1 超临界流体色谱法
色谱是用于样品组分分离的一种方法，组分在两相间进行分配，一相为固定相，另一相为流动相。固定相可以是固体或涂于固体上的液体，而流动相可以是气体、液体或超临界流体。超临界流体色谱(Supercritical fluid chromatography) 就是以超临界流体做流动相依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的色谱过程。它是集气相色谱法和液相色谱法的优势而在20世纪70年代发展起来的一种色谱分离技术。超临界流体色谱不仅能够分析气相色谱不宜分析的高沸点、低挥发性的试样组分，而且具有比高效液相色谱法更快的分析速率和更高的柱效，因此得到迅速发展。
1.1 概述
1.1.1 超临界流体及其特性
自从1869年Andrews首先发现临界现象以来，各种研究工作陆续展开，其包括1879年Hannay和Hogarth测量了固体在超临界流体中的溶解度，1937年Michels等人准确测量了二氧化碳临界点的状态等等。对于某些纯净物质而言，根据温度和压力的不同，呈现出液体、气体、固体等状态变化，即具有三相点和临界点，纯物质的相图如图 1-1所示。在温度高于某一数值时，任何大的压力均不能使该纯物质由气相转化为液相，此时的温度即被称之为临界温度Tc；而在临界温度下，气体能被液化的最低压力称为临界压力Pc。在临界点附近，会出现流体的密度、粘度、溶解度、热容量、介电常数等所有流体的物性发生急剧变化的现象。当物质所处的温度高于临界温度，压力大于临界压力时，该物质处于超临界状态。温度及压力均处于临界点以上的液体叫超临界流体(Supercritical fluid，SF)。
图 1-1 纯物质的相图
超临界流体由于液体与气体分界消失，它的流体性质兼具液体性质与气体性质，见表 1-1所示。从表 1-1
中的数据可知，超临界流体的扩散性能和粘度接近于气体，因此溶质
的传质阻力较小，能更迅速地达到分配平衡，获得更快速、高效的分离。另一方面，密度与液体相似，这样可以保证超临界流体具有与液体比拟的溶解度，因此在较低的温度下，仍然可以分析热不稳定性和分子量大的物质，同时还能增加柱子的选择性。此外，超临界流体的扩散系数、粘度等都是密度的函数。通过改变液体的密度，就可以改变流体的性质，达到控制流体性能的目的。
表 1-1 气体、液体和超临界流体的物理性质的比较
名称 密度 ρ/g·ml-1 粘度 ŋ/g(cm·s)-1
(1-3)×10-4
(1-3)×10-4
(3-9)×10-4
(0.2-3)×10-2 扩散系数 D/cm2·s-1 0.1-0.4 0.7×10-3 0.2×10-3 (0.2-2)×10-2 气体常压（15-(0.6-2)×10-3 60℃） 0.2-0.5 超临界流体Tc,Pc- 0.4-0.9 Tc,4Pc 液体（有机溶剂，0.6-1.6 水，15-60℃）
1.1.2 超临界流体色谱法及其特点
超临界流体具有液体相似的溶解能力，溶解能力比气体大，能溶解固体物质，这种溶解性质被用于分离过程，最先用于萃取技术-超临界流体萃取法（supercritical fluid extraction, SFE）。后来，将超临界流体用作色谱的流动相，建立了超临界流体色谱法。
SFC因其超临界流体自身的一些特性，使得SFC的某些应用方法具有超过液相（LC）、气相（GC）两者的有点，有其独到之处，但它并不能取代这两类色谱，而是它们的有力补充。
1. SFC与GC的比较
a) SFC可以用比GC更低的温度，从而实现对热不稳定化合物进行有效的
分离。由于柱温降低，分离选择性改进，可以分离手性化合物。
b) 由于超临界流体的扩散系数比气体小，因此SFC的谱带展宽比GC的要
窄。
c) SFC溶剂能力强，许多非挥发性组分在SFC中溶解度较大，可分析非挥
发性的高分子、生物大分子等样品。
d) 选择性较强，SFC可选用压力程序、温度程序，并可选用不同的流动相
或者改性剂，因此操作条件的选择范围较GC更广。
2. SFC与LC的比较
a) 分析时间短，由于超临界流体粘度低，可使其流动速率比高效液相色谱
（HPLC）快得多，在最小理论塔板高度下，SFC的流动相速率是HPLC
的3-5倍左右，因此分离时间缩短。
b) 总柱效比LC高，毛细管SFC总柱效可高达百万，可分析极其复杂的混
合物，而LC的柱效要低得多。当平均线速率为0.6 cm/s时，SFC法的柱
效可为HPLC法的4倍左右。
c) SFC的检测器应用广。SFC可连结各种类型的GC、LC检测器，如氢离
子火焰（FID）、氮磷检测器（NPD）、质谱（MS）、傅里叶变换红外
光谱（FTIR）以及紫外（UV）、荧光（FLD）等检测器。
d) 流动相消耗量比LC更低，操作更安全。
通常，在SFC中由于极性和溶解度的局限，使用单一的超临界流体并不能满足分离要求，需要在超临界流体中加入改性剂。在SFC中，选择性是流动相和固定相两者的函数，在GC中溶质的保留受流动相压力及其性质的影响较小，故选择性基本上是固定相的函数，在LC中可用梯度洗脱，改变流动相的性质，从而影响溶质的保留。在SFC中流动相的极性也可采用梯度技术（加入改性剂）加以调整，达到与LC同样的梯度效果。同时，SFC中的压力程序（通过程序升压实现流体的密度改变达到改善分离的目的）相当GC中程序升温技术。
1.1.3 超临界流体色谱法的分类
超临界流体色谱根据所用的色谱柱不同可分为两种，用填充柱的称为填充柱超临界流体色谱（packed column supercritical fluid chromatography, pcSFC），用毛细管柱的称为毛细管超临界流体色谱（capillary supercritical fluid chromatography），两者各有所长并已建立了相应的方法和理论，相比较而言，毛细管SFC具有更多优点，但目前填充柱SFC应用更广泛些。超临界流体色谱中的填充柱可使用普通HPLC中的色谱柱，目前已有部分商品化专用于SFC的填充色谱柱。
根据色谱过程的用途，也可分为两种，分析型SFC和制备型SFC。分析型SFC主要用于常规的分析。制备型SFC常用超临界二氧化碳作为流动相，由于二氧化碳便宜、环保、安全的特点，而得到广泛应用。而且二氧化碳在常温下易除去，样品的后处理过程较制备型HPLC简单，因此制备型SFC应用广泛，特别是在手性制备的领域。
1.1.4 超临界流体色谱的发展
用超临界流体作色谱流动相是由Klesper等人于1962年首先提出的，他们首先报道了用二氯二氟甲烷和一氯二氟甲烷超临界流体作流动相，成功地分离卟啉衍生物，之后发展了填充柱SFC的技术，用以分离聚苯乙烯的齐聚物。随后Sie和Rijnderder等人又进一步研究了SFC的方法，研究了二氧化碳、异丙醇、正戊烷等作流动相的问题，并以此技术分析了多环芳烃、抗氧化剂、燃料和环氧树脂等样品。60年代末，由于Sie和Giddings等人的卓越工作，解释了SFC在各方面的应用潜力，并于是了SFC的前途极其光明。在这个时间，也是HPLC高速发展的时期，而SFC的发展却不如HPLC那么迅速，这主要是在使用超临界流体时遇到了一些实验方面的问题，所以发展较慢。直到80年代初，SFC才开始焕发出新的光辉，得到了日趋完善的发展。
1981-1982年惠普公司在皮茨堡会议上发布了SFC色谱仪，在此期间Berger和Gere等人进行了一系列的研究。此后这一技术得到了迅猛的发展，研究论文数急剧增加，其他科学公司也相继推出了超临界流体色谱的商品仪器。SFC在发展之初，着重于毛细管柱的使用，当时的主要研究者来自于GC领域而非HPLC领域。但是，随后SFC的发展遇到瓶颈，毛细管SFC很难满足药物中极性化合物的分析，而且该技术的一些固有的缺点，仪器条件要求比较高，未能普及应用。此后，填充柱色谱逐渐受到研究者的青睐，它使用与HPLC
类似的装置，而且在超临界流体中加入改性剂，增加了流体对化合物的溶解能力，大大增加了SFC的应用对象。近些年SFC的应用主要集中在填充柱SFC上。自SFC技术自上个世纪90年代以来每年发表在SCI上的文章数如图 1-2所示。
图 1-2 90年代以来SFC在SCI上每年发表文章统计
1.1.5 超临界流体色谱的一般流程
SFC的一般流程如所示。超临界状态流体源（二氧化碳）在进入高压泵之前预冷却，高压泵把液态流体经脉冲抑制器注入在恒温箱中的预柱，进行压力和温度的平衡，形成超临界状态流体，进入色谱柱。要保持整个系统的压力，在泄压口处装限流器或备压控制器，这也是SFC仪器与普通HPLC仪器最大的差别之处。
1.2 基本原理
SFC的流动相主要采用二氧化碳，一氧化氮和氨气等，其中主要使用二氧化碳作为超临界流体。SFC的固定相可采用固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的聚合物，现在研究比较多的是液相色谱的柱填料。
分离机理：吸附与脱附，组分在两相间的分配系数不同而被分离。
压力效应：SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），压力对分离有显著影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）。SFC流体的密度受压力影响显著，在临界压力处具有最大的压力，超过该点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对密度的影响较小。超临界流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，色谱峰的出峰时间缩短。
1.2.1 超临界流体色谱法的基本概念
SFC中的一些基本概念，如保留时间（tR）、容量因子（k）、选择性（α）、柱效（N）和分离度（R）等参数，其定义和公式同普通的LC和GC。本节简述相对变数和超临界流体的溶剂力。
相对变数（reduced variable），是指某一参数与其临界变数之比值，也叫折合变数、归一变数或简化变数，主要有相对压力（Pr）、相对体积（Vr）、相对温度（Tr）和相对密度（ρr），定义式为
PrTPV Vr Tr r TcPcVcc
式中Pc、Vc、Tc、c分别为临界压力、临界体积、临界温度和临界密度。
图 1-3 各种具有液体密度的压缩气体与液体的溶剂力比较分度表
(1 cal=4.1868 J)
超临界流体的溶剂力目前还没有一个严格定义，但可给出一个合理的分度表，Gidding认为，溶剂力主要由“状态效应”（如密度、分子间距离等）和“化学效应”（极性、酸碱性、氢键亲和力等）组成，可以用Hildbrand溶度参数（δ）表示
a V
式中，a为分子间引力，V为摩尔体积，δ为溶度参数，cal/cm3 或者 J/cm3
各种流体的溶剂力与液体比较的分度表见图 1-3所示，由图 1-3可看出，超临界流体状态二氧化碳的溶剂力与异丙醇（45.22 J/cm3）、吡啶（44.80 J/cm3）相当，即相当于极性较强的溶剂，故可溶解并分析大部分非极性、中等极性样品，一氧化氮的溶剂力（44.38 J/cm3）与二氧化碳相似，当分离需要溶剂力更强的流动相时，可选用氨气（55.27 J/cm3），对于那些不能用二氧化碳来分离的碱性胺类物质，氨是很好的流动相，n-C4和n-C5是非极性流动相，分离非极性样品时选用。
1.2.2 超临界流体色谱法的速率理论
实验发现，描叙流速对柱效影响的Van Deem特人方程和Golay方程仍适用。
1. Golay速率理论
毛细管SFC的速率理论模型与毛细管GC相同，其总塔板高度也是由分子扩散、流动相传质、固定相传质三相加和而成，经许多学者验证，Golay涂壁开管柱速率理论方程适合用于毛细管SFC，其方程为
2kd22Dm(16k11k2)r2ufuH 22u96(1k)Dm3(1k)Ds
式中，Dm为溶质在流动相中的扩散系数，cm2/s；Ds为溶质在流动相中的扩散系数，cm2/s；r为柱内径；df为固定相的液膜厚度，cm；u为流动相的线速度，cm/s；k为容量因子。
该方程式指出了操作参数对柱效的影响，当Dm、Ds、k确定后，H-u曲线就成为双曲线，Golay方程可简化为
HBCmuCsu u
式中，B/u为纵向扩散对塔板高度的贡献；Cmu为流动相传质对塔板高度的贡献；Csu为固定相传质对踏板高度的贡献。
2. 填充柱的速率方程
对填充柱SFC，目前尚未给出一个精确的塔板高度方程。一些研究沿用了普通HPLC中的范式方程，有一定的借鉴意义。方程式为
HABCu u
式中，A为色谱柱中多路径效应对塔板高度的贡献；B/u为纵向扩散对塔板高度的贡献；Cu为传质阻力对塔板高度的贡献。
Knox给出适合填充柱SFC的折合塔板高度方程，方程式为
hAv1/3BCv v
式中，h和v分别为折合塔板高度和折合线速度；A、B和C为特征常数，其特征值A=1-2，B=2，C=0.05-0.5，而h和v的值在实践中常为3和10。
1.2.3 影响踏板高度的因素
结合速率方程可知，影响踏板高度的因素主要有线速度、柱直径、液膜厚度和密度，对填充柱SFC而言还包括色谱柱的粒径和填充的均匀度。
1. 流动相线速度对塔板高度的影响
由图 1-4中曲线的最低点处的线速度即为最佳线速度uopt，对应的塔板高度为最小塔板高度Hmin。在Hmin处，色谱柱有最佳的柱效，但最佳线速度却不是很高。对于SFC，塔板高度随线速度的增加而缓慢增加，特别是在流动相密度较低时，增加更加缓慢，曲线趋于平滑。因此，在实际操作中可采用3-5倍的最佳线速度为操作线速度，从而加快了分析速度。
图 1-4 SFC H-u曲线
2. 柱径对塔板高度的影响
Lee等采用直径为0.25 μm，SE-54石英交联柱，研究了柱径对柱效的影响，如图 1-5所示，最佳线速度反比于柱径，塔板高度则与柱径成正比，降低柱径将导致塔板高度降低，有利于提高柱效。另一方面，柱径还影响压差，在毛细管SFC的实践中，限制使用长柱子的因素之一是通过柱子的压力差。压差是柱长的函数，而反比于柱径的平方。图 1-6表示了柱径和柱长与压差的关系，柱径小于50 μm显示出较大的压差，这就限制了特细色谱柱的应用。而一般常用的柱压差为3%，这表明柱内径大于50 μm时可使用较长的色谱柱而无压差大之虑。事实上，控制线速度的是阻力器，而阻力器产生了约80%的压力差。
3. 固定相液膜厚度对柱效的影响
固定相液膜厚度对塔板高度的影响如所示，对不同k值（k=1-5）组分，液膜厚度在0.25-1.0 μm范围变化，对H的影响很小，甚至可用更厚的液膜，这取决于所能允许的分离度的损失，最佳流速随液膜厚度的增加而降低，且曲线更加陡峭。在SFC中可采用比GC更厚的液膜，承受更大的样品容量，以补偿检测器灵敏度的不足。
4. 流动相密度塔板高度和最佳线速度的影响
在SFC中实际上是流动相的密度而不是压力控制着各种色谱柱参数。密度ρ对塔板高度和最佳线速度的影响如图 1-8所示。从图中发现，当操作条件一定时，随流动相ρ值增加，最佳线速度在减小，而且曲线变陡。但其H值保持不变，说明程序升密度时并不影响柱效。
图 1-5 不同柱径上的H-u曲线
图 1-6 柱径、k值对柱效的影响
图 1-7 液膜厚度对H-u曲线的影响
图 1-8 流动相密度对H-u曲线的影响
1.3 超临界流体色谱法的操作条件
超临界流体色谱法操作条件根据填充柱和毛细管柱的不同，进而选择适合的操作条件，主要有固定相和液膜厚度、流动相及其线速、压力和密度、柱温和检测室温度，还有柱径、柱长、阻力器和检测器的选择。
1.3.1 超临界流体色谱的色谱柱
不论是毛细管柱还是填充柱，SFC对固定相的要求，首先是抗溶剂冲刷，即在大量溶剂冲淡、加压和减降，体积膨胀和收缩后，稳定性好；其次是化学稳定性好，选择性高，即固定相不与组分发生化学反应，且带有一定基团，呈现出良好的选择性；再次是热稳定性好，使用温度范围较宽。同时固定相的选择也要考虑流动相的性质。
1. 填充柱
虽然在80年代初主要是发展了毛细管SFC，但是填充柱SFC也得到一定的发展。而填充柱SFC色谱柱，几乎使用了所有的反相和正相HPLC键合相填料，固定相有非极性、中等极性和极性，使用最多的是硅胶和烷基键合硅胶，正相色谱填料中的二醇基、腈基、2-乙基吡啶等键合硅胶也有不少应用。
在SFC中，流动相的密度对保留值有很大的影响，溶质的保留性能要靠流动相的压力来调节。在填充柱SFC中，由于柱压降很大，比毛细管柱要大30倍，因而在填充柱SFC色谱柱的入口处和出口处，其保留值由很大差别，也就是说在柱头由于流动相的密度大、溶解能力大，而在柱尾则溶解能力变小。但是超临界流体密度受压力的影响在临界压力处最大，超过此点以后影响就不是太大，所以在超过临界压力20%的情况下，柱压降对填充柱SFC结果的影响就不那么明显了。
在填充柱SFC中，由于色谱柱的相比（β）小、固定相和样品接触和作用的几率比较大，所以要针对所分析的样品很好地选择固定相。在用填充柱SFC分析极性和碱性样品时，常会出现不对称峰，这是由于填料的硅胶基质残余硅羟基所引起的离子作用。如果使用封尾填料制成的色谱柱就会在一定程度上解决这一问题。但是由于基团的立体效应，不可能把硅胶表面所有的硅醇基全部反应。将各种齐聚物和单体处理硅胶，并把这些齐聚物和单体聚合固定化到硅胶表面上。这样就大大改善了色谱峰的不对称现象。
在超临界流体色谱的填充柱中也有用微和亚微级填充柱的，填充1.7-10 μ的填料，内径几个毫米。还有用内径为0.25 mm的毛细管柱填充3-10 μm填料的毛细管填充柱。
2. 毛细管色谱柱
在毛细管超临界流体色谱中使用的毛细管柱，主要是细内径的毛细管柱，内径为50 um和100 um。SFC的操作温度比GC低，因此SFC可用的固定相较GC多。但由于SFC的流动相是具有溶解能力的液体，所以毛细管柱内的固定相必须进行交联，并且在老化处理中，加长老化时间，以使液膜牢固。所使用的固定相有聚二甲基硅氧烷、苯甲基聚硅氧烷、二苯甲基聚硅氧烷、含乙烯基的聚硅氧烷、正辛基、正壬基聚硅氧烷等，在手性分离中使用了连结手性基团的聚硅氧烷。
在毛细管SFC中，液膜厚度主要受样品的挥发性和检测器灵敏度限制。薄液膜毛细管柱可达快速高效，适合分析非挥发性的样品。但样品容量低、检测器灵敏度要求高。厚液膜毛细管柱，样品容量大，柱效损失小，可接各种检测器，对于一般样品的分析，柱效和柱容量能得到兼顾，应用面广。
1.3.2 超临界流体色谱的流动相和改性剂
1. 超临界流体的溶解性能
超临界流体色谱的流动相特点，主要是它在不同压力下有不同的溶解各种样品的能力。 溶剂的溶解能力常用溶解度常数δ来描述。溶解度常数δ的定义为
E v
式中，E是分子的摩尔内聚能；v 是分子的摩尔体积。
而δ和化合物临界参数的关系为
1.Pcρc ρ1
式中Pc是临界压力；ρc是和Pc对应的密度；ρ1是化合物在液态形式下的密度。 式中的1.Pc项称化学效应项，它和分子里内部作用力有关，而ρc项称为状态效应项，ρ1
它和分子的摩尔体积有关。从方程中可以看出溶解度常数随超临界流体密度的增加而增加。研究经验表明，当两组分的δ之差的绝对值小于2.04MP1/2时，二者的互溶性就好，或者或二组分的δ约接近，其互溶性就好。对二氧化碳的超临界流体的δ可用式计算
8.54ρ
计算误差约为10%。
2. 流动相的选择原则
SFC的流动相为压缩状态下的流体，有较多的气体或液相可供选择，其选择原则为：临界常数越低越好；对样品有合适的溶解度；化学惰性，不与样品等作用；能与检测器匹配，还需安全不易爆炸；价格便宜，方便易得等。
3. 常用流动相
SFC可以使用的超临界流体列于表 1-2中。由表可见，二氧化碳的临界温度（Tc）和临界压力（Pc）均较低，且是无毒、化学惰性、热稳定性好且便宜，并能用于大多数的检测器，但样品中含有氨或者氨基时，能发生反应因而不能使用。但是二氧化他并不是SFC理想的超临界流体，主要是它的极性太弱，对一些极性化合物溶解能力差。在表 1-2中的下半部分是极性的超临界流体。氨也可用作流动相，主要用于碱性化合物，氨能与六氟化硫一起使用，但不能与二氧化碳在一起使用。但是氨的溶解能力太强，不适合于硅胶类固定相，甚至连一些仪器的部件也能溶解。在高压下，正戊烷、二乙醚、甲醇和异丙醇等加热至200℃时，仍保持稳定，也可作流动相。在实际使用中仍然以二氧化碳为最多。有研究者进行过系统的研究认为：下列常用超临界流体的溶解能力，在相同的压力下其次序为
乙烷
在同样情况下，分离能力按下列次序增加
二氧化碳
早起的萃取研究表明，选择SFC流动相的另一个着眼点是和检测器相匹配，如果使用UV检测器，上述超临界流体均可使用。如果考虑到使用FID，流动相要不可燃，只有二氧化碳、六氟化硫和氙可以使用。氙适合于使用红外检测器，因为它是惰性气体，在检测波段处无红外吸收。另外，SFC/MS联用可用氙作流动相。二氧化碳是一种非极性溶剂，
低分子量和非极性化合物可以在超临界二氧化碳流体中溶解，当极性和分子量增加时溶解度就下降。表 1-3是各种物质在超临界二氧化碳流体中的溶解度。
表 1-2 SFC中使用的超临界流体
表 1-3 一些物质在超临界二氧化碳流体中的溶解度表
4. 改性剂
二氧化碳是最常见的流动相，由于它是非极性溶剂，欲增加其在SFC中队极性化合物的
溶解和洗脱能力，常常在二氧化碳中加入少量的极性溶剂。这些改性剂包括甲醇、异丙醇、
乙腈、二氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环、二甲基酰胺、丙烯、碳酸盐、甲酸和水等。最常用的改性剂是甲醇，其次是其他脂肪醇。在戊烷中加入甲醇或者异丙醇作为阻滞剂以减少吸附效应，使之较纯戊烷在相同时间内可洗脱出更多的组分。在非极性流体中加入适量的极性流体，可以得到降低保留值，改进分离的选择性因子，达到改善分离的效果，提高柱效。这种在流动相中加入改性剂的流动相可称为混合流动相。混合流动相目前研究仍较为活跃。
混合流动相的近似临界常数可用Kay法计算
Tc,MYATc,AYBTc,B
Pc,MYAPc,AYBPc,B
式中，Tc,M，Pc,M分别为混合流动相的近似临界温度和临界压力；Tc,A，Tc,B，Pc,A，Pc,B分别为纯组分的临界温度和临界压力；YA和YB分别为各组分相应的摩尔分数。
对于改性剂的作用机理，进行了大量的研究工作。除了溶质的增加溶解度以外，改性剂还可以起到如下的色谱作用：掩盖了固定相上残留的硅醇基活性基团；改善了流动相与固定相的表面张力。对于中等极性的物质，在超临界二氧化碳中加入一定量的极性有机溶剂便可达到理想的分离目的；而对于强极性的化合物仅加入极性改性剂是不够的。为实现对强极性物质的SFC 分离，在改性剂中加入了微量的强极性有机物(称之为添加剂)成功地分离了有机酸和有机碱。流动相中微量强极性添加剂的加入拓宽了SFC的适用范围。
5. 流动相的流速
流动相的流速是影响分离柱效和分析速度的操作参数。流动相流速选择的原则是快速、高效。由前所讨论，尽管SFC的最低塔板高度很低，但最佳线速度却很小，很难达到快速分析的目的。超临界流体的流速可远大于LC的流速，多采用3-5倍LC流速作为流动相的流速。
1.3.3 超临界流体色谱的温度
1. 色谱柱温度
色谱柱温度对保留值的影响是复杂的，一般要大于或等于超临界流体的临界温度。Chester研究了柱温和保留的关系，导出了以下的公式
lgk0.43HmHs0.43lg RTRT
式中，k为容量因子；Hm为溶质在流动相中的溶解热；Hs为溶质在固定相中的熔解热；为柱子的相比；R为气体常数；T为热力学温度。
式中第1项为类似LC溶解作用对保留的贡献，第2、3项为类似GC挥发作用对保留的。理想的情况，lgk对1/T作图应为直线，但这种情况并不总是存在。一些研究表明，当温度区间范围较小的时候线性关系才成立，因为小的温度范围，超临界流体的密度变化较小，溶解度变化不大。Takeuchi等验证了柱温对芳烃、邻苯二甲酸二烷基酯的影响，并说明了
可用正或负温度程序进行分离，柱温也常选择为：对于一般样品分析，柱温应先在高压GC区，在100-125℃；当没有压力或密度程序时，在恒压下SFC区（100℃）可利用程序升温提高高沸物的扩散系数、粘度而改进分离。
2. 检测器温度
关于检测器的温度大致分为破坏型和非破坏型两类，其检测器温度应有所不同。
a) 破坏型检测器
火焰基破坏型检测器，如FID、FPD、TID、RPD等，为补偿流动相减压气化所吸收的热量及高分子量物质气化所需要热量，必须给予足够的热量，一般应保持在250-450℃，通常为350-400℃，检测器温度基本上与FID灵敏度无关，但有报道，FID温度每增加100℃灵敏度提高约1%，但检测器温度的提高还要受某些限制，如石英弹性阻力器的聚酰亚胺保护漆在400℃以上会有很快老化变质，并且FPD温度增高灵敏度下降等。
b) 非破坏型检测器
光谱型非破坏型检测器、UV、荧光检测器，其阻力器置于检测器之后，其温度一般为室温或柱温，而FTIR的阻力器出口则应加以冷冻等。
1.3.4 压力和密度
流动相压力和密度在每一温度以下同样方式影响保留，在类似GC区，增加压力，lg k值降低，在较低温度下，类似LC区，lg k随压力增加而增加。选择适当的密度程序可使多组分混合物得到最佳分离，提高分离速度（图 1-9所示）。
图 1-9 程序升压对SFC分离改善的效果图
实验条件：柱：DB-1；流动相：二氧化碳；温度：90℃；检测器：FID
样品：1-胆甾辛酸酯 2-胆甾辛葵酸酯 3-胆甾辛月桂酸酯 4-胆甾十四酸酯 5-胆甾十六酸酯 6-胆甾十八酸酯
Chester等研究了流动相的密度对保留值的影响，对于一个特定的溶质lg k正比于流动相的密度ρ
lgklgk0S
式中，k0是ρ=0时的k，k0是温度的函数；S为比例常数。
密度程序是SFC最重要的操作参数，一个非挥发性多组分混合物能否分离好，关键是程序设计及选择。Fjeldsted等研究了毛细管SFC的压力和密度程序，由于流动相的密度是两相间分配的重要因素，由压力密度数据，经n级多项式回归分析得到一个六元多项式逼近的压力、密度关系式。采用适当的软件控制，可建立任何希望的密度程序，包括线性压力、线性密度和非线性（渐近线）密度程序。实现程序升密度有两种方法，，一种是改变温度，另一种是改变压力。但改变压力的方法较为灵敏，并且容易控制。因此，通常采用改变压力的方法。通过程序升压，可控制流动相的溶解能力，有利于提高选择性和分离效率，有利于对具有宽范围分子量的混合物进行快速分离。
SFC中的程序设计有：线性压力程序；线性密度程序；非线性密度程序；同步非线性密度、温度程序，一般根据样品要求具体对待。
1.3.5 柱径、柱长和阻力器
柱径、柱长和阻力器是影响柱效、分析速度的操作变数。对填充柱来说，改变的余地较小，而对毛细管柱则有较大的选择性。
在毛细管SFC中柱径与柱效和最佳线速度成反比。降低柱径将导致最佳线速度增加和柱效的提高，有利于分离，但是柱径减低对同样液膜厚度的毛细管柱，将导致柱容量急剧下降，和柱压差的大幅度增加。这就限制了特细内径、高效柱的应用。一般直径大于50μm，柱压差小于3%，柱效和柱容量都较好，故毛细管SFC通常选用大于50μm的柱径。对于一般分析应用，可选用50 μm的毛细管柱，在已有的毛细管SFC应用中约占60%。对于常规分析，也可选用100 μm的毛细管柱，在已有的毛细管是FC应用中约占20%。
在毛细管SFC中，柱长与总柱效和柱容量成正比，增加柱长将增加总柱效和柱容量，对分离多组分混合物很有利，但需要延长分析时间，因此在SFC中：对于常规分析，可选用3-5 m的毛细管柱；对于一般分析应用，可选用10 m的毛细管柱；对复杂的多组分分析，可选用15-20 m的毛细管柱。
阻力器或备压调节器是SFC中影响分离的一个特殊部件。通常接到色谱柱后，以保证超临界流体在整个色谱柱分离过程中和整个系统中始终保持为流体状态，而阻力器后流动相就降为大气压。常用的阻力器有直管型、小孔型和多孔玻璃型。对于火焰基检测器，阻力器接到色谱柱后和检测器喷嘴之间，对于光谱型检测器接到检测器出口。对于复杂样品及一般应用，可选用多孔玻璃型阻力器，由烧结玻璃段的长短决定线速度，使用方便，效果好。对于一般样品分析，可选用小孔及锥型阻力器。对于紫外、荧光检测器，可在出口接直管型阻力器，调整阻力器长短，能确定流动相线速度。
1.4 超临界流体色谱法仪器
以超临界流体作流动相的色谱仪器称为超临界流体色谱仪，它与气相色谱仪和高效液相色谱仪类似，同样包括流动相、净化系统、高压泵、进样系统、色谱柱、检测器和数据处理系统。长期以来，SFC仪器一直处于实验室自制水平，直到20世纪80年代才逐渐有商品化仪器。SFC仪器主要包括三个组成部分（图 1-10所示）：输送系统，其功能为在超临界压力下输送流动相；精密的恒温箱，保证系统的恒温性；控制系统，以实现超临界压力或密度等变化及色谱柱柱温温度调节等。高压流体（如二氧化碳）由气源流经净化管及热平衡装置后，进入二氧化碳高压泵，然后和有机改性剂混合，经过热平衡进入进样阀，样品由进样阀导入系统，然后经色谱柱分离后进入检测器，最后经过阻力器，整个系统由计算机控制。
图 1-10 填充柱SFC仪器示意简图
它与气、液色谱的主要区别是
a) 超临界流体色谱仪必须装有阻力器（或备压调节器）。它的作用是对系统维持一个合适的压力，为使流体在整个分离过程中始终保持在超临界流体状态；另
一方面通过它使流体转换为气体，实现相的转变。当使用氢火焰离子化检测器
时，阻力器应放在检测器之前（以保证色谱柱的出口压力缓慢地降至常压）。
使用其他（能承受高压的）检测器时，阻力器可放在检测器之后，如紫外检测
器。为防止高沸点组分的冷凝，阻力器一般应维持在300-400℃。
b) 色谱柱应有精密的温控系统，以便为流动相提供精确的温度控制。
c) 整个SFC色谱仪器都处在足够的高压下，只有这样才能使流动相处于高密度状态，以提高洗脱能力，因此，超临界色谱仪必须有精密的升压控制装置。
d) 当使用极性较弱的超临界流体（如二氧化碳）作为流动相，在分离分析极性化合物或相对分子量高的化合物时，常需加入甲醇、乙腈等有机改性剂，以改善
流动相对极性样品的溶解能力，扩大流动相样品的适用范围。
e) 由于有机改姓剂的加入和流体流速对分离效果影响明显，因此要求输送系统具
有较高的精密度，用以保证色谱分离的重复性。
因此SFC仪器要求的操作条件很高，对仪器各部件的制造和连结都提出了新的要求。早起的理论或应用研究中，SFC设备多由实验室改装气体色谱仪或液相色谱仪而成，目前已有多钟商品化的SFC仪器问世。例如用HPLC进行改装时，只要在原有设备基础上添加高压进样器和压力控制系统，并根据需要选择合适的高压检测器，即可将HPLC改装成简易的填充柱SFC。因为SFC在高压状态下操作，因此改装时必须解决好压力控制问题，既要使流体在系统中保持超临界状态，又要防止管线堵塞和泄露。商品化的SFC有Berger公司的SFC系列、Agilent公司的1200 SFC系列和Waters公司的UPSFC系列等。与之前的通过HPLC仪器组装的SFC仪器不同，现代SFC仪器越来越注重仪器的整体化，通过整体设计(系统体积小)，色谱柱技术的改进（色谱柱颗粒小），能使色谱分离在一个梯度条件下，不仅基线噪音极低，而且重复性好、峰形窄、峰宽一致。
1.4.1 流动相输送系统
流动相输送系统或为高压泵系统，是SFC的关键部件，对泵的要求便于SFC的最佳化操作。具体要求：无脉冲输送；泵体较大；能够精密控制压力和流量；具有线性或非线性压力密度程序；适于超临界流体。目前在应用上有注射泵和往复泵，在该系统中，还有二氧化碳增压器和泵的程序控制。对于室温常压为气体的流动相，可将高压钢品中的流动相减压至所需压力或用升压泵增压。对于室温常压为液体的流动相，通常采用无脉动注射泵输送。
在毛细管SFC中，由于所需流量很低，大都采用注射泵。其优点是无脉冲，泵体大于
150 mL，充液一次可用几天，耐压性好，基本上符合泵的设计要求，因此被广泛推荐使用。缺点是其泵体有时需要冷却，更换溶剂时清晰困难，无法进行梯度（如加改性剂）冲洗。 当前LC中广泛使用的输液泵是往复泵，不仅易于操作，可快速该换溶剂，无限输送溶剂，而且可采用双泵系统，一泵输送流动相，另一泵加改性剂，进行梯度洗脱。但往复泵不能直接输送液体二氧化碳，需要对泵体加以改装，并用冷冻剂将泵头冷至-8℃，才能输送液体二氧化碳。还有采用二氧化碳增压器，即增加液体二氧化碳的头压就可在室温下注入注射泵。国外都以氦气充入二氧化碳钢瓶，国内多以氢气代替氦气制成二氧化碳钢瓶，效果很好。一般是在二氧化碳钢瓶瓶嘴下，焊一根不锈钢管，直插瓶底，装进二氧化碳后，接氦气或氢气钢瓶。
在SFC中注射泵、往复泵的控制参数，通常是压力而不是流量。泵的流出压力一般由计算机控制。以设定点压力与世纪压力进行比较控制流出压力。实际压力是由泵出口处的压力传感器得到的，控制系统能控制流动相的压力或密度程序。密度程序是由有关流动相的压力及温度与密度的关系，通过一定算法而得到的，然后用密度作为控制参数。
1.4.2 进样系统
一般来说，LC的进样器，都适合于SFC的仪器，特别是对填充柱SFC，可用类似于LC的进样器。但毛细管SFC因其进样量很小，要求进样器的内管体积小，进样速度快，故常用分流进样法进样。通常采用四通、六通进样阀。在分流进样中也存在样品“失真”的问题，应特别注意。
1. 手动注射阀
LC用的定量管体积为10 μL的六通进样阀也常用，采用半填充法，进样量为0-10 μL，重复性良好，这种阀无论接细孔径填充柱直接进样，还是由分流三通接毛细管柱进样，重复性和柱效都令人满意，在进样体积较大时，还可采用预柱浓缩样品，提高柱效。
2. 气动转动注射阀
Lee Scientific公司600型SFC/GC及Carlo Crba SFC-3000系列都采用气动转动注射阀，这种阀设计新颖，可在注射位置停留一定时间，然后快速回到采样位置，定时进样可由停留时间的长短控制进样量1-500 μL。快速复位使进样真正达到脉冲进样，从而达到提高柱效的效果。
a) 定时分流注射阀
定时分流注射器如所示，这种阀由10 MPa 氢气压力驱动，阀内管体积为0.2 μL，停留时间为若干毫秒，由微机控制。进样时由注射头打进样品，过量样品由废液容器收集，按动注射开关，阀在注射位置停留一定时间后，很快复位，就可打进纳升样品。大部分经分流阻力器或开关阀放空，小部分进石英毛细管柱进行分离。分流与进柱流速比即为分流比，一般控制在（6-20）：1或更大些。分流比可由测量分流阻力器及柱后阻力器出口处的流速来测定。定时分流注射定量分析的定量重复性很好。
b) 不分流注射阀
可将毛细管柱直接插到进样阀的底部，在瞬间注入极小量的样品，因此可用不分流注射阀进样。不分流进样阀的定量重复性经试验也是令人满意的。
1.4.3 色谱柱管理系统
一般GC色谱炉可以满足需要，但也有些较特殊的问题。
1. 低容量双柱双流路色谱炉
一般炉腔较大，便于安装色谱柱及阻力器，检测器插件能够容纳多重检测器。炉子两侧留有接MS、FTIR等的接口。
2. 多级温度程序
在SFC中由于柱温随组分的保留作用很复杂，故在不同的温度区间，要求不同的温度控制程序，在低温区（100℃），组分的保留随柱温增加而降低，则要求用程序升温进行分析。
3. 温度的稳定性
因为超临界流体的密度是与柱温直接有关，故要求柱温控制精度要高，保证温度的稳定性。
4. 安全保护
在使用超临界流体n-C5时，如有渗漏，当炉子加热丝变红时，就会引起爆炸，故要求炉丝设计，在最高温度时，电热丝不产生橘红色，并注意安全保护。
1.4.4 阻力器
为使超临界流体在整个色谱柱分离过程中始终保持为流体状态，当用FID、NPD、FPD、MS时，在色谱柱出口和检测器之间，需要一个阻力器（或称备压调节器），以保证色谱柱的出口压力缓和地降至大气压，当用紫外、荧光检测器时，因其本身可在高压下操作，故可在检测器出口接阻力器降压，阻力器大致分为三类，即直管型、小孔型和多孔玻璃型阻力器。下面分别进行简单的介绍。
1. 直管型阻力器
直管型阻力器，是由一根内径5-10 μm石英毛细管组成，长度根据需要确定。这种阻力器结构简单，可由细管长度决定阻力大小。但非挥发性物质易凝结而使喷口阻塞，易产生毛刺而使样品“失真”。
2. 小孔型阻力器
小孔型阻力器，可以单独做成，亦可作为石英毛细管的一端，做成整体阻力器，使用方便，效果较好。
3. 多孔玻璃型阻力器
此种阻力器是由多孔二氧化硅烧结制成的，是Lee公司据专利生产的。在内径100 μm烧结玻璃（或陶瓷）构成。全长约20cm，一端由对接连接器与毛细管柱相连，另一端接FID，使用方便，效果好。
1.4.5 检测器
在超临界流体色谱中由于流动相具有惰性和流体性质，因此可接LC的光度检测器，而流体流出了色谱柱可减压成气体，故可接大部分GC检测器，尤其是氢离子火焰检测器。流动相这些特性，使GC和LC检测器在SFC中得以通用，使其可利用的检测器大为扩展。其中最重要的检测器是高灵敏度的通用型GC检测器FID，其次是LC检测器紫外和荧光检测器。实际过程中，检测器的选择要考虑不同的流体和检测方法的匹配问题。
1. 氢离子火焰检测器
氢离子火焰检测器（FID）因其死体积小、响应快，是接毛细管柱SFC的理想检测器。但是要作为SFC的检测器要求其稳定性更好、灵敏度再提高。由此Lee Scientific公司推出新的FID设计，采用新的筒状收集电极，力求把全部产生的离子收集下来，可以显著提高检测器的效率；采用废气防空限流法，使火焰稳定性提高，噪声降低。FID的检测限达
10-13g/s。为使满足超临界流体气化时大量吸热，使高分子物质气化，FID具有大的加热器，并保持在350-450℃。但FID属于破坏型检测器，有些场合并不适用。
2. 紫外和荧光检测器
紫外和荧光检测器是LC常用的检测器，它们在SFC中也很重要。当用正己烷、正戊烷等作流动相，或在超临界流体中添加改性剂梯度洗脱时，氢离子火焰检测器不能使用，只能采用紫外和荧光检测器。在SFC中，紫外和荧光检测器是非破坏型检测器，因此可以用来制备微量样品或制备色谱。
3. 其他检测器
氮磷检测器（NPD）是测定含氮有机物的选择性检测器，可用于药物及氨基酸分析。双火焰光度检测器（FPD）是一种高灵敏度、高选择性的测定有机硫和有机磷化合物的检测器。这种检测器能够消除大量烃类对测定硫和磷的干扰。射频等离子体检测器（RPD）是一种高灵敏度、高选择性的多元素光谱检测器，有很好的发展前景。微波诱导等离子体检测器、无线电频率等离子体检测器、及ICP检测器可用于金属有机化合物的检测，在SFC中也被广泛采用。电流检测器、电子捕获检测器及激光散射检测器等都作为检测手段在SFC中得到良好应用。
1.4.6 超临界流体色谱联用技术
色谱-光谱联用技术仍是当今较为活跃的研究领域，其中联用最多的包括SFC/MS联用、SFC/FRIT联用及SFC/NMR联用。
1. SFC/MS联用技术
色谱/质谱联用技术首先是由GC/MS联用发展起来的。MS对单一组分有很强的鉴别能力，但不适于多组分混合物的定性。相反，GC是一种高灵敏度的分析手段，但对物质的鉴别能力低于MS。所以将两者结合起来实行联用，正是扬其所长、避其所短的有效途径，从而可以取得在各自单独使用时无法得到的信息。MS使SFC/MS联用技术成为近年来强有力的分析手段之一，是分析热不稳定、高分子量物质的重要分析方法。
SFC像GC一样，与MS有共同之处：如色谱的分离与质谱的检测都是在气相进行，两者的灵敏度都很高，温度范围相当，样品量及最小检知量相接近。而且色谱的出峰速度与MS的扫描速度也能相匹配。因此， 联用时无须对两种仪器本身做任何改装。但两者之间存在着差异，如SFC是在压力条件下操作，而质谱是在真空条件下运转。而且，SFC的流出物量往往大于质谱的泵容量。所以，必须采用接口装置(interface)才能实现联用。
SFC/MS联用流程如图 1-11所示。此图左边是用液体色谱仪改装的超临界流体色谱仪，右边是质谱仪，通过直接液体引入(DLI)接口联接起来，即成为SFC/MS联用仪。显然，接口是实现联用的关键部件。联接装置的探针（Prole）中有一不锈钢隔膜，在隔膜中心用激光穿一小针孔（2.5～3.0 μm）。为了保持探针中流体的超临界状态，小针孔的尺寸是非常重要的。同时，探针必须恒温在流动相的临界温度之上。进入质谱仪的流量可部分地由反压调节器调节， 但主要是通过选择具有适当针孔尺寸的不锈钢隔膜进行控制。
在SFC/MS联用中，防止溶质在管壁上沉淀也是十分重要的。反压调节器后面的压力低于流体的临界压力，其中的流体已不是超临界流体，因而溶解能力显著下降，若出现沉淀会沉积于管壁而不能依次流出，显著影响分离效果。
图 1-11 SFC/MS联用流程图
SFC/MS联用技术分别有超临界流体色谱与四级杆质谱联用和超临界色谱与高分辨质谱联用。目前SFC/MS采用的电离方式主要有ESI、APCI和CI等。SFC/MS联用的研究和应用日渐增加，为发展高速、高分辨率、高灵敏度的分析方法提供了有效的途径。
2. SFC/FTIR联用技术
近年来，GC/FTIR发展迅速，已成为分析挥发性混合物的有力工具，并能提供有价值的结构信息。然而，GC/FTIR不能分析难挥发、易热解的高分子化合物。LC/FTIR采用“溶剂消除”和扩散反射技术，虽然能分析难挥发，易热解的物质，但分析速度慢，而且LC用的流动相，大部分在中等红外区具有强的吸收，因而限制了它的应用。SFC/FTIR联用是最近发展起来的先进联用技术。由于SFC具有快速、高效和强溶解能力的优点，而且它所用的大多数流动相在中等红外区具有最少的吸收，这些固有的特性导致了SFC/FTIR的迅速发展。
SFC/FTIR联用流程可简单地用方框图 1-12表示。联用流程与一般超临界流体色谱流程相似，FTIR红外光馄谱仪作为检测器通过接口装置与SFC联接。当采用溶剂消除接口时，FTIR接在阻力器之后；如采用高压红外流通池接口，则置于阻力器之前。流量限制器之前的体系都在超临界态操作。
SFC/FTIR中采用溶剂消除接口，接口装置为一条沉积有薄层KC1粉末的自动旋转带，置于距SFC阻力器1mm的地方。样品组分在色谱柱中实现分离后，随流动相通过流量限制器喷射在旋转带上，被分析组分则沉积在KC1粉末上，溶剂则挥发至大气中。与此同时，红外光束聚焦在带上，便可测定被分析组分的红外吸收光谱，根据吸收光谱，可重新构成色谱图。
采用溶剂消除接口，可在常压下进行检测，而且检测灵敏度高，但接口在结构上较复杂；
所用流动相必须是易挥发的，极性物质及高沸点物质不适于用作流动相；作为流动相物质
必须具有高的纯度，否则其中兴所 的杂质可能随样品组分沉积在KC1粉末上而影响检测结果。
采用高压流通池接口，可在临俪超界态直接进行检测，设备紧凑简单，但流通他必须有耐压能力。流通池本体可用不锈钢制成，它的两旁开有能透过红外光的窗口，窗口材料必须具有足够的强度并在中等红外区有透明性。红外光束照射在窗口上（垂直于流动方向），则可刹测量流通池中样品组分的吸收光谱。高压流通池接口对流动相要求符合下列条件：
(1)在中等红外区的吸收为最少；(2)对被分析组分具有强的溶解能力；（3）对溶质有高的扩散系数，以提供高的柱效；（4）具有高的选择性，选择性应随压力而变化。符合上述条件的流动相物质有丙烷、二氯二氟甲烷和二氧化碳等。
图 1-12 SFC/FTIR联用流程图
SFC是分析热不稳定、高分子量样品的分离技术，而IR光谱则可提供物质的结构数据，故SFC/FTIR联用将是强有力的近代分析手段之一，当前SFC/FTIR联用的关键，是采用能提高检测领命都的接口。已经报道的接口有两类。第一类为色谱流出物通过高压流动池，测量在流动相存在下的分离组分的透射光谱。这种接口的缺点是受流动相吸收光谱的干扰较大。第二类是在测量红外光谱前消除流动相的干扰。
3. SFC/NMR联用技术
在SFC中由于常用二氧化碳作为流动相，其分子中无质子，这大大方便了溶质NMR谱图的测定，也促进了SFC/NMR联用技术及应用的发展，通过SFC/NMR联用可以一次性完成从样品的分离纯化到峰的检测、结构测定和定量分析，并提供混合物的组成和结构信息，从而提高了研究效率和灵活性。
由微机控制整个实验过程的SFC/NMR联用装置框图如图 1-13所示。SFC装置与一般SFC装置相似，在常规检测器与NMR探头通过两个阀门连接在一起。在NMR探头后面连接有一个反压调节器，其作用是对压力和流速进行独立调节，以保证NMR探头中的流体维持在超临界状态。
图 1-13 SFC/NMR联用装置示意图及其NMR探头
NMR探头是联用装置中最关键的部分。Dorn等人在液相检测探头的基础上设计了一个适用于超临界工作条件的NMR探头，如图 1-13放大部分所示。探头内部的玻璃管是一个外径为5mm，内径为3mm，体积为120 μL的蓝宝石管。一个氢-氘双调谐线圈直接嵌在蓝宝石流动腔壁上，并将其置于常规探头玻璃器皿的中央。在探头中还插有一个热电偶，用于实时测量温度。
为了研究SFC-NMR联用装置的性能，Albert等测定了1H NMR 探头在13C卫星峰高度时的1H 线宽。在超临界态下，所获得的1H 谱线的线宽与HPLC-NMR 联用装置在液态下所得的结果无明显差异。在匀场较好的情况下，谱线的线宽主要由自旋-自旋弛豫时间T2决定。Albert等发现即使在超临界条件下，谱线线宽也基本不变，这意味着质子的T2值无明显变化。然而与T2不同，在超临界条件下作为流动相的二氧化碳随着压力的增大，粘度降低，自旋-晶格弛豫时间T1明显增大。采用反转恢复法脉冲序列测量邻苯二甲酸正丁基苯酯1H谱的T1表明：在超临界条件下的T1值是同一温度下液态T1值的2-3倍。为此，当信噪比较低需多次累加时，应适当延长脉冲重复时间，或设定较小的脉冲翻转角，以提高单位时间内的信噪比。
SFC-NMR联用技术避免了HPLC-NMR联用技术中溶剂峰干扰问题，解决了样品在处理
过程可能造成的损失、污染或分解，从而提供了一种快捷有效的分离，并能提供混合物的
组成和结构信息的分析方法。超临界流体分离与NMR 联用技术的优点不仅来自超临界流体独特的分离能力和NMR 精确的结构分析能力，而且还在于将二者有机结合的巧妙而完美的联用技术。目前其已成为分析难挥发、不耐热的大分子化合物和生物样品的有效方法，在分析复杂混合物中(如中药复方体系化学成分和结构研究)有着广阔的应用前景。
1.4.7 超临界萃取与超临界流体色谱联用技术
超临界流体萃取-超临界流体色谱法联用技术（SFE-SFC）是一种新型的二级分离分析方法，60年代以来，SFE和SFC分别得到长足的发展，但二者的联用尚不多见。由于SFE和SFC所用流动相为同一状态的流体，使得SFE-SFC联用技术成为可能。自80年代中期，该技术的研究报道日益增多，并逐渐发展成为一钟比较成熟的分析方法。SFE-SFC联用技术兼有提取、浓缩、分离和检测等功能，具有简便、快速、条件温和等特点，适用于天然产物和环境样品的分析。
现以日本分光株式会社(JASCO)生产的SUPER-200型超临界流体萃取色谱仪为例，说明SFE-SFC联用装置的组成和特点(如图 1-14所示)。该装置主要由流体输出、提取、浓缩、层析和检测等部分组成。整个系统在一定的压力和温度下工作，并由微机调控。调节六通阀，可将提取分离部分分成2个独立的工作系统, 以便对提取分离条件进行选择。使用高分辨多波长紫外检测器，可获得三维色谱图。根据色谱和光谱数据对被测成分进行定性定量分析。紫外检测器需配备高压样品池。浓缩柱固定相多用活性较低的填料，以利提取物的洗脱。分离柱一般采用化学键合固定相填充柱或化学交联毛细管柱，以防固定相被SF (超临界流体) 洗脱。为了避免柱压损失，填充柱最好采用微型柱。进行SFE-SFC联用分析时，提取管、浓缩柱和分离柱的容量应匹配。
操作过程大致如下：调节SV1、SV2和SV3，将流体输出部分、提取浓缩部分和检测收集部分接通，使层离部分处于旁路。开启PU1输出二氧化碳，调节PH和BR1，获得提取所需的SF，对样品进行提取。同时调节BR2，降低流体的压力和溶解能力，使提取物在浓缩住中析出富集。当提取完成后，调节SV1、SV2和SV3，将流体输出部分、层离部分和检测部分接通，使提取浓缩部分处于旁路。调节BR2和PH，得到层离所需的SF。首先对分离柱进行饱和处理，平衡后再调节SV2，使浓缩部分与层离部分接通，完全打开BR1，浓缩柱中提取物被依次洗脱、层离和检测。提取分离时若需改性剂，可开启PU2，将其注入二氧化碳中。
SFE-SFC联用技术集提取、浓缩、分离和检测于一体。运用该技术可省去较为繁琐的前处理，直接对样品进行分析。若以二氧化碳为流体，可获得低温、无氧的工作条件，适用于不稳定成分的分析。若使用高分辨多波长紫外检测器，可在无参照物的情况下，对成分的定性定量分析提供有用的信息。因此，SFE-SFC联用技术对于天然固体样品尤其是天然药物来说，无疑是一种理想的分析方法。
图 1-14 SFC-SFC联用装置示意图
1.4.8 制备型SFC
制备型SFC现已应用于食品、医药、生物及石油等多个领域。制备型SFC与分析型SFC的区别在于制备型SFC需要将分离的样品收集起来。因此，色谱系统增加样品收集装置，相应地增加了复杂的样品进样系统。相对于制备型HPLC而言，制备型SFC的流动相使用少，无溶剂残留，分离速率快。
1.5 超临界流体色谱的应用
超临界流体色谱正处在研究、发展阶段，超临界流体色谱的应用也处在开发、推广时期。近年来，超临界流体色谱技术的发展速度较快，发表的研究论文日渐增多，商品化仪器也增长较快。SFC以其独特的有点应用于药物分析，对映体拆分，食物和天然药物、生物分子、炸药、农药和化工产品等的分析。近来，模拟移动床式制备型SFC的出现拓宽了SFC的适用范围和生产规模。
1.5.1 在手性拆分中的应用
SFC 分离手性化合物可分为直接法和间接法两种。直接法包括使用手性固定相和手性流动相；而间接法则基于手性衍生作用，先把对映物转化为非对映物，然后用非手性固定相分目前，手性固定相直接分离法是发展最快的领域，而间接法则相对使用较少。超临界流体色谱的手性固定相是在HPLC和GC手性固定相的基础上发展起来的。目前已有大量的商品化手性固定相（CSPs）问世。通常CSPs按手性选择器的类型分为酰胺类、环糊精类多糖类及酰胺类等，除冠醚类和蛋白质类外，绝大多数CSPs都可直接用于SFC，而不需任何改进处理。分析时，温度对分离的选择性、分离度和保留时间的影响较大。一般表现为温度降低，选择性会线性增大，分离度得以提高，保留时间则稍增加；此外，流动相的组成，特别是流动相中极性添加剂的种类和用量对分离的影响也很大，在分析酸碱性的手性药物时，流动相中添加少量酸或碱对分离的选择性和保留值具有很大影响。
一般来说，SFC的分离效果要比HPLC好，但也有例外情况，，如2-氨基-3-苯基丙醇可以在HPLC 上很好地分离，但在SFC上的分离，效果却很差。对于以上现象，Anton等认为：溶质-流动相之间和流动相-固定相之间的相互作用在普通流体和超临界流体中有很大差异。在手性固定相上，超临界流体比普通流体受到更强烈的多层吸附，而超临界CO2中加入低浓度的极性改性剂能极大地增强溶剂的溶解能力。因此，必须同时考虑两种相互作用对分离度的影响。
1. Pirkle 型手性固定相
Pirkle 型CSPs 是根据三点作用原理设计合成的，母体结构为3，5-二硝基苯甲酰，然后接上苯基甘氨酸或亮氨酸等基团。
Pirkle 型CSPs 在SFC 上可直接分离氨基酸、抗疟药和β-blockers（一类含仲胺基团的化合物）等对映物以及亚砜、内酰胺等含有芳基的对映物；极性更强的物质一般在进样前先转化为弱极性的衍生物，然后再进行分离。1993 年Nishikawa用装填有Pirkle型CSPs的SFC和SFC分离了拟除虫菊酯，其分离效果在温度较低时比HPLC好得多。
2. 环糊精手性固定相
环糊精（Cyclodextrin，简称CD）是一种包含6-12 个葡萄糖单元的手性环状低聚糖，包括α，β，γ等类型，其中以β型应用最广。
环糊精主要用于开管式SFC，含有不同官能团（单醇、二醇、内酯、酮、胺、羧酸和甾体等）的手性对映物有的可在β-环糊精上得到有效分离。Susanne等用开管式SFC 的β-环糊精上基线分离了5 种拟除虫菊酯。Armstrong等报道了一种以短链聚硅氧烷聚合物为取代基的甲基化β-环糊精CSPs，并用它在开管式SFC 上分离了1-氨基二氢化茚和全氢化吲哚。Chirasil Dex（固着在聚硅氧烷上的二甲基化β-环糊精）是一种新型的CSPs，据报道用Chirasil Dex可分离多种芳香醇、氨基醇、氨基酸、羧酸、二醇、胺和酰亚胺等对映物；许多药用化合物（如巴比妥药物、甾族药物等）也可在Chirasil Dex 上分析或分离，且与GC 相比，分离效果好，操作温度低。
3. 多糖类手性固定相
多糖类CSPs 包括纤维素衍生物和直链淀粉衍生物两种，过去只用于填充式色谱柱，1992年，Juvancz 及合作者把它推广到了开管式SFC。
纤维素三苯甲酸酯（ChiralCel OB）和纤维素三-3，5-二甲基氨基酸甲酯（ChiralCel OD）是两种广泛应用的纤维素CPSs。使用超临界流体色谱，OB 可分α-亚甲基-γ-内酯与内酰胺、芳基酰胺、1，2-氨基醇（β-blocders）等对映物；OD 可以分离β-blockers 对映物、苯并二氮杂草和反-均二苯代乙烯手性物质。OB 和OD 都可用于分离苯丙醇及恬尔心（抗心绞痛药）的氢氯化物（一种抗癌药物）。
直链淀粉衍生物CSPS 虽不如纤维素类应用广泛，但许多非甾族抗炎药的对映物都可以在直链淀粉三-3，5-二甲基氨基酸甲酯（Chiralpak AD）柱上直接分离。Kaida 与合作者用苯基甲酸酯直链淀粉作CSPs，CO2-醇作流动相，分离了Troeger's碱等多种外消旋体
Bargmann 等则比较了在纤维素和直链淀粉衍生物CSPs上的SFC和HPLC 手性分离情况，通过研究β-blockers 在OD 和AD 上的手性识别机理，发现初级或二级羟基和胺等极性基团的存在是导致HPLC、SFC 之间存在明显选择性差异的原因。
4. 其它手性固定相
除上述用于SFC 手性分离的固定相外，还有许多其它类型，如基于螺旋聚甲基丙烯酸酯的CSPs、大环抗菌素类CSPs 和基于金属络合物的CSPs 等等，它们都在SFC 分离技术中得到应用。
Macaudi re 等曾对Chiral OT（涂覆在硅胶上的螺旋聚甲基丙烯酸酯）CPSs 进行了研究，在填充柱SFC 中成功分离了二-β-联萘酚和α-亚甲基-γ-内酯。此外，他们还用ChiralPak OT（涂覆在硅胶上的聚三苯甲基异丁酸酯）CSPs 在填充柱SFC 上分离了联萘酚。1997 年，Medvedovic 等用大环抗菌素类手性固定相Chirobiotic V和Chirobiotic T在填充柱SFC 上分离了多种不同类型的外消旋化合物（β-blockers、β-兴奋剂、苯二氮类、非甾族抗炎药、巴比妥酸盐、氨基酸及其衍生物等）。但与OD 和AD 等CSPs 相比，其应用范围相对较小。Chirasil Nickel是一种基于镍络合物的CSPs，Schleimer 等曾以苯基乙醇和樟脑为典型手性溶质，用开管式SFC 研究了温度、压力和流动相密度对保留值和分离因子的影响。 实例：班布特罗消旋体的SFC拆分，见图 1-15所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：IA-S CHIR-ALPAK（4.6×150 mm,3 μm）
分析条件：A.二氧化碳，B.20 mM甲酸铵的甲醇，洗脱梯度：0 min，15% B，3 min 30% B。备压：1800 psi，柱温：50℃。
检测器：紫外，205 nm
说明：班布特罗消旋体的分离度达到2.28。
图 1-15 班布特罗消旋体在SFC上的分离色谱图
1.5.2 在药物分析中的应用
SFC用于药物分析时，具有分析速度快，选择性好，分离效率高，样品处理简单等优点，并适用于稳定性差、极性大和挥发性小的药物分析，可以作为GC和HPLC在该领域的重要补充技术。SFC 应用于药物分析主要采用以二氧化碳为主体的流动相，由于多数药物都有极性，所以必须在流动相中加入极性改性剂，最常用的改性剂为甲醇。另外，微量的添加剂，像三氟乙酸、乙酸、三乙胺和异丙醇胺等，可起到改善色谱峰形的作用。
1. 药物稳定性试验及代谢产物测定
药物稳定性试验是通过分析药物中活性物质及相关化合物，如降解、分解产物和杂质等，从而保证药品符合质量要求。SFC 用于此项分析时, 可以给出稳定准确的分析结果, 在对抗癌药物紫杉醇及其杂质和降解产物分析时，通过在二氧化碳流动相中程序增加甲醇量, 16 个相关化合物得到检定；Anton等讨论了SFC在药物稳定性、剂量、含量均一性、溶解速度及活性物质测定等方面的应用；Steuer等则比较了SFC，HPLC 和毛细管区带电泳(CZE) 在药物分析和草本制剂的稳定性研究，赋形剂分析和生物体液中药物测定等方面的应用研究, 表明SFC是一种可靠的方法。在测定活性物质时，使用SFC具有省时(分析时间短, 样品前处理简单)和污染小(二氧化碳取代有机溶剂作流动相)等特点。在分析乳剂和洗剂时，可以用四氢呋喃稀释后直接进行分析，不需要进行前处理。
Smith 等在应用SFC 分析雷尼替丁及4个代谢产物时其分离度得到提高; Simmons等则用以对片剂中苯基保泰松以及它在尿液中的主要代谢产物进行分析；药用Camazepam (CM Z)为外消旋体，其R-异构体在大鼠和人的肝脏里被选择性地代射，使用SFC可以将CM Z 和它的多个代谢产物在10 min 内完全分离；工业上常用的苯乙烯吸入人体后代谢生成苯乙酮酸和扁桃酸，该法分析其代谢产物时，样品尿液勿需前处理，只需乙睛烯释10 倍，离心后即可进行分析。
2. 其他类药物分析
消炎镇痛药布洛芬和蔡普生的分析：这两种药物都含有叛基，酸性很强。若用GC分析则必须先进行衍生化, 而要用H PL C 则必须将流动相酸化, 对药物进行离子抑制后才行。但可以在氨丙基硅胶柱上用含20 % 甲醇的二氧化碳作流动相进行SFC分析。
磺胺类药物的分析：磺胺类药物的抗菌谱广，常作兽用药物。磺胺类药物可被动物组织吸收，若在体内的半衰期长，则人类食用动物时，在动物组织内有药物残留的危险。现在美国规定在食用动物体内，磺胺类药物的最大残留量不应超过0.1 ppm，这说明应该建立一种分析磺胺类药物的灵敏方法。Perkins等用填充柱SFC 和SFC/MS法分析用药猪的肾脏提取液中磺胺类药物的含量。固定相可用硅胶或氨基键合固定相，流动相用甲醇改性的二氧化碳。色谱流出液一半经紫外检测器进行检测；一半经M S 仪进行检测和确证。用这种方法可以分离确证八种结构不同的磺胺类药物。用UV检测的最低检测限可达1-5 ng。 Berry等用SFC/MS联用技术对磺胺、激素、角麦菌生物碱和黄嘌呤等极性药物进行分析，在二氧化碳中加不同量的甲醇构成二元流动相以改善分离；还可用MS作检测器分析咖啡因、可待因和苯基保泰松等药物。
有些酚类化合物排放到空气中后对环境有害，美国环境保护机构用GC对11种酚类进行监测，但测定有困难并费时间。Berger等用Liehrosorb Diol色谱柱，用二氧化碳中加甲醇作改性剂、TFA作添加剂所组成的流动相，于填充柱SFC上成功地分离了这11 种酚类。他们还用上述分析酚类化合物的方法分析了苯多梭酸。过去曾有人用S FC 分离苯甲酸和水杨酸，但必须用高浓度的流动相改性剂(含17.9 % -20 %甲醇的二氧化碳)，同时保留时间较长(17 -30 min )。在SFC中用极性很强的流动相分析极性化合物时，上述极性固定相所得的分离效果都比C8或苯基等低极性键合固定相好。
SFC 存在的一个主要问题是在分离强极性和离子化合物时会延长保留时间及色谱峰拖尾。Steuer等用离子对SFC(IPSFC)分析阳离子和阴离子药物。阳离子药物如含脂肪胺衍生物的
普蔡洛尔等，不能被超临界二氧化碳洗脱，即使在其中添加大量甲醇作改性剂时也不能奏效。此外，这些药物还可以和键合固定相上硅胶的游离硅醇基强烈作用，这样就更加难以洗脱了。但若于超临界二氧化碳中加人甲醇作改性剂，再加庚烷磺酸钠和二甲基辛胺分别作反离子和竞争离子，以离子对的方式是可以很顺利地分离分析普茶洛尔的。与此相似，苯甲酸、水杨酸等阴离子药物也可用IPSFC 法作分析。
Later等用SFC 分析激素、抗菌素和依赖性药物时，只用二氧化碳作流动相就将结构相近的物质分开, 并用于尿中咖啡因和激素的测定，在分析一个含多个极性基团，分子量达440 的抗菌素时不需衍生化，直接进样分析，分离四羟基大麻酚和它的6 个代谢产物时，也是用二氧化碳作流动相即可完成。Chester等系统介绍了SFC及其应用，包括对生物碱等药物的分析。
SFC用于巴比妥类药物分析时，不同固定相以及流动相中甲醇的量不同对容量因子、保留时间等将产生较大影响；使用MS作检测器可以将该类药物进行纳克级测定；通过分析苯巴比妥，检查SFC的稳定性，证明结果可靠。
SFC可用于激素类药物的常规分析，Baiocch等在不同固定相上分离该类药物，讨论了固定相对保留时间的影响，David和Novotny将激素反应后生成的亚磷酸酯，用磷热离子检测器分析人血浆和尿中的激素，分离效率和灵敏度都很好。
用SFC分析一个二氢吡啶类药物的乳剂时，用有机溶剂稀释后直接进样分析，其定量结果与HPLC分析结果相似；用SFC分析碱性的胃质子泵抑制剂与其类似物时，于二氧化碳和甲醇流动相中加入1%三乙胺，有助于分离；在分析一种治疗高血压及预防心绞痛的药物以及12个同类化合物时，刻将含量0.1%，结构相近的同系物分开；Strod等论述了钙离子通道拮抗剂的分离；Jagota和Stewart在不同固定相上分析非激素类抗炎制剂时，进样量为纳克级，并比较了不同固定相对保留因子、拖尾因子和最低检出限的影响。
由于青蒿素受热不稳定，并且在紫外/可见光区无吸收，使其测定方法收到限制，采用SFC/ECD分析时，成功地测定了全血中的青蒿素；在对其它抗疟疾药物，如氯喹、奎宁等分析时，检测限达纳克级，并表现出很好的线性和精密度。
实例：阿咖酚散中阿司匹林、咖啡因和对乙酰氨基酚三种组分的SFC分析，见图 1-16所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Kromasil Slica填充柱（4.6 ×250mm，5μm）
分析条件：18%甲醇（二氧化碳），备压：20 MPa，柱温：50 ℃
检测器：紫外，275 nm
说明：建立了SFC分离测定阿咖酚散中阿咖酚散中阿司匹林、咖啡因和对乙酰氨基酚三种组分含量的方法，并研究了改性剂、流速、压力和温度对分离选择性的影响。在测定范围内，对照品浓度与峰面积呈良好的线性关系，以峰面积和保留时间精密度分别为阿司匹林0.38%，1.7%，咖啡因0.49%，1.88%和对乙酰氨基酚0.44%，1.09%，整个分离过程在5 min内即可完成测定，且具有较好的重现性和线性关系。
图 1-16 阿司匹林、咖啡因和对乙酰氨基酚的SFC分析
（a）标准品，（b）对照品
实例：布洛芬异构体的手性分析，如图 1-17所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Chiralpak AD-H（4.6 ×250 mm，5μm）
分析条件：7% 甲醇、乙醇和异丙醇（二氧化碳），备压：120 bar，柱温：30 ℃ 检测器：紫外，220 nm
说明：经过优化后的分离条件，分离度能达到5.3-11.8，理论塔板数有5000，表明了SFC具有高的柱效。
图 1-17 布洛芬异构体的分离
甲醇，（b）乙醇，（c）异丙醇
实例：美托洛尔及其类似物在SFC上的分离，见图 1-18所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Kromasil 100-5NH2（4.6 ×150 mm）
分析条件：8% 甲醇（二氧化碳），备压：250 bar，柱温：60℃。
检测器：紫外
说明：在氨基柱上分离了美托洛尔及其类似物，通过对柱温、备压和改性剂进行优化，得到了最佳的色谱条件。
图 1-18 美托洛尔及其类似物在SFC上的分离色谱图
实例：化妆品中维生素D2和维生素D3的SFC分析，见图 1-19所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：ACQUITY UPC2 2-EP（2.1×100 mm，1.7 μm）
分析条件：A.二氧化碳，B.异丙醇，洗脱梯度：0 min，1% B，0.5 min，1% B，4 min，5% B。备压：2000 psi，柱温：50 ℃。
检测器：紫外，263 nm
说明：维生素D2和维生素D3由于结构上极为相似，因此是HPLC分离的难点，目前主要采用正相HPLC分析方法进行分析。采用SFC的检测方法能获得比正相HPLC方法一致或更高的分离度，而且分析时间仅为4.5 min，效率很高。
图 1-19 维生素D2和维生素D3在SFC上的分析色谱图
1.5.3 在生物分子、食品和天然产物中的应用
生物分子通常是热不稳定的，用GC无法直接分析，用HPLC有时又苦于无法采用紫外检测器。利用SFC的高分辨能力，中等柱温和检测器可选范围大，可分离生物分子。食品和天然产物等一类复杂的多组分混合物，正是SFC发挥其高分离效能的场所。热不稳定的天然脂类、甾类化合物、多元不饱和脂肪酸及其脂、天然色素、氨基酸和糖类等。
1. 糖类
很多种色谱方法可用于糖类的分析(如LC、CE等)，但都存在一定的局限性，最简单的方法是无需对样品进行衍生化处理。CE的分离效率高且需要的样品量小，但一般要对样品衍生化，未衍生化分离样品的报道较少。由于该类化合物中多数含有低聚或多聚体，用LC分离时需要梯度洗脱，比较麻烦。用SFC分离分析糖类相对要容易得多，一般无需进行衍生化处理，并有较高的分离选择性。
Chester最早用纯二氧化碳作为SFC的流动相，研究了低聚糖、多聚糖及聚甘油酯的保留性质，研究结果表明，对于含一到四个自由羟基的聚甘油酯类，用纯CO。可以分离，但峰形较宽且有拖尾，尤其是含有四个自由羟基的聚甘油酯，峰形更差。若将样品衍生化可使保留值下降且峰形变窄。聚糖在纯二氧化碳中的溶解度太低，不易分离，而用硅烷衍生化后，可以分离洗脱且峰型良好。Garrand采用蒸发光散射检测技术(ELSD)，对两种单糖进行了简单的分离。
由于糖类是极性较强的化合物，目前用SFC分离时通常需在主流动相二氧化碳中加入第二组分，作为流动相改性剂，以提高流动相对样品的溶解能力。Slavader等研究了单糖和多双键烯烃的保留性质，用三甲基硅烷键合的硅胶作为固定相，所用流动相分别为CO2-甲醇、CO2-甲醇-水、CO2-甲醇-水-三甲基胺，流速为5 mL/min，在10 min内，使四种单糖得以完全分离。
2. 脂肪酸和脂类
对于紫外检测器，由于甘油三酯在紫外区域的吸收非常弱，因此灵敏度比较低，使得检测不准确。虽然FID检测器可以实现对甘油三酯的检测，但是它和紫外检测器一样在定性的时候需要标准晶作对照，对于甘油三酯组成非常复杂的油脂来说，很难用标准品进行逐一定性。质谱检测器具有非常高的灵敏度，它的优势在于能产生对分析结果有用的离予，如提供分子质量信息的分子离子、脂肪酰基离子以及一些单酰基甘油离子和二酰基甘油离子等，根据这些离子的特征可以准确判断甘油酯的类型、脂肪酸组成及其位置分布等。因此，质谱检测器对于分析甘油三酯是非常合适的。对油脂直接进行质谱分析，可以不经色谱分离快速获得油脂中甘油三酯的种类及其各自的分子量等信息，另外也可以利用氨负离子化学电离的碰撞诱导双重MS技术分析脂肪酰基在Sn-2和Sn-1/3位的位置分布。如果甘油三酯样品中存在同分异构体如脂肪酰基双键的位置不同或者构象不同等，这种情况下就需要先对样品进行色谱分离然后进行质谱检测。利用SFC可以实现对几乎所有甘油三酯样品的高效分离，采用APCI质谱可以对甘油三酯的结构特征进行分析。SFC与APCI的MS联用对分离检测甘油三酯是非常有效的，APCI产生的质谱图具有很好的规律性，分子离子峰提供了甘油三酯的分子量信息，产生的碎片离子峰则提供了甘油三酯的脂肪酸组成、位置分布和脂肪酸结构等非常重要的信息。对于不同的样品关键是要选择好合适的分离条件和质谱条件，以期达到理想的分离和检测效果。
多数单官能团有机酸，尤其是脂肪酸，在毛细管SFC或填充柱SFC中以纯二氧化碳为流动相可以分离。而分子中如存在第二个极性官能团时，通常使峰形不理想甚至不能分离，一般需加人流动相改性剂，具有氢键的改性剂(如甲醇)用的最多。脂肪酸是一类可解离的强极性化合物，在一般的固定相上易发生吸附和拖尾，有时需制成相应的衍生物。未衍生的脂肪酸 和甲基脂肪酸酯 ，在键合的填充柱SFC上用纯二氧化碳作为流动相很容易洗脱，其原因是分子上有较长的疏水基团。大多数芳香酸和多取代酸不能用纯二氧化碳分离。在甲基脂肪酸酯上有取代羟基时将使保留值明显增大。直链甲基酯用纯二氧化碳在C18柱上可以迅速洗脱，但2-羟基酸甲基酯则不能洗脱。
含有30~70个碳原子的甘油一、二、三酯分子量都比较大，但由于含有较少的羟基基团，极性不是很强。它们在填充柱SFC上用纯二氧化碳作为流动相可以洗脱，若加入少量甲醇或乙腈作改性剂，将得到较高的选择性。用水和二氧化碳为流动相，在聚碱性PRN-300柱和一个毛细管柱上，用SFC可以分离蔬菜油中的脂肪酸及二、三甘油酯。乙腈和甲醇的加入使选择性明显改善，当改性剂浓度较高时，随改性剂浓度增加，洗脱能力增强而选择性相对下降，这表明分离机理已变为反向SFC。
3. 甾类化合物
甾类化合物是一种含有羟基的极性异构体混合物，其性质极其相似，用一般的分离技术较难分离，而用SFC则相对容易。胆固醇和甾酮用纯二氧化碳为流动相，在SFC中很容易被分离，如果极性取代基的数量增加，用纯二氧化碳洗脱将比较困难。多数的毛细管SFC分离甾类用纯二氧化碳，而填充柱SFC则多加入改性剂。
Bored等在二氧化碳中加入1.5％的甲醇为改性剂，分离了孕甾酮和雌素酮。Berry用含20％ 甲氧基乙醇的二氧化碳为流动相，硅胶填充柱上，10 min内分离了8种甾类。
Lesellier等用含6.1％甲醇的二氧化碳流动相，在4. 6×75 mm 柱上，分离了包括：睾丸酮、雌素酮、雌二酮、雌三酮等11种甾类。HansonE 最近研究了酮类化合物的保留性质，提
出用一个分析装置进行半制备的分离技术。Baieehl等用SFC在OV-1701固定相上分离了六种甾类化合物。蜕皮激素甾中含四个甾环骨架和7个羟基，极性较强不能用纯CO 洗脱，而加入低浓度的甲醇为改性剂，可容易被洗脱。Snyder等 用SFE富集天然油样品中的植物甾醇，发现用SFC分离之前，在温和条件下用SFE预浓缩样品是一种理想的分离分析手段。
4. 其他天然产物
郭亚东等采用SFC对野甘菊中小白菊内酯进行含量测定，其分析时间仅用3 min，速度极快，可见SFC是一种快速色谱。陆峰等建立了超临界流体色谱法用于测定补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素的含量的方法，并研究了影响试验结果的各种因素。SFC还可适用于中药生物碱的分离，并有较好的应用前景。郭亚东还采用SFC同时测定维生素B2，B3和烟酰胺的含量，与传统的方法比较具有简便，样品前处理简单，分析速度快的特点。因此对于复杂成分的分析，SFC具有显著的优势。蒋崇文等运用SFC分离了生育酚的同系物（α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚），在实验条件下，压力和温度对生育酚在SFC的保留和选择性有显著影响。
实例：乳清酸的SFC分离，见图 1-20所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Cyano填充柱（氰基）（4.6×250mm，5μm）
分析条件：20%甲醇（二氧化碳），甲醇中含有0.25%三氟乙酸作改性剂
检测器：紫外，280nm
说明：在测定范围内，对照品浓度与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9991）。分析过程迅速，3 min即可完成，且样品前处理简单。
图 1-20 乳清酸在SFC上的分离色谱图
实例：银杏提取物中黄酮类化合物SFC上的测定，见图 1-21所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：苯基柱（4.6×200mm， 5 μm）
分析条件：二氧化碳-乙醇-磷酸（90：9.98：0.02 v/v）；流速：1.05 mL/min；压力：25.0 MPa；温度：50.0 ℃。
检测器：紫外
说明：A为标准品，B为样品。化合物：1. 异鼠李素；2.山奈酚；3.槲皮素
图 1-21 标准品及银杏提取物中黄酮类化合物色谱图
实例：二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）在SFC上的分析，见图 1-22所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Dikma ODS色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）
分析条件：纯的二氧化碳，备压：20 MPa，柱温：90 ℃
说明：从EPA和DHA的分子结构可以看出，EPA和DHA的主要差别在于碳链长度和双键数目的不同，可利用ODS柱对EPA和DHA作用力的差异将两者分开。在试验中考察了操作温度和压力对容量因子和分离度的影响，提高温度和降低备压对分离是有利的。
图 1-22 二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）在SFC上的分析色谱图
实例：胡萝卜素、叶黄素和叶绿素在反相SFC中的分离，见图 1-23所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Zorbax ODS（4.6×250mm，5μm）
分析条件：3%正丙醇（二氧化碳），备压：4000 psi，柱温：40 ℃
检测器：紫外，
435 nm
说明：胡萝卜素、叶黄素和叶绿素在色谱条件下被完全分开，与反相C18 HPLC色谱结果相比，这些组分的SFC呈正相洗脱行为。这一结果表明，超临界二氧化碳具有很强的非极性，同时，也证明了预装的反相C18可以作为正相固定相来分离该类化合物。
图 1-23 胡萝卜素、叶黄素和叶绿素在SFC中的分离色谱图
I=β-胡萝卜素II=叶绿素b III=叶绿素a IV= 叶黄素V=含氧类胡萝卜素VI=含氧类胡萝卜素
实例：类胡萝卜素在SFC上的分离，见图 1-24所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：SunFire C18 (4.6×250 mm, 5 μm)和Viridis SFC Silica 2-Ethylpyridine (4.6×250 mm, 5 μm)
分析条件：A.二氧化碳，B.乙醇，洗脱梯度：0 min，10%B, 8 min, 17%B, 10 min, 25%B, 15 min, 25%B；备压：120 bar，柱温：32 ℃。
检测器：紫外
说明：通过在线色谱柱串联，8个类胡萝卜素类化合物在10 min内得到分离。1. 鸡油菌素，
2. 虾青素，3. 海胆烯酮，4. 紫黄素，5. 叶黄素，6. 玉米黄素，7.β-胡萝卜素，8. 新叶黄素
图 1-24 类胡萝卜素在SFC上的分离色谱图
实例：三萜类化合物在SFC上的分离，见图 1-25所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Viridis 2-Ethyl-pyridine（4.6×250 mm, 5 μm）和Synergi Polar-RP（4.6×250 mm, 5 μm）
分析条件：5% 甲醇（二氧化碳），备压：15 MPa，柱温：25 ℃
检测器：蒸发光散射检测器（ELSD）
说明：8个三萜类化合物分别为：齐墩果酸，高根二醇，β-香树脂醇，乌索酸，熊果醇，桦木酸，桦木醇和羽扇豆醇。在Viridis 2-Ethyl-pyridine色谱柱上的洗脱顺序为：单元醇
图 1-25 三萜类化合物在SFC上的分离色谱图
（a）Viridis 2-Ethyl-pyridine，（b）Synergi Polar-RP
实例：磷脂在SFC上的分析，见图 1-26所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Supelcosil LC-Diol（4.6×250 mm, 5 μm）
分析条件：A.二氧化碳，B.甲醇，洗脱梯度：0 min，15% B，1 min 15%B，5 min 55%B，10 min 55%B；备压：125 bar，柱温：40 ℃。
检测器：蒸发光散射检测器（ELSD）
说明：四个磷脂类化合物：（a）L-α-磷脂酰乙醇胺(PE)，(b) L-α-磷脂酰胆碱(PC)，(c) L-α-磷脂酰肌醇铵盐(PI)，(d) L-α-磷脂酰-L-丝氨酸(PS)。实验中，考察了添加剂异丙醇胺、三氟乙酸和乙酸铵对分离选择性的影响。PC和PE的洗脱不受添加剂的影响，PS和PI在加入异丙醇胺后分离效果更好，但是PS的色谱峰始终是宽峰。对于该类化合物的分离，乙酸铵的效果比三氟乙酸更好。
图 1-26 磷脂在SFC上的分析色谱图
实例：辅酶Q10氧化还原给状态的SFC分析，见图 1-27所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Chromolith Performance RP-18e（4.6×100 mm）
分析条件：30%甲醇（含0.1% 甲酸铵）的二氧化碳，备压：10 MPa，柱温：35℃。 检测器：质谱（MS）
说明：Ubiquinol-10为还原态的辅酶Q10，Ubiquinone-10为氧化态的辅酶Q10，实验中通过在线超临界提取和超临界色谱分析，检测到了还原态的辅酶Q10，检测量比传统的离线方式要高。结果表明，这个在线提取和检测方法可以避免目标化合物在前处理过程中发生氧化反应。
图 1-27 辅酶Q10氧化还原状态在SFC上的分离色谱图
实例：SFC测定三七及云南白药中人参二醇和人参三醇的含量
分离模式：毛细管SFC
柱系统：SB-Cyanopropyl-50石英毛细管交联柱（50 μm×10 m，膜厚 0.25 μm）
分析条件：纯二氧化碳，起始备压为10.1 MPa，程序升压1.01 MPa/min 至35.5 MPa，柱温：90℃。
检测器：氢离子火焰检测器（FID）
说明：三个化合物：1. 胆固醇（内标物），2. 人参二醇，3.人参三醇。在测定范围内具有良好的线性，采用通用型FID检测器，弥补了在普通HPLC上弱紫外吸收的不足之处。
图 1-28 SFC测定三七及云南白药中人参二醇和人参三醇的色谱图
（A）三七，（B）云南白药
1.5.4 在其他方面的应用
SFC在其他方面还有着非常广阔的应用前景，可用于聚合物及其添加剂的分析，在化工上用于石油化工产品的分析，在环保中用于农药、除草剂等的残留物检测和其他污染物分析，对氨基甲酸酯、拟除虫菊花酯、有机磷、有机氯、有机硫及有机氮类等农药具有良好分离效果还可用于炸药和多环芳烃化合物的分析。而SFC在金属络合物和金属有机化合物中的分析应用也有报道。
SFC分析聚苯醚低聚物（图 1-29），色谱柱采用毛细管柱，固定相为键合二甲基聚硅氧烷，流动相使用纯的二氧化碳，柱温选择120 ℃，在程序升压的洗脱条件下完成分离。
图 1-29 SFC分离聚苯醚低聚物的色谱图
孙云鹏等研究了在不同极性毛细管填充柱上加氢尾油中多环芳烃的分离条件， 选用国产1 mm×150 mm CN填充柱，二氧化碳为流动相，线性升压，FID检测，可在26 min内将烃中3到10环多环芳烃分离，定量重复性好。高连存等研究了9个多环芳烃混合样品的超临界流体色谱分析条件，并与毛细管气相色谱法做了比较，认为SFC比毛细管气相色谱法具有明显的优越性。梅特勒-托利多自动化学部研究人员应用SFC在15 min内完成了对石油产品中的10个低沸点化合物的分离，其分离效果与毛细管气相色谱并无不同。SFC同样适用于较低沸点的低极性化合物。
对于表面活性剂，可以采用传统的HPLC法和GC法，但是HPLC难用于缺乏紫外吸收的非离子型表面活性剂，而大部分表面活性剂的分子量在200-1000之间，属于难挥发或不挥发物质，必须对样品进行预处理，才能用GC分析。近年来毛细管SFC在非离子型表面活性剂的分析研究，显示了SFC在这方面的优越性。周良模等采用的SFC仪器对聚氧乙烯型非离子表面活性剂进行了分析。这种表面活性剂平均分子量650，如果采用传统的GC法，及时在330℃下，也不能得到好的色谱分离。如将样品处理为三甲基硅醚衍生物，在GC上也只能分析分子量在300左右的化合物，而用毛细管SFC进行分离，其峰形、基线和峰数目等都令人满意。对于其它聚氧乙烯型非离子表面活性剂（如Span型和Twean型）及多元醇型非离子表面活性剂所进行的SFC研究也很多，效果也比较理想。但目前对于阴离子、阳离子和两性型表面活性剂的SFC研究工作仍需要进一步开发。
在农业生产中，农药及除草剂发挥着重要作用，它们是一类含有氧、硫、磷和氮杂原子的极性物质，有些还含有热不稳定性。由于SFC是在中等温度下操作，在这类物质分析上，可以发挥一定的作用，更由于超临界萃取（SFE）-SFC的在线、脱线连接，可直接对环境样品进行测试，更加扩大了SFC的测定范围。目前，研究农药的分析，是SFC中一个比较活跃的领域，可测试的品种越来越多，测试下限已经达到pg级。毛细管SFC和填充柱SFC都能完成组分复杂的环境样品的分析。
卤代烃在大气光化学反应中起着重要的作用，它能通过光解反应，产生卤素自由基，从而参与催化破坏臭氧层的反应。目前SFC法被证明用于分析热不稳定性卤代烃（如溴代烷烃）效果较好。多氯联苯（PCBs）是已知的最毒的几类环境污染物之一。目前，PCBs的测定方法主要是GC法。对于测试PCBs组分十分复杂的环境样品来说，GC法分析时间较长、柱温较高及分辨能力较差。Cammanm等以二氧化碳和一氧化二氮为混合流动相，用氰丙基色谱柱测试了沉泥中的PCBs和PAH（多环芳烃）。
金属络合物在超临界二氧化碳中的溶解度相差甚大，这主要取决于络合物的化学性质，而金属有机化合物通常能溶解在超临界二氧化碳中。过渡金属、重金属、镧系、锕系等络合物，以及金属有机化合物（二茂铁及其衍生物）等，都在SFC上得到了较好的分离。金属络合物和金属有机化合物的超临界萃取（SFC）和分离主要是取决于选择适合的螯合剂。氟化螯合剂在金属离子的系统内络合-SFE以及金属有机化合物的SFC方面是十分有效的。有机螯合物取代金属络合物中配位水分子，能增加其在超临界二氧化碳中的溶解度以及改善在SFC中的分离。加合物的形成对提高金属络合物的SFE/SFC的有效性极为有用。含磷和硅的螯合物，同样可在二氧化碳中形成溶解度较高的金属络合物。在较低温度下，与一般GC相比，SFC能在较短的时间内，提供金属络合物和金属有机化合物的色谱分析。 实例：杀虫剂在SFC上的分析，见图 1-30所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Inertsil ODS-EP（4.6×100 mm，5 μm）
分析条件：(A) 二氧化碳， (B)甲醇（0.1 %甲酸铵），洗脱梯度：5% B(2 min), 5–10% B(5 min), 10–40% B(2 min), 40% B(8 min), 40–5% B(1 min), 5% B(2 min)。柱温：35 ℃。 检测器：质谱（MS）
说明：分离的杀虫剂为：1. 二溴杀草快，2. 乙膦酸，3. 马来酰肼，4. 丁酰肼，5. 甲胺磷，
6. 灭多虫，7. 啶虫脒，8. 多菌灵，9. 甲菌定，10. 噻氟菌胺，11. 四溴菊酯，12. 甲氨基阿维菌素苯甲酸盐，13. 定虫隆，14. 灭螨醌，15. 哒螨灵，16. 氯氰菊酯，17. 醚菊酯。这些化合物的极性相差较大，log Pow介于−4.6-7.05之间，在反相色谱柱上能在11 min内得到分离。采用质谱检测器，在实验范围内，各个化合物具有良好的线性和较低的定量限（μg/L级别）。传统上，敌草快(log Pow = –4.6)需要采用离子色谱或离子对色谱进行分析，而氯氰菊酯(log Pow = 6.6) 和四溴菊酯(log Pow = 5.05)需要用GC分析。SFC能够在同一条件下完成这些化合物的分离。结果也表明，SFC可用于不同极性化合物的分离。
图 1-30 杀虫剂在SFC上的分离色谱图
实例：汽车润滑剂添加物在SFC上的分析，见图 1-31所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Gammabond RP-18（4.6×100 mm，5 μm）
分析条件：纯二氧化碳，程序升压洗脱：在10 min内备压从100 bar升至300 bar，柱温：80℃。
检测器：氢离子火焰检测器（FID）
说明：润滑剂添加剂依次为：1. Irganox L08，2. Lowinox DBNP，3. Irganox L115，4. Irganox L57，6. Lowinox TBP-6，7. Lowinox TBM-6，8. Lowinox dLTDP，9. Irgafos 168，
10. Irganox L03，11. Lowinox DSTDP，12. Lowinox TNPP。使用纯的二氧化碳为流动相，在通用型FID检测器的条件下，完成小分子化合物的分离。采用烷基键合的固定相，降低了硅醇基作用，中等极性的化合物能得到较好的分离。
图 1-31 汽车润滑剂添加物在SFC上的分离色谱图
1 超临界流体色谱法
色谱是用于样品组分分离的一种方法，组分在两相间进行分配，一相为固定相，另一相为流动相。固定相可以是固体或涂于固体上的液体，而流动相可以是气体、液体或超临界流体。超临界流体色谱(Supercritical fluid chromatography) 就是以超临界流体做流动相依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的色谱过程。它是集气相色谱法和液相色谱法的优势而在20世纪70年代发展起来的一种色谱分离技术。超临界流体色谱不仅能够分析气相色谱不宜分析的高沸点、低挥发性的试样组分，而且具有比高效液相色谱法更快的分析速率和更高的柱效，因此得到迅速发展。
1.1 概述
1.1.1 超临界流体及其特性
自从1869年Andrews首先发现临界现象以来，各种研究工作陆续展开，其包括1879年Hannay和Hogarth测量了固体在超临界流体中的溶解度，1937年Michels等人准确测量了二氧化碳临界点的状态等等。对于某些纯净物质而言，根据温度和压力的不同，呈现出液体、气体、固体等状态变化，即具有三相点和临界点，纯物质的相图如图 1-1所示。在温度高于某一数值时，任何大的压力均不能使该纯物质由气相转化为液相，此时的温度即被称之为临界温度Tc；而在临界温度下，气体能被液化的最低压力称为临界压力Pc。在临界点附近，会出现流体的密度、粘度、溶解度、热容量、介电常数等所有流体的物性发生急剧变化的现象。当物质所处的温度高于临界温度，压力大于临界压力时，该物质处于超临界状态。温度及压力均处于临界点以上的液体叫超临界流体(Supercritical fluid，SF)。
图 1-1 纯物质的相图
超临界流体由于液体与气体分界消失，它的流体性质兼具液体性质与气体性质，见表 1-1所示。从表 1-1
中的数据可知，超临界流体的扩散性能和粘度接近于气体，因此溶质
的传质阻力较小，能更迅速地达到分配平衡，获得更快速、高效的分离。另一方面，密度与液体相似，这样可以保证超临界流体具有与液体比拟的溶解度，因此在较低的温度下，仍然可以分析热不稳定性和分子量大的物质，同时还能增加柱子的选择性。此外，超临界流体的扩散系数、粘度等都是密度的函数。通过改变液体的密度，就可以改变流体的性质，达到控制流体性能的目的。
表 1-1 气体、液体和超临界流体的物理性质的比较
名称 密度 ρ/g·ml-1 粘度 ŋ/g(cm·s)-1
(1-3)×10-4
(1-3)×10-4
(3-9)×10-4
(0.2-3)×10-2 扩散系数 D/cm2·s-1 0.1-0.4 0.7×10-3 0.2×10-3 (0.2-2)×10-2 气体常压（15-(0.6-2)×10-3 60℃） 0.2-0.5 超临界流体Tc,Pc- 0.4-0.9 Tc,4Pc 液体（有机溶剂，0.6-1.6 水，15-60℃）
1.1.2 超临界流体色谱法及其特点
超临界流体具有液体相似的溶解能力，溶解能力比气体大，能溶解固体物质，这种溶解性质被用于分离过程，最先用于萃取技术-超临界流体萃取法（supercritical fluid extraction, SFE）。后来，将超临界流体用作色谱的流动相，建立了超临界流体色谱法。
SFC因其超临界流体自身的一些特性，使得SFC的某些应用方法具有超过液相（LC）、气相（GC）两者的有点，有其独到之处，但它并不能取代这两类色谱，而是它们的有力补充。
1. SFC与GC的比较
a) SFC可以用比GC更低的温度，从而实现对热不稳定化合物进行有效的
分离。由于柱温降低，分离选择性改进，可以分离手性化合物。
b) 由于超临界流体的扩散系数比气体小，因此SFC的谱带展宽比GC的要
窄。
c) SFC溶剂能力强，许多非挥发性组分在SFC中溶解度较大，可分析非挥
发性的高分子、生物大分子等样品。
d) 选择性较强，SFC可选用压力程序、温度程序，并可选用不同的流动相
或者改性剂，因此操作条件的选择范围较GC更广。
2. SFC与LC的比较
a) 分析时间短，由于超临界流体粘度低，可使其流动速率比高效液相色谱
（HPLC）快得多，在最小理论塔板高度下，SFC的流动相速率是HPLC
的3-5倍左右，因此分离时间缩短。
b) 总柱效比LC高，毛细管SFC总柱效可高达百万，可分析极其复杂的混
合物，而LC的柱效要低得多。当平均线速率为0.6 cm/s时，SFC法的柱
效可为HPLC法的4倍左右。
c) SFC的检测器应用广。SFC可连结各种类型的GC、LC检测器，如氢离
子火焰（FID）、氮磷检测器（NPD）、质谱（MS）、傅里叶变换红外
光谱（FTIR）以及紫外（UV）、荧光（FLD）等检测器。
d) 流动相消耗量比LC更低，操作更安全。
通常，在SFC中由于极性和溶解度的局限，使用单一的超临界流体并不能满足分离要求，需要在超临界流体中加入改性剂。在SFC中，选择性是流动相和固定相两者的函数，在GC中溶质的保留受流动相压力及其性质的影响较小，故选择性基本上是固定相的函数，在LC中可用梯度洗脱，改变流动相的性质，从而影响溶质的保留。在SFC中流动相的极性也可采用梯度技术（加入改性剂）加以调整，达到与LC同样的梯度效果。同时，SFC中的压力程序（通过程序升压实现流体的密度改变达到改善分离的目的）相当GC中程序升温技术。
1.1.3 超临界流体色谱法的分类
超临界流体色谱根据所用的色谱柱不同可分为两种，用填充柱的称为填充柱超临界流体色谱（packed column supercritical fluid chromatography, pcSFC），用毛细管柱的称为毛细管超临界流体色谱（capillary supercritical fluid chromatography），两者各有所长并已建立了相应的方法和理论，相比较而言，毛细管SFC具有更多优点，但目前填充柱SFC应用更广泛些。超临界流体色谱中的填充柱可使用普通HPLC中的色谱柱，目前已有部分商品化专用于SFC的填充色谱柱。
根据色谱过程的用途，也可分为两种，分析型SFC和制备型SFC。分析型SFC主要用于常规的分析。制备型SFC常用超临界二氧化碳作为流动相，由于二氧化碳便宜、环保、安全的特点，而得到广泛应用。而且二氧化碳在常温下易除去，样品的后处理过程较制备型HPLC简单，因此制备型SFC应用广泛，特别是在手性制备的领域。
1.1.4 超临界流体色谱的发展
用超临界流体作色谱流动相是由Klesper等人于1962年首先提出的，他们首先报道了用二氯二氟甲烷和一氯二氟甲烷超临界流体作流动相，成功地分离卟啉衍生物，之后发展了填充柱SFC的技术，用以分离聚苯乙烯的齐聚物。随后Sie和Rijnderder等人又进一步研究了SFC的方法，研究了二氧化碳、异丙醇、正戊烷等作流动相的问题，并以此技术分析了多环芳烃、抗氧化剂、燃料和环氧树脂等样品。60年代末，由于Sie和Giddings等人的卓越工作，解释了SFC在各方面的应用潜力，并于是了SFC的前途极其光明。在这个时间，也是HPLC高速发展的时期，而SFC的发展却不如HPLC那么迅速，这主要是在使用超临界流体时遇到了一些实验方面的问题，所以发展较慢。直到80年代初，SFC才开始焕发出新的光辉，得到了日趋完善的发展。
1981-1982年惠普公司在皮茨堡会议上发布了SFC色谱仪，在此期间Berger和Gere等人进行了一系列的研究。此后这一技术得到了迅猛的发展，研究论文数急剧增加，其他科学公司也相继推出了超临界流体色谱的商品仪器。SFC在发展之初，着重于毛细管柱的使用，当时的主要研究者来自于GC领域而非HPLC领域。但是，随后SFC的发展遇到瓶颈，毛细管SFC很难满足药物中极性化合物的分析，而且该技术的一些固有的缺点，仪器条件要求比较高，未能普及应用。此后，填充柱色谱逐渐受到研究者的青睐，它使用与HPLC
类似的装置，而且在超临界流体中加入改性剂，增加了流体对化合物的溶解能力，大大增加了SFC的应用对象。近些年SFC的应用主要集中在填充柱SFC上。自SFC技术自上个世纪90年代以来每年发表在SCI上的文章数如图 1-2所示。
图 1-2 90年代以来SFC在SCI上每年发表文章统计
1.1.5 超临界流体色谱的一般流程
SFC的一般流程如所示。超临界状态流体源（二氧化碳）在进入高压泵之前预冷却，高压泵把液态流体经脉冲抑制器注入在恒温箱中的预柱，进行压力和温度的平衡，形成超临界状态流体，进入色谱柱。要保持整个系统的压力，在泄压口处装限流器或备压控制器，这也是SFC仪器与普通HPLC仪器最大的差别之处。
1.2 基本原理
SFC的流动相主要采用二氧化碳，一氧化氮和氨气等，其中主要使用二氧化碳作为超临界流体。SFC的固定相可采用固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的聚合物，现在研究比较多的是液相色谱的柱填料。
分离机理：吸附与脱附，组分在两相间的分配系数不同而被分离。
压力效应：SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），压力对分离有显著影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）。SFC流体的密度受压力影响显著，在临界压力处具有最大的压力，超过该点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对密度的影响较小。超临界流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，色谱峰的出峰时间缩短。
1.2.1 超临界流体色谱法的基本概念
SFC中的一些基本概念，如保留时间（tR）、容量因子（k）、选择性（α）、柱效（N）和分离度（R）等参数，其定义和公式同普通的LC和GC。本节简述相对变数和超临界流体的溶剂力。
相对变数（reduced variable），是指某一参数与其临界变数之比值，也叫折合变数、归一变数或简化变数，主要有相对压力（Pr）、相对体积（Vr）、相对温度（Tr）和相对密度（ρr），定义式为
PrTPV Vr Tr r TcPcVcc
式中Pc、Vc、Tc、c分别为临界压力、临界体积、临界温度和临界密度。
图 1-3 各种具有液体密度的压缩气体与液体的溶剂力比较分度表
(1 cal=4.1868 J)
超临界流体的溶剂力目前还没有一个严格定义，但可给出一个合理的分度表，Gidding认为，溶剂力主要由“状态效应”（如密度、分子间距离等）和“化学效应”（极性、酸碱性、氢键亲和力等）组成，可以用Hildbrand溶度参数（δ）表示
a V
式中，a为分子间引力，V为摩尔体积，δ为溶度参数，cal/cm3 或者 J/cm3
各种流体的溶剂力与液体比较的分度表见图 1-3所示，由图 1-3可看出，超临界流体状态二氧化碳的溶剂力与异丙醇（45.22 J/cm3）、吡啶（44.80 J/cm3）相当，即相当于极性较强的溶剂，故可溶解并分析大部分非极性、中等极性样品，一氧化氮的溶剂力（44.38 J/cm3）与二氧化碳相似，当分离需要溶剂力更强的流动相时，可选用氨气（55.27 J/cm3），对于那些不能用二氧化碳来分离的碱性胺类物质，氨是很好的流动相，n-C4和n-C5是非极性流动相，分离非极性样品时选用。
1.2.2 超临界流体色谱法的速率理论
实验发现，描叙流速对柱效影响的Van Deem特人方程和Golay方程仍适用。
1. Golay速率理论
毛细管SFC的速率理论模型与毛细管GC相同，其总塔板高度也是由分子扩散、流动相传质、固定相传质三相加和而成，经许多学者验证，Golay涂壁开管柱速率理论方程适合用于毛细管SFC，其方程为
2kd22Dm(16k11k2)r2ufuH 22u96(1k)Dm3(1k)Ds
式中，Dm为溶质在流动相中的扩散系数，cm2/s；Ds为溶质在流动相中的扩散系数，cm2/s；r为柱内径；df为固定相的液膜厚度，cm；u为流动相的线速度，cm/s；k为容量因子。
该方程式指出了操作参数对柱效的影响，当Dm、Ds、k确定后，H-u曲线就成为双曲线，Golay方程可简化为
HBCmuCsu u
式中，B/u为纵向扩散对塔板高度的贡献；Cmu为流动相传质对塔板高度的贡献；Csu为固定相传质对踏板高度的贡献。
2. 填充柱的速率方程
对填充柱SFC，目前尚未给出一个精确的塔板高度方程。一些研究沿用了普通HPLC中的范式方程，有一定的借鉴意义。方程式为
HABCu u
式中，A为色谱柱中多路径效应对塔板高度的贡献；B/u为纵向扩散对塔板高度的贡献；Cu为传质阻力对塔板高度的贡献。
Knox给出适合填充柱SFC的折合塔板高度方程，方程式为
hAv1/3BCv v
式中，h和v分别为折合塔板高度和折合线速度；A、B和C为特征常数，其特征值A=1-2，B=2，C=0.05-0.5，而h和v的值在实践中常为3和10。
1.2.3 影响踏板高度的因素
结合速率方程可知，影响踏板高度的因素主要有线速度、柱直径、液膜厚度和密度，对填充柱SFC而言还包括色谱柱的粒径和填充的均匀度。
1. 流动相线速度对塔板高度的影响
由图 1-4中曲线的最低点处的线速度即为最佳线速度uopt，对应的塔板高度为最小塔板高度Hmin。在Hmin处，色谱柱有最佳的柱效，但最佳线速度却不是很高。对于SFC，塔板高度随线速度的增加而缓慢增加，特别是在流动相密度较低时，增加更加缓慢，曲线趋于平滑。因此，在实际操作中可采用3-5倍的最佳线速度为操作线速度，从而加快了分析速度。
图 1-4 SFC H-u曲线
2. 柱径对塔板高度的影响
Lee等采用直径为0.25 μm，SE-54石英交联柱，研究了柱径对柱效的影响，如图 1-5所示，最佳线速度反比于柱径，塔板高度则与柱径成正比，降低柱径将导致塔板高度降低，有利于提高柱效。另一方面，柱径还影响压差，在毛细管SFC的实践中，限制使用长柱子的因素之一是通过柱子的压力差。压差是柱长的函数，而反比于柱径的平方。图 1-6表示了柱径和柱长与压差的关系，柱径小于50 μm显示出较大的压差，这就限制了特细色谱柱的应用。而一般常用的柱压差为3%，这表明柱内径大于50 μm时可使用较长的色谱柱而无压差大之虑。事实上，控制线速度的是阻力器，而阻力器产生了约80%的压力差。
3. 固定相液膜厚度对柱效的影响
固定相液膜厚度对塔板高度的影响如所示，对不同k值（k=1-5）组分，液膜厚度在0.25-1.0 μm范围变化，对H的影响很小，甚至可用更厚的液膜，这取决于所能允许的分离度的损失，最佳流速随液膜厚度的增加而降低，且曲线更加陡峭。在SFC中可采用比GC更厚的液膜，承受更大的样品容量，以补偿检测器灵敏度的不足。
4. 流动相密度塔板高度和最佳线速度的影响
在SFC中实际上是流动相的密度而不是压力控制着各种色谱柱参数。密度ρ对塔板高度和最佳线速度的影响如图 1-8所示。从图中发现，当操作条件一定时，随流动相ρ值增加，最佳线速度在减小，而且曲线变陡。但其H值保持不变，说明程序升密度时并不影响柱效。
图 1-5 不同柱径上的H-u曲线
图 1-6 柱径、k值对柱效的影响
图 1-7 液膜厚度对H-u曲线的影响
图 1-8 流动相密度对H-u曲线的影响
1.3 超临界流体色谱法的操作条件
超临界流体色谱法操作条件根据填充柱和毛细管柱的不同，进而选择适合的操作条件，主要有固定相和液膜厚度、流动相及其线速、压力和密度、柱温和检测室温度，还有柱径、柱长、阻力器和检测器的选择。
1.3.1 超临界流体色谱的色谱柱
不论是毛细管柱还是填充柱，SFC对固定相的要求，首先是抗溶剂冲刷，即在大量溶剂冲淡、加压和减降，体积膨胀和收缩后，稳定性好；其次是化学稳定性好，选择性高，即固定相不与组分发生化学反应，且带有一定基团，呈现出良好的选择性；再次是热稳定性好，使用温度范围较宽。同时固定相的选择也要考虑流动相的性质。
1. 填充柱
虽然在80年代初主要是发展了毛细管SFC，但是填充柱SFC也得到一定的发展。而填充柱SFC色谱柱，几乎使用了所有的反相和正相HPLC键合相填料，固定相有非极性、中等极性和极性，使用最多的是硅胶和烷基键合硅胶，正相色谱填料中的二醇基、腈基、2-乙基吡啶等键合硅胶也有不少应用。
在SFC中，流动相的密度对保留值有很大的影响，溶质的保留性能要靠流动相的压力来调节。在填充柱SFC中，由于柱压降很大，比毛细管柱要大30倍，因而在填充柱SFC色谱柱的入口处和出口处，其保留值由很大差别，也就是说在柱头由于流动相的密度大、溶解能力大，而在柱尾则溶解能力变小。但是超临界流体密度受压力的影响在临界压力处最大，超过此点以后影响就不是太大，所以在超过临界压力20%的情况下，柱压降对填充柱SFC结果的影响就不那么明显了。
在填充柱SFC中，由于色谱柱的相比（β）小、固定相和样品接触和作用的几率比较大，所以要针对所分析的样品很好地选择固定相。在用填充柱SFC分析极性和碱性样品时，常会出现不对称峰，这是由于填料的硅胶基质残余硅羟基所引起的离子作用。如果使用封尾填料制成的色谱柱就会在一定程度上解决这一问题。但是由于基团的立体效应，不可能把硅胶表面所有的硅醇基全部反应。将各种齐聚物和单体处理硅胶，并把这些齐聚物和单体聚合固定化到硅胶表面上。这样就大大改善了色谱峰的不对称现象。
在超临界流体色谱的填充柱中也有用微和亚微级填充柱的，填充1.7-10 μ的填料，内径几个毫米。还有用内径为0.25 mm的毛细管柱填充3-10 μm填料的毛细管填充柱。
2. 毛细管色谱柱
在毛细管超临界流体色谱中使用的毛细管柱，主要是细内径的毛细管柱，内径为50 um和100 um。SFC的操作温度比GC低，因此SFC可用的固定相较GC多。但由于SFC的流动相是具有溶解能力的液体，所以毛细管柱内的固定相必须进行交联，并且在老化处理中，加长老化时间，以使液膜牢固。所使用的固定相有聚二甲基硅氧烷、苯甲基聚硅氧烷、二苯甲基聚硅氧烷、含乙烯基的聚硅氧烷、正辛基、正壬基聚硅氧烷等，在手性分离中使用了连结手性基团的聚硅氧烷。
在毛细管SFC中，液膜厚度主要受样品的挥发性和检测器灵敏度限制。薄液膜毛细管柱可达快速高效，适合分析非挥发性的样品。但样品容量低、检测器灵敏度要求高。厚液膜毛细管柱，样品容量大，柱效损失小，可接各种检测器，对于一般样品的分析，柱效和柱容量能得到兼顾，应用面广。
1.3.2 超临界流体色谱的流动相和改性剂
1. 超临界流体的溶解性能
超临界流体色谱的流动相特点，主要是它在不同压力下有不同的溶解各种样品的能力。 溶剂的溶解能力常用溶解度常数δ来描述。溶解度常数δ的定义为
E v
式中，E是分子的摩尔内聚能；v 是分子的摩尔体积。
而δ和化合物临界参数的关系为
1.Pcρc ρ1
式中Pc是临界压力；ρc是和Pc对应的密度；ρ1是化合物在液态形式下的密度。 式中的1.Pc项称化学效应项，它和分子里内部作用力有关，而ρc项称为状态效应项，ρ1
它和分子的摩尔体积有关。从方程中可以看出溶解度常数随超临界流体密度的增加而增加。研究经验表明，当两组分的δ之差的绝对值小于2.04MP1/2时，二者的互溶性就好，或者或二组分的δ约接近，其互溶性就好。对二氧化碳的超临界流体的δ可用式计算
8.54ρ
计算误差约为10%。
2. 流动相的选择原则
SFC的流动相为压缩状态下的流体，有较多的气体或液相可供选择，其选择原则为：临界常数越低越好；对样品有合适的溶解度；化学惰性，不与样品等作用；能与检测器匹配，还需安全不易爆炸；价格便宜，方便易得等。
3. 常用流动相
SFC可以使用的超临界流体列于表 1-2中。由表可见，二氧化碳的临界温度（Tc）和临界压力（Pc）均较低，且是无毒、化学惰性、热稳定性好且便宜，并能用于大多数的检测器，但样品中含有氨或者氨基时，能发生反应因而不能使用。但是二氧化他并不是SFC理想的超临界流体，主要是它的极性太弱，对一些极性化合物溶解能力差。在表 1-2中的下半部分是极性的超临界流体。氨也可用作流动相，主要用于碱性化合物，氨能与六氟化硫一起使用，但不能与二氧化碳在一起使用。但是氨的溶解能力太强，不适合于硅胶类固定相，甚至连一些仪器的部件也能溶解。在高压下，正戊烷、二乙醚、甲醇和异丙醇等加热至200℃时，仍保持稳定，也可作流动相。在实际使用中仍然以二氧化碳为最多。有研究者进行过系统的研究认为：下列常用超临界流体的溶解能力，在相同的压力下其次序为
乙烷
在同样情况下，分离能力按下列次序增加
二氧化碳
早起的萃取研究表明，选择SFC流动相的另一个着眼点是和检测器相匹配，如果使用UV检测器，上述超临界流体均可使用。如果考虑到使用FID，流动相要不可燃，只有二氧化碳、六氟化硫和氙可以使用。氙适合于使用红外检测器，因为它是惰性气体，在检测波段处无红外吸收。另外，SFC/MS联用可用氙作流动相。二氧化碳是一种非极性溶剂，
低分子量和非极性化合物可以在超临界二氧化碳流体中溶解，当极性和分子量增加时溶解度就下降。表 1-3是各种物质在超临界二氧化碳流体中的溶解度。
表 1-2 SFC中使用的超临界流体
表 1-3 一些物质在超临界二氧化碳流体中的溶解度表
4. 改性剂
二氧化碳是最常见的流动相，由于它是非极性溶剂，欲增加其在SFC中队极性化合物的
溶解和洗脱能力，常常在二氧化碳中加入少量的极性溶剂。这些改性剂包括甲醇、异丙醇、
乙腈、二氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环、二甲基酰胺、丙烯、碳酸盐、甲酸和水等。最常用的改性剂是甲醇，其次是其他脂肪醇。在戊烷中加入甲醇或者异丙醇作为阻滞剂以减少吸附效应，使之较纯戊烷在相同时间内可洗脱出更多的组分。在非极性流体中加入适量的极性流体，可以得到降低保留值，改进分离的选择性因子，达到改善分离的效果，提高柱效。这种在流动相中加入改性剂的流动相可称为混合流动相。混合流动相目前研究仍较为活跃。
混合流动相的近似临界常数可用Kay法计算
Tc,MYATc,AYBTc,B
Pc,MYAPc,AYBPc,B
式中，Tc,M，Pc,M分别为混合流动相的近似临界温度和临界压力；Tc,A，Tc,B，Pc,A，Pc,B分别为纯组分的临界温度和临界压力；YA和YB分别为各组分相应的摩尔分数。
对于改性剂的作用机理，进行了大量的研究工作。除了溶质的增加溶解度以外，改性剂还可以起到如下的色谱作用：掩盖了固定相上残留的硅醇基活性基团；改善了流动相与固定相的表面张力。对于中等极性的物质，在超临界二氧化碳中加入一定量的极性有机溶剂便可达到理想的分离目的；而对于强极性的化合物仅加入极性改性剂是不够的。为实现对强极性物质的SFC 分离，在改性剂中加入了微量的强极性有机物(称之为添加剂)成功地分离了有机酸和有机碱。流动相中微量强极性添加剂的加入拓宽了SFC的适用范围。
5. 流动相的流速
流动相的流速是影响分离柱效和分析速度的操作参数。流动相流速选择的原则是快速、高效。由前所讨论，尽管SFC的最低塔板高度很低，但最佳线速度却很小，很难达到快速分析的目的。超临界流体的流速可远大于LC的流速，多采用3-5倍LC流速作为流动相的流速。
1.3.3 超临界流体色谱的温度
1. 色谱柱温度
色谱柱温度对保留值的影响是复杂的，一般要大于或等于超临界流体的临界温度。Chester研究了柱温和保留的关系，导出了以下的公式
lgk0.43HmHs0.43lg RTRT
式中，k为容量因子；Hm为溶质在流动相中的溶解热；Hs为溶质在固定相中的熔解热；为柱子的相比；R为气体常数；T为热力学温度。
式中第1项为类似LC溶解作用对保留的贡献，第2、3项为类似GC挥发作用对保留的。理想的情况，lgk对1/T作图应为直线，但这种情况并不总是存在。一些研究表明，当温度区间范围较小的时候线性关系才成立，因为小的温度范围，超临界流体的密度变化较小，溶解度变化不大。Takeuchi等验证了柱温对芳烃、邻苯二甲酸二烷基酯的影响，并说明了
可用正或负温度程序进行分离，柱温也常选择为：对于一般样品分析，柱温应先在高压GC区，在100-125℃；当没有压力或密度程序时，在恒压下SFC区（100℃）可利用程序升温提高高沸物的扩散系数、粘度而改进分离。
2. 检测器温度
关于检测器的温度大致分为破坏型和非破坏型两类，其检测器温度应有所不同。
a) 破坏型检测器
火焰基破坏型检测器，如FID、FPD、TID、RPD等，为补偿流动相减压气化所吸收的热量及高分子量物质气化所需要热量，必须给予足够的热量，一般应保持在250-450℃，通常为350-400℃，检测器温度基本上与FID灵敏度无关，但有报道，FID温度每增加100℃灵敏度提高约1%，但检测器温度的提高还要受某些限制，如石英弹性阻力器的聚酰亚胺保护漆在400℃以上会有很快老化变质，并且FPD温度增高灵敏度下降等。
b) 非破坏型检测器
光谱型非破坏型检测器、UV、荧光检测器，其阻力器置于检测器之后，其温度一般为室温或柱温，而FTIR的阻力器出口则应加以冷冻等。
1.3.4 压力和密度
流动相压力和密度在每一温度以下同样方式影响保留，在类似GC区，增加压力，lg k值降低，在较低温度下，类似LC区，lg k随压力增加而增加。选择适当的密度程序可使多组分混合物得到最佳分离，提高分离速度（图 1-9所示）。
图 1-9 程序升压对SFC分离改善的效果图
实验条件：柱：DB-1；流动相：二氧化碳；温度：90℃；检测器：FID
样品：1-胆甾辛酸酯 2-胆甾辛葵酸酯 3-胆甾辛月桂酸酯 4-胆甾十四酸酯 5-胆甾十六酸酯 6-胆甾十八酸酯
Chester等研究了流动相的密度对保留值的影响，对于一个特定的溶质lg k正比于流动相的密度ρ
lgklgk0S
式中，k0是ρ=0时的k，k0是温度的函数；S为比例常数。
密度程序是SFC最重要的操作参数，一个非挥发性多组分混合物能否分离好，关键是程序设计及选择。Fjeldsted等研究了毛细管SFC的压力和密度程序，由于流动相的密度是两相间分配的重要因素，由压力密度数据，经n级多项式回归分析得到一个六元多项式逼近的压力、密度关系式。采用适当的软件控制，可建立任何希望的密度程序，包括线性压力、线性密度和非线性（渐近线）密度程序。实现程序升密度有两种方法，，一种是改变温度，另一种是改变压力。但改变压力的方法较为灵敏，并且容易控制。因此，通常采用改变压力的方法。通过程序升压，可控制流动相的溶解能力，有利于提高选择性和分离效率，有利于对具有宽范围分子量的混合物进行快速分离。
SFC中的程序设计有：线性压力程序；线性密度程序；非线性密度程序；同步非线性密度、温度程序，一般根据样品要求具体对待。
1.3.5 柱径、柱长和阻力器
柱径、柱长和阻力器是影响柱效、分析速度的操作变数。对填充柱来说，改变的余地较小，而对毛细管柱则有较大的选择性。
在毛细管SFC中柱径与柱效和最佳线速度成反比。降低柱径将导致最佳线速度增加和柱效的提高，有利于分离，但是柱径减低对同样液膜厚度的毛细管柱，将导致柱容量急剧下降，和柱压差的大幅度增加。这就限制了特细内径、高效柱的应用。一般直径大于50μm，柱压差小于3%，柱效和柱容量都较好，故毛细管SFC通常选用大于50μm的柱径。对于一般分析应用，可选用50 μm的毛细管柱，在已有的毛细管SFC应用中约占60%。对于常规分析，也可选用100 μm的毛细管柱，在已有的毛细管是FC应用中约占20%。
在毛细管SFC中，柱长与总柱效和柱容量成正比，增加柱长将增加总柱效和柱容量，对分离多组分混合物很有利，但需要延长分析时间，因此在SFC中：对于常规分析，可选用3-5 m的毛细管柱；对于一般分析应用，可选用10 m的毛细管柱；对复杂的多组分分析，可选用15-20 m的毛细管柱。
阻力器或备压调节器是SFC中影响分离的一个特殊部件。通常接到色谱柱后，以保证超临界流体在整个色谱柱分离过程中和整个系统中始终保持为流体状态，而阻力器后流动相就降为大气压。常用的阻力器有直管型、小孔型和多孔玻璃型。对于火焰基检测器，阻力器接到色谱柱后和检测器喷嘴之间，对于光谱型检测器接到检测器出口。对于复杂样品及一般应用，可选用多孔玻璃型阻力器，由烧结玻璃段的长短决定线速度，使用方便，效果好。对于一般样品分析，可选用小孔及锥型阻力器。对于紫外、荧光检测器，可在出口接直管型阻力器，调整阻力器长短，能确定流动相线速度。
1.4 超临界流体色谱法仪器
以超临界流体作流动相的色谱仪器称为超临界流体色谱仪，它与气相色谱仪和高效液相色谱仪类似，同样包括流动相、净化系统、高压泵、进样系统、色谱柱、检测器和数据处理系统。长期以来，SFC仪器一直处于实验室自制水平，直到20世纪80年代才逐渐有商品化仪器。SFC仪器主要包括三个组成部分（图 1-10所示）：输送系统，其功能为在超临界压力下输送流动相；精密的恒温箱，保证系统的恒温性；控制系统，以实现超临界压力或密度等变化及色谱柱柱温温度调节等。高压流体（如二氧化碳）由气源流经净化管及热平衡装置后，进入二氧化碳高压泵，然后和有机改性剂混合，经过热平衡进入进样阀，样品由进样阀导入系统，然后经色谱柱分离后进入检测器，最后经过阻力器，整个系统由计算机控制。
图 1-10 填充柱SFC仪器示意简图
它与气、液色谱的主要区别是
a) 超临界流体色谱仪必须装有阻力器（或备压调节器）。它的作用是对系统维持一个合适的压力，为使流体在整个分离过程中始终保持在超临界流体状态；另
一方面通过它使流体转换为气体，实现相的转变。当使用氢火焰离子化检测器
时，阻力器应放在检测器之前（以保证色谱柱的出口压力缓慢地降至常压）。
使用其他（能承受高压的）检测器时，阻力器可放在检测器之后，如紫外检测
器。为防止高沸点组分的冷凝，阻力器一般应维持在300-400℃。
b) 色谱柱应有精密的温控系统，以便为流动相提供精确的温度控制。
c) 整个SFC色谱仪器都处在足够的高压下，只有这样才能使流动相处于高密度状态，以提高洗脱能力，因此，超临界色谱仪必须有精密的升压控制装置。
d) 当使用极性较弱的超临界流体（如二氧化碳）作为流动相，在分离分析极性化合物或相对分子量高的化合物时，常需加入甲醇、乙腈等有机改性剂，以改善
流动相对极性样品的溶解能力，扩大流动相样品的适用范围。
e) 由于有机改姓剂的加入和流体流速对分离效果影响明显，因此要求输送系统具
有较高的精密度，用以保证色谱分离的重复性。
因此SFC仪器要求的操作条件很高，对仪器各部件的制造和连结都提出了新的要求。早起的理论或应用研究中，SFC设备多由实验室改装气体色谱仪或液相色谱仪而成，目前已有多钟商品化的SFC仪器问世。例如用HPLC进行改装时，只要在原有设备基础上添加高压进样器和压力控制系统，并根据需要选择合适的高压检测器，即可将HPLC改装成简易的填充柱SFC。因为SFC在高压状态下操作，因此改装时必须解决好压力控制问题，既要使流体在系统中保持超临界状态，又要防止管线堵塞和泄露。商品化的SFC有Berger公司的SFC系列、Agilent公司的1200 SFC系列和Waters公司的UPSFC系列等。与之前的通过HPLC仪器组装的SFC仪器不同，现代SFC仪器越来越注重仪器的整体化，通过整体设计(系统体积小)，色谱柱技术的改进（色谱柱颗粒小），能使色谱分离在一个梯度条件下，不仅基线噪音极低，而且重复性好、峰形窄、峰宽一致。
1.4.1 流动相输送系统
流动相输送系统或为高压泵系统，是SFC的关键部件，对泵的要求便于SFC的最佳化操作。具体要求：无脉冲输送；泵体较大；能够精密控制压力和流量；具有线性或非线性压力密度程序；适于超临界流体。目前在应用上有注射泵和往复泵，在该系统中，还有二氧化碳增压器和泵的程序控制。对于室温常压为气体的流动相，可将高压钢品中的流动相减压至所需压力或用升压泵增压。对于室温常压为液体的流动相，通常采用无脉动注射泵输送。
在毛细管SFC中，由于所需流量很低，大都采用注射泵。其优点是无脉冲，泵体大于
150 mL，充液一次可用几天，耐压性好，基本上符合泵的设计要求，因此被广泛推荐使用。缺点是其泵体有时需要冷却，更换溶剂时清晰困难，无法进行梯度（如加改性剂）冲洗。 当前LC中广泛使用的输液泵是往复泵，不仅易于操作，可快速该换溶剂，无限输送溶剂，而且可采用双泵系统，一泵输送流动相，另一泵加改性剂，进行梯度洗脱。但往复泵不能直接输送液体二氧化碳，需要对泵体加以改装，并用冷冻剂将泵头冷至-8℃，才能输送液体二氧化碳。还有采用二氧化碳增压器，即增加液体二氧化碳的头压就可在室温下注入注射泵。国外都以氦气充入二氧化碳钢瓶，国内多以氢气代替氦气制成二氧化碳钢瓶，效果很好。一般是在二氧化碳钢瓶瓶嘴下，焊一根不锈钢管，直插瓶底，装进二氧化碳后，接氦气或氢气钢瓶。
在SFC中注射泵、往复泵的控制参数，通常是压力而不是流量。泵的流出压力一般由计算机控制。以设定点压力与世纪压力进行比较控制流出压力。实际压力是由泵出口处的压力传感器得到的，控制系统能控制流动相的压力或密度程序。密度程序是由有关流动相的压力及温度与密度的关系，通过一定算法而得到的，然后用密度作为控制参数。
1.4.2 进样系统
一般来说，LC的进样器，都适合于SFC的仪器，特别是对填充柱SFC，可用类似于LC的进样器。但毛细管SFC因其进样量很小，要求进样器的内管体积小，进样速度快，故常用分流进样法进样。通常采用四通、六通进样阀。在分流进样中也存在样品“失真”的问题，应特别注意。
1. 手动注射阀
LC用的定量管体积为10 μL的六通进样阀也常用，采用半填充法，进样量为0-10 μL，重复性良好，这种阀无论接细孔径填充柱直接进样，还是由分流三通接毛细管柱进样，重复性和柱效都令人满意，在进样体积较大时，还可采用预柱浓缩样品，提高柱效。
2. 气动转动注射阀
Lee Scientific公司600型SFC/GC及Carlo Crba SFC-3000系列都采用气动转动注射阀，这种阀设计新颖，可在注射位置停留一定时间，然后快速回到采样位置，定时进样可由停留时间的长短控制进样量1-500 μL。快速复位使进样真正达到脉冲进样，从而达到提高柱效的效果。
a) 定时分流注射阀
定时分流注射器如所示，这种阀由10 MPa 氢气压力驱动，阀内管体积为0.2 μL，停留时间为若干毫秒，由微机控制。进样时由注射头打进样品，过量样品由废液容器收集，按动注射开关，阀在注射位置停留一定时间后，很快复位，就可打进纳升样品。大部分经分流阻力器或开关阀放空，小部分进石英毛细管柱进行分离。分流与进柱流速比即为分流比，一般控制在（6-20）：1或更大些。分流比可由测量分流阻力器及柱后阻力器出口处的流速来测定。定时分流注射定量分析的定量重复性很好。
b) 不分流注射阀
可将毛细管柱直接插到进样阀的底部，在瞬间注入极小量的样品，因此可用不分流注射阀进样。不分流进样阀的定量重复性经试验也是令人满意的。
1.4.3 色谱柱管理系统
一般GC色谱炉可以满足需要，但也有些较特殊的问题。
1. 低容量双柱双流路色谱炉
一般炉腔较大，便于安装色谱柱及阻力器，检测器插件能够容纳多重检测器。炉子两侧留有接MS、FTIR等的接口。
2. 多级温度程序
在SFC中由于柱温随组分的保留作用很复杂，故在不同的温度区间，要求不同的温度控制程序，在低温区（100℃），组分的保留随柱温增加而降低，则要求用程序升温进行分析。
3. 温度的稳定性
因为超临界流体的密度是与柱温直接有关，故要求柱温控制精度要高，保证温度的稳定性。
4. 安全保护
在使用超临界流体n-C5时，如有渗漏，当炉子加热丝变红时，就会引起爆炸，故要求炉丝设计，在最高温度时，电热丝不产生橘红色，并注意安全保护。
1.4.4 阻力器
为使超临界流体在整个色谱柱分离过程中始终保持为流体状态，当用FID、NPD、FPD、MS时，在色谱柱出口和检测器之间，需要一个阻力器（或称备压调节器），以保证色谱柱的出口压力缓和地降至大气压，当用紫外、荧光检测器时，因其本身可在高压下操作，故可在检测器出口接阻力器降压，阻力器大致分为三类，即直管型、小孔型和多孔玻璃型阻力器。下面分别进行简单的介绍。
1. 直管型阻力器
直管型阻力器，是由一根内径5-10 μm石英毛细管组成，长度根据需要确定。这种阻力器结构简单，可由细管长度决定阻力大小。但非挥发性物质易凝结而使喷口阻塞，易产生毛刺而使样品“失真”。
2. 小孔型阻力器
小孔型阻力器，可以单独做成，亦可作为石英毛细管的一端，做成整体阻力器，使用方便，效果较好。
3. 多孔玻璃型阻力器
此种阻力器是由多孔二氧化硅烧结制成的，是Lee公司据专利生产的。在内径100 μm烧结玻璃（或陶瓷）构成。全长约20cm，一端由对接连接器与毛细管柱相连，另一端接FID，使用方便，效果好。
1.4.5 检测器
在超临界流体色谱中由于流动相具有惰性和流体性质，因此可接LC的光度检测器，而流体流出了色谱柱可减压成气体，故可接大部分GC检测器，尤其是氢离子火焰检测器。流动相这些特性，使GC和LC检测器在SFC中得以通用，使其可利用的检测器大为扩展。其中最重要的检测器是高灵敏度的通用型GC检测器FID，其次是LC检测器紫外和荧光检测器。实际过程中，检测器的选择要考虑不同的流体和检测方法的匹配问题。
1. 氢离子火焰检测器
氢离子火焰检测器（FID）因其死体积小、响应快，是接毛细管柱SFC的理想检测器。但是要作为SFC的检测器要求其稳定性更好、灵敏度再提高。由此Lee Scientific公司推出新的FID设计，采用新的筒状收集电极，力求把全部产生的离子收集下来，可以显著提高检测器的效率；采用废气防空限流法，使火焰稳定性提高，噪声降低。FID的检测限达
10-13g/s。为使满足超临界流体气化时大量吸热，使高分子物质气化，FID具有大的加热器，并保持在350-450℃。但FID属于破坏型检测器，有些场合并不适用。
2. 紫外和荧光检测器
紫外和荧光检测器是LC常用的检测器，它们在SFC中也很重要。当用正己烷、正戊烷等作流动相，或在超临界流体中添加改性剂梯度洗脱时，氢离子火焰检测器不能使用，只能采用紫外和荧光检测器。在SFC中，紫外和荧光检测器是非破坏型检测器，因此可以用来制备微量样品或制备色谱。
3. 其他检测器
氮磷检测器（NPD）是测定含氮有机物的选择性检测器，可用于药物及氨基酸分析。双火焰光度检测器（FPD）是一种高灵敏度、高选择性的测定有机硫和有机磷化合物的检测器。这种检测器能够消除大量烃类对测定硫和磷的干扰。射频等离子体检测器（RPD）是一种高灵敏度、高选择性的多元素光谱检测器，有很好的发展前景。微波诱导等离子体检测器、无线电频率等离子体检测器、及ICP检测器可用于金属有机化合物的检测，在SFC中也被广泛采用。电流检测器、电子捕获检测器及激光散射检测器等都作为检测手段在SFC中得到良好应用。
1.4.6 超临界流体色谱联用技术
色谱-光谱联用技术仍是当今较为活跃的研究领域，其中联用最多的包括SFC/MS联用、SFC/FRIT联用及SFC/NMR联用。
1. SFC/MS联用技术
色谱/质谱联用技术首先是由GC/MS联用发展起来的。MS对单一组分有很强的鉴别能力，但不适于多组分混合物的定性。相反，GC是一种高灵敏度的分析手段，但对物质的鉴别能力低于MS。所以将两者结合起来实行联用，正是扬其所长、避其所短的有效途径，从而可以取得在各自单独使用时无法得到的信息。MS使SFC/MS联用技术成为近年来强有力的分析手段之一，是分析热不稳定、高分子量物质的重要分析方法。
SFC像GC一样，与MS有共同之处：如色谱的分离与质谱的检测都是在气相进行，两者的灵敏度都很高，温度范围相当，样品量及最小检知量相接近。而且色谱的出峰速度与MS的扫描速度也能相匹配。因此， 联用时无须对两种仪器本身做任何改装。但两者之间存在着差异，如SFC是在压力条件下操作，而质谱是在真空条件下运转。而且，SFC的流出物量往往大于质谱的泵容量。所以，必须采用接口装置(interface)才能实现联用。
SFC/MS联用流程如图 1-11所示。此图左边是用液体色谱仪改装的超临界流体色谱仪，右边是质谱仪，通过直接液体引入(DLI)接口联接起来，即成为SFC/MS联用仪。显然，接口是实现联用的关键部件。联接装置的探针（Prole）中有一不锈钢隔膜，在隔膜中心用激光穿一小针孔（2.5～3.0 μm）。为了保持探针中流体的超临界状态，小针孔的尺寸是非常重要的。同时，探针必须恒温在流动相的临界温度之上。进入质谱仪的流量可部分地由反压调节器调节， 但主要是通过选择具有适当针孔尺寸的不锈钢隔膜进行控制。
在SFC/MS联用中，防止溶质在管壁上沉淀也是十分重要的。反压调节器后面的压力低于流体的临界压力，其中的流体已不是超临界流体，因而溶解能力显著下降，若出现沉淀会沉积于管壁而不能依次流出，显著影响分离效果。
图 1-11 SFC/MS联用流程图
SFC/MS联用技术分别有超临界流体色谱与四级杆质谱联用和超临界色谱与高分辨质谱联用。目前SFC/MS采用的电离方式主要有ESI、APCI和CI等。SFC/MS联用的研究和应用日渐增加，为发展高速、高分辨率、高灵敏度的分析方法提供了有效的途径。
2. SFC/FTIR联用技术
近年来，GC/FTIR发展迅速，已成为分析挥发性混合物的有力工具，并能提供有价值的结构信息。然而，GC/FTIR不能分析难挥发、易热解的高分子化合物。LC/FTIR采用“溶剂消除”和扩散反射技术，虽然能分析难挥发，易热解的物质，但分析速度慢，而且LC用的流动相，大部分在中等红外区具有强的吸收，因而限制了它的应用。SFC/FTIR联用是最近发展起来的先进联用技术。由于SFC具有快速、高效和强溶解能力的优点，而且它所用的大多数流动相在中等红外区具有最少的吸收，这些固有的特性导致了SFC/FTIR的迅速发展。
SFC/FTIR联用流程可简单地用方框图 1-12表示。联用流程与一般超临界流体色谱流程相似，FTIR红外光馄谱仪作为检测器通过接口装置与SFC联接。当采用溶剂消除接口时，FTIR接在阻力器之后；如采用高压红外流通池接口，则置于阻力器之前。流量限制器之前的体系都在超临界态操作。
SFC/FTIR中采用溶剂消除接口，接口装置为一条沉积有薄层KC1粉末的自动旋转带，置于距SFC阻力器1mm的地方。样品组分在色谱柱中实现分离后，随流动相通过流量限制器喷射在旋转带上，被分析组分则沉积在KC1粉末上，溶剂则挥发至大气中。与此同时，红外光束聚焦在带上，便可测定被分析组分的红外吸收光谱，根据吸收光谱，可重新构成色谱图。
采用溶剂消除接口，可在常压下进行检测，而且检测灵敏度高，但接口在结构上较复杂；
所用流动相必须是易挥发的，极性物质及高沸点物质不适于用作流动相；作为流动相物质
必须具有高的纯度，否则其中兴所 的杂质可能随样品组分沉积在KC1粉末上而影响检测结果。
采用高压流通池接口，可在临俪超界态直接进行检测，设备紧凑简单，但流通他必须有耐压能力。流通池本体可用不锈钢制成，它的两旁开有能透过红外光的窗口，窗口材料必须具有足够的强度并在中等红外区有透明性。红外光束照射在窗口上（垂直于流动方向），则可刹测量流通池中样品组分的吸收光谱。高压流通池接口对流动相要求符合下列条件：
(1)在中等红外区的吸收为最少；(2)对被分析组分具有强的溶解能力；（3）对溶质有高的扩散系数，以提供高的柱效；（4）具有高的选择性，选择性应随压力而变化。符合上述条件的流动相物质有丙烷、二氯二氟甲烷和二氧化碳等。
图 1-12 SFC/FTIR联用流程图
SFC是分析热不稳定、高分子量样品的分离技术，而IR光谱则可提供物质的结构数据，故SFC/FTIR联用将是强有力的近代分析手段之一，当前SFC/FTIR联用的关键，是采用能提高检测领命都的接口。已经报道的接口有两类。第一类为色谱流出物通过高压流动池，测量在流动相存在下的分离组分的透射光谱。这种接口的缺点是受流动相吸收光谱的干扰较大。第二类是在测量红外光谱前消除流动相的干扰。
3. SFC/NMR联用技术
在SFC中由于常用二氧化碳作为流动相，其分子中无质子，这大大方便了溶质NMR谱图的测定，也促进了SFC/NMR联用技术及应用的发展，通过SFC/NMR联用可以一次性完成从样品的分离纯化到峰的检测、结构测定和定量分析，并提供混合物的组成和结构信息，从而提高了研究效率和灵活性。
由微机控制整个实验过程的SFC/NMR联用装置框图如图 1-13所示。SFC装置与一般SFC装置相似，在常规检测器与NMR探头通过两个阀门连接在一起。在NMR探头后面连接有一个反压调节器，其作用是对压力和流速进行独立调节，以保证NMR探头中的流体维持在超临界状态。
图 1-13 SFC/NMR联用装置示意图及其NMR探头
NMR探头是联用装置中最关键的部分。Dorn等人在液相检测探头的基础上设计了一个适用于超临界工作条件的NMR探头，如图 1-13放大部分所示。探头内部的玻璃管是一个外径为5mm，内径为3mm，体积为120 μL的蓝宝石管。一个氢-氘双调谐线圈直接嵌在蓝宝石流动腔壁上，并将其置于常规探头玻璃器皿的中央。在探头中还插有一个热电偶，用于实时测量温度。
为了研究SFC-NMR联用装置的性能，Albert等测定了1H NMR 探头在13C卫星峰高度时的1H 线宽。在超临界态下，所获得的1H 谱线的线宽与HPLC-NMR 联用装置在液态下所得的结果无明显差异。在匀场较好的情况下，谱线的线宽主要由自旋-自旋弛豫时间T2决定。Albert等发现即使在超临界条件下，谱线线宽也基本不变，这意味着质子的T2值无明显变化。然而与T2不同，在超临界条件下作为流动相的二氧化碳随着压力的增大，粘度降低，自旋-晶格弛豫时间T1明显增大。采用反转恢复法脉冲序列测量邻苯二甲酸正丁基苯酯1H谱的T1表明：在超临界条件下的T1值是同一温度下液态T1值的2-3倍。为此，当信噪比较低需多次累加时，应适当延长脉冲重复时间，或设定较小的脉冲翻转角，以提高单位时间内的信噪比。
SFC-NMR联用技术避免了HPLC-NMR联用技术中溶剂峰干扰问题，解决了样品在处理
过程可能造成的损失、污染或分解，从而提供了一种快捷有效的分离，并能提供混合物的
组成和结构信息的分析方法。超临界流体分离与NMR 联用技术的优点不仅来自超临界流体独特的分离能力和NMR 精确的结构分析能力，而且还在于将二者有机结合的巧妙而完美的联用技术。目前其已成为分析难挥发、不耐热的大分子化合物和生物样品的有效方法，在分析复杂混合物中(如中药复方体系化学成分和结构研究)有着广阔的应用前景。
1.4.7 超临界萃取与超临界流体色谱联用技术
超临界流体萃取-超临界流体色谱法联用技术（SFE-SFC）是一种新型的二级分离分析方法，60年代以来，SFE和SFC分别得到长足的发展，但二者的联用尚不多见。由于SFE和SFC所用流动相为同一状态的流体，使得SFE-SFC联用技术成为可能。自80年代中期，该技术的研究报道日益增多，并逐渐发展成为一钟比较成熟的分析方法。SFE-SFC联用技术兼有提取、浓缩、分离和检测等功能，具有简便、快速、条件温和等特点，适用于天然产物和环境样品的分析。
现以日本分光株式会社(JASCO)生产的SUPER-200型超临界流体萃取色谱仪为例，说明SFE-SFC联用装置的组成和特点(如图 1-14所示)。该装置主要由流体输出、提取、浓缩、层析和检测等部分组成。整个系统在一定的压力和温度下工作，并由微机调控。调节六通阀，可将提取分离部分分成2个独立的工作系统, 以便对提取分离条件进行选择。使用高分辨多波长紫外检测器，可获得三维色谱图。根据色谱和光谱数据对被测成分进行定性定量分析。紫外检测器需配备高压样品池。浓缩柱固定相多用活性较低的填料，以利提取物的洗脱。分离柱一般采用化学键合固定相填充柱或化学交联毛细管柱，以防固定相被SF (超临界流体) 洗脱。为了避免柱压损失，填充柱最好采用微型柱。进行SFE-SFC联用分析时，提取管、浓缩柱和分离柱的容量应匹配。
操作过程大致如下：调节SV1、SV2和SV3，将流体输出部分、提取浓缩部分和检测收集部分接通，使层离部分处于旁路。开启PU1输出二氧化碳，调节PH和BR1，获得提取所需的SF，对样品进行提取。同时调节BR2，降低流体的压力和溶解能力，使提取物在浓缩住中析出富集。当提取完成后，调节SV1、SV2和SV3，将流体输出部分、层离部分和检测部分接通，使提取浓缩部分处于旁路。调节BR2和PH，得到层离所需的SF。首先对分离柱进行饱和处理，平衡后再调节SV2，使浓缩部分与层离部分接通，完全打开BR1，浓缩柱中提取物被依次洗脱、层离和检测。提取分离时若需改性剂，可开启PU2，将其注入二氧化碳中。
SFE-SFC联用技术集提取、浓缩、分离和检测于一体。运用该技术可省去较为繁琐的前处理，直接对样品进行分析。若以二氧化碳为流体，可获得低温、无氧的工作条件，适用于不稳定成分的分析。若使用高分辨多波长紫外检测器，可在无参照物的情况下，对成分的定性定量分析提供有用的信息。因此，SFE-SFC联用技术对于天然固体样品尤其是天然药物来说，无疑是一种理想的分析方法。
图 1-14 SFC-SFC联用装置示意图
1.4.8 制备型SFC
制备型SFC现已应用于食品、医药、生物及石油等多个领域。制备型SFC与分析型SFC的区别在于制备型SFC需要将分离的样品收集起来。因此，色谱系统增加样品收集装置，相应地增加了复杂的样品进样系统。相对于制备型HPLC而言，制备型SFC的流动相使用少，无溶剂残留，分离速率快。
1.5 超临界流体色谱的应用
超临界流体色谱正处在研究、发展阶段，超临界流体色谱的应用也处在开发、推广时期。近年来，超临界流体色谱技术的发展速度较快，发表的研究论文日渐增多，商品化仪器也增长较快。SFC以其独特的有点应用于药物分析，对映体拆分，食物和天然药物、生物分子、炸药、农药和化工产品等的分析。近来，模拟移动床式制备型SFC的出现拓宽了SFC的适用范围和生产规模。
1.5.1 在手性拆分中的应用
SFC 分离手性化合物可分为直接法和间接法两种。直接法包括使用手性固定相和手性流动相；而间接法则基于手性衍生作用，先把对映物转化为非对映物，然后用非手性固定相分目前，手性固定相直接分离法是发展最快的领域，而间接法则相对使用较少。超临界流体色谱的手性固定相是在HPLC和GC手性固定相的基础上发展起来的。目前已有大量的商品化手性固定相（CSPs）问世。通常CSPs按手性选择器的类型分为酰胺类、环糊精类多糖类及酰胺类等，除冠醚类和蛋白质类外，绝大多数CSPs都可直接用于SFC，而不需任何改进处理。分析时，温度对分离的选择性、分离度和保留时间的影响较大。一般表现为温度降低，选择性会线性增大，分离度得以提高，保留时间则稍增加；此外，流动相的组成，特别是流动相中极性添加剂的种类和用量对分离的影响也很大，在分析酸碱性的手性药物时，流动相中添加少量酸或碱对分离的选择性和保留值具有很大影响。
一般来说，SFC的分离效果要比HPLC好，但也有例外情况，，如2-氨基-3-苯基丙醇可以在HPLC 上很好地分离，但在SFC上的分离，效果却很差。对于以上现象，Anton等认为：溶质-流动相之间和流动相-固定相之间的相互作用在普通流体和超临界流体中有很大差异。在手性固定相上，超临界流体比普通流体受到更强烈的多层吸附，而超临界CO2中加入低浓度的极性改性剂能极大地增强溶剂的溶解能力。因此，必须同时考虑两种相互作用对分离度的影响。
1. Pirkle 型手性固定相
Pirkle 型CSPs 是根据三点作用原理设计合成的，母体结构为3，5-二硝基苯甲酰，然后接上苯基甘氨酸或亮氨酸等基团。
Pirkle 型CSPs 在SFC 上可直接分离氨基酸、抗疟药和β-blockers（一类含仲胺基团的化合物）等对映物以及亚砜、内酰胺等含有芳基的对映物；极性更强的物质一般在进样前先转化为弱极性的衍生物，然后再进行分离。1993 年Nishikawa用装填有Pirkle型CSPs的SFC和SFC分离了拟除虫菊酯，其分离效果在温度较低时比HPLC好得多。
2. 环糊精手性固定相
环糊精（Cyclodextrin，简称CD）是一种包含6-12 个葡萄糖单元的手性环状低聚糖，包括α，β，γ等类型，其中以β型应用最广。
环糊精主要用于开管式SFC，含有不同官能团（单醇、二醇、内酯、酮、胺、羧酸和甾体等）的手性对映物有的可在β-环糊精上得到有效分离。Susanne等用开管式SFC 的β-环糊精上基线分离了5 种拟除虫菊酯。Armstrong等报道了一种以短链聚硅氧烷聚合物为取代基的甲基化β-环糊精CSPs，并用它在开管式SFC 上分离了1-氨基二氢化茚和全氢化吲哚。Chirasil Dex（固着在聚硅氧烷上的二甲基化β-环糊精）是一种新型的CSPs，据报道用Chirasil Dex可分离多种芳香醇、氨基醇、氨基酸、羧酸、二醇、胺和酰亚胺等对映物；许多药用化合物（如巴比妥药物、甾族药物等）也可在Chirasil Dex 上分析或分离，且与GC 相比，分离效果好，操作温度低。
3. 多糖类手性固定相
多糖类CSPs 包括纤维素衍生物和直链淀粉衍生物两种，过去只用于填充式色谱柱，1992年，Juvancz 及合作者把它推广到了开管式SFC。
纤维素三苯甲酸酯（ChiralCel OB）和纤维素三-3，5-二甲基氨基酸甲酯（ChiralCel OD）是两种广泛应用的纤维素CPSs。使用超临界流体色谱，OB 可分α-亚甲基-γ-内酯与内酰胺、芳基酰胺、1，2-氨基醇（β-blocders）等对映物；OD 可以分离β-blockers 对映物、苯并二氮杂草和反-均二苯代乙烯手性物质。OB 和OD 都可用于分离苯丙醇及恬尔心（抗心绞痛药）的氢氯化物（一种抗癌药物）。
直链淀粉衍生物CSPS 虽不如纤维素类应用广泛，但许多非甾族抗炎药的对映物都可以在直链淀粉三-3，5-二甲基氨基酸甲酯（Chiralpak AD）柱上直接分离。Kaida 与合作者用苯基甲酸酯直链淀粉作CSPs，CO2-醇作流动相，分离了Troeger's碱等多种外消旋体
Bargmann 等则比较了在纤维素和直链淀粉衍生物CSPs上的SFC和HPLC 手性分离情况，通过研究β-blockers 在OD 和AD 上的手性识别机理，发现初级或二级羟基和胺等极性基团的存在是导致HPLC、SFC 之间存在明显选择性差异的原因。
4. 其它手性固定相
除上述用于SFC 手性分离的固定相外，还有许多其它类型，如基于螺旋聚甲基丙烯酸酯的CSPs、大环抗菌素类CSPs 和基于金属络合物的CSPs 等等，它们都在SFC 分离技术中得到应用。
Macaudi re 等曾对Chiral OT（涂覆在硅胶上的螺旋聚甲基丙烯酸酯）CPSs 进行了研究，在填充柱SFC 中成功分离了二-β-联萘酚和α-亚甲基-γ-内酯。此外，他们还用ChiralPak OT（涂覆在硅胶上的聚三苯甲基异丁酸酯）CSPs 在填充柱SFC 上分离了联萘酚。1997 年，Medvedovic 等用大环抗菌素类手性固定相Chirobiotic V和Chirobiotic T在填充柱SFC 上分离了多种不同类型的外消旋化合物（β-blockers、β-兴奋剂、苯二氮类、非甾族抗炎药、巴比妥酸盐、氨基酸及其衍生物等）。但与OD 和AD 等CSPs 相比，其应用范围相对较小。Chirasil Nickel是一种基于镍络合物的CSPs，Schleimer 等曾以苯基乙醇和樟脑为典型手性溶质，用开管式SFC 研究了温度、压力和流动相密度对保留值和分离因子的影响。 实例：班布特罗消旋体的SFC拆分，见图 1-15所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：IA-S CHIR-ALPAK（4.6×150 mm,3 μm）
分析条件：A.二氧化碳，B.20 mM甲酸铵的甲醇，洗脱梯度：0 min，15% B，3 min 30% B。备压：1800 psi，柱温：50℃。
检测器：紫外，205 nm
说明：班布特罗消旋体的分离度达到2.28。
图 1-15 班布特罗消旋体在SFC上的分离色谱图
1.5.2 在药物分析中的应用
SFC用于药物分析时，具有分析速度快，选择性好，分离效率高，样品处理简单等优点，并适用于稳定性差、极性大和挥发性小的药物分析，可以作为GC和HPLC在该领域的重要补充技术。SFC 应用于药物分析主要采用以二氧化碳为主体的流动相，由于多数药物都有极性，所以必须在流动相中加入极性改性剂，最常用的改性剂为甲醇。另外，微量的添加剂，像三氟乙酸、乙酸、三乙胺和异丙醇胺等，可起到改善色谱峰形的作用。
1. 药物稳定性试验及代谢产物测定
药物稳定性试验是通过分析药物中活性物质及相关化合物，如降解、分解产物和杂质等，从而保证药品符合质量要求。SFC 用于此项分析时, 可以给出稳定准确的分析结果, 在对抗癌药物紫杉醇及其杂质和降解产物分析时，通过在二氧化碳流动相中程序增加甲醇量, 16 个相关化合物得到检定；Anton等讨论了SFC在药物稳定性、剂量、含量均一性、溶解速度及活性物质测定等方面的应用；Steuer等则比较了SFC，HPLC 和毛细管区带电泳(CZE) 在药物分析和草本制剂的稳定性研究，赋形剂分析和生物体液中药物测定等方面的应用研究, 表明SFC是一种可靠的方法。在测定活性物质时，使用SFC具有省时(分析时间短, 样品前处理简单)和污染小(二氧化碳取代有机溶剂作流动相)等特点。在分析乳剂和洗剂时，可以用四氢呋喃稀释后直接进行分析，不需要进行前处理。
Smith 等在应用SFC 分析雷尼替丁及4个代谢产物时其分离度得到提高; Simmons等则用以对片剂中苯基保泰松以及它在尿液中的主要代谢产物进行分析；药用Camazepam (CM Z)为外消旋体，其R-异构体在大鼠和人的肝脏里被选择性地代射，使用SFC可以将CM Z 和它的多个代谢产物在10 min 内完全分离；工业上常用的苯乙烯吸入人体后代谢生成苯乙酮酸和扁桃酸，该法分析其代谢产物时，样品尿液勿需前处理，只需乙睛烯释10 倍，离心后即可进行分析。
2. 其他类药物分析
消炎镇痛药布洛芬和蔡普生的分析：这两种药物都含有叛基，酸性很强。若用GC分析则必须先进行衍生化, 而要用H PL C 则必须将流动相酸化, 对药物进行离子抑制后才行。但可以在氨丙基硅胶柱上用含20 % 甲醇的二氧化碳作流动相进行SFC分析。
磺胺类药物的分析：磺胺类药物的抗菌谱广，常作兽用药物。磺胺类药物可被动物组织吸收，若在体内的半衰期长，则人类食用动物时，在动物组织内有药物残留的危险。现在美国规定在食用动物体内，磺胺类药物的最大残留量不应超过0.1 ppm，这说明应该建立一种分析磺胺类药物的灵敏方法。Perkins等用填充柱SFC 和SFC/MS法分析用药猪的肾脏提取液中磺胺类药物的含量。固定相可用硅胶或氨基键合固定相，流动相用甲醇改性的二氧化碳。色谱流出液一半经紫外检测器进行检测；一半经M S 仪进行检测和确证。用这种方法可以分离确证八种结构不同的磺胺类药物。用UV检测的最低检测限可达1-5 ng。 Berry等用SFC/MS联用技术对磺胺、激素、角麦菌生物碱和黄嘌呤等极性药物进行分析，在二氧化碳中加不同量的甲醇构成二元流动相以改善分离；还可用MS作检测器分析咖啡因、可待因和苯基保泰松等药物。
有些酚类化合物排放到空气中后对环境有害，美国环境保护机构用GC对11种酚类进行监测，但测定有困难并费时间。Berger等用Liehrosorb Diol色谱柱，用二氧化碳中加甲醇作改性剂、TFA作添加剂所组成的流动相，于填充柱SFC上成功地分离了这11 种酚类。他们还用上述分析酚类化合物的方法分析了苯多梭酸。过去曾有人用S FC 分离苯甲酸和水杨酸，但必须用高浓度的流动相改性剂(含17.9 % -20 %甲醇的二氧化碳)，同时保留时间较长(17 -30 min )。在SFC中用极性很强的流动相分析极性化合物时，上述极性固定相所得的分离效果都比C8或苯基等低极性键合固定相好。
SFC 存在的一个主要问题是在分离强极性和离子化合物时会延长保留时间及色谱峰拖尾。Steuer等用离子对SFC(IPSFC)分析阳离子和阴离子药物。阳离子药物如含脂肪胺衍生物的
普蔡洛尔等，不能被超临界二氧化碳洗脱，即使在其中添加大量甲醇作改性剂时也不能奏效。此外，这些药物还可以和键合固定相上硅胶的游离硅醇基强烈作用，这样就更加难以洗脱了。但若于超临界二氧化碳中加人甲醇作改性剂，再加庚烷磺酸钠和二甲基辛胺分别作反离子和竞争离子，以离子对的方式是可以很顺利地分离分析普茶洛尔的。与此相似，苯甲酸、水杨酸等阴离子药物也可用IPSFC 法作分析。
Later等用SFC 分析激素、抗菌素和依赖性药物时，只用二氧化碳作流动相就将结构相近的物质分开, 并用于尿中咖啡因和激素的测定，在分析一个含多个极性基团，分子量达440 的抗菌素时不需衍生化，直接进样分析，分离四羟基大麻酚和它的6 个代谢产物时，也是用二氧化碳作流动相即可完成。Chester等系统介绍了SFC及其应用，包括对生物碱等药物的分析。
SFC用于巴比妥类药物分析时，不同固定相以及流动相中甲醇的量不同对容量因子、保留时间等将产生较大影响；使用MS作检测器可以将该类药物进行纳克级测定；通过分析苯巴比妥，检查SFC的稳定性，证明结果可靠。
SFC可用于激素类药物的常规分析，Baiocch等在不同固定相上分离该类药物，讨论了固定相对保留时间的影响，David和Novotny将激素反应后生成的亚磷酸酯，用磷热离子检测器分析人血浆和尿中的激素，分离效率和灵敏度都很好。
用SFC分析一个二氢吡啶类药物的乳剂时，用有机溶剂稀释后直接进样分析，其定量结果与HPLC分析结果相似；用SFC分析碱性的胃质子泵抑制剂与其类似物时，于二氧化碳和甲醇流动相中加入1%三乙胺，有助于分离；在分析一种治疗高血压及预防心绞痛的药物以及12个同类化合物时，刻将含量0.1%，结构相近的同系物分开；Strod等论述了钙离子通道拮抗剂的分离；Jagota和Stewart在不同固定相上分析非激素类抗炎制剂时，进样量为纳克级，并比较了不同固定相对保留因子、拖尾因子和最低检出限的影响。
由于青蒿素受热不稳定，并且在紫外/可见光区无吸收，使其测定方法收到限制，采用SFC/ECD分析时，成功地测定了全血中的青蒿素；在对其它抗疟疾药物，如氯喹、奎宁等分析时，检测限达纳克级，并表现出很好的线性和精密度。
实例：阿咖酚散中阿司匹林、咖啡因和对乙酰氨基酚三种组分的SFC分析，见图 1-16所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Kromasil Slica填充柱（4.6 ×250mm，5μm）
分析条件：18%甲醇（二氧化碳），备压：20 MPa，柱温：50 ℃
检测器：紫外，275 nm
说明：建立了SFC分离测定阿咖酚散中阿咖酚散中阿司匹林、咖啡因和对乙酰氨基酚三种组分含量的方法，并研究了改性剂、流速、压力和温度对分离选择性的影响。在测定范围内，对照品浓度与峰面积呈良好的线性关系，以峰面积和保留时间精密度分别为阿司匹林0.38%，1.7%，咖啡因0.49%，1.88%和对乙酰氨基酚0.44%，1.09%，整个分离过程在5 min内即可完成测定，且具有较好的重现性和线性关系。
图 1-16 阿司匹林、咖啡因和对乙酰氨基酚的SFC分析
（a）标准品，（b）对照品
实例：布洛芬异构体的手性分析，如图 1-17所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Chiralpak AD-H（4.6 ×250 mm，5μm）
分析条件：7% 甲醇、乙醇和异丙醇（二氧化碳），备压：120 bar，柱温：30 ℃ 检测器：紫外，220 nm
说明：经过优化后的分离条件，分离度能达到5.3-11.8，理论塔板数有5000，表明了SFC具有高的柱效。
图 1-17 布洛芬异构体的分离
甲醇，（b）乙醇，（c）异丙醇
实例：美托洛尔及其类似物在SFC上的分离，见图 1-18所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Kromasil 100-5NH2（4.6 ×150 mm）
分析条件：8% 甲醇（二氧化碳），备压：250 bar，柱温：60℃。
检测器：紫外
说明：在氨基柱上分离了美托洛尔及其类似物，通过对柱温、备压和改性剂进行优化，得到了最佳的色谱条件。
图 1-18 美托洛尔及其类似物在SFC上的分离色谱图
实例：化妆品中维生素D2和维生素D3的SFC分析，见图 1-19所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：ACQUITY UPC2 2-EP（2.1×100 mm，1.7 μm）
分析条件：A.二氧化碳，B.异丙醇，洗脱梯度：0 min，1% B，0.5 min，1% B，4 min，5% B。备压：2000 psi，柱温：50 ℃。
检测器：紫外，263 nm
说明：维生素D2和维生素D3由于结构上极为相似，因此是HPLC分离的难点，目前主要采用正相HPLC分析方法进行分析。采用SFC的检测方法能获得比正相HPLC方法一致或更高的分离度，而且分析时间仅为4.5 min，效率很高。
图 1-19 维生素D2和维生素D3在SFC上的分析色谱图
1.5.3 在生物分子、食品和天然产物中的应用
生物分子通常是热不稳定的，用GC无法直接分析，用HPLC有时又苦于无法采用紫外检测器。利用SFC的高分辨能力，中等柱温和检测器可选范围大，可分离生物分子。食品和天然产物等一类复杂的多组分混合物，正是SFC发挥其高分离效能的场所。热不稳定的天然脂类、甾类化合物、多元不饱和脂肪酸及其脂、天然色素、氨基酸和糖类等。
1. 糖类
很多种色谱方法可用于糖类的分析(如LC、CE等)，但都存在一定的局限性，最简单的方法是无需对样品进行衍生化处理。CE的分离效率高且需要的样品量小，但一般要对样品衍生化，未衍生化分离样品的报道较少。由于该类化合物中多数含有低聚或多聚体，用LC分离时需要梯度洗脱，比较麻烦。用SFC分离分析糖类相对要容易得多，一般无需进行衍生化处理，并有较高的分离选择性。
Chester最早用纯二氧化碳作为SFC的流动相，研究了低聚糖、多聚糖及聚甘油酯的保留性质，研究结果表明，对于含一到四个自由羟基的聚甘油酯类，用纯CO。可以分离，但峰形较宽且有拖尾，尤其是含有四个自由羟基的聚甘油酯，峰形更差。若将样品衍生化可使保留值下降且峰形变窄。聚糖在纯二氧化碳中的溶解度太低，不易分离，而用硅烷衍生化后，可以分离洗脱且峰型良好。Garrand采用蒸发光散射检测技术(ELSD)，对两种单糖进行了简单的分离。
由于糖类是极性较强的化合物，目前用SFC分离时通常需在主流动相二氧化碳中加入第二组分，作为流动相改性剂，以提高流动相对样品的溶解能力。Slavader等研究了单糖和多双键烯烃的保留性质，用三甲基硅烷键合的硅胶作为固定相，所用流动相分别为CO2-甲醇、CO2-甲醇-水、CO2-甲醇-水-三甲基胺，流速为5 mL/min，在10 min内，使四种单糖得以完全分离。
2. 脂肪酸和脂类
对于紫外检测器，由于甘油三酯在紫外区域的吸收非常弱，因此灵敏度比较低，使得检测不准确。虽然FID检测器可以实现对甘油三酯的检测，但是它和紫外检测器一样在定性的时候需要标准晶作对照，对于甘油三酯组成非常复杂的油脂来说，很难用标准品进行逐一定性。质谱检测器具有非常高的灵敏度，它的优势在于能产生对分析结果有用的离予，如提供分子质量信息的分子离子、脂肪酰基离子以及一些单酰基甘油离子和二酰基甘油离子等，根据这些离子的特征可以准确判断甘油酯的类型、脂肪酸组成及其位置分布等。因此，质谱检测器对于分析甘油三酯是非常合适的。对油脂直接进行质谱分析，可以不经色谱分离快速获得油脂中甘油三酯的种类及其各自的分子量等信息，另外也可以利用氨负离子化学电离的碰撞诱导双重MS技术分析脂肪酰基在Sn-2和Sn-1/3位的位置分布。如果甘油三酯样品中存在同分异构体如脂肪酰基双键的位置不同或者构象不同等，这种情况下就需要先对样品进行色谱分离然后进行质谱检测。利用SFC可以实现对几乎所有甘油三酯样品的高效分离，采用APCI质谱可以对甘油三酯的结构特征进行分析。SFC与APCI的MS联用对分离检测甘油三酯是非常有效的，APCI产生的质谱图具有很好的规律性，分子离子峰提供了甘油三酯的分子量信息，产生的碎片离子峰则提供了甘油三酯的脂肪酸组成、位置分布和脂肪酸结构等非常重要的信息。对于不同的样品关键是要选择好合适的分离条件和质谱条件，以期达到理想的分离和检测效果。
多数单官能团有机酸，尤其是脂肪酸，在毛细管SFC或填充柱SFC中以纯二氧化碳为流动相可以分离。而分子中如存在第二个极性官能团时，通常使峰形不理想甚至不能分离，一般需加人流动相改性剂，具有氢键的改性剂(如甲醇)用的最多。脂肪酸是一类可解离的强极性化合物，在一般的固定相上易发生吸附和拖尾，有时需制成相应的衍生物。未衍生的脂肪酸 和甲基脂肪酸酯 ，在键合的填充柱SFC上用纯二氧化碳作为流动相很容易洗脱，其原因是分子上有较长的疏水基团。大多数芳香酸和多取代酸不能用纯二氧化碳分离。在甲基脂肪酸酯上有取代羟基时将使保留值明显增大。直链甲基酯用纯二氧化碳在C18柱上可以迅速洗脱，但2-羟基酸甲基酯则不能洗脱。
含有30~70个碳原子的甘油一、二、三酯分子量都比较大，但由于含有较少的羟基基团，极性不是很强。它们在填充柱SFC上用纯二氧化碳作为流动相可以洗脱，若加入少量甲醇或乙腈作改性剂，将得到较高的选择性。用水和二氧化碳为流动相，在聚碱性PRN-300柱和一个毛细管柱上，用SFC可以分离蔬菜油中的脂肪酸及二、三甘油酯。乙腈和甲醇的加入使选择性明显改善，当改性剂浓度较高时，随改性剂浓度增加，洗脱能力增强而选择性相对下降，这表明分离机理已变为反向SFC。
3. 甾类化合物
甾类化合物是一种含有羟基的极性异构体混合物，其性质极其相似，用一般的分离技术较难分离，而用SFC则相对容易。胆固醇和甾酮用纯二氧化碳为流动相，在SFC中很容易被分离，如果极性取代基的数量增加，用纯二氧化碳洗脱将比较困难。多数的毛细管SFC分离甾类用纯二氧化碳，而填充柱SFC则多加入改性剂。
Bored等在二氧化碳中加入1.5％的甲醇为改性剂，分离了孕甾酮和雌素酮。Berry用含20％ 甲氧基乙醇的二氧化碳为流动相，硅胶填充柱上，10 min内分离了8种甾类。
Lesellier等用含6.1％甲醇的二氧化碳流动相，在4. 6×75 mm 柱上，分离了包括：睾丸酮、雌素酮、雌二酮、雌三酮等11种甾类。HansonE 最近研究了酮类化合物的保留性质，提
出用一个分析装置进行半制备的分离技术。Baieehl等用SFC在OV-1701固定相上分离了六种甾类化合物。蜕皮激素甾中含四个甾环骨架和7个羟基，极性较强不能用纯CO 洗脱，而加入低浓度的甲醇为改性剂，可容易被洗脱。Snyder等 用SFE富集天然油样品中的植物甾醇，发现用SFC分离之前，在温和条件下用SFE预浓缩样品是一种理想的分离分析手段。
4. 其他天然产物
郭亚东等采用SFC对野甘菊中小白菊内酯进行含量测定，其分析时间仅用3 min，速度极快，可见SFC是一种快速色谱。陆峰等建立了超临界流体色谱法用于测定补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素的含量的方法，并研究了影响试验结果的各种因素。SFC还可适用于中药生物碱的分离，并有较好的应用前景。郭亚东还采用SFC同时测定维生素B2，B3和烟酰胺的含量，与传统的方法比较具有简便，样品前处理简单，分析速度快的特点。因此对于复杂成分的分析，SFC具有显著的优势。蒋崇文等运用SFC分离了生育酚的同系物（α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚），在实验条件下，压力和温度对生育酚在SFC的保留和选择性有显著影响。
实例：乳清酸的SFC分离，见图 1-20所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Cyano填充柱（氰基）（4.6×250mm，5μm）
分析条件：20%甲醇（二氧化碳），甲醇中含有0.25%三氟乙酸作改性剂
检测器：紫外，280nm
说明：在测定范围内，对照品浓度与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9991）。分析过程迅速，3 min即可完成，且样品前处理简单。
图 1-20 乳清酸在SFC上的分离色谱图
实例：银杏提取物中黄酮类化合物SFC上的测定，见图 1-21所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：苯基柱（4.6×200mm， 5 μm）
分析条件：二氧化碳-乙醇-磷酸（90：9.98：0.02 v/v）；流速：1.05 mL/min；压力：25.0 MPa；温度：50.0 ℃。
检测器：紫外
说明：A为标准品，B为样品。化合物：1. 异鼠李素；2.山奈酚；3.槲皮素
图 1-21 标准品及银杏提取物中黄酮类化合物色谱图
实例：二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）在SFC上的分析，见图 1-22所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Dikma ODS色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）
分析条件：纯的二氧化碳，备压：20 MPa，柱温：90 ℃
说明：从EPA和DHA的分子结构可以看出，EPA和DHA的主要差别在于碳链长度和双键数目的不同，可利用ODS柱对EPA和DHA作用力的差异将两者分开。在试验中考察了操作温度和压力对容量因子和分离度的影响，提高温度和降低备压对分离是有利的。
图 1-22 二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）在SFC上的分析色谱图
实例：胡萝卜素、叶黄素和叶绿素在反相SFC中的分离，见图 1-23所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Zorbax ODS（4.6×250mm，5μm）
分析条件：3%正丙醇（二氧化碳），备压：4000 psi，柱温：40 ℃
检测器：紫外，
435 nm
说明：胡萝卜素、叶黄素和叶绿素在色谱条件下被完全分开，与反相C18 HPLC色谱结果相比，这些组分的SFC呈正相洗脱行为。这一结果表明，超临界二氧化碳具有很强的非极性，同时，也证明了预装的反相C18可以作为正相固定相来分离该类化合物。
图 1-23 胡萝卜素、叶黄素和叶绿素在SFC中的分离色谱图
I=β-胡萝卜素II=叶绿素b III=叶绿素a IV= 叶黄素V=含氧类胡萝卜素VI=含氧类胡萝卜素
实例：类胡萝卜素在SFC上的分离，见图 1-24所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：SunFire C18 (4.6×250 mm, 5 μm)和Viridis SFC Silica 2-Ethylpyridine (4.6×250 mm, 5 μm)
分析条件：A.二氧化碳，B.乙醇，洗脱梯度：0 min，10%B, 8 min, 17%B, 10 min, 25%B, 15 min, 25%B；备压：120 bar，柱温：32 ℃。
检测器：紫外
说明：通过在线色谱柱串联，8个类胡萝卜素类化合物在10 min内得到分离。1. 鸡油菌素，
2. 虾青素，3. 海胆烯酮，4. 紫黄素，5. 叶黄素，6. 玉米黄素，7.β-胡萝卜素，8. 新叶黄素
图 1-24 类胡萝卜素在SFC上的分离色谱图
实例：三萜类化合物在SFC上的分离，见图 1-25所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Viridis 2-Ethyl-pyridine（4.6×250 mm, 5 μm）和Synergi Polar-RP（4.6×250 mm, 5 μm）
分析条件：5% 甲醇（二氧化碳），备压：15 MPa，柱温：25 ℃
检测器：蒸发光散射检测器（ELSD）
说明：8个三萜类化合物分别为：齐墩果酸，高根二醇，β-香树脂醇，乌索酸，熊果醇，桦木酸，桦木醇和羽扇豆醇。在Viridis 2-Ethyl-pyridine色谱柱上的洗脱顺序为：单元醇
图 1-25 三萜类化合物在SFC上的分离色谱图
（a）Viridis 2-Ethyl-pyridine，（b）Synergi Polar-RP
实例：磷脂在SFC上的分析，见图 1-26所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Supelcosil LC-Diol（4.6×250 mm, 5 μm）
分析条件：A.二氧化碳，B.甲醇，洗脱梯度：0 min，15% B，1 min 15%B，5 min 55%B，10 min 55%B；备压：125 bar，柱温：40 ℃。
检测器：蒸发光散射检测器（ELSD）
说明：四个磷脂类化合物：（a）L-α-磷脂酰乙醇胺(PE)，(b) L-α-磷脂酰胆碱(PC)，(c) L-α-磷脂酰肌醇铵盐(PI)，(d) L-α-磷脂酰-L-丝氨酸(PS)。实验中，考察了添加剂异丙醇胺、三氟乙酸和乙酸铵对分离选择性的影响。PC和PE的洗脱不受添加剂的影响，PS和PI在加入异丙醇胺后分离效果更好，但是PS的色谱峰始终是宽峰。对于该类化合物的分离，乙酸铵的效果比三氟乙酸更好。
图 1-26 磷脂在SFC上的分析色谱图
实例：辅酶Q10氧化还原给状态的SFC分析，见图 1-27所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Chromolith Performance RP-18e（4.6×100 mm）
分析条件：30%甲醇（含0.1% 甲酸铵）的二氧化碳，备压：10 MPa，柱温：35℃。 检测器：质谱（MS）
说明：Ubiquinol-10为还原态的辅酶Q10，Ubiquinone-10为氧化态的辅酶Q10，实验中通过在线超临界提取和超临界色谱分析，检测到了还原态的辅酶Q10，检测量比传统的离线方式要高。结果表明，这个在线提取和检测方法可以避免目标化合物在前处理过程中发生氧化反应。
图 1-27 辅酶Q10氧化还原状态在SFC上的分离色谱图
实例：SFC测定三七及云南白药中人参二醇和人参三醇的含量
分离模式：毛细管SFC
柱系统：SB-Cyanopropyl-50石英毛细管交联柱（50 μm×10 m，膜厚 0.25 μm）
分析条件：纯二氧化碳，起始备压为10.1 MPa，程序升压1.01 MPa/min 至35.5 MPa，柱温：90℃。
检测器：氢离子火焰检测器（FID）
说明：三个化合物：1. 胆固醇（内标物），2. 人参二醇，3.人参三醇。在测定范围内具有良好的线性，采用通用型FID检测器，弥补了在普通HPLC上弱紫外吸收的不足之处。
图 1-28 SFC测定三七及云南白药中人参二醇和人参三醇的色谱图
（A）三七，（B）云南白药
1.5.4 在其他方面的应用
SFC在其他方面还有着非常广阔的应用前景，可用于聚合物及其添加剂的分析，在化工上用于石油化工产品的分析，在环保中用于农药、除草剂等的残留物检测和其他污染物分析，对氨基甲酸酯、拟除虫菊花酯、有机磷、有机氯、有机硫及有机氮类等农药具有良好分离效果还可用于炸药和多环芳烃化合物的分析。而SFC在金属络合物和金属有机化合物中的分析应用也有报道。
SFC分析聚苯醚低聚物（图 1-29），色谱柱采用毛细管柱，固定相为键合二甲基聚硅氧烷，流动相使用纯的二氧化碳，柱温选择120 ℃，在程序升压的洗脱条件下完成分离。
图 1-29 SFC分离聚苯醚低聚物的色谱图
孙云鹏等研究了在不同极性毛细管填充柱上加氢尾油中多环芳烃的分离条件， 选用国产1 mm×150 mm CN填充柱，二氧化碳为流动相，线性升压，FID检测，可在26 min内将烃中3到10环多环芳烃分离，定量重复性好。高连存等研究了9个多环芳烃混合样品的超临界流体色谱分析条件，并与毛细管气相色谱法做了比较，认为SFC比毛细管气相色谱法具有明显的优越性。梅特勒-托利多自动化学部研究人员应用SFC在15 min内完成了对石油产品中的10个低沸点化合物的分离，其分离效果与毛细管气相色谱并无不同。SFC同样适用于较低沸点的低极性化合物。
对于表面活性剂，可以采用传统的HPLC法和GC法，但是HPLC难用于缺乏紫外吸收的非离子型表面活性剂，而大部分表面活性剂的分子量在200-1000之间，属于难挥发或不挥发物质，必须对样品进行预处理，才能用GC分析。近年来毛细管SFC在非离子型表面活性剂的分析研究，显示了SFC在这方面的优越性。周良模等采用的SFC仪器对聚氧乙烯型非离子表面活性剂进行了分析。这种表面活性剂平均分子量650，如果采用传统的GC法，及时在330℃下，也不能得到好的色谱分离。如将样品处理为三甲基硅醚衍生物，在GC上也只能分析分子量在300左右的化合物，而用毛细管SFC进行分离，其峰形、基线和峰数目等都令人满意。对于其它聚氧乙烯型非离子表面活性剂（如Span型和Twean型）及多元醇型非离子表面活性剂所进行的SFC研究也很多，效果也比较理想。但目前对于阴离子、阳离子和两性型表面活性剂的SFC研究工作仍需要进一步开发。
在农业生产中，农药及除草剂发挥着重要作用，它们是一类含有氧、硫、磷和氮杂原子的极性物质，有些还含有热不稳定性。由于SFC是在中等温度下操作，在这类物质分析上，可以发挥一定的作用，更由于超临界萃取（SFE）-SFC的在线、脱线连接，可直接对环境样品进行测试，更加扩大了SFC的测定范围。目前，研究农药的分析，是SFC中一个比较活跃的领域，可测试的品种越来越多，测试下限已经达到pg级。毛细管SFC和填充柱SFC都能完成组分复杂的环境样品的分析。
卤代烃在大气光化学反应中起着重要的作用，它能通过光解反应，产生卤素自由基，从而参与催化破坏臭氧层的反应。目前SFC法被证明用于分析热不稳定性卤代烃（如溴代烷烃）效果较好。多氯联苯（PCBs）是已知的最毒的几类环境污染物之一。目前，PCBs的测定方法主要是GC法。对于测试PCBs组分十分复杂的环境样品来说，GC法分析时间较长、柱温较高及分辨能力较差。Cammanm等以二氧化碳和一氧化二氮为混合流动相，用氰丙基色谱柱测试了沉泥中的PCBs和PAH（多环芳烃）。
金属络合物在超临界二氧化碳中的溶解度相差甚大，这主要取决于络合物的化学性质，而金属有机化合物通常能溶解在超临界二氧化碳中。过渡金属、重金属、镧系、锕系等络合物，以及金属有机化合物（二茂铁及其衍生物）等，都在SFC上得到了较好的分离。金属络合物和金属有机化合物的超临界萃取（SFC）和分离主要是取决于选择适合的螯合剂。氟化螯合剂在金属离子的系统内络合-SFE以及金属有机化合物的SFC方面是十分有效的。有机螯合物取代金属络合物中配位水分子，能增加其在超临界二氧化碳中的溶解度以及改善在SFC中的分离。加合物的形成对提高金属络合物的SFE/SFC的有效性极为有用。含磷和硅的螯合物，同样可在二氧化碳中形成溶解度较高的金属络合物。在较低温度下，与一般GC相比，SFC能在较短的时间内，提供金属络合物和金属有机化合物的色谱分析。 实例：杀虫剂在SFC上的分析，见图 1-30所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Inertsil ODS-EP（4.6×100 mm，5 μm）
分析条件：(A) 二氧化碳， (B)甲醇（0.1 %甲酸铵），洗脱梯度：5% B(2 min), 5–10% B(5 min), 10–40% B(2 min), 40% B(8 min), 40–5% B(1 min), 5% B(2 min)。柱温：35 ℃。 检测器：质谱（MS）
说明：分离的杀虫剂为：1. 二溴杀草快，2. 乙膦酸，3. 马来酰肼，4. 丁酰肼，5. 甲胺磷，
6. 灭多虫，7. 啶虫脒，8. 多菌灵，9. 甲菌定，10. 噻氟菌胺，11. 四溴菊酯，12. 甲氨基阿维菌素苯甲酸盐，13. 定虫隆，14. 灭螨醌，15. 哒螨灵，16. 氯氰菊酯，17. 醚菊酯。这些化合物的极性相差较大，log Pow介于−4.6-7.05之间，在反相色谱柱上能在11 min内得到分离。采用质谱检测器，在实验范围内，各个化合物具有良好的线性和较低的定量限（μg/L级别）。传统上，敌草快(log Pow = –4.6)需要采用离子色谱或离子对色谱进行分析，而氯氰菊酯(log Pow = 6.6) 和四溴菊酯(log Pow = 5.05)需要用GC分析。SFC能够在同一条件下完成这些化合物的分离。结果也表明，SFC可用于不同极性化合物的分离。
图 1-30 杀虫剂在SFC上的分离色谱图
实例：汽车润滑剂添加物在SFC上的分析，见图 1-31所示
分离模式：填充柱SFC
柱系统：Gammabond RP-18（4.6×100 mm，5 μm）
分析条件：纯二氧化碳，程序升压洗脱：在10 min内备压从100 bar升至300 bar，柱温：80℃。
检测器：氢离子火焰检测器（FID）
说明：润滑剂添加剂依次为：1. Irganox L08，2. Lowinox DBNP，3. Irganox L115，4. Irganox L57，6. Lowinox TBP-6，7. Lowinox TBM-6，8. Lowinox dLTDP，9. Irgafos 168，
10. Irganox L03，11. Lowinox DSTDP，12. Lowinox TNPP。使用纯的二氧化碳为流动相，在通用型FID检测器的条件下，完成小分子化合物的分离。采用烷基键合的固定相，降低了硅醇基作用，中等极性的化合物能得到较好的分离。
图 1-31 汽车润滑剂添加物在SFC上的分离色谱图