重组质粒的构建.转化与重组子筛选

重组质粒的构建、转化与重组子筛选

【实验目的】 1、学习掌握限制性内切酶的分类、特性和作用原理； 2、学习在实现 DNA 的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性核酸内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的 DNA 进行切割，产生利于连接的合适末端。通过对 DNA 的酶切，学会设计构建重组 DNA 分子的基本方法，掌握载体和外源目的 DNA 酶切的操作技术； 3、学习利用 T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的 DNA 片段连接起来，构建体外重组 DNA 分子的技术，了解并掌握几种常见的连接方法； 4、掌握利用 CaCl2 制备感受态细胞的方法； 5、学习和掌握热激法转化 E.coli 的原理和方法； 6、掌握 α -互补筛选法的原理； 7、学习用试剂盒提取质粒 DNA 的方法； 8、学习和掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒； 9、学习掌握重组子 DNA 分子鉴定的基本方法。【实验原理】 1、体外构建重组 DNA 分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体 DNA 时，能得到完整的目的基因。其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。 2、单酶切法，即只能用一种限制性核酸内切酶切割目的 DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端。选择具有相同限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，在构建重组分子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的 DNA 片段以相反方向插入载体分子中，或目的 DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。单酶切法简单易行，但后期筛选工作比较复杂。本实验采用单酶切法。 3、酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的 DNA 数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的 DNA 的量，以及相应的酶量。一般的，酶切 0.2~1.0μ g 的 DNA 分子时，反应体积约为 15~20μ L，DNA 的量增大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位（U）酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h 完全酶解 1μ g pBR322 DNA。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的 10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在 50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过 5%，就会抑制酶的活性。 4、载体与外源 DNA 的链接反应。在基因工程操作中，连接反应总是紧跟酶切反应。外源 DNA 片段

与载体分子连接的方法，即 DNA 分子体外重组技术，主要依赖于限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶催化完成的。DNA 连接酶催化两双链 DNA 片段相邻的 5’-磷酸核 3’-OH 间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的 DNA

连接酶是来自 T4 噬菌体的 T4DNA 连接酶，该酶需要 ATP 作为辅助因子。本实验的连接反应方式是互补粘性末端 DNA 片段之间的连接：当载体和外源 DNA 用同一种限制性核酸内切酶切割时，产生相同的黏性末端，连接后形成的重组 DNA 分子仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列。若外源 DNA 插入片段和适当的载体存在同源黏性末端，这将是最方便的克隆途径。但是，在同黏性末端连接方案中，存在高背景和两向插入的弊端。 5、在基因工程中，转化的实现是借助于人工制备的感受态细胞。目前，常用的感受态细胞制备方法有 CaCl2 法和 RbCl(KCl)法。RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率高，但 CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验要求，制备的感受态细胞暂不用时，加入终浓度为 15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。经过 CaCl2 处理的细胞细胞膜通透性增加，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。在低温下，将携带有外源 DNA 片段的载体与感受态细胞混合，经过热激或电穿孔技术，使载体分子进入受体细胞。进入受体细胞的外源 DNA 分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择培养基上培养，即可筛选出重组子。影响感受态细胞制备及转化的因素：1）细胞的生长状态和密度：从甘油管中新鲜活化而不是多次转接的菌；培养至指数前期到指数期（OD600≈0.30.6）；应为限制-修饰系统缺陷菌株；受体细胞与所转化的载体性质应相匹配。2）质粒 DNA 的质量和浓度：超螺旋构象的质粒 DNA，较其线性构象的转化率高 10-100 倍；加入 DNA 的体积不应超过感受态细胞的 5%，1ng 的 cccDNA 即可使 50μ L 的感受态细胞达到饱和；对于同一类型的载体而言，分子量越大转化率越低。3）其他药品、试剂质量：如 CaCl2 应用高纯度药品、超纯水配制，过滤除菌、分装保存；所有试剂、容器、耗材等均需无菌处理；感受态细胞制备过程均需要无菌、冰浴操作。 6、本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理，使其处于感受态，然后将 pUC19 质粒在 42℃下热激 90s，实现转化。质粒 pUC19 携带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr),在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒 pUC19 的受体细胞，在含有氨苄青霉素培养基上不生长。质粒 pUC19 进入 E.coli DH5α 后，通过α -互补作用，形成完整的β -半乳糖苷

酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β -半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH 降低，培养基中的指示剂变红，转化子的菌落变成红色。当外源片段插入后失去α -互补能力，因而不产生β -半乳糖苷酶，不能利用培养基中的乳糖产生有机酸，而是利用培养基中的有机碳源，不使培养基 pH 降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。挑取在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养，可将重组后的质粒提取出来，进行后续的酶切、连接等。 7、重组 DNA 转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组 DNA 分子，一般仅有少数重组 DNA 分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组 DNA 分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组 DNA 分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源 DNA 片段形成非期待重组 DNA 分子导入所致。因此必须使用各种筛选及鉴定手

段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法和酶切验证。 8、平板筛选法主要用于重组质粒 DNA 分子的转化子的筛选，而不含重组质粒 DNA 分子的受体菌则不能存活，α 互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。质粒 pUC19 携带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr ）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒 pUC19 的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。质粒 pUC19 进入 E.coli DH 5α 后，通过α -互补作用，形成完整的β -半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β -半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH 降低，培养基中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质粒的 E.coli DH 5α ，没有β -半乳糖苷酶活性，不能利用培养基中的乳糖产生有机酸，而是利用培养基中的有机碳源，不使培养基 pH 降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。重组后的载体 DNA 因为目的基因的插入位点在 pUC19 乳糖利用基因内部，不能形成α -互补作用，所以也不能利用培养基中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。 9、利用 α 互补现象对转化菌落进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌 β 半乳糖苷酶的启动子及其 α 肽链的 DNA 序列，此结构称为 lacZ′基因。LacZ′基因编码的 α 肽链是 β 半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146 个氨基酸）。宿

主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的 β 半乳糖苷酶分子。 LacZ′基因编码的 α 肽链与失去了正常氨基端的 β 半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为 α 互补。由 α 互补而形成的有功能活性的 β 半乳糖苷酶，可以用 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷）显色出来，它能将无色的化合物 X-gal 切割成半乳糖和深蓝色的底物 5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着 lacZ′基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种 β 半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的 β 半乳糖苷酶，在 IPTG（异丙基硫代 β -D-半乳糖苷）诱导后，在含有 X-gal 的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源 DNA 片段插入到位于 lacZ′中的多克隆位点后，就会破坏 α 肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的 β 半乳糖苷酶相互补的活性 α 肽，而导致不能形成有功能活性的 β 半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。 10、重组质粒是外源基因通过单酶切（或双酶切）与用相同的（或两种）限制性核酸内切酶切割的质粒载体连接后获得的，因此在连接处仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列，用该酶（或两种酶）再次切割重组质粒，能把插入片段切离载体，根据琼脂糖凝胶电泳检测可见有载体片段和插入的外源 DNA 片段，并可知插入片段的大小。 11、质粒不亲和性/不相容性（plasmid incompatibility）——在没有选择压力的情况下，两种亲缘密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共

存的现象。不亲和质粒——在细胞增殖过程中，两种亲缘关系密切的不同质粒中，必有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉，这样的两种质粒为不亲和质粒。不亲和群（incompatibility group）——具有亲缘关系，但彼此之间互不相容的一组质粒。质粒不相容的分子基础：两种不亲和/相容质粒；同一个细胞中的两种不亲和质粒，随细胞分裂而分配到子细胞中；质粒扩增拷贝数增加；再分配中质粒比例发生改变；最终子细胞中只含一种质粒。【实验试剂与仪器】 1、实验试剂：LB 培养基，麦康凯培养基，抗生素（氨苄青霉素），1×TAE 电泳缓冲液，上样缓冲液（10×loading buffer），琼脂糖，溴化乙锭（EB）， ddH2O, 限制性核酸内切酶（HindⅢ）及其相应的缓冲液,T4 DNA 连接酶，λ DNA，质粒 pUC19，100mmol/L CaCl2 溶液, 试剂盒（含有 Rnase A 的溶液 I，溶液 II，溶液 III，HB buffer，DNA washing buffer，elution buffer）； Supercoiled DNA Ladder Marker, λ -Hind Ⅲ DNA Maker,pUC19 DNA Maker， DL2000 DNA Maker 2、实验仪器：恒温振荡培养箱

，高速离心机，漩涡振荡器，-20℃冰箱，

Eppendorf 管，不同型号枪头，微量移液器，培养皿，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，一次性手套，凝胶成像仪，酒精灯，恒温水浴锅，平板，试管，接种环，牙签 3、菌株：E.coli DH5α

【操作步骤】一、 λ DNA 和 pUC19 的单酶切 1、在 Eppendorf 管中依次加入酶切反应各种成分：

反应体系成分 ddH2O 10×M Buffer DNA pUC19 体积/μ L 14.0 2.0 3.0 1.0 20.0 λ DNA(商品) 体积/μ L 70.0 10.0 15.0（0.3μ g/μ L） 5.0 100.0

Hind Ⅲ(15U/μ L)

总计

2、各管样品混合均匀后，4000rpm，1min，将液体集中于管底； 3、37℃反应 1-2h，电泳检测酶切效率（1.2%琼脂糖，-20℃保存）。二、载体与外源 DNA 的连接反应 1、在 Eppendorf 管中依次加入连接反应所需要的各种成分；

连接反应成分加量/μ L

ddH2O 10×缓冲液 pUC19/Hind Ⅲ λ DNA/Hind Ⅲ T4 DNA 连接酶总计

3.5 1.0 1.5 3.5 0.5 10.0

2、各管样品混匀后，4000rpm 离心 1min，将液体集中于管底； 3、16℃恒温水浴锅过夜连接。三、

感受态细胞的制备及质粒转化 A．受体菌的培养

1、固-液接种：从 LB 平板中挑取新活化的 E.coli DH5α 单菌落，接种于 5mL LB 培养基中，37℃振荡培养过夜； 2、液-液转接：以 1%接种量将过夜培养的 E.coli DH5α 接种于新鲜 LB 培养基中；37℃，220r/min 振荡培养 2-2.5h； 3、菌液冰浴：振荡培养 2-2.5h 后，将菌液冰浴。 B. 感受态细胞的制备 1、取 2 个无菌 Ep 管，各加入 1.5mL 菌液，4℃，4000rpm 离心 5min,弃上清。重复以上步骤至每个 Ep 管中收集 3mL 培养液的菌体； 2、残留液体涡旋细胞至混匀，加 1mL 预冷的 100mmol/L CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置数分钟。4℃，4000rpm 离心 5min，弃干净上清； 3、加入 100μ L 预冷的 0.1M CaCl2，轻轻悬浮细胞，将其中一管分装至 2 管； 4、冰浴 20min，感受态细胞制备完成。 C. 感受态细胞的转化 1、取新制备的感受态细胞悬液做转化实验：实验转化组：感受态细胞悬液 100μ L+5.0μ L 连接产物转化对照组：感受态细胞悬液 50μ L+pUC19 1.0μ L 细胞对照组：感受态细胞悬液 50μ L； 2、将以上样品轻轻混匀后冰浴 10min； 4、向上述各管分别加入新鲜 LB 培养基 900μ L（对照组加 450μ L），摇匀，37℃振荡复苏 0.5-1h，使受体菌恢复正常生长。 D. 稀释和涂布平板 1、将转化细胞溶液按一下操作涂布平板：实验转化组：分别取 50、100、150、200μ L 培养液涂布在 2 个含有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板上；转化对照组：取 50μ L 培养液涂布在一个含氨苄青霉素的麦康凯培养基平板上；细胞对照组:取 50μ L 培养基分别涂布在含氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的

麦康凯培养基平板上。

2、当菌液完全被培养基吸收后倒置平板，于 37℃恒温培养箱中培养 1620h。四、重组子转化的筛选与验证 1、观察平板上有无菌落生长、菌落与平板颜色及菌落数量并记录； 2、从含有氨苄青霉素的麦康凯培养基平板上挑取 8 个不同的白色菌落划线于含氨苄青霉素的空平板上，37℃恒温培养 16-20h； 3、挑取平板上的白色菌落于 20mL 含氨苄 LB 液体培养基中，37℃恒温振荡培养过夜。五、重组质粒的提取（试剂盒法）与电泳检测

1、按 E.Z.N.A.TM Plasmid Mini ProtocolⅠ试剂盒说明书提取高纯度质

粒；

2、电泳检测：在离心管中加入 2μ L ddH2O ,3μ L 质粒及 1μ L 10×Loading Buffer，混匀，快速离心，上样，120V，电泳 30min。 3、EB 染色 10min,清水漂洗 10min 后，凝胶成像仪观察

【实验结果及分析讨论】一、 pUC19 酶切电泳检测

23130 9416 6557 4361 2322 2027

3 4

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

564

备注： 1. λ -DNA/HindⅢ DNA Marker 上样量：5μ L 2. λ -DNA Marker 上样量：100ng 3. λ -DNA/HindⅢ 4. pUC19 DNA Marker 上样量：100ng 5-6: sk1,sk2 pUC19/ HindⅢ 上样量：10μ L 7-14：sk5-sk12 pUC19/ HindⅢ 上样量：10μ L 15,16：Sk3 pUC19/ HindⅢ （+，-）上样量：10μ L 17,18：Sk4 pUC19/ HindⅢ （+，-）上样量：10μ L

上样量：5μ L

分析： 1、第 10 泳道为我组 pUC19/ HindⅢ 样品。可以看到有明显的两条亮带，对比 pUC19 DNA Marker 可知，下面一条亮带为还没有切开的超螺旋 pUC19 质

粒，上面一条亮带为切开的自提 pUC19 质粒。 2、可以看到在 50kb 附近有弥散区域，应为没有除尽的染色质 DNA。而最下方有一条暗带应为 RNA 杂质。

3、对比实验组λ -DNA/HindⅢ与λ -DNA Marker，发现条带相同，表示λ -DNA 酶切完全，可以用于连接。

二、重组子筛选及酸碱理论检测 1.重组子筛选结果实验设组培养基涂布量 Ⅰ-实验组麦康凯培养基 50μ L×2 +氨苄青霉素 100μ L×2 150μ L×2

200μ L×2 Ⅱ-转化对照 Ⅲ-细胞对照麦康凯培养基 +氨苄青霉素麦康凯培养基 +氨苄青霉素麦康凯培养基 50μ L×1 50μ L×1 50μ L×1

培养结果多数菌落为红色，少数为白色，大小中等；培养基为红色白色菌落多于红色菌落，大小中等，培养基为红色白色菌落稍多于红色菌落，为小型或中型菌落，出现粘连；培养基为红色菌落小且多，粘连程度高；培养基为红色菌落均为红色；培养基为红色无菌落生长，培养基为红色菌落小且密集，菌落透明；培养基为黄色

2.酸碱理论检测平板 pH 值 DH5α 6.5 （pUC19）on MAC plate (Ap+,100μ g/mL) DH5α on MAC plate (Ap-) 7.2

图片

MAC plate (blank)

5.5

图 2.酸碱理论检测图

3. DH5α (Amp+)平板酸碱溶液检测滴加溶液现象

图片

3N HCl

平板滴加部位变紫平板滴加部位变紫平板滴加部位变紫无明显颜色变化平板滴加部位变黄

图 3.DH5α (Amp+)平板酸碱溶液检测结果图

3M NaAc, pH=5.2 SolutionⅢ, pH=4.8 TE 溶液

3N NaOH

分析： 1、在Ⅰ-实验组中，随着涂布量的加大，菌落数目增加。在平板上均出现红色菌落和白色菌落。这是因为质粒 pUC19 进入 E.coli DH 5α 后，通过α 互补作用，形成完整的β -半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用 β -半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH 降低，培养基中的指示剂变红，含转化子的菌落变红；重组后的载体 DNA 因为目的基因的插入位点在 pUC19 乳糖利用基因内部，不能形成α -互补作用，所以也不能利用培养基中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。 2、在Ⅱ-转化对照组中，菌落为红色，平板也为红色，这是因为Ⅱ组中生长的菌落均为转入 pUC19 的 E.coli DH 5α ，pUC19 进入 E.coli DH 5α 后，通过α -互补作用，形成完整的β -半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β -半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH 降低，培养基中的指示剂变红，含转化子的菌落变红。且实验结果说明在操作过程中以及系统中基本没有杂菌污染。 3、在Ⅲ-细胞对照组中，添加氨苄的麦康凯平板上无菌落生长，不添加氨苄的麦康凯平板上长有密集的透明菌落。这是因为 DH5α 为氨苄敏感型菌株，不能在含氨苄青霉素的平板上生长。 4、仅不含 pUC19 的菌株培养基颜色变黄，其余均为红色，无变化。原因是：质粒 pUC19 进入 E.coli DH 5α 后，通过α -互补作用，形成完整的β -半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β -半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH 降低，培养基中的指示剂变红，故培养基颜色为红

色；而不含 pUC19 质粒的菌株则会分解其他碳源，产生氨气，使培养基变成黄色。 5、同样基于α -互补，蓝-白筛选与红-白筛选的原理不完全相同。两者均通过α -互补作用，形成完整的β -半乳糖苷酶。蓝-白筛选是由于产生有色物质而使整个培养菌落产生颜色变化；而红-白筛选是由于产酸/碱，使培养基中的指示剂颜色变化，进而改变菌落颜色。 6、从酸碱理论检测的结果中可以看出 DH5α （pUC19）on MAC plate (Ap ,100μ g/mL) pH 为 6.5，DH5α on MAC plate (Ap-) pH 为 7.2，而 MAC plate (blank) pH 为 5.5。这说明不含 pUC19 质粒的菌株代谢使得培养基变

碱，而 DH5α （pUC19）on MAC plate (Ap ,100μ g/mL)实验组平板上由于含 pUC19 质粒的菌株代谢分解乳糖产生有机酸，但是同时含有重组质粒的菌株不能分解乳

糖，代谢产生氨气，二者共同作用导致平板 pH 略有上升。实验结果符合酸碱理论。 7、从 DH5α (Amp+)平板酸碱溶液检测结果可已看出，加酸后培养基颜色变紫，加碱后培养基颜色变黄，加 TE 溶液无明显颜色变化。这是因为麦康凯培养基中添加了中性红指示剂，中性红变色范围为 6.4-8.0。说明 DH5α (Amp+)平板本身为偏碱性，添加酸性溶液后变紫，添加酸性溶液后变黄，符合酸碱理论。

三、重组质粒电泳检测

11649 10085 8023 6133 5026 3049 2087

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

bp 23130 9416 6557 4361 2322 2027

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图 4.重组质粒电泳检测结果图备注： 1．Supercoiled DNA Ladder Marker 2.pUC19 DNA Marker 3-4. sk7 重组质粒 R1，R2 5-6．Sk8 重组质粒 R1，R2 7-8. sk9 重组质粒 R1，R2 9-10. sk10 重组质粒 R1，R2 11-12. sk11 重组质粒 R1，R2 13-14. sk12 重组质粒 R1，R2 15-16:空 17：pUC19 DNA Marker 上样量：6μ L 18. λ -DNA/HindⅢ DNA Marker 上样量：10μ L 上样量：6μ L 上样量：100ng 上样量：3μ L 上样量：3μ L 上样量：3μ L 上样量：3μ L 上样量：3μ L 上样量：3μ L

分析：第 5 泳道样品为我组重组质粒 R1，对比超螺旋 marker，质粒大小约为 10000bp，pUC19 质粒大小为 2.7kb，可知插入片段大小约为 6500bp 左右。第 6 泳道样品为我组重组之力 R2，对比超螺旋 marker，质粒大小约为 6000bp，可判断插入片段大小约为 2kb。此时插入片段的大小只能粗略估计，具体大小需根据后续 PCR 及酶切检测判断。【附录】培养基及试剂配方 1、LB 液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%NaCl。用 NaOH 调 pH 至 7.2 以上，121℃灭菌 20min 备用。

2、麦康凯培养基：取 52g 麦康凯培养基加入 1000mL 去离子水，溶解后 121℃高温灭菌 20min。冷却至 60℃左右加入氨苄青霉素贮存液至终浓度 100μ g/mL,混匀后倾注平板。 3、氨苄青霉素：母液浓度为 100mg/mL，工作浓度为 50-100μ g/mL。

4、10×TAE 缓冲液：母液 50×TAE 缓冲液（Tris 碱 242g，冰乙酸 57.1mL，0.5mol/L EDTA（pH8.0）100mL，定容至 1L）稀释 20 倍。 5、溴化乙锭（EB）染色液：1000×母液浓度 0.5mg/mL，工作浓度 0.5mg/L 水溶液。 10、上样缓冲液（6×）：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液。