HPLC法测定甲氧苄啶片主药及有关物质的含量
池秀珍＊（福建泉州市药品检验所，泉州市362000）
中图分类号
R927.2；R978.2+4
文献标识码
A
文章编号
1001-0408（2010）05-0449-02
摘要目的：建立高效液相色谱法测定甲氧苄啶片中主药及有关物质的含量。方法：色谱柱为WaterssymmetryC18，流动相为
－1－1
0.015mol·L磷酸（pH3.5）-乙腈（83∶17)，检测波长为271nm，流速为1.0mL·min，柱温为30℃。结果：甲氧苄啶与其相邻杂质
－1
峰能有效分离；甲氧苄啶检测浓度线性范围为16.1～161.3μg·mL（r＝0.9999，n＝5）；平均回收率为100.4％，RSD＝0.7％（n＝9）；有关物质含量＜0.6％。结论：该方法简便、准确，专属性强，可用于甲氧苄啶片的含量测定及有关物质的检查。关键词甲氧苄啶片；高效液相色谱法；含量；有关物质
ContentDeterminationofTrimethoprimandItsRelatedSubstancesbyHPLCCHIXiu-zhen（FujianQuanzhouInstituteforDrugControl，Quanzhou362000，China）
ABSTRACTOBJECTIVE：ToestablishanHPLCmethodfordeterminationoftrimethoprimanditsrelativesubstanceinTrime-thoprimtablets.METHODS：WatersSymmetryC18Columnwasadoptedwith0.015mol·L－1phosphorousacid（pH3.5）-acetoni-－1trile（83∶17）asmobilephaseatflowrateof1.0mL·min.Thedetectionwavelengthwassetat271nmandcolumntemperaturewas30℃.RESULTS：Goodseparationbetweentrimethoprimandmainrelatedsubstancewasachieved.Thelinearrangeoftrime-thoprimwere16.1～161.3μg·L－1（r＝0.9999，n＝5）.Theaveragerecoverywas100.4％（RSD＝0.7％，n＝9）.Thecontentofre-latedsubstancewaslowerthan0.6％.CONCLUSION：Thismethodissimple，accurateandspecificforcontentdeterminationofTrimethoprimtabletsanditsrelatedsubstances.
KEYWORDSTrimethoprimtablets；HPLC；Content；Relatedsubstances甲氧苄啶为一种广谱、高效、低毒的抗菌增效剂[1]，其制剂甲氧苄啶片收载于《中国药典》2005年版二部中。该标准[2]中含量测定采用紫外分光光度法，其原料药项下有关物质检查采用薄层色谱法，但甲氧苄啶片项下未对有关物质进行控制。为了更全面的控制甲氧苄啶片的质量，笔者建立了高效液相色谱（HPLC）法同时测定甲氧苄啶片中主药及有关物质的含量。结果表明，该法简便、准确，专属性强，可用于甲氧苄啶片的含量测定及有关物质的检查。
1
1
06A1
1218min04B1
812min04C1
812min
1仪器与试药
6D
1
12
18min
6E12
18min
4
8F
1216min
1100系列HPLC仪、色谱工作站（美国Agilent公司）。甲氧苄啶标准品（中国药品生物制品检定所，批号：100031-200304，供含量测定用）；甲氧苄啶片（广东台城制药有限公司，批号：20081001、20090402；江苏永大药业有限公司，批号：20060303。规格均为每片100mg）；乙腈为色谱纯，磷酸、三乙胺均为分析纯，水为超纯水。
06G
1216min
2
2.1
方法与结果
色谱条件及系统适用性试验
色谱柱：WaterssymmetryC18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：0.015mol·L－1磷酸（用三乙胺调pH至3.5）-乙腈（83∶17)；流速：1mL·min－1；柱温：30℃；检测波长：271nm；进样量：10μL。取“2.2”项下标准品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液进样分析，结果在上述色谱条件下，理论板数按甲氧苄啶计为11053，阴性对照溶液不干扰测定。色谱见图1。2.2溶液的制备
2.2.1标准品溶液。精密称取甲氧苄啶标准品（105℃干燥3h）20mg置于25mL容量瓶中，加0.01mol·L－1HCl溶液适量，
＊副主任药师。研究方向：药品检验。电话：0595-22119785。E-mail：[email protected]年第5图1高效液相色谱图
A.阴性对照溶液；B.供试品溶液；C.标准品溶液；D.氧化破坏后样品；E.
碱破坏后样品；F.酸破坏后样品；G.光破坏后样品；1.甲氧苄啶
Fig1HPLCchromatography
A.negativesample；B.samplesolution；C.referencesubstance；D.sampletreatedwithoxidant；E.sampletreatedwithalkali；F.sampletreated
withacid；G.sampletreatedwithstronglight；1.trimethoprim
超声使溶解，稀释至刻度，摇匀，作为标准品贮备液。精密吸取贮备液5mL，置于50mL容量瓶中，用0.01mol·L－1HCl溶液稀释至刻度，摇匀。2.2.2
供试品溶液与阴性对照溶液。取本品20片，精密称定，
研细，精密称取适量（约相当于甲氧苄啶80mg）置于100mL
Pharmacy2010Vol.215
·449·
容量瓶中，加0.01mol·L－1HCl溶液适量，超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，滤过。精密吸取续滤液5mL，置于50mL容量瓶中，加0.01mol·L－1HCl溶液至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另按处方比例称取空白辅料适量，同法制成阴性对照溶液。
2.3专属性试验
分别取本品细粉适量，分置于4个10mL具塞试管中，1份
－1
加入0.01mol·LHCl溶液10mL摇匀后于4500Lx光照48h；1份加3％H2O2溶液10mL摇匀后于80℃水浴1h；另2份分
－1－1
别加入1mol·LHCl溶液10mL、3mol·LNaOH溶液10mL于80℃水浴2h。精密吸取各条件下破坏后的样品溶液各1mL，分置于10mL容量瓶中（经酸、碱破坏的样品在稀释前
－1
先中和），加0.01mol·LHCl溶液至刻度，摇匀。取上述各溶液，照“2.1”项下的色谱条件，分别进样10μL，记录色谱至主峰保留时间的4倍。结果，供试液在氧化破坏条件下产生的降解产物峰最多，其他破坏条件下也均有不同程度的降解产物产生。在此色谱条件下，甲氧苄啶与其相邻降解产物峰都能达到有效分离，降解产物不干扰样品的测定，色谱见图1。2.4线性关系考察
精密吸取标准品贮备液0.2、0.6、1.0、1.4、2.0mL分别置于
－1
10mL容量瓶中，用0.01mol·LHCl溶液稀释至刻度，摇匀，得系列标准品溶液。分别取上述溶液各10μL注入色谱仪，照“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱。以标准品的浓度（C）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得线性方程为Y＝11.6586C+4.2987（r＝0.9999，n＝5）。结果表明，甲氧苄啶检测浓度线性范围为16.1～161.3μg·mL－1。2.5精密度试验
取“2.4”项下标准品溶液（80μg·mL－1），连续进样5次，测定峰面积，结果峰面积的RSD＝0.1％。2.6重复性试验
取同一批样品（20081001）6份，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件试验，测得其平均含量为99.6％，RSD＝0.3％。2.7稳定性试验
取“2.6”项下的供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24h时进样10μL，结果其峰面积的RSD＝0.5％。表明供试品溶液在室温放置24h内稳定。2.8加样回收率试验
取已知含量的样品9份，按高、中、低浓度加入不同量的标准品各3份，照“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。
2.9最低检测限与定量限
取标准品溶液逐级稀释、测定，按信噪比（S/N）为3∶1，测得最低检测限为3.8ng；按信噪比（S/N）为10∶1，测得定量限为13.9ng。
2.10样品中主药及有关物质含量测定
取不同生产厂家的样品3批，按“2.2”项下方法制备供试品溶液、标准品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱，按外标法以峰面积计算含量，并与《中国药典》记载的紫外分光光度法测定结果进行比较。
精密称取本品细粉适量，用0.01mol·L－1HCl溶液制成每1mL含0.8mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试液；精密吸取
Pharmacy2010Vol.21No.5
表1回收率试验结果（n＝9）
Tab1Resultofrecoverytest（n＝9）
样品含量加入量－1
/μg·mL/μg·mL－1
31.2232.0830.9331.6848.9235.2944.2850.7255.5838.5057.0263.16
测得量/μg·mL－1
63.7163.2063.9783.9679.8786.2094.3095.69101.46
回收率/％101.28100.59100.6599.29100.85100.54100.57100.4499.48
平均回收率
/％
RSD/％
100.40.7
供试液1mL，用0.01mol·L－1HCl溶液制成每1mL含0.008mg的溶液作为对照溶液。取对照溶液10μL，注入色谱仪，调节仪器检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％～25％，再精密吸取供试液与对照溶液各10μL，分别注入色谱仪，记录色谱至主成分峰保留时间的2倍，供试液如有杂质峰，按主成分自身对照法计算杂质总量，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(1.0％)。
主药及有关物质含量测定结果见表2。表2Tab2
样品中主药及有关物质含量测定结果（％）
edsubstances（％）
批号[***********]090402
标示量/％
药典方法HPLC法99.999.7100.099.497.696.9
有关物质/％
0.3
0.60.3
Contentdeterminationoftrimethoprimanditsrelat-
由表2可见，本文建立的主药含量测定方法与药典法比较结果无差异。
3讨论
笔者参考了相关文献[3～5]，比较了不同比例、不同pH的乙
腈-磷酸溶液以及甲醇-0.1mol·L－1磷酸二氢钾溶液作为流动相系统时的分离效果。结果以0.015mol·L－1磷酸（用三乙胺调pH至3.5）-乙腈（83∶17）为流动相时，甲氧苄啶色谱峰峰形最好，保留时间适中（5.7min），主峰与其相邻的杂质峰能有效分离，溶剂、辅料均不干扰测定。
参考文献
[1][2][3][4][5]
张
伦.甲氧苄啶的应用、生产和市场状况[J].中国药房，2001，12（3）：143.
国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：118.
国家药典委员会编.国家药品标准化学药品[S].第十三册.2002，12：108.
韩志云，朱迎春.HPLC法测定头孢氨苄甲氧苄啶胶囊含量的方法改进[J].海峡药学，2007，19（1）：48.谢
燕，陈
明，肖艳萍.高效液相色谱法测定甲氧苄啶
氯化钠注射液中甲氧苄啶的含量[J].精细化工中间体，2006，36（4）：63.
（收稿日期：2009-03-23
修回日期：2009-08-12）
中国药房201021卷第5期
HPLC法测定甲氧苄啶片主药及有关物质的含量
池秀珍＊（福建泉州市药品检验所，泉州市362000）
中图分类号
R927.2；R978.2+4
文献标识码
A
文章编号
1001-0408（2010）05-0449-02
摘要目的：建立高效液相色谱法测定甲氧苄啶片中主药及有关物质的含量。方法：色谱柱为WaterssymmetryC18，流动相为
－1－1
0.015mol·L磷酸（pH3.5）-乙腈（83∶17)，检测波长为271nm，流速为1.0mL·min，柱温为30℃。结果：甲氧苄啶与其相邻杂质
－1
峰能有效分离；甲氧苄啶检测浓度线性范围为16.1～161.3μg·mL（r＝0.9999，n＝5）；平均回收率为100.4％，RSD＝0.7％（n＝9）；有关物质含量＜0.6％。结论：该方法简便、准确，专属性强，可用于甲氧苄啶片的含量测定及有关物质的检查。关键词甲氧苄啶片；高效液相色谱法；含量；有关物质
ContentDeterminationofTrimethoprimandItsRelatedSubstancesbyHPLCCHIXiu-zhen（FujianQuanzhouInstituteforDrugControl，Quanzhou362000，China）
ABSTRACTOBJECTIVE：ToestablishanHPLCmethodfordeterminationoftrimethoprimanditsrelativesubstanceinTrime-thoprimtablets.METHODS：WatersSymmetryC18Columnwasadoptedwith0.015mol·L－1phosphorousacid（pH3.5）-acetoni-－1trile（83∶17）asmobilephaseatflowrateof1.0mL·min.Thedetectionwavelengthwassetat271nmandcolumntemperaturewas30℃.RESULTS：Goodseparationbetweentrimethoprimandmainrelatedsubstancewasachieved.Thelinearrangeoftrime-thoprimwere16.1～161.3μg·L－1（r＝0.9999，n＝5）.Theaveragerecoverywas100.4％（RSD＝0.7％，n＝9）.Thecontentofre-latedsubstancewaslowerthan0.6％.CONCLUSION：Thismethodissimple，accurateandspecificforcontentdeterminationofTrimethoprimtabletsanditsrelatedsubstances.
KEYWORDSTrimethoprimtablets；HPLC；Content；Relatedsubstances甲氧苄啶为一种广谱、高效、低毒的抗菌增效剂[1]，其制剂甲氧苄啶片收载于《中国药典》2005年版二部中。该标准[2]中含量测定采用紫外分光光度法，其原料药项下有关物质检查采用薄层色谱法，但甲氧苄啶片项下未对有关物质进行控制。为了更全面的控制甲氧苄啶片的质量，笔者建立了高效液相色谱（HPLC）法同时测定甲氧苄啶片中主药及有关物质的含量。结果表明，该法简便、准确，专属性强，可用于甲氧苄啶片的含量测定及有关物质的检查。
1
1
06A1
1218min04B1
812min04C1
812min
1仪器与试药
6D
1
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18min
6E12
18min
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8F
1216min
1100系列HPLC仪、色谱工作站（美国Agilent公司）。甲氧苄啶标准品（中国药品生物制品检定所，批号：100031-200304，供含量测定用）；甲氧苄啶片（广东台城制药有限公司，批号：20081001、20090402；江苏永大药业有限公司，批号：20060303。规格均为每片100mg）；乙腈为色谱纯，磷酸、三乙胺均为分析纯，水为超纯水。
06G
1216min
2
2.1
方法与结果
色谱条件及系统适用性试验
色谱柱：WaterssymmetryC18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：0.015mol·L－1磷酸（用三乙胺调pH至3.5）-乙腈（83∶17)；流速：1mL·min－1；柱温：30℃；检测波长：271nm；进样量：10μL。取“2.2”项下标准品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液进样分析，结果在上述色谱条件下，理论板数按甲氧苄啶计为11053，阴性对照溶液不干扰测定。色谱见图1。2.2溶液的制备
2.2.1标准品溶液。精密称取甲氧苄啶标准品（105℃干燥3h）20mg置于25mL容量瓶中，加0.01mol·L－1HCl溶液适量，
＊副主任药师。研究方向：药品检验。电话：0595-22119785。E-mail：[email protected]年第5图1高效液相色谱图
A.阴性对照溶液；B.供试品溶液；C.标准品溶液；D.氧化破坏后样品；E.
碱破坏后样品；F.酸破坏后样品；G.光破坏后样品；1.甲氧苄啶
Fig1HPLCchromatography
A.negativesample；B.samplesolution；C.referencesubstance；D.sampletreatedwithoxidant；E.sampletreatedwithalkali；F.sampletreated
withacid；G.sampletreatedwithstronglight；1.trimethoprim
超声使溶解，稀释至刻度，摇匀，作为标准品贮备液。精密吸取贮备液5mL，置于50mL容量瓶中，用0.01mol·L－1HCl溶液稀释至刻度，摇匀。2.2.2
供试品溶液与阴性对照溶液。取本品20片，精密称定，
研细，精密称取适量（约相当于甲氧苄啶80mg）置于100mL
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容量瓶中，加0.01mol·L－1HCl溶液适量，超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，滤过。精密吸取续滤液5mL，置于50mL容量瓶中，加0.01mol·L－1HCl溶液至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另按处方比例称取空白辅料适量，同法制成阴性对照溶液。
2.3专属性试验
分别取本品细粉适量，分置于4个10mL具塞试管中，1份
－1
加入0.01mol·LHCl溶液10mL摇匀后于4500Lx光照48h；1份加3％H2O2溶液10mL摇匀后于80℃水浴1h；另2份分
－1－1
别加入1mol·LHCl溶液10mL、3mol·LNaOH溶液10mL于80℃水浴2h。精密吸取各条件下破坏后的样品溶液各1mL，分置于10mL容量瓶中（经酸、碱破坏的样品在稀释前
－1
先中和），加0.01mol·LHCl溶液至刻度，摇匀。取上述各溶液，照“2.1”项下的色谱条件，分别进样10μL，记录色谱至主峰保留时间的4倍。结果，供试液在氧化破坏条件下产生的降解产物峰最多，其他破坏条件下也均有不同程度的降解产物产生。在此色谱条件下，甲氧苄啶与其相邻降解产物峰都能达到有效分离，降解产物不干扰样品的测定，色谱见图1。2.4线性关系考察
精密吸取标准品贮备液0.2、0.6、1.0、1.4、2.0mL分别置于
－1
10mL容量瓶中，用0.01mol·LHCl溶液稀释至刻度，摇匀，得系列标准品溶液。分别取上述溶液各10μL注入色谱仪，照“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱。以标准品的浓度（C）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得线性方程为Y＝11.6586C+4.2987（r＝0.9999，n＝5）。结果表明，甲氧苄啶检测浓度线性范围为16.1～161.3μg·mL－1。2.5精密度试验
取“2.4”项下标准品溶液（80μg·mL－1），连续进样5次，测定峰面积，结果峰面积的RSD＝0.1％。2.6重复性试验
取同一批样品（20081001）6份，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件试验，测得其平均含量为99.6％，RSD＝0.3％。2.7稳定性试验
取“2.6”项下的供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24h时进样10μL，结果其峰面积的RSD＝0.5％。表明供试品溶液在室温放置24h内稳定。2.8加样回收率试验
取已知含量的样品9份，按高、中、低浓度加入不同量的标准品各3份，照“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。
2.9最低检测限与定量限
取标准品溶液逐级稀释、测定，按信噪比（S/N）为3∶1，测得最低检测限为3.8ng；按信噪比（S/N）为10∶1，测得定量限为13.9ng。
2.10样品中主药及有关物质含量测定
取不同生产厂家的样品3批，按“2.2”项下方法制备供试品溶液、标准品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱，按外标法以峰面积计算含量，并与《中国药典》记载的紫外分光光度法测定结果进行比较。
精密称取本品细粉适量，用0.01mol·L－1HCl溶液制成每1mL含0.8mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试液；精密吸取
Pharmacy2010Vol.21No.5
表1回收率试验结果（n＝9）
Tab1Resultofrecoverytest（n＝9）
样品含量加入量－1
/μg·mL/μg·mL－1
31.2232.0830.9331.6848.9235.2944.2850.7255.5838.5057.0263.16
测得量/μg·mL－1
63.7163.2063.9783.9679.8786.2094.3095.69101.46
回收率/％101.28100.59100.6599.29100.85100.54100.57100.4499.48
平均回收率
/％
RSD/％
100.40.7
供试液1mL，用0.01mol·L－1HCl溶液制成每1mL含0.008mg的溶液作为对照溶液。取对照溶液10μL，注入色谱仪，调节仪器检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％～25％，再精密吸取供试液与对照溶液各10μL，分别注入色谱仪，记录色谱至主成分峰保留时间的2倍，供试液如有杂质峰，按主成分自身对照法计算杂质总量，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(1.0％)。
主药及有关物质含量测定结果见表2。表2Tab2
样品中主药及有关物质含量测定结果（％）
edsubstances（％）
批号[***********]090402
标示量/％
药典方法HPLC法99.999.7100.099.497.696.9
有关物质/％
0.3
0.60.3
Contentdeterminationoftrimethoprimanditsrelat-
由表2可见，本文建立的主药含量测定方法与药典法比较结果无差异。
3讨论
笔者参考了相关文献[3～5]，比较了不同比例、不同pH的乙
腈-磷酸溶液以及甲醇-0.1mol·L－1磷酸二氢钾溶液作为流动相系统时的分离效果。结果以0.015mol·L－1磷酸（用三乙胺调pH至3.5）-乙腈（83∶17）为流动相时，甲氧苄啶色谱峰峰形最好，保留时间适中（5.7min），主峰与其相邻的杂质峰能有效分离，溶剂、辅料均不干扰测定。
参考文献
[1][2][3][4][5]
张
伦.甲氧苄啶的应用、生产和市场状况[J].中国药房，2001，12（3）：143.
国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：118.
国家药典委员会编.国家药品标准化学药品[S].第十三册.2002，12：108.
韩志云，朱迎春.HPLC法测定头孢氨苄甲氧苄啶胶囊含量的方法改进[J].海峡药学，2007，19（1）：48.谢
燕，陈
明，肖艳萍.高效液相色谱法测定甲氧苄啶
氯化钠注射液中甲氧苄啶的含量[J].精细化工中间体，2006，36（4）：63.
（收稿日期：2009-03-23
修回日期：2009-08-12）
中国药房201021卷第5期