分子克隆实验步骤
1. 对目的片段进行pcr扩增：
Pcr体系：（50µL）
DNA Template： 10-100ng
10×PCR buffer： 5µL
50mM dNTPs： 0.5µL
Primers： 1µM each
Water： add to 49µL
Taq Polymerase： 1µL
2.琼脂糖电泳，看有无目的条带
3.对目的条带进行切胶回收
4.对pcr产物加尾: 72℃，20min（如用高保真酶，则需加尾；则无需加尾）
加尾体系：（10µL）
胶回收DNA: 8µL
Buffer: 1µL
dNTPmix: 0.5µL
Taq Polymerase： 0.5µL
5.T载体连接：室温，30min
体系：（6µL）
加尾后产物： 4µL
T载体： 1µL Taq酶，
Salt solution 1µL
6.30-40µL感受态加入重组后的质粒。
7.放冰上30min。
8.42℃热击90s（放冰上冷:1-2min）
9. 加SOC（200-250µL）
10.37℃，300rpm，1h
11.平板涂布：加氨苄的培养基，37℃培养箱倒置培养过夜
12.挑单菌落：用牙签挑单菌落，放到含6mL液体培养基的试管中，
37℃摇床培养过夜
13.试剂盒提质粒
14.酶切：37℃，2h
体系：（20µL）
Buffer2: 2µL
酶： 0.5µL
模板： 1µL
BSA： 0.2µL
H2O： 16.31µL
15.琼脂糖凝胶电泳分析是否正确导入目的片段
鉴定阳性克隆的另一个方法----菌落PCR
从平板挑单菌落到含1ml LB（Amp+）的1.5drof管中，37℃摇床培养8小时左右，进行菌落PCR鉴定，引物可选用载体的通用引物，如T载体用M13F/R。
菌落PCR体系（20ul） 10*taq buf 2ul
dNTPs（2.5mM）1.6ul Mg2+（25mM） 1.6ul Primer F（10uM） 0.5ul Primer R（10uM） 0.5ul
DNA 1 ul Ex taq 0.3 ul
ddH2O 12.5ul
程序：
94度10min
94度 30sec
56度 30sec
72度 2:10 30cycle 72度 10min
4度 forever
分子克隆实验步骤
1. 对目的片段进行pcr扩增：
Pcr体系：（50µL）
DNA Template： 10-100ng
10×PCR buffer： 5µL
50mM dNTPs： 0.5µL
Primers： 1µM each
Water： add to 49µL
Taq Polymerase： 1µL
2.琼脂糖电泳，看有无目的条带
3.对目的条带进行切胶回收
4.对pcr产物加尾: 72℃，20min（如用高保真酶，则需加尾；则无需加尾）
加尾体系：（10µL）
胶回收DNA: 8µL
Buffer: 1µL
dNTPmix: 0.5µL
Taq Polymerase： 0.5µL
5.T载体连接：室温，30min
体系：（6µL）
加尾后产物： 4µL
T载体： 1µL Taq酶，
Salt solution 1µL
6.30-40µL感受态加入重组后的质粒。
7.放冰上30min。
8.42℃热击90s（放冰上冷:1-2min）
9. 加SOC（200-250µL）
10.37℃，300rpm，1h
11.平板涂布：加氨苄的培养基，37℃培养箱倒置培养过夜
12.挑单菌落：用牙签挑单菌落，放到含6mL液体培养基的试管中，
37℃摇床培养过夜
13.试剂盒提质粒
14.酶切：37℃，2h
体系：（20µL）
Buffer2: 2µL
酶： 0.5µL
模板： 1µL
BSA： 0.2µL
H2O： 16.31µL
15.琼脂糖凝胶电泳分析是否正确导入目的片段
鉴定阳性克隆的另一个方法----菌落PCR
从平板挑单菌落到含1ml LB（Amp+）的1.5drof管中，37℃摇床培养8小时左右，进行菌落PCR鉴定，引物可选用载体的通用引物，如T载体用M13F/R。
菌落PCR体系（20ul） 10*taq buf 2ul
dNTPs（2.5mM）1.6ul Mg2+（25mM） 1.6ul Primer F（10uM） 0.5ul Primer R（10uM） 0.5ul
DNA 1 ul Ex taq 0.3 ul
ddH2O 12.5ul
程序：
94度10min
94度 30sec
56度 30sec
72度 2:10 30cycle 72度 10min
4度 forever