构建的质粒

构建载体注意事项

1、双酶切时注意挑选的酶切位点，有时识别序列不一样的，酶，在酶切后会产生相同的粘性末端，给试验造成很大的麻烦；

2、注意两种酶工作条件的差异，尽量使用可以同时双酶切的两种酶；

3、在PCR产物末端引入酶切位点时，要注意在引物酶切位点的末端加入保护碱基；

4、PCR产物最好在沉淀之后再进行酶切，怡排除残存的Taq活性的影响；

5、酶切时要注意酶的星活性问题，要控制甘油含量在5％之内（酶中含有50％的甘油，所以加入酶的量不能超过反应体系的1/10）；

6、双酶切入单独进行时要注意酶切的先后顺序，有些酶在末端时酶切效果不好，这时应该先做这个酶切；

7、酶切后要加热（65度10min）使酶失活，有些酶则必须用酚氯仿抽提，切胶回收使比较好的方法；

8、连接使注意载体与片断的比例，一般为片断：载体3－5：1比较好，连接反应体系要小一些（5－10ul）；连接后可直接进行转化，但连接产物的比例不能超过感受态细胞的1/10为佳；

9、在连接时反应体系中氯化钠或氯化钾的浓度不要大于200mM，因为这回抑制ligase的活性；

10、在连接之后进行转化之前应在65度加热10min，这样可以提高转化效率，如是进行电机转化则应用酚氯仿进行抽提；

11、转化时要设对照怡确定转化的效率；

构建载体注意事项

1、双酶切时注意挑选的酶切位点，有时识别序列不一样的，酶，在酶切后会产生相同的粘性末端，给试验造成很大的麻烦；

2、注意两种酶工作条件的差异，尽量使用可以同时双酶切的两种酶；

3、在PCR产物末端引入酶切位点时，要注意在引物酶切位点的末端加入保护碱基；

4、PCR产物最好在沉淀之后再进行酶切，怡排除残存的Taq活性的影响；

5、酶切时要注意酶的星活性问题，要控制甘油含量在5％之内（酶中含有50％的甘油，所以加入酶的量不能超过反应体系的1/10）；

6、双酶切入单独进行时要注意酶切的先后顺序，有些酶在末端时酶切效果不好，这时应该先做这个酶切；

7、酶切后要加热（65度10min）使酶失活，有些酶则必须用酚氯仿抽提，切胶回收使比较好的方法；

8、连接使注意载体与片断的比例，一般为片断：载体3－5：1比较好，连接反应体系要小一些（5－10ul）；连接后可直接进行转化，但连接产物的比例不能超过感受态细胞的1/10为佳；

9、在连接时反应体系中氯化钠或氯化钾的浓度不要大于200mM，因为这回抑制ligase的活性；

10、在连接之后进行转化之前应在65度加热10min，这样可以提高转化效率，如是进行电机转化则应用酚氯仿进行抽提；

11、转化时要设对照怡确定转化的效率；


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