分子植物育种，2009年，第7卷，第1期，第155－161页MolecularPlantBreeding,2009,Vol.7,No.1,155－161
专题介绍Review
VIGS：植物功能基因组学研究的革命
姚丹青张微微
原丽华
潘俊松
何欢乐
蔡润*
上海交通大学农业与生物学院,上海,200240*通讯作者,[email protected]
病毒诱导基因沉默(virusinducedgenesilencing,VIGS)技术是一种RNA介导的抗病毒防御反应机制，目前在植物反向遗传学领域已经表现出巨大的潜力。VIGS技术不仅优于传统的植物转基因技术，方法简便，高效耐用，而且具有高通量特性。在功能基因组学领域的研究中，这些优越性已经使VIGS技术成为最具吸引力的首选技术手段。目前，VIGS体系应用最成功的植物是病毒学家常用的模式植物－本氏烟草(Nicotianabenthamiana)，与此同时，也在努力改良VIGS技术，使其能够在包括单子叶植物在内的其它物种中得到广泛应用。我们讨论的重点是针对利用VIGS技术来确定基因功能，该技术已经在抗病性，逆境胁迫，细胞信号传导以及次生代谢生物合成途径研究中显示出相关基因功能的多样性，并随之构建出一系列新的相关模型。
关键词VIGS,病毒载体,基因沉默,功能基因组学
摘
要
VIGS:theRevolutionofPlantFunctionGenomicsResearch
YaoDanqingZhangWeiweiYuanLihuaPanJunsongHeHuanleCaiRun*
TheCollegeofAgricultureandBiology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai,200240*Correspondingauthor,[email protected]
AbstractVirus-inducedgenesilencing(VIGS)isatechnologythatexploitsanRNA-mediatedantiviraldefensemechanismandhasbeenshowntobeofgreatpotentialinplantreversegenetics.Becauseofthemethodologicalsimplicity,robustness,andspeedyresultsthanplantnormaltransformation,VIGShasbeenusedwidelyforanalysisofgenefunctionandhigh-throughputfunctionalgenomicsinplant.UntilnowmostapplicationsofVIGShavebeeninNicotianabenthamiana.Moreover,newvectorsystemsandmethodsaredevelopedtouseinotherplants,includingmonocots.Here,wediscusstheissuesspecifictotheapplicationofVIGStechnologytodeterminegenefunction,whichhasrevealedtherolesofavarietyofgenesindiseaseresistance,abioticstress,cellularsignalingandsecondarymetabolitebiosynthesisandthenconstructaseriesofnewrelatedmodels.KeywordsVIGS,Viralvectors,Genesilencing,Functiongenomics一直以来，生物学家借助传统遗传学手段，利用突变体进行图位克隆，鉴定这些野生型序列，并通过遗传转化证实该基因的功能。通过这种转基因的技术，也为植物保护领域的研究以及提高作物产量方面开启新纪元(Bartonetal.,1983)。然而，目前的转基因技术并不能显示全部的表达结果。将同一基因转入到不同植物中，可表现出极大的差异和变化，某些条件下，后代繁育过程中就会丧失转入基因的功能表达(Allenetal.,2000;Ascenzietal.,2003)。转入基因的非正常表达不仅会使转入基因表达发生沉默，而且会沉默与其同源的内源基因表达(Napolietal.,1990;
vanderKroletal.,1990)。
随着水稻和拟南芥等模式植物全基因组序列的完成，以及更多植物基因组测序的进行，建立了大规模的基因组序列信息数据库，应运而生“反向遗传学”这一新名词。“反向遗传学”直接通过改变某段序列表达来研究该基因功能或DNA序列，之后鉴别所产生的突变型。到目前为止，植物中大部分用到的“反向遗传学”方法几乎都是“转录后基因沉默”(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)(Watsonetal.,2005)。PTGS现象是植物抵御病毒入侵，保持自身基因组完整性的一种防御机制，是植物与病毒
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(30671111)和上海市重点学科建设项目(B209)资助
156
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
www.molplantbreed.org
共进化的结果。PTGS中能够合成mRNA，但随后被降解而不能积累，并同时诱导与外源基因同源的内源性基因沉默。Waterhouse等(1998)首次明确了dsRNA在植物基因沉默中的关键作用。后来发现，正义RNA介导的共抑制，反义RNA介导的基因抑制，以及通过倒位重复转基因产生发夹转录(hairpinRNAs,hpRNAs)(Smithetal.,2000)的介导都与VIGS共有很相似的基因沉默现象。
目前，虽然前几种利用RNA介导的基因沉默的手段已经开发出许多新的突变体，但同时表现出一些局限性，包括不能研究重叠基因(overlappinggene)的功能(多基因家族)，难以使基因组功能研究达到饱和等。而植物病毒诱导的PTGS工具解决了这些局限性，并且不需要产生能够稳定表达沉默结构的转化植株后代，与传统技术相比快捷省力(WangandWagner,2003)。
1VIGS技术的发展
VIGS是指携带植物功能基因cDNA的病毒，在侵染植物体后可诱导植物发生基因沉默而出现表型变异，从而可以通过植物表型或生理指标上的变化反映该基因的功能(图1)。vanKammen(1997)首先使用术语“VIGS”来描述防御病毒感染的现象。然而，该术语已经几乎专门应用于涉及重组病毒敲除内源基因的表达(Baulcombe,1999;Ruizetal.,1998)。早在1995年，Kumagai等(1995)通过携带有一段八氢番茄红素脱氢酶(phytoenedesaturase,PDS)cDNA序列的重组烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)接种到
图1VIGS原理图
注:dsRNA:双链RNA;Dicer酶:核糖核酸酶Ⅲ(RibonucleaseⅢ,RNaseⅢ)家族的成员;siRNA:小干扰RNA;RISC:RNA诱导沉默复合体
Figure1VIGSprinciple
Note:dsRNA:double-strandedRNA;Dicer:afamilymemberofRNaseⅢ;siRNA:SmallInterferingRNA;RISC:RNA-inducedsilencing
complex
发现了内源基因的本氏烟(Nicotianabenthamiana)中，
PTGS现象。早期研究中，VIGS体系通常应用于野生型本氏烟草，由于这种本氏烟对病毒侵染高度敏感，与包括普通烟草(N.tabacum)在内的其它植物相比，本氏烟对许多病毒都比较敏感，且产生VIGS性状也更为持久，因此能够表现出有效的基因沉默。
1998年，Ruiz等人又新构建了基于马铃薯病毒X(potatovirusX,PVX)的VIGS载体。虽然该载体比基于TMV的载体更稳定，但与TMV相比，PVX寄主范围更有限，有9个科的植物对TMV侵染敏感，而PVX只有3个科的植物(Bruntetal.,1996,http://im-age.fs.uidaho.edu/vide/refs.htm#authors)。而且基于TMV和PVX的载体导致接种植物表现病症，进一步表明要想很清楚地解释转录后基因沉默的表现型是有难度的(Ratcliffetal.,2001)。另外，这两种病毒载体并不适用于寄主的生长点和分生组织，在这些组织中不能够发生有效的基因沉默(Ratcliffetal.,2001)。
虽然这些病毒载体不能用于分裂组织，但基于烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus,TRV)的载体体系的开发可以克服寄主分生组织障碍的局限性(Liuetal.,2002b;Ratcliffetal.,2001)。TRV可以有力地蔓延整个植物组织，包括分生组织，而且侵染的全部症状与其它病毒相比更加温和。改良的TRV诱导体系(pYL156和pYL279)对于内源基因的沉默更加有效(Liuetal.,2002a;2002b)。这些病毒载体与早期的TRV载体不同，带有重复的启动子和C－末端的一个酶，这更有利于病毒RNA的产生，而且使病毒序列的大量氨基酸发生变化(Liuetal.,2002b)。迄今为止，与其他的VIGS体系相比，pYL156和pYL279在本氏烟中的效率没有被限制，并且它们被成功地用于番茄和其它物种中，造成了如phytoenedesaturase(PDS)等特定基因的沉默(Liuetal.,2002a;Ekengrenetal.,2003)。随着病毒诱导基因沉默体系的完善，很多种不同的RNA和DNA病毒经修饰后作为载体用于基因表达(Pogueetal.,2002;Timmermansetal.,1994)。如TMV,PVX和TRV可分别用于蛋白表达和基因沉默(AllenandBaulcombe,1999;Kumagaietal.,1995;MacFar-laneandPopovich,2000;Malloryetal.,2002)。然而，并非所有基于RNA病毒的表达载体都可以用于基因沉默，因为很多像烟草蚀纹病毒(tobaccoetchvirus,
它直接影响到宿主的TEV)类似的载体有抗沉默蛋白，
沉默机制(Anandalakshmietal.,1998;KasschauandCarrington,1998)。
早先，由于DNA病毒体积结构大限制其移动，因此没有广泛作为表达载体(PalmerandRybicki,2001)。
VIGS：植物功能基因组学研究的革命
VIGS:theRevolutionofPlantFunctionGenomicsResearch
157
但后来，通过将DNA病毒中具有帽子结构的蛋白基因替换成它的同源序列从而得以利用。尽管RNA病毒复制发生在细胞质，DNA复制发生在植物细胞核并使用宿主的DNA复制条件，但两种病毒都能够诱导内源基因的扩散降解，从而使其所调控的同源独
沉默的程度根据宿主植物和病立系统沉默。然而，
毒的组合不同，表现出的沉默程度也不一样。由于病毒种类、传输载体、感染方式以及植物防御方式都不同，使得病毒沉默的效果不尽相同(TeycheneyandTepfer,2001)。Teycheney和Tepfer(2001)在牵牛花(redstar-typepetuniahybridacultivars)的研究中发现，病毒侵染会干涉植物内源查尔酮合成酶A基因(chs-A)的转录后基因沉默，而且马铃薯病毒Y(potatovirusY,PVY)、烟草蚀纹病毒和黄瓜花叶病毒(cu-cumbermosaicvirus,CMV)分别以空间特异的方式干涉chs-A的PTGS导致花瓣白色区域部分产生不同模式的颜色恢复现象，即不同的病毒侵染宿主后会产生复杂的空间上的对PTGS介导的基因沉默的诱导和干涉之间的相互作用。由基于DNA病毒改造成的番茄金花叶病毒(tomatogoldenmosaicvirus,TG－MV)VIGS体系能够成功地用于本氏烟增殖细胞核抗原(PCNA)分生组织基因沉默(Peeleetal.,2001)。TGMV载体已用于沉默非分生组织基因以及外源转入基因(Kjemtrupetal.,1998)。
除此之外，许多单子叶植物病毒也被改建成载体，以便在单子叶植物中抑制基因表达。由于在单子叶植物中应用功能缺失的方法比较困难，这就使得用于功能基因组的VIGS开发具有重要意义。目前，DNA病毒玉米条纹病毒(maizestreakvirus,MSV)载体也已经成功地应用到提高玉米细胞的蛋白含量中(Palmeretal.,1999)。大麦条纹花叶病毒(barleystripemosaicvirus,BSMV)(Lacommeetal.,2003)以及小麦矮缩病毒(wheatdwarfvirus,WDV)等(Matzeitetal.,1991)都已经用于基因沉默，这对水稻和小麦等重要经济作物功能基因组研究提供了有效的工具。最近，感染单子叶植物的雀麦花叶病毒株“Tall-fescue”已经被改造用于VIGS，在重要的谷稻类作物中成功沉默了PDS基因、肌动蛋白和Rubisco活化酶基因(Dingetal.,2006)。
除了直接改造利用RNA和DNA植物病毒之外，二元体系,如卫星病毒诱导沉默体系(satellitevirusinducesilencesystem,SVISS)也已在烟草中应用(Gosseléetal.,2002)。这个体系由TMV(strainU2)和一个卫星病毒(satellitetobaccomosaicvirus,STMV)组成。改造过的中国番茄黄化曲叶病毒(DNA卫星病毒分子)作为VIGS体系的载体已经在本氏烟上应用，
最初的DNA卫星病毒沉默载体本身在植物中并不产生任何症状，因此在最大程度上减少了对VIGS沉默表型的干扰效应(TaoandZhou,2004)。为了更好地将VIGS体系推广到重要的块茎作物木薯中(Manihot
开发了包含DNA的双生病毒――非洲木esculenta)，
薯花叶病毒载体，携带叶绿体镁合金螯合酶(su)亚基基因，导致接种后(dpi)7~21d叶片中的su基因沉默。利用VIGS体系木薯中的有害次生代谢产物亚麻苦苷水平量减少70%(Fofanaetal.,2004)。
拟南芥是植物中最为重要的模式植物之一，通过
能够为改善VIGS技术对其进行研究具有重大意义，
其中最值得关注大规模的功能基因组筛选提供便利。
的开发就是在拟南芥中利用甘蓝曲叶病毒(cabbageleafcurlvirus,CbLCV)进行VIGS(Turnageetal.,2002)。但存在一些制约因素，一方面将载体引到植物中需要质粒轰击(Turnageetal.,2002)，另一方面能够使适用于病毒基因组插入的位点受到限制(800bp)(MuangsanandRobertson,2004)。除了CbLCV在模式植物中作
在拟南芥中有报道TRV已经有效地为VIGS载体外，
用于瞬时表达VIGS体系。随着一系列的修复，以前用在本氏烟或番茄中的VIGS方案都能够用于拟南芥中进行基因沉默(Luetal.,2003;Burch-Smithetal.,2004)。Burch-Smith等(2006)利用TRV-VIGS载体(Liuetal.,2002a)优化了它在拟南芥中的传输效率。并有报道在成熟组织中，利用VIGS检测到了CUL1(nullmutant
使用相同ofwhichisembryolethal)基因的沉默效应。
的体系，沉默两个抗病基因rpm1和伴随gfp的rps2，导致对丁香假单胞菌的抗病性缺失，并且叶片中gfp沉默共表达(Liuetal.,2002b)。以上的沉默表现型与相应的转录水平密切相关。
2VIGS技术对基因功能的研究进展
由于VIGS的有效性和快速性，近些年将一些VIGS体系的载体进行改良，在特定的寄主植物上赋予新的功能，并且成功地用于解析许多具有重要意
其中，应用最多的就是基于TRV义的植物基因功能。
的VIGS体系，并广泛用于验证重要经济作物的多基因沉默，从最初的烟草、番茄到新近研究的辣椒(Chungetal.,2004)和罂粟(Hilemanetal.,2005)等茄科作物，再到拟南芥、矮牵牛以及耧斗菜属植物(GouldandKramer,2007)，都已经报道了多基因沉默，如使用TRV诱导的VIGS使二磷酸核酮糖羧化酶的小亚基编码基因(rbcS)发生表达沉默，rbcS为多基因家族，表明VIGS可有效地使多基因家族发生基
158
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
www.molplantbreed.org
因沉默(Ratcliffetal.,2001)。可见TRV载体应用的广泛性和实用价值。近来利用改良的TRV载体研究了果实成熟基因，并直接在番茄果实中将基因沉默(Fuetal.,2006)。与生物素合成或果实中乙烯信号转导途径相关的几个基因的沉默造成了颜色与细胞壁结构的改变。在每一种情况中，都显示出目标基因转录水平相应的减少，这与表现型的改变相关联。另外，在有关花发育衰老(Chenetal.,2004)与形态学以及气味产生途径的相关基因功能(Spitzeretal.,2007)都已通过VIGS体系得到验证，并应用到多个物种当中。在大量的基因功能研究中，有绝大部分归属于防御反应通路相关基因的研究。在拟南芥中，利用TRV-VIGS体系研究防御反应通路相关基因的功能，这些基因与抗丁香假单胞菌基因R的产物RPS2转
将抗病反应中的导的信号途径相关(Caietal.,2006)。
rar1，hsp90和ndr1基因沉默的植物，甚至在rps2基因表达的情况下，会出现丁香假单胞菌病症的发展，表明被沉默的基因在防御反应路径中起到积极作用。同样，将rin4基因沉默引起并加强了抗病反应，从而推断其在路径中起到抑制的作用。目前已经将TRV-VIGS体系应用于类异戊二烯生物合成途径的研究，Page等(2004)沉默了在上述途径中必需的3个本氏烟基因，引起该植物的代谢障碍，说明能够从代谢途径以及个体上将用于类异戊二烯生物合成的甲羟戊酸，3－甲(基)－3,5－二羟(基)戊酸和DXP途径区分开。
VIGS通过沉默基因的方法已经成功地解析了植物细胞程序性死亡(PCD)反应，并已知在该反应中所沉默基因的产物在其它反应体系中也同样作为重要的调节元件，例如编码己糖激酶的hxk1基因(Kimetal.,2006)，顺乌头酸酶(aconitase)(Moederetal.,2007)LePP2Ac1的同源基因，与磷酸化蛋白相关的番茄基因(Heetal.,2004)以及编码prohibitins-PhPHB1和PhPHB2的矮牵牛基因(Chenetal.,2005)。除了TRV-VIGS体系，在本氏烟中，利用基于PVX的表达体系进行高通量筛选，确定了细胞死亡的正调控元件(NbCD1)是一个新颖的Ⅱ级乙烯响应元件结合因子(Nasiretal.,2005)。利用PVX-VIGS将NbCD1沉默，证明植物只是对病菌接种表现出部分的防御反应，甚至是对非致病性假单胞菌(Pseudomonascichorii)也是同样表现。利用番茄丁香假单胞菌(P.syringae)进行类似的研究开发出信号转导途径中的一个正调控基因apr134。而且，在植物抗病防御领域，利用BSMV-VIGS体系描述了与小麦抗病反应的相关基因，即rar1、sgt1和hsp90基因。人们怀疑这些基因是小麦抗锈病(Pucciniatriticina)反应中借助R基因lr-21
调节的信号转导体系的一部分(Scofieldetal.,2005)，能够导致植物体对病原菌的敏感性，体现了这些基因在抗病反应中的直接作用。另外，抗大麦白粉病菌(Blumeriagraminis)的R基因mla13和HSP90，也是利用BSMV-VIGS体系分析(Heinetal.,2005)。
由于VIGS技术中存在寄主专一性这一特点，使得广泛用于茄科和十字花科等作物的病毒载体在其它科作物中未能得以利用。尤其是在葫芦科作物中一
直到直缺少一个有力的载体能够用于基因功能验证。
2002年，新开发出了台湾矮南瓜黄化嵌纹病毒(zuc-chiniyellowmosaicvirus,ZYMV)载体pT7ZYMV2－5及p35SZYMV2－26，并验证所构建载体对体内和体外转录都具有侵染力(Linetal.,2002)。近年来，借助ZYMV研究葫芦科植物南瓜(Cucurbitamoschata,对短日照敏感品种)花芽诱导必需的长距离运动的物质是成花基因FT(FLOWERINGLOCUST)的mRNA还是FT蛋白，即利用ZYMV进行FT异位表达后，高效介导了长日照处理南瓜植株的成花诱导，而
Real-ZYMV的侵染区远离花芽原基；通过嫁接实验，timeRT-PCR以及对韧皮部汁液蛋白的质谱分析等一系列研究，确定通过韧皮部传导而起成花信号作用的是FT蛋白，不是其mRNA(Linetal.,2007)。可见，ZYMV载体的开发对葫芦科作物的基因功能研究具有重要意义。
3VIGS的优点
VIGS作为功能基因组的鉴定手段具有重要意义。目前，许多表现型引起关注的基因只能通过大规模筛选群体来筛选特定基因中的突变体，同时在多个物种中传代转化的方法进行鉴定；而VIGS克服了传统转化方法所带来的诸多困难，能够鉴别当代植株特定基因功能缺失的表现型，直接靶定受关注的基因，使得具有特别意义的基因能够快速通过VIGS载体测序和鉴定。另外，近来有研究表明，利用VIGS技术通过包含多基因序列的病毒载体，使几个基因
将能够引起视觉上表同时发生沉默成为可能。例如，
现型的标记基因(编码查尔酮合成酶,CHS)与矮牵牛中的目标基因(与衰老相关的aco4)显示出共沉默后的共表达效应(Chenetal.,2004)。此外，在说明上位相关性的同时，VIGS技术已经被用于抗感途径中木质素生物合成酶的研究(Abbottetal.,2002)。随着VIGS技术的不断成熟，利用这种方法能够更加容易和形象地组织筛选出目标基因的沉默效应，抑制多重截然不同的基因表达。与此同时，VIGS技术还克服了基因家族功能冗余的问题，通过利用来自基因
VIGS：植物功能基因组学研究的革命
VIGS:theRevolutionofPlantFunctionGenomicsResearch
159
功能研究和高通量功能基因组研究中的一种工具表现出更多的前景和价值。同时，在遗传学领域上的研究得到快速发展，与早期传统遗传学筛选最接近
且VIGS能够容易的对不同品种间的基因功能进行的VIGS技术，通过将随机cDNA序列克隆进一个
称为“fast-forwardLiu等(2002a;2002b)设计的TRV-VIGS载体就病毒载体并筛选感兴趣的表现型，比对。
方法具有重要意义，并能很快分离和鉴别出genetics”能够应用于本氏烟和番茄中确定基因功能。
来产生感兴趣表现型的基因序列(Baulcombe,1999)。
4VIGS的局限性但由于仅有少量相关EST数据库，因此当作用于某
一物种时就表现出极大的局限性，这就引起我们对
虽然VIGS的优势显而易见，但其作为功能验证
一些物种基因组序列测序工作的关注，可以通过在
一个重要手段的同时，也存在着固有的局限性。首
线数据库和快速沉默来鉴别关注基因。而且，随着基
先，针对不同的寄主植物需要选择不同的病毒载体，
VIGS也可用于研究一类基因全部成因载体的构建，
在病原体与寄主间互作的同时就表现出该技术的不
员的功能，例如，蛋白激酶或磷酸脂酶。随着VIGS技
足。目前，最可靠和有效的VIGS载体TRV就存在着
术所采用的植物种类的增多及研究人员对技术的熟
寄主范围的局限性，该载体体系仅仅适用于本氏烟
练，我们期待看见该技术在植物功能基因组的研究
及像番茄等茄科家族的其他成员。这就要求开发具
中成为一个更加常用的工具。
有较宽寄主范围的载体，尤其是那些能够在拟南芥
(Burch-Smithetal.,2006)和水稻中有效促进VIGS参考文献效能的载体。另外，单独用病毒接种植物能改变植物的发育，尤其会影响植株高度和叶片形态。这一点显AbbottJ.C.,BarakateA.,PinconG.,LegrandM.,LapierreC.,
MilaI.,SchuchW.,andHalpinC.,2002,Simultaneoussup-著体现于PVX和TMV的VIGS体系，细微的表现型
pressionofmultiplegenesbysingletransgenes.Down-regu-作为基因抑制的结果可能被病毒的症状所掩盖。lationofthreeunrelatedligninbiosyntheticgenesintobacco,
因此不可能有效PVX和TMV都不能用于分生组织，PlantPhysiol.,128(3):844-853
地用于评定涉及芽、叶片、花和果实发育等基因的功AllenG.C.,SpikerS.,andThompsonW.F.,2000,Useofmatrix
attachmentregions(MARs)tominimizetransgenesilencing,能。VIGS很少使目标基因表达完全抑制，导致其所表
PlantMol.Biol.,43:361-376现出的特征较弱。虽然转录水平减少，仍足以产生足
够的功能蛋白，所以在沉默植物中很有可能观察不到AllenS.M.,andBaulcombeD.C.,1999,Technicaladvance:
potatovirusXamplicon-mediatedsilencingofnucleargenes,
相应的表现型。如果表现型不突出的话，VIGS就不能
PlantJ.,20(3):357-362
沉默特别功能背景下的一个基因，同时很有可能错过
AnandalakshmiR.,PrussG.J.,GeX.,MaratheR.,MalloryA.C.,
一些表现型，这些表现型被基因家族成员间功能的冗SmithT.H.,andVanceV.B.,1998,Aviralsuppressorof余而掩盖。目前，有报道在低温，潮湿条件下，可以加genesilencinginplants,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,95(22):
其次，VIGS强番茄中VIGS的表现型(Fuetal.,2006)。13079-13084
(及普遍的PTGS转录后基因沉默方法)还可能不小AscenziR.,UlkerB.,ToddJ.J.,SowinskiD.A.,SchimeneckC.R.,
AllenG.C.,WeissingerA.K.,andThompsonW.F.,2003,心抑制非目标基因功能，这个可能性对于一个未进
Analysisoftrans-silencersofvaryingstrengthandtargets
行基因测序的植物品种是很难排除的。另一方面，
withandwithoutflankingnuclearmatrixattachmentregion,
VIGS不能遍及整个侵染植株诱使基因一致沉默，而
TransgenicRes.,12(3):305-318
且在植株和实验中沉默水平能够发生变化。这使得
BartonK.A.,BinnsA.N.,MatzkeA.J.,andChiltonM.D.,1983,
要清楚的阐明结果就变得更加复杂，尤其是在不能Regenerationofintacttobaccoplantscontainingfulllength够产生明显的沉默表现型的情况下。要解决这一问copiesofgeneticallyengineeredT-DNA,andtransmission
可题，就要设计针对于VIGS载体的内在阳性对照，ofT-DNAtoR1progeny,Cell,32(4):1033-1043
BaulcombeD.C.,1999,Fastforwardgeneticsbasedonvirus-in-用一个突出的表现型标记沉默区域。
ducedgenesilencing,Curr.Opin.PlantBiol.,2:109-113
家族高度保守区域的目标序列，可以来沉默特定家族的全部或部分成员。相反，特定成员的基因家族也可以通过选择家族成员中的一段序列进行靶定。而
5前景展望
目前，现有载体以及接种技术的改进为病毒诱导基因沉默试验敞开了大门，VIGS作为在植物基因
Burch-SmithT.M.,AndersonJ.C.,MartinG.B.,andDinesh-Ku-marS.P.,2004,Applicationsandadvantagesofvirus-in-ducedgenesilencingforgenefunctionstudiesinplants,PlantJ.,39(5):734-746
160
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
38:2155-2164
www.molplantbreed.org
Burch-SmithT.M.,SchiffM.,LiuY.,andDinesh-KumarS.P.,
2006,Efficientvirus-inducedgenesilencinginArabidopsis,PlantPhysiol.,142(1):21-27
CaiX.Z.,XuQ.F.,WangC.C.,andZhengZ.,2006,Development
ofavirusinducedgene-silencingsystemforfunctionalanal-ysisoftheRPS2－dependentresistancesignalingpathwayinArabidopsis,PlantMol.Biol.,62:223-232
ChenJ.C.,JiangC.Z.,andReidM.S.,2005,Silencingaprohibitin
altersplantdevelopmentandsenescence,PlantJ.,44(1):16-24ChenJ.C.,JiangC.Z.,GookinT.E.,HunterD.A.,ClarkD.G.,and
ReidM.S.,2004,Chalconesynthaseasareporterinvirus-inducedgenesilencingstudiesofflowersenescence,PlantMol.Biol.,55(4):521-530
ChungE.,SeongE.,KimY.C.,ChungE.J.,OhS.K.,LeeS.,Park
J.M.,JoungY.H.,andChoiD.,2004,Amethodofhighfre-quencyvirusinducedgenesilencinginchilipepper(Cap－sicumannuumL.cv.Bukang),Mol.Cell,17:377-380DingX.S.,SchneiderW.L.,ChaluvadiS.R.,MianM.A.R.,andNel-sonR.S.,2006,CharacterizationofaBromemosaicvirusstrainanditsuseasavectorforgenesilencinginmonocotyledonoushosts,Mol.PlantMicrobe.Interact.,19(11):1229-1239EkengrenS.K.,LiuY.,SchiffM.,Dinesh-KumarS.P.,andMar-tinG.B.,2003,TwoMAPKcascades,NPR1,andTGAtran-scriptionfactorsplayaroleinPto-mediateddiseaseresis-tanceintomato,PlantJ.,36:905-917
FofanaI.B.,SangareA.,CollierR.,TaylorC.,andFauquetC.M.,
2004,Ageminivirus-inducedgenesilencingsystemforgenefunctionvalidationincassava,PlantMol.Biol.,56(4):613-624FuD.Q.,ZhuB.Z.,ZhuH.L.,ZhangH.X.,XieY.H.,JiangW.B.,
ZhaoX.D.,andLuoK.B.,2006,Enhancementofvirus-in-ducedgenesilencingintomatobylowtemperatureandlowhumidity,Mol.Cell,21:153-160
GosseléV.,FachéI.,MeulewaeterF.,CornelissenM.,andMet-zlaffM.,2002,SVISS-anoveltransientgenesilencingsys-temforgenefunctiondiscoveryandvalidationintobacco,PlantJ.,32(5):859-866
GouldB.,andKramerE.M.,2007,Virus-inducedgenesilencing
asatoolforfunctionalanalysesintheemergingmodelplantAquilegia(columbine,Ranunculaceae),PlantMethods,3:6HeX.,AndersonJ.C.,delPozoO.,GuY.Q.,TangX.,andMartin
G.B.,2004,SilencingofsubfamilyIofproteinphosphatase2Acatalyticsubunitsresultsinactivationofplantdefenseresponsesandlocalizedcelldeath,PlantJ.,38:563-577HeinI.,Barciszewska-PacakM.,HrubikovaK.,WilliamsonS.,
DinesenM.,SoenderbyI.E.,SundarS.,JarmolowskiA.,ShirasuK.,andLacommeC.,2005,Virus-inducedgenesi-lencing-basedfunctionalcharacterizationofgenesassociat-edwithpowderymildewresistanceinbarley,PlantPhysiol.,
HilemanL.C.,DreaS.,MartinoG.,LittA.,andIrishV.F.,2005,
Virus-inducedgenesilencingisaneffectivetoolforassayinggenefunctioninthebasaleudicotspeciesPapaversomniferum(opiumpoppy),PlantJ.,44:334-341
KasschauK.D.,andCarringtonJ.C.,1998,Acounterdefensive
strategyofplantviruses:suppressionofposttranscriptionalgenesilencing,Cell,95:461-470
KimM.,LimJ.H.,AhnC.S.,ParkK.,KimG.T.,KimW.T.,and
PaiH.S.,2006,Mitochondria-associatedhexokinasesplayaroleinthecontrolofprogrammedcelldeathinN.benthami－ana,PlantCell,18:2341-2355
KjemtrupS.,SampsonK.S.,PeeleC.G.,NguyenL.V.,andCon-klingM.A.,1998,GenesilencingfromplantDNAcarriedbyageminivirus,PlantJ.,14:91-100
KumagaiM.H.,DonsonJ.,Della-CioppaG.,HarveyD.,HanleyK.,
andGrillL.K.,1995,Cytoplasmicinhibitionofcarotenoidbiosynthesiswithvirus-derivedRNA,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,92:1679-1683
LacommeC.,HrubikovaK.,andHeinI.,2003,Enhancementof
virus-inducedgenesilencingthroughviral-basedproductionofinverted-repeats,PlantJ.,34:543-553
LinM.K.,BelangerH.,LeeY.J.,Varkonyi-GasicE.,TaokaK.,
MiuraE.,Xoconostle-CázaresB.,GendlerK.,JorgensenR.A.,PhinneyB.,LoughT.J.,andLucasW.J.,2007,Flower-inglocusTproteinmayactasthelong-distanceflorigenicsignalinthecucurbits,PlantCell,19(5):1488-1506LinS.S.,HouR.F.,andYehS.D.,2002,Constructionofinvitro
andinvivoinfectioustranscriptsofaTaiwanstrainofzuc－chiniyellowmosaicvirus,Bot.Bull.Acad.Sin.,43:261-269LiuY.,SchiffM.,andDinesh-KumarS.P.,2002a,Virus-induced
genesilencingintomato,PlantJ.,31:777-786
LiuY.,SchiffM.,MaratheR.,andDinesh-KumarS.P.,2002b,
TobaccoRar1,EDS1andNPR1/NIM1likegenesarere-quiredforN-mediatedresistancetotobaccomosaicvirus,PlantJ.,30:415-429
LuR.,Martin-HernandezA.M.,PeartJ.R.,MalcuitI.,and
BaulcombeD.C.,2003,Virus-inducedgenesilencinginplants,Methods,30:296-303
MacFarlaneS.A.,andPopovichA.H.,2000,Efficientexpressionof
foreignproteinsinrootsfromtobravirusvectors,Virology,267:29-35
MalloryA.C.,ParksG.,EndresM.W.,BaulcombeD.,Bowman
L.H.,PrussG.J.,andVanceV.B.,2002,Theamplicon-plussystemforhigh-levelexpressionoftransgenesinplants,Nat.Biotechnol.,20(6):622-25
MatzeitV.,SchaeferS.,KammannM.,SchalkH.J.,SchellJ.,and
GronenbomB.,1991,Wheatdwarfvirusvectorsreplicate
VIGS：植物功能基因组学研究的革命
VIGS:theRevolutionofPlantFunctionGenomicsResearch
andexpressforeigngenesincellsofmonocotyledonousplants,PlantCell,3:247-258
MoederW.,delPozoO.,NavarreD.A.,MartinG.B.,andKlessig
D.F.,2007,AconitaseplaysaroleinregulatingresistancetooxidativestressandcelldeathinArabidopsisandNicotianabenthamiana,PlantMol.Biol.,63:273-287
MuangsanN.,andRobertsonD.,2004,Geminivirusvectorsfor
transientgenesilencinginplants,MethodsMol.Biol.,265:101-115
NapoliC.,LemieuxC.,andJorgensenR.,1990,Introductionofa
chimericchalconesynthasegeneintoPetuniaresultsinre-versibleco-suppressionofhomologousgenesintrans,PlantCell,2:279-289
NasirK.H.,TakahashiY.,ItoA.,SaitohH.,MatsumuraH.,Kan-zakiH.,ShimizuT.,ItoM.,FujisawaS.,SharmaP.C.,Ohme-TakagiM.,KamounS.,andTerauchiR.,2005,High-throughputinplantaexpressionscreeningidentifiesaclassIIethylene-responsiveelementbindingfactor-likepro-teinthatregulatesplantcelldeathandnon-hostresistance,PlantJ.,43:491-505
PageJ.E.,HauseG.,RaschkeM.,GaoW.,SchmidtJ.,ZenkM.
H.,andKutchanT.M.,2004,Functionalanalysisofthefinalstepsofthe1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate(DXP)path-waytoisoprenoidsinplantsusingvirus-inducedgenesi-lencing,PlantPhysiol,134(4):1401-1413
PalmerK.E.,andRybickiE.P.,2001,Investigationofthepoten-tialofmaizestreakvirustoactasaninfectiousgenevectorinmaizeplants,Arch.Virol.,146:1089-104
PalmerK.E.,ThomsonJ.A.,andRybickiE.P.,1999,Generationof
maizecelllinescontainingautonomouslyreplicatingmaizestreakvirus-basedgenevectors,Arch.Virol,144:1345-1360PeeleC.,JordanC.V.,MuangsanN.,TurnageM.,EgelkroutE.,
EagleP.,Hanley-BowdoinL.,andRobertsonD.,2001,Si-lencingofameristematicgeneusinggeminivirus-derivedvectors,PlantJ.,27:357-366
PogueG.P.,LindboJ.A.,GargerS.J.,andFitzmauriceW.P.,
2002,Makinganallyfromanenemy:plantvirologyandthenewagriculture,Annu.Rev.Phytopathol.,40:45-74RatcliffF.,Martin-HernandezA.M.,andBaulcombeD.C.,2001,
Tobaccorattlevirusasavectorforanalysisofgenefunctionbysilencing,PlantJ.,25:237-245
RuizM.T.,VoinnetO.,andBaulcombeD.C.,1998,Initiation
161
andmaintenanceofvirus-inducedgenesilencing,PlantCell,10:937-946
ScofieldS.R.,HuangL.,BrandtA.S.,andGillB.S.,2005,Devel-opmentofavirus-inducedgenesilencingsystemforhexaploidwheatanditsuseinfunctionalanalysisoftheLr21-mediatedleafrustresistancepathway,PlantPhysiol.,138:2165-2173
SmithN.A.,SinghS.P.,WangM.B.,StoutjesdijkP.A.,GreenA.G.,
andWaterhouseP.M.,2000,Totalsilencingbyin-tron-splicedhairpinRNAs,Nature,407:319-320
SpitzerB.,ZviM.M.,OvadisM.,MarhevkaE.,BarkaiO.,Edel-baumO.,MartonI.,MasciT.,AlonM.,MorinS.,RogachevI.,AharoniA.,andVainsteinA.,2007,Reversegeneticsoffloralscent:applicationoftobaccorattlevirus-basedgenesi-lencinginpetunia,PlantPhysiol.,145(4):1241-1250,TaoX.,andZhouX.,2004,AmodifiedviralsatelliteDNAthat
suppressesgeneexpressioninplants,PlantJ.,38:850-860TeycheneyP.Y.,andTepferM.,2001,Virus-specificspatialdif-ferencesintheinterferencewithsilencingofthechs-Ageneinnon-transgenicpetunia,J.Gen.Virol.,82:1239-1243TimmermansM.C.P.,DasO.P.,andMessingJ.,1994,Geminivirus-esandtheirusesasextrachromosomalreplicons,Annu.PlantPhysiol.,45:79-112
TurnageM.A.,MuangsanN.,PeeleC.G.,andRobertsonD.,
2002,Geminivirus-basedvectorsforgenesilencinginAra－bidopsis,PlantJ.,30:107-117
vanderKrolA.R.,MurL.A.,BeldM.,MolJ.N.,andStuitjeA.R.,
1990,Flavonoidgenesinpetunia:additionofalimitednum-berofgenecopiesmayleadtoasuppressionofgeneexpres-sion,PlantCell,2:291-299
vanKammenA.,1997,Virus-inducedgenesilencingininfected
andtransgenicplants,TrendsPlantSci.,2:409-411WangE.,andWagnerG.J.,2003,Elucidationofthefunctionsof
genescentraltoditerpenemetabolismintobaccotrichomesusingposttranscriptionalgenesilencing,Planta,216:686-691WaterhouseP.M.,GrahamM.W.,andWangM.B.,1998,Virus
resistanceandgenesilencinginplantscanbeinducedbysi-multaneousexpressionofsenseandantisenseRNA,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,95(23):13959-13964
WatsonJ.M.,FusaroA.F.,WangM.,andWaterhouseP.M.,
2005,RNAsilencingplatformsinplants,FEBSLett.,579:5982-5987
分子植物育种，2009年，第7卷，第1期，第155－161页MolecularPlantBreeding,2009,Vol.7,No.1,155－161
专题介绍Review
VIGS：植物功能基因组学研究的革命
姚丹青张微微
原丽华
潘俊松
何欢乐
蔡润*
上海交通大学农业与生物学院,上海,200240*通讯作者,[email protected]
病毒诱导基因沉默(virusinducedgenesilencing,VIGS)技术是一种RNA介导的抗病毒防御反应机制，目前在植物反向遗传学领域已经表现出巨大的潜力。VIGS技术不仅优于传统的植物转基因技术，方法简便，高效耐用，而且具有高通量特性。在功能基因组学领域的研究中，这些优越性已经使VIGS技术成为最具吸引力的首选技术手段。目前，VIGS体系应用最成功的植物是病毒学家常用的模式植物－本氏烟草(Nicotianabenthamiana)，与此同时，也在努力改良VIGS技术，使其能够在包括单子叶植物在内的其它物种中得到广泛应用。我们讨论的重点是针对利用VIGS技术来确定基因功能，该技术已经在抗病性，逆境胁迫，细胞信号传导以及次生代谢生物合成途径研究中显示出相关基因功能的多样性，并随之构建出一系列新的相关模型。
关键词VIGS,病毒载体,基因沉默,功能基因组学
摘
要
VIGS:theRevolutionofPlantFunctionGenomicsResearch
YaoDanqingZhangWeiweiYuanLihuaPanJunsongHeHuanleCaiRun*
TheCollegeofAgricultureandBiology,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai,200240*Correspondingauthor,[email protected]
AbstractVirus-inducedgenesilencing(VIGS)isatechnologythatexploitsanRNA-mediatedantiviraldefensemechanismandhasbeenshowntobeofgreatpotentialinplantreversegenetics.Becauseofthemethodologicalsimplicity,robustness,andspeedyresultsthanplantnormaltransformation,VIGShasbeenusedwidelyforanalysisofgenefunctionandhigh-throughputfunctionalgenomicsinplant.UntilnowmostapplicationsofVIGShavebeeninNicotianabenthamiana.Moreover,newvectorsystemsandmethodsaredevelopedtouseinotherplants,includingmonocots.Here,wediscusstheissuesspecifictotheapplicationofVIGStechnologytodeterminegenefunction,whichhasrevealedtherolesofavarietyofgenesindiseaseresistance,abioticstress,cellularsignalingandsecondarymetabolitebiosynthesisandthenconstructaseriesofnewrelatedmodels.KeywordsVIGS,Viralvectors,Genesilencing,Functiongenomics一直以来，生物学家借助传统遗传学手段，利用突变体进行图位克隆，鉴定这些野生型序列，并通过遗传转化证实该基因的功能。通过这种转基因的技术，也为植物保护领域的研究以及提高作物产量方面开启新纪元(Bartonetal.,1983)。然而，目前的转基因技术并不能显示全部的表达结果。将同一基因转入到不同植物中，可表现出极大的差异和变化，某些条件下，后代繁育过程中就会丧失转入基因的功能表达(Allenetal.,2000;Ascenzietal.,2003)。转入基因的非正常表达不仅会使转入基因表达发生沉默，而且会沉默与其同源的内源基因表达(Napolietal.,1990;
vanderKroletal.,1990)。
随着水稻和拟南芥等模式植物全基因组序列的完成，以及更多植物基因组测序的进行，建立了大规模的基因组序列信息数据库，应运而生“反向遗传学”这一新名词。“反向遗传学”直接通过改变某段序列表达来研究该基因功能或DNA序列，之后鉴别所产生的突变型。到目前为止，植物中大部分用到的“反向遗传学”方法几乎都是“转录后基因沉默”(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS)(Watsonetal.,2005)。PTGS现象是植物抵御病毒入侵，保持自身基因组完整性的一种防御机制，是植物与病毒
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(30671111)和上海市重点学科建设项目(B209)资助
156
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
www.molplantbreed.org
共进化的结果。PTGS中能够合成mRNA，但随后被降解而不能积累，并同时诱导与外源基因同源的内源性基因沉默。Waterhouse等(1998)首次明确了dsRNA在植物基因沉默中的关键作用。后来发现，正义RNA介导的共抑制，反义RNA介导的基因抑制，以及通过倒位重复转基因产生发夹转录(hairpinRNAs,hpRNAs)(Smithetal.,2000)的介导都与VIGS共有很相似的基因沉默现象。
目前，虽然前几种利用RNA介导的基因沉默的手段已经开发出许多新的突变体，但同时表现出一些局限性，包括不能研究重叠基因(overlappinggene)的功能(多基因家族)，难以使基因组功能研究达到饱和等。而植物病毒诱导的PTGS工具解决了这些局限性，并且不需要产生能够稳定表达沉默结构的转化植株后代，与传统技术相比快捷省力(WangandWagner,2003)。
1VIGS技术的发展
VIGS是指携带植物功能基因cDNA的病毒，在侵染植物体后可诱导植物发生基因沉默而出现表型变异，从而可以通过植物表型或生理指标上的变化反映该基因的功能(图1)。vanKammen(1997)首先使用术语“VIGS”来描述防御病毒感染的现象。然而，该术语已经几乎专门应用于涉及重组病毒敲除内源基因的表达(Baulcombe,1999;Ruizetal.,1998)。早在1995年，Kumagai等(1995)通过携带有一段八氢番茄红素脱氢酶(phytoenedesaturase,PDS)cDNA序列的重组烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)接种到
图1VIGS原理图
注:dsRNA:双链RNA;Dicer酶:核糖核酸酶Ⅲ(RibonucleaseⅢ,RNaseⅢ)家族的成员;siRNA:小干扰RNA;RISC:RNA诱导沉默复合体
Figure1VIGSprinciple
Note:dsRNA:double-strandedRNA;Dicer:afamilymemberofRNaseⅢ;siRNA:SmallInterferingRNA;RISC:RNA-inducedsilencing
complex
发现了内源基因的本氏烟(Nicotianabenthamiana)中，
PTGS现象。早期研究中，VIGS体系通常应用于野生型本氏烟草，由于这种本氏烟对病毒侵染高度敏感，与包括普通烟草(N.tabacum)在内的其它植物相比，本氏烟对许多病毒都比较敏感，且产生VIGS性状也更为持久，因此能够表现出有效的基因沉默。
1998年，Ruiz等人又新构建了基于马铃薯病毒X(potatovirusX,PVX)的VIGS载体。虽然该载体比基于TMV的载体更稳定，但与TMV相比，PVX寄主范围更有限，有9个科的植物对TMV侵染敏感，而PVX只有3个科的植物(Bruntetal.,1996,http://im-age.fs.uidaho.edu/vide/refs.htm#authors)。而且基于TMV和PVX的载体导致接种植物表现病症，进一步表明要想很清楚地解释转录后基因沉默的表现型是有难度的(Ratcliffetal.,2001)。另外，这两种病毒载体并不适用于寄主的生长点和分生组织，在这些组织中不能够发生有效的基因沉默(Ratcliffetal.,2001)。
虽然这些病毒载体不能用于分裂组织，但基于烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus,TRV)的载体体系的开发可以克服寄主分生组织障碍的局限性(Liuetal.,2002b;Ratcliffetal.,2001)。TRV可以有力地蔓延整个植物组织，包括分生组织，而且侵染的全部症状与其它病毒相比更加温和。改良的TRV诱导体系(pYL156和pYL279)对于内源基因的沉默更加有效(Liuetal.,2002a;2002b)。这些病毒载体与早期的TRV载体不同，带有重复的启动子和C－末端的一个酶，这更有利于病毒RNA的产生，而且使病毒序列的大量氨基酸发生变化(Liuetal.,2002b)。迄今为止，与其他的VIGS体系相比，pYL156和pYL279在本氏烟中的效率没有被限制，并且它们被成功地用于番茄和其它物种中，造成了如phytoenedesaturase(PDS)等特定基因的沉默(Liuetal.,2002a;Ekengrenetal.,2003)。随着病毒诱导基因沉默体系的完善，很多种不同的RNA和DNA病毒经修饰后作为载体用于基因表达(Pogueetal.,2002;Timmermansetal.,1994)。如TMV,PVX和TRV可分别用于蛋白表达和基因沉默(AllenandBaulcombe,1999;Kumagaietal.,1995;MacFar-laneandPopovich,2000;Malloryetal.,2002)。然而，并非所有基于RNA病毒的表达载体都可以用于基因沉默，因为很多像烟草蚀纹病毒(tobaccoetchvirus,
它直接影响到宿主的TEV)类似的载体有抗沉默蛋白，
沉默机制(Anandalakshmietal.,1998;KasschauandCarrington,1998)。
早先，由于DNA病毒体积结构大限制其移动，因此没有广泛作为表达载体(PalmerandRybicki,2001)。
VIGS：植物功能基因组学研究的革命
VIGS:theRevolutionofPlantFunctionGenomicsResearch
157
但后来，通过将DNA病毒中具有帽子结构的蛋白基因替换成它的同源序列从而得以利用。尽管RNA病毒复制发生在细胞质，DNA复制发生在植物细胞核并使用宿主的DNA复制条件，但两种病毒都能够诱导内源基因的扩散降解，从而使其所调控的同源独
沉默的程度根据宿主植物和病立系统沉默。然而，
毒的组合不同，表现出的沉默程度也不一样。由于病毒种类、传输载体、感染方式以及植物防御方式都不同，使得病毒沉默的效果不尽相同(TeycheneyandTepfer,2001)。Teycheney和Tepfer(2001)在牵牛花(redstar-typepetuniahybridacultivars)的研究中发现，病毒侵染会干涉植物内源查尔酮合成酶A基因(chs-A)的转录后基因沉默，而且马铃薯病毒Y(potatovirusY,PVY)、烟草蚀纹病毒和黄瓜花叶病毒(cu-cumbermosaicvirus,CMV)分别以空间特异的方式干涉chs-A的PTGS导致花瓣白色区域部分产生不同模式的颜色恢复现象，即不同的病毒侵染宿主后会产生复杂的空间上的对PTGS介导的基因沉默的诱导和干涉之间的相互作用。由基于DNA病毒改造成的番茄金花叶病毒(tomatogoldenmosaicvirus,TG－MV)VIGS体系能够成功地用于本氏烟增殖细胞核抗原(PCNA)分生组织基因沉默(Peeleetal.,2001)。TGMV载体已用于沉默非分生组织基因以及外源转入基因(Kjemtrupetal.,1998)。
除此之外，许多单子叶植物病毒也被改建成载体，以便在单子叶植物中抑制基因表达。由于在单子叶植物中应用功能缺失的方法比较困难，这就使得用于功能基因组的VIGS开发具有重要意义。目前，DNA病毒玉米条纹病毒(maizestreakvirus,MSV)载体也已经成功地应用到提高玉米细胞的蛋白含量中(Palmeretal.,1999)。大麦条纹花叶病毒(barleystripemosaicvirus,BSMV)(Lacommeetal.,2003)以及小麦矮缩病毒(wheatdwarfvirus,WDV)等(Matzeitetal.,1991)都已经用于基因沉默，这对水稻和小麦等重要经济作物功能基因组研究提供了有效的工具。最近，感染单子叶植物的雀麦花叶病毒株“Tall-fescue”已经被改造用于VIGS，在重要的谷稻类作物中成功沉默了PDS基因、肌动蛋白和Rubisco活化酶基因(Dingetal.,2006)。
除了直接改造利用RNA和DNA植物病毒之外，二元体系,如卫星病毒诱导沉默体系(satellitevirusinducesilencesystem,SVISS)也已在烟草中应用(Gosseléetal.,2002)。这个体系由TMV(strainU2)和一个卫星病毒(satellitetobaccomosaicvirus,STMV)组成。改造过的中国番茄黄化曲叶病毒(DNA卫星病毒分子)作为VIGS体系的载体已经在本氏烟上应用，
最初的DNA卫星病毒沉默载体本身在植物中并不产生任何症状，因此在最大程度上减少了对VIGS沉默表型的干扰效应(TaoandZhou,2004)。为了更好地将VIGS体系推广到重要的块茎作物木薯中(Manihot
开发了包含DNA的双生病毒――非洲木esculenta)，
薯花叶病毒载体，携带叶绿体镁合金螯合酶(su)亚基基因，导致接种后(dpi)7~21d叶片中的su基因沉默。利用VIGS体系木薯中的有害次生代谢产物亚麻苦苷水平量减少70%(Fofanaetal.,2004)。
拟南芥是植物中最为重要的模式植物之一，通过
能够为改善VIGS技术对其进行研究具有重大意义，
其中最值得关注大规模的功能基因组筛选提供便利。
的开发就是在拟南芥中利用甘蓝曲叶病毒(cabbageleafcurlvirus,CbLCV)进行VIGS(Turnageetal.,2002)。但存在一些制约因素，一方面将载体引到植物中需要质粒轰击(Turnageetal.,2002)，另一方面能够使适用于病毒基因组插入的位点受到限制(800bp)(MuangsanandRobertson,2004)。除了CbLCV在模式植物中作
在拟南芥中有报道TRV已经有效地为VIGS载体外，
用于瞬时表达VIGS体系。随着一系列的修复，以前用在本氏烟或番茄中的VIGS方案都能够用于拟南芥中进行基因沉默(Luetal.,2003;Burch-Smithetal.,2004)。Burch-Smith等(2006)利用TRV-VIGS载体(Liuetal.,2002a)优化了它在拟南芥中的传输效率。并有报道在成熟组织中，利用VIGS检测到了CUL1(nullmutant
使用相同ofwhichisembryolethal)基因的沉默效应。
的体系，沉默两个抗病基因rpm1和伴随gfp的rps2，导致对丁香假单胞菌的抗病性缺失，并且叶片中gfp沉默共表达(Liuetal.,2002b)。以上的沉默表现型与相应的转录水平密切相关。
2VIGS技术对基因功能的研究进展
由于VIGS的有效性和快速性，近些年将一些VIGS体系的载体进行改良，在特定的寄主植物上赋予新的功能，并且成功地用于解析许多具有重要意
其中，应用最多的就是基于TRV义的植物基因功能。
的VIGS体系，并广泛用于验证重要经济作物的多基因沉默，从最初的烟草、番茄到新近研究的辣椒(Chungetal.,2004)和罂粟(Hilemanetal.,2005)等茄科作物，再到拟南芥、矮牵牛以及耧斗菜属植物(GouldandKramer,2007)，都已经报道了多基因沉默，如使用TRV诱导的VIGS使二磷酸核酮糖羧化酶的小亚基编码基因(rbcS)发生表达沉默，rbcS为多基因家族，表明VIGS可有效地使多基因家族发生基
158
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
www.molplantbreed.org
因沉默(Ratcliffetal.,2001)。可见TRV载体应用的广泛性和实用价值。近来利用改良的TRV载体研究了果实成熟基因，并直接在番茄果实中将基因沉默(Fuetal.,2006)。与生物素合成或果实中乙烯信号转导途径相关的几个基因的沉默造成了颜色与细胞壁结构的改变。在每一种情况中，都显示出目标基因转录水平相应的减少，这与表现型的改变相关联。另外，在有关花发育衰老(Chenetal.,2004)与形态学以及气味产生途径的相关基因功能(Spitzeretal.,2007)都已通过VIGS体系得到验证，并应用到多个物种当中。在大量的基因功能研究中，有绝大部分归属于防御反应通路相关基因的研究。在拟南芥中，利用TRV-VIGS体系研究防御反应通路相关基因的功能，这些基因与抗丁香假单胞菌基因R的产物RPS2转
将抗病反应中的导的信号途径相关(Caietal.,2006)。
rar1，hsp90和ndr1基因沉默的植物，甚至在rps2基因表达的情况下，会出现丁香假单胞菌病症的发展，表明被沉默的基因在防御反应路径中起到积极作用。同样，将rin4基因沉默引起并加强了抗病反应，从而推断其在路径中起到抑制的作用。目前已经将TRV-VIGS体系应用于类异戊二烯生物合成途径的研究，Page等(2004)沉默了在上述途径中必需的3个本氏烟基因，引起该植物的代谢障碍，说明能够从代谢途径以及个体上将用于类异戊二烯生物合成的甲羟戊酸，3－甲(基)－3,5－二羟(基)戊酸和DXP途径区分开。
VIGS通过沉默基因的方法已经成功地解析了植物细胞程序性死亡(PCD)反应，并已知在该反应中所沉默基因的产物在其它反应体系中也同样作为重要的调节元件，例如编码己糖激酶的hxk1基因(Kimetal.,2006)，顺乌头酸酶(aconitase)(Moederetal.,2007)LePP2Ac1的同源基因，与磷酸化蛋白相关的番茄基因(Heetal.,2004)以及编码prohibitins-PhPHB1和PhPHB2的矮牵牛基因(Chenetal.,2005)。除了TRV-VIGS体系，在本氏烟中，利用基于PVX的表达体系进行高通量筛选，确定了细胞死亡的正调控元件(NbCD1)是一个新颖的Ⅱ级乙烯响应元件结合因子(Nasiretal.,2005)。利用PVX-VIGS将NbCD1沉默，证明植物只是对病菌接种表现出部分的防御反应，甚至是对非致病性假单胞菌(Pseudomonascichorii)也是同样表现。利用番茄丁香假单胞菌(P.syringae)进行类似的研究开发出信号转导途径中的一个正调控基因apr134。而且，在植物抗病防御领域，利用BSMV-VIGS体系描述了与小麦抗病反应的相关基因，即rar1、sgt1和hsp90基因。人们怀疑这些基因是小麦抗锈病(Pucciniatriticina)反应中借助R基因lr-21
调节的信号转导体系的一部分(Scofieldetal.,2005)，能够导致植物体对病原菌的敏感性，体现了这些基因在抗病反应中的直接作用。另外，抗大麦白粉病菌(Blumeriagraminis)的R基因mla13和HSP90，也是利用BSMV-VIGS体系分析(Heinetal.,2005)。
由于VIGS技术中存在寄主专一性这一特点，使得广泛用于茄科和十字花科等作物的病毒载体在其它科作物中未能得以利用。尤其是在葫芦科作物中一
直到直缺少一个有力的载体能够用于基因功能验证。
2002年，新开发出了台湾矮南瓜黄化嵌纹病毒(zuc-chiniyellowmosaicvirus,ZYMV)载体pT7ZYMV2－5及p35SZYMV2－26，并验证所构建载体对体内和体外转录都具有侵染力(Linetal.,2002)。近年来，借助ZYMV研究葫芦科植物南瓜(Cucurbitamoschata,对短日照敏感品种)花芽诱导必需的长距离运动的物质是成花基因FT(FLOWERINGLOCUST)的mRNA还是FT蛋白，即利用ZYMV进行FT异位表达后，高效介导了长日照处理南瓜植株的成花诱导，而
Real-ZYMV的侵染区远离花芽原基；通过嫁接实验，timeRT-PCR以及对韧皮部汁液蛋白的质谱分析等一系列研究，确定通过韧皮部传导而起成花信号作用的是FT蛋白，不是其mRNA(Linetal.,2007)。可见，ZYMV载体的开发对葫芦科作物的基因功能研究具有重要意义。
3VIGS的优点
VIGS作为功能基因组的鉴定手段具有重要意义。目前，许多表现型引起关注的基因只能通过大规模筛选群体来筛选特定基因中的突变体，同时在多个物种中传代转化的方法进行鉴定；而VIGS克服了传统转化方法所带来的诸多困难，能够鉴别当代植株特定基因功能缺失的表现型，直接靶定受关注的基因，使得具有特别意义的基因能够快速通过VIGS载体测序和鉴定。另外，近来有研究表明，利用VIGS技术通过包含多基因序列的病毒载体，使几个基因
将能够引起视觉上表同时发生沉默成为可能。例如，
现型的标记基因(编码查尔酮合成酶,CHS)与矮牵牛中的目标基因(与衰老相关的aco4)显示出共沉默后的共表达效应(Chenetal.,2004)。此外，在说明上位相关性的同时，VIGS技术已经被用于抗感途径中木质素生物合成酶的研究(Abbottetal.,2002)。随着VIGS技术的不断成熟，利用这种方法能够更加容易和形象地组织筛选出目标基因的沉默效应，抑制多重截然不同的基因表达。与此同时，VIGS技术还克服了基因家族功能冗余的问题，通过利用来自基因
VIGS：植物功能基因组学研究的革命
VIGS:theRevolutionofPlantFunctionGenomicsResearch
159
功能研究和高通量功能基因组研究中的一种工具表现出更多的前景和价值。同时，在遗传学领域上的研究得到快速发展，与早期传统遗传学筛选最接近
且VIGS能够容易的对不同品种间的基因功能进行的VIGS技术，通过将随机cDNA序列克隆进一个
称为“fast-forwardLiu等(2002a;2002b)设计的TRV-VIGS载体就病毒载体并筛选感兴趣的表现型，比对。
方法具有重要意义，并能很快分离和鉴别出genetics”能够应用于本氏烟和番茄中确定基因功能。
来产生感兴趣表现型的基因序列(Baulcombe,1999)。
4VIGS的局限性但由于仅有少量相关EST数据库，因此当作用于某
一物种时就表现出极大的局限性，这就引起我们对
虽然VIGS的优势显而易见，但其作为功能验证
一些物种基因组序列测序工作的关注，可以通过在
一个重要手段的同时，也存在着固有的局限性。首
线数据库和快速沉默来鉴别关注基因。而且，随着基
先，针对不同的寄主植物需要选择不同的病毒载体，
VIGS也可用于研究一类基因全部成因载体的构建，
在病原体与寄主间互作的同时就表现出该技术的不
员的功能，例如，蛋白激酶或磷酸脂酶。随着VIGS技
足。目前，最可靠和有效的VIGS载体TRV就存在着
术所采用的植物种类的增多及研究人员对技术的熟
寄主范围的局限性，该载体体系仅仅适用于本氏烟
练，我们期待看见该技术在植物功能基因组的研究
及像番茄等茄科家族的其他成员。这就要求开发具
中成为一个更加常用的工具。
有较宽寄主范围的载体，尤其是那些能够在拟南芥
(Burch-Smithetal.,2006)和水稻中有效促进VIGS参考文献效能的载体。另外，单独用病毒接种植物能改变植物的发育，尤其会影响植株高度和叶片形态。这一点显AbbottJ.C.,BarakateA.,PinconG.,LegrandM.,LapierreC.,
MilaI.,SchuchW.,andHalpinC.,2002,Simultaneoussup-著体现于PVX和TMV的VIGS体系，细微的表现型
pressionofmultiplegenesbysingletransgenes.Down-regu-作为基因抑制的结果可能被病毒的症状所掩盖。lationofthreeunrelatedligninbiosyntheticgenesintobacco,
因此不可能有效PVX和TMV都不能用于分生组织，PlantPhysiol.,128(3):844-853
地用于评定涉及芽、叶片、花和果实发育等基因的功AllenG.C.,SpikerS.,andThompsonW.F.,2000,Useofmatrix
attachmentregions(MARs)tominimizetransgenesilencing,能。VIGS很少使目标基因表达完全抑制，导致其所表
PlantMol.Biol.,43:361-376现出的特征较弱。虽然转录水平减少，仍足以产生足
够的功能蛋白，所以在沉默植物中很有可能观察不到AllenS.M.,andBaulcombeD.C.,1999,Technicaladvance:
potatovirusXamplicon-mediatedsilencingofnucleargenes,
相应的表现型。如果表现型不突出的话，VIGS就不能
PlantJ.,20(3):357-362
沉默特别功能背景下的一个基因，同时很有可能错过
AnandalakshmiR.,PrussG.J.,GeX.,MaratheR.,MalloryA.C.,
一些表现型，这些表现型被基因家族成员间功能的冗SmithT.H.,andVanceV.B.,1998,Aviralsuppressorof余而掩盖。目前，有报道在低温，潮湿条件下，可以加genesilencinginplants,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,95(22):
其次，VIGS强番茄中VIGS的表现型(Fuetal.,2006)。13079-13084
(及普遍的PTGS转录后基因沉默方法)还可能不小AscenziR.,UlkerB.,ToddJ.J.,SowinskiD.A.,SchimeneckC.R.,
AllenG.C.,WeissingerA.K.,andThompsonW.F.,2003,心抑制非目标基因功能，这个可能性对于一个未进
Analysisoftrans-silencersofvaryingstrengthandtargets
行基因测序的植物品种是很难排除的。另一方面，
withandwithoutflankingnuclearmatrixattachmentregion,
VIGS不能遍及整个侵染植株诱使基因一致沉默，而
TransgenicRes.,12(3):305-318
且在植株和实验中沉默水平能够发生变化。这使得
BartonK.A.,BinnsA.N.,MatzkeA.J.,andChiltonM.D.,1983,
要清楚的阐明结果就变得更加复杂，尤其是在不能Regenerationofintacttobaccoplantscontainingfulllength够产生明显的沉默表现型的情况下。要解决这一问copiesofgeneticallyengineeredT-DNA,andtransmission
可题，就要设计针对于VIGS载体的内在阳性对照，ofT-DNAtoR1progeny,Cell,32(4):1033-1043
BaulcombeD.C.,1999,Fastforwardgeneticsbasedonvirus-in-用一个突出的表现型标记沉默区域。
ducedgenesilencing,Curr.Opin.PlantBiol.,2:109-113
家族高度保守区域的目标序列，可以来沉默特定家族的全部或部分成员。相反，特定成员的基因家族也可以通过选择家族成员中的一段序列进行靶定。而
5前景展望
目前，现有载体以及接种技术的改进为病毒诱导基因沉默试验敞开了大门，VIGS作为在植物基因
Burch-SmithT.M.,AndersonJ.C.,MartinG.B.,andDinesh-Ku-marS.P.,2004,Applicationsandadvantagesofvirus-in-ducedgenesilencingforgenefunctionstudiesinplants,PlantJ.,39(5):734-746
160
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
38:2155-2164
www.molplantbreed.org
Burch-SmithT.M.,SchiffM.,LiuY.,andDinesh-KumarS.P.,
2006,Efficientvirus-inducedgenesilencinginArabidopsis,PlantPhysiol.,142(1):21-27
CaiX.Z.,XuQ.F.,WangC.C.,andZhengZ.,2006,Development
ofavirusinducedgene-silencingsystemforfunctionalanal-ysisoftheRPS2－dependentresistancesignalingpathwayinArabidopsis,PlantMol.Biol.,62:223-232
ChenJ.C.,JiangC.Z.,andReidM.S.,2005,Silencingaprohibitin
altersplantdevelopmentandsenescence,PlantJ.,44(1):16-24ChenJ.C.,JiangC.Z.,GookinT.E.,HunterD.A.,ClarkD.G.,and
ReidM.S.,2004,Chalconesynthaseasareporterinvirus-inducedgenesilencingstudiesofflowersenescence,PlantMol.Biol.,55(4):521-530
ChungE.,SeongE.,KimY.C.,ChungE.J.,OhS.K.,LeeS.,Park
J.M.,JoungY.H.,andChoiD.,2004,Amethodofhighfre-quencyvirusinducedgenesilencinginchilipepper(Cap－sicumannuumL.cv.Bukang),Mol.Cell,17:377-380DingX.S.,SchneiderW.L.,ChaluvadiS.R.,MianM.A.R.,andNel-sonR.S.,2006,CharacterizationofaBromemosaicvirusstrainanditsuseasavectorforgenesilencinginmonocotyledonoushosts,Mol.PlantMicrobe.Interact.,19(11):1229-1239EkengrenS.K.,LiuY.,SchiffM.,Dinesh-KumarS.P.,andMar-tinG.B.,2003,TwoMAPKcascades,NPR1,andTGAtran-scriptionfactorsplayaroleinPto-mediateddiseaseresis-tanceintomato,PlantJ.,36:905-917
FofanaI.B.,SangareA.,CollierR.,TaylorC.,andFauquetC.M.,
2004,Ageminivirus-inducedgenesilencingsystemforgenefunctionvalidationincassava,PlantMol.Biol.,56(4):613-624FuD.Q.,ZhuB.Z.,ZhuH.L.,ZhangH.X.,XieY.H.,JiangW.B.,
ZhaoX.D.,andLuoK.B.,2006,Enhancementofvirus-in-ducedgenesilencingintomatobylowtemperatureandlowhumidity,Mol.Cell,21:153-160
GosseléV.,FachéI.,MeulewaeterF.,CornelissenM.,andMet-zlaffM.,2002,SVISS-anoveltransientgenesilencingsys-temforgenefunctiondiscoveryandvalidationintobacco,PlantJ.,32(5):859-866
GouldB.,andKramerE.M.,2007,Virus-inducedgenesilencing
asatoolforfunctionalanalysesintheemergingmodelplantAquilegia(columbine,Ranunculaceae),PlantMethods,3:6HeX.,AndersonJ.C.,delPozoO.,GuY.Q.,TangX.,andMartin
G.B.,2004,SilencingofsubfamilyIofproteinphosphatase2Acatalyticsubunitsresultsinactivationofplantdefenseresponsesandlocalizedcelldeath,PlantJ.,38:563-577HeinI.,Barciszewska-PacakM.,HrubikovaK.,WilliamsonS.,
DinesenM.,SoenderbyI.E.,SundarS.,JarmolowskiA.,ShirasuK.,andLacommeC.,2005,Virus-inducedgenesi-lencing-basedfunctionalcharacterizationofgenesassociat-edwithpowderymildewresistanceinbarley,PlantPhysiol.,
HilemanL.C.,DreaS.,MartinoG.,LittA.,andIrishV.F.,2005,
Virus-inducedgenesilencingisaneffectivetoolforassayinggenefunctioninthebasaleudicotspeciesPapaversomniferum(opiumpoppy),PlantJ.,44:334-341
KasschauK.D.,andCarringtonJ.C.,1998,Acounterdefensive
strategyofplantviruses:suppressionofposttranscriptionalgenesilencing,Cell,95:461-470
KimM.,LimJ.H.,AhnC.S.,ParkK.,KimG.T.,KimW.T.,and
PaiH.S.,2006,Mitochondria-associatedhexokinasesplayaroleinthecontrolofprogrammedcelldeathinN.benthami－ana,PlantCell,18:2341-2355
KjemtrupS.,SampsonK.S.,PeeleC.G.,NguyenL.V.,andCon-klingM.A.,1998,GenesilencingfromplantDNAcarriedbyageminivirus,PlantJ.,14:91-100
KumagaiM.H.,DonsonJ.,Della-CioppaG.,HarveyD.,HanleyK.,
andGrillL.K.,1995,Cytoplasmicinhibitionofcarotenoidbiosynthesiswithvirus-derivedRNA,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,92:1679-1683
LacommeC.,HrubikovaK.,andHeinI.,2003,Enhancementof
virus-inducedgenesilencingthroughviral-basedproductionofinverted-repeats,PlantJ.,34:543-553
LinM.K.,BelangerH.,LeeY.J.,Varkonyi-GasicE.,TaokaK.,
MiuraE.,Xoconostle-CázaresB.,GendlerK.,JorgensenR.A.,PhinneyB.,LoughT.J.,andLucasW.J.,2007,Flower-inglocusTproteinmayactasthelong-distanceflorigenicsignalinthecucurbits,PlantCell,19(5):1488-1506LinS.S.,HouR.F.,andYehS.D.,2002,Constructionofinvitro
andinvivoinfectioustranscriptsofaTaiwanstrainofzuc－chiniyellowmosaicvirus,Bot.Bull.Acad.Sin.,43:261-269LiuY.,SchiffM.,andDinesh-KumarS.P.,2002a,Virus-induced
genesilencingintomato,PlantJ.,31:777-786
LiuY.,SchiffM.,MaratheR.,andDinesh-KumarS.P.,2002b,
TobaccoRar1,EDS1andNPR1/NIM1likegenesarere-quiredforN-mediatedresistancetotobaccomosaicvirus,PlantJ.,30:415-429
LuR.,Martin-HernandezA.M.,PeartJ.R.,MalcuitI.,and
BaulcombeD.C.,2003,Virus-inducedgenesilencinginplants,Methods,30:296-303
MacFarlaneS.A.,andPopovichA.H.,2000,Efficientexpressionof
foreignproteinsinrootsfromtobravirusvectors,Virology,267:29-35
MalloryA.C.,ParksG.,EndresM.W.,BaulcombeD.,Bowman
L.H.,PrussG.J.,andVanceV.B.,2002,Theamplicon-plussystemforhigh-levelexpressionoftransgenesinplants,Nat.Biotechnol.,20(6):622-25
MatzeitV.,SchaeferS.,KammannM.,SchalkH.J.,SchellJ.,and
GronenbomB.,1991,Wheatdwarfvirusvectorsreplicate
VIGS：植物功能基因组学研究的革命
VIGS:theRevolutionofPlantFunctionGenomicsResearch
andexpressforeigngenesincellsofmonocotyledonousplants,PlantCell,3:247-258
MoederW.,delPozoO.,NavarreD.A.,MartinG.B.,andKlessig
D.F.,2007,AconitaseplaysaroleinregulatingresistancetooxidativestressandcelldeathinArabidopsisandNicotianabenthamiana,PlantMol.Biol.,63:273-287
MuangsanN.,andRobertsonD.,2004,Geminivirusvectorsfor
transientgenesilencinginplants,MethodsMol.Biol.,265:101-115
NapoliC.,LemieuxC.,andJorgensenR.,1990,Introductionofa
chimericchalconesynthasegeneintoPetuniaresultsinre-versibleco-suppressionofhomologousgenesintrans,PlantCell,2:279-289
NasirK.H.,TakahashiY.,ItoA.,SaitohH.,MatsumuraH.,Kan-zakiH.,ShimizuT.,ItoM.,FujisawaS.,SharmaP.C.,Ohme-TakagiM.,KamounS.,andTerauchiR.,2005,High-throughputinplantaexpressionscreeningidentifiesaclassIIethylene-responsiveelementbindingfactor-likepro-teinthatregulatesplantcelldeathandnon-hostresistance,PlantJ.,43:491-505
PageJ.E.,HauseG.,RaschkeM.,GaoW.,SchmidtJ.,ZenkM.
H.,andKutchanT.M.,2004,Functionalanalysisofthefinalstepsofthe1－deoxy－D－xylulose－5－phosphate(DXP)path-waytoisoprenoidsinplantsusingvirus-inducedgenesi-lencing,PlantPhysiol,134(4):1401-1413
PalmerK.E.,andRybickiE.P.,2001,Investigationofthepoten-tialofmaizestreakvirustoactasaninfectiousgenevectorinmaizeplants,Arch.Virol.,146:1089-104
PalmerK.E.,ThomsonJ.A.,andRybickiE.P.,1999,Generationof
maizecelllinescontainingautonomouslyreplicatingmaizestreakvirus-basedgenevectors,Arch.Virol,144:1345-1360PeeleC.,JordanC.V.,MuangsanN.,TurnageM.,EgelkroutE.,
EagleP.,Hanley-BowdoinL.,andRobertsonD.,2001,Si-lencingofameristematicgeneusinggeminivirus-derivedvectors,PlantJ.,27:357-366
PogueG.P.,LindboJ.A.,GargerS.J.,andFitzmauriceW.P.,
2002,Makinganallyfromanenemy:plantvirologyandthenewagriculture,Annu.Rev.Phytopathol.,40:45-74RatcliffF.,Martin-HernandezA.M.,andBaulcombeD.C.,2001,
Tobaccorattlevirusasavectorforanalysisofgenefunctionbysilencing,PlantJ.,25:237-245
RuizM.T.,VoinnetO.,andBaulcombeD.C.,1998,Initiation
161
andmaintenanceofvirus-inducedgenesilencing,PlantCell,10:937-946
ScofieldS.R.,HuangL.,BrandtA.S.,andGillB.S.,2005,Devel-opmentofavirus-inducedgenesilencingsystemforhexaploidwheatanditsuseinfunctionalanalysisoftheLr21-mediatedleafrustresistancepathway,PlantPhysiol.,138:2165-2173
SmithN.A.,SinghS.P.,WangM.B.,StoutjesdijkP.A.,GreenA.G.,
andWaterhouseP.M.,2000,Totalsilencingbyin-tron-splicedhairpinRNAs,Nature,407:319-320
SpitzerB.,ZviM.M.,OvadisM.,MarhevkaE.,BarkaiO.,Edel-baumO.,MartonI.,MasciT.,AlonM.,MorinS.,RogachevI.,AharoniA.,andVainsteinA.,2007,Reversegeneticsoffloralscent:applicationoftobaccorattlevirus-basedgenesi-lencinginpetunia,PlantPhysiol.,145(4):1241-1250,TaoX.,andZhouX.,2004,AmodifiedviralsatelliteDNAthat
suppressesgeneexpressioninplants,PlantJ.,38:850-860TeycheneyP.Y.,andTepferM.,2001,Virus-specificspatialdif-ferencesintheinterferencewithsilencingofthechs-Ageneinnon-transgenicpetunia,J.Gen.Virol.,82:1239-1243TimmermansM.C.P.,DasO.P.,andMessingJ.,1994,Geminivirus-esandtheirusesasextrachromosomalreplicons,Annu.PlantPhysiol.,45:79-112
TurnageM.A.,MuangsanN.,PeeleC.G.,andRobertsonD.,
2002,Geminivirus-basedvectorsforgenesilencinginAra－bidopsis,PlantJ.,30:107-117
vanderKrolA.R.,MurL.A.,BeldM.,MolJ.N.,andStuitjeA.R.,
1990,Flavonoidgenesinpetunia:additionofalimitednum-berofgenecopiesmayleadtoasuppressionofgeneexpres-sion,PlantCell,2:291-299
vanKammenA.,1997,Virus-inducedgenesilencingininfected
andtransgenicplants,TrendsPlantSci.,2:409-411WangE.,andWagnerG.J.,2003,Elucidationofthefunctionsof
genescentraltoditerpenemetabolismintobaccotrichomesusingposttranscriptionalgenesilencing,Planta,216:686-691WaterhouseP.M.,GrahamM.W.,andWangM.B.,1998,Virus
resistanceandgenesilencinginplantscanbeinducedbysi-multaneousexpressionofsenseandantisenseRNA,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,95(23):13959-13964
WatsonJ.M.,FusaroA.F.,WangM.,andWaterhouseP.M.,
2005,RNAsilencingplatformsinplants,FEBSLett.,579:5982-5987