligo （如PCR 引物），按下键“6/Oligo”。
2、将空白对照置入样品孔。
注意：空白对照是空白液，并非所有情况都是水。例如，用Tris 溶液溶解DNA 样品，则要用Tris 液做空白对照。
3、按下 “Blank ”键。仪器记录空白对照，设置为0.000A 。
4、将样品置入样品孔，按下“Sample ”键，仪器显示样品的吸光度和浓度值，以及其他相关参考比值。
五、实验结果与分析
A 260/A280=1.118，DNA 浓度86.45。
A 260/A280小于1.6，说明蛋白质或苯酚污染严重，这可能是在制备质粒
DNA 时加入的酚/氯仿不足，或加入酚/氯仿后没有混合均匀等原因。 DNA 浓度偏低，可能是实验的多次弃上清过程中存在损耗。
六、思考题
问：利用紫外-可见分光光度计测得的结果比实际浓度偏高还是偏低？为什么？
答：核酸在波长 260 nm处有最高吸收峰。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能区分DNA 和RNA ，只能用来鉴定核酸的纯度和含量，故结果偏高。