Folin-酚法测定蛋白质含量
器材 （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）秒表 （4）试管16支
操作方法
1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。 注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。
2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。
Bicinchoninic acid (BCA )法测定蛋白质浓度
Bicinchoninic acid (BCA )法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
*器材 1. 7220型分光光度计 2. 比色杯 3. 恒温水浴箱 4. 中试管7支 5. 枪式移液管
2. 试剂 B：4％硫酸铜。 3. CA工作液：试剂A?100ml?＋?试剂B?2ml混合。 4. 蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定） 5. 待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。
ELISA 酶联免疫吸附测定法 指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。
1.基本原理 1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
2.方法类型和操作步骤 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
（一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，中的8、9、10试管。 根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。 *试剂 1. 试剂A： 1％BCA二钠盐 2％无水碳酸钠 0.16%酒石酸钠 0.4％氢氧化钠 0.95％碳酸氢钠混合调PH值至11.25。
形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
（二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。
（三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 （2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 （3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。 （4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。
（四）竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下： （1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。 （2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
（五）捕获法测IgM抗体 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下： （1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。 （2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 （3）加入特异性抗原试剂：
（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。
（六）应用亲和素和生物素的ELISA 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。 亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。 ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色.
它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
空白实验 空白实验是在不加样品的情况下，用测定样品相同的方法、步骤进行定量分析，把所得结果作为空白值，从样品的分析结果中扣除。这样可以消除由于试剂不纯或试剂干扰等所造成的系统误差。其是分析化学实验中常用的一种方法，它可以减小实验误差。比如在溴酸钾法测定苯酚的实验中，由于溴的易挥发性在相同的实验下，将溴酸钾（含有溴化钾）加入另一试剂瓶中，待测溶液苯酚用去离子水代替，其它条件保持不变。这样可以减少由于溴的挥发损失等因素而引起的误差
空白试验 试验中的“空白试验”,系指在不加供试品或以等量溶剂替代供试液的情况下,按同法操作所得的结果;含量测定中的“并将滴定的结果用空白试验校正”,系指按供试品所耗滴定液的量(ml)与空白试验中所耗滴定液量(ml)之差进行计算。
精密度试验包括：（先做重复性试验，再做中间精密度试验）
1.重复性系指在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度。
2.中间精密度系指在同一实验室，由于实验室内部条件(验证设计方案中的变动因素一般为时间、分析人员、仪器设备) 改变，测定结果的精密度。
3.重现性为不同实验室之间的精密度。
重复性 用于评价连续进样后，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5 次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%；采用内标法时，通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3 种不同浓度的溶液，分别至少进样2 次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%
测量方法确认技术分成以下几类。
(1)正确度试验(标准物质分析试验、回收率试验、不同方法的比对试验)。(2)精密度试验(室内重复性、中间精密度、协同试验、极差试验)。(3)检出限的确定。(4)测量范围试验。(5)影响结果因素的系统评价。(6)结果不确定度的评价。
根据测量方法预期用途的特定要求,选用以上至少两项确认试验或评价技术,以便得到与特定要求相关的技术指标。
在没有系统偏差或系统偏差不显著时,精密度好,则正确度高。否则精密度好,正确度不一定高。方法精密度好,才可能采用最少的重复测定次数得到准确的结果。从这个意义上说,方法的精密度对正确度有很大影响。因此,测量方法的精密度要优于正确度的限量,才能满足测量方法正确度的要求。
新制定的标准测量方法应首选实验室间协同试验来确定测量方法精密度,扩充和更改的标准测量方法应视情况选择其他精密度试验。
实践中通常把残留分析检测方法的精密度试验简化为高(略低于检测方法的最高限量)、中(检出限的两倍)、低(略高于检出限)3个浓度各进行不少于10次的测试。应用线性回归原理进行测量的方法一般在线性范围内选择包括检测低限、检测高限在内的6个质量水平样品分别进行不少于3次的测试。检测结果经统计应满足拟确认测量方法精密度的要求。化学分析方法一般采用Horwite方程：cM=2(1-0.5lgc)(%)(c为浓度水平,1,10,100,1000,,)评价方法的精密度。
对于组成不十分清楚的试样, 常采用加入回收法。在试样中加入已知量的被测组分与等量的另一份相同的试样平行进行分析, 求得加入的被测组分的回收率, 由回收率检查系统误差的大小。
提高试验精密度和采用回收试验，都是为了尽可能减少实验误差，使得试验更准确。
BSA代替干扰素 牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。它是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。
BSA在内切酶的缓冲液的作用 1.BSA[N,O-双三甲硅基乙酰胺]是酶的稳定剂，防止酶的分解和非特异性吸附; 2.BSA能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的至于作用机理我不是很清楚，可能是因为它结构中有34个二硫键，和一个巯基，巯基的化学反应很活泼，二硫键有抗氧化还原的作用，因此可与多种阳离子，阴离子和小分子结合; 3.BSA能防止酶吸附到管壁而损失。
BSA的作用 BSA一般做为稳定剂被用于限制酶或者修饰酶的保存溶液和反应液中，因为有些酶在低浓度下不稳定或活
性低。加入BSA后，它可能起到“保护”或“载体”作用，不少酶类添加 BSA后能使其活性大幅度提高。不需要加BSA的酶加入BSA一般不会受到什么影响。对多数底物DNA而言，BSA可以使酶切更完全，并可实现重复切割。在37℃，酶切反应超过1h时，BSA可以使酶更加稳定，因为在不含BSA的反应缓冲液中，许多限制性内切酶在37℃下只能存活10"20min甚至更短的时间。而BSA可以结合缓冲液或底物DNA中抑制限制性内切酶活性的金属离子和其它化学物质。
脂质体 由连续的双层或多层复合脂质组成的人工小球囊。借助超声处理使复合脂质在水溶液中膨胀，即可形成脂质体。可以作为生物膜的实验模型， 在临床上用于捕获外源性物质(如药物、酶或其他制剂)后将它们更有效地运送到靶细胞,经同细胞融合而释放。
脂质体脂质体（liposome）是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25~1000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部 生物学定义:当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，称为脂质体。 药剂学定义 脂质体 (liposome): 系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。
恒量消除 是药物代谢动力学的一个概念，指一种药物消除类型（药物在体内转运或转化\处理）。即零级动力学消除，是指单位时间内药物按恒定的量进行消除，即单位时间消除的药量相等。当机体的消除功能低下或者用药量超过机体最大的消除能力时，药物按恒量方式消除。由于血药浓度按恒定的速率消除，与血药浓度无关，故而称零级动力学消除。按零级动力学消除时，半衰期是一个不恒定的数值，随血药浓度高底而变化，当药物浓度降至最大消除能力以下时，则转为一级动力学消除。
不论血浆药物浓度高低，单位时间内消除的药物量不变。 公式为：Ct=-kot+Co ko为常数
恒比消除 一级动力学消除。。在单位时间里,体内药物按恒定的比例衰减,称恒比消除。
一级速率消除 是指血中药物消除速率与血中药物浓度成正比，血药浓度高，单位时间内消除的药量多，当血药浓度降低后，药物消除速率也按比例下降，也称为定比消除。
公式 dVC／dt=-kVC 式中，k为常数，V为表观分布容积，C为药物浓度。 对上式积分得：C=C 0 e-kt 或 lnC=lnC0-kt C = 1/2C 0，t1/2 = 0.693/k。可见,将t时药物浓度的对数对时间作图,可得一条直线,其斜率为-K/2.303.
特点：（1）药物转运或消除速率与当时药量或一次方成正比。 （2）血药浓度-时间曲线为指数曲线，lnC对t作图为直线。 （3）t1/2恒定，与剂量无关。 （4）一次给药的血药浓度-时间曲线下面积（area under curve，AUC）与剂量成正比。 （5）一次给药，药物消除分数取决于t 1/2，约经5个t1/2时，药物基本消除完全；多次给药，约经5个t1/2血药浓度达稳态。 因此，按一级速率消除的药物半衰期与血药浓度高低无关，是恒定值。体内药物按瞬时血药浓度（或体内药量）以恒定的百分比消除，单位时间内实际消除的药量随时间递减。消除速率常数（k）的单位是h-1，它不表示单位时间内实际消除的实际药量，而是体内药物瞬时消除的百分率
复乳是由普通乳剂进一步乳化而形成的复杂乳剂体系，又称多层乳，如果是W/O型乳剂进一步乳化分散在水中，则形成W/O/W型复乳；O/W乳剂进一步乳化分散在油中，则形成O/W/O型复乳。 复乳中个项依次叫内相、中间项和外项，中间项也被称为液膜。 复乳的制备方法通常采用两步制备法，目前研究的较多的是W/O/W型复乳。 复乳是不稳定的体系，其主要表现为液膜破裂及内项外溢，以W/O/W为例，其稳定性主要受到3个因素的影响：1.内水项微滴的大小；2.内水项和外水项之间的渗透性；3.油膜的性质与厚度。
纳米药物好像挺时髦，实际上是一个伪名词，因为药物研究早半个世纪前就进入纳米时代了。药物学研究早已达到分子水平，例如根据药物的作用位点来设计药物的分子结构，很多药物的结构就是根据生物细胞上的膜蛋白、酶、离子通道、受体等大分子来设计的。你所说的“纳米脂质体”本来就叫做“脂质体”（Liposome），与纳米没什么关系，只是为了赶时髦才加上“纳米”这两个字。它是包裹了药物的脂质微球，主要用于癌症的治疗，由于包裹的药物毒性很高，必须要能够与癌细胞产生定向结合，并释放药物。理想的设计是在脂质体上镶嵌上某种能够于特定癌细胞的表面特征蛋白结合的抗体，这样就能够起到“导弹”的定向作用，在抗体与癌细胞抗原结合之后，脂质体与癌细胞的细胞膜融合，然后脂质体中的药物就可以进入癌细胞，产生细胞毒性作用而杀死癌细胞。
Folin-酚法测定蛋白质含量
器材 （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）秒表 （4）试管16支
操作方法
1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。 注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。 进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。
2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。
Bicinchoninic acid (BCA )法测定蛋白质浓度
Bicinchoninic acid (BCA )法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
*器材 1. 7220型分光光度计 2. 比色杯 3. 恒温水浴箱 4. 中试管7支 5. 枪式移液管
2. 试剂 B：4％硫酸铜。 3. CA工作液：试剂A?100ml?＋?试剂B?2ml混合。 4. 蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定） 5. 待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。
ELISA 酶联免疫吸附测定法 指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。
1.基本原理 1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
2.方法类型和操作步骤 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
（一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，中的8、9、10试管。 根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。 *试剂 1. 试剂A： 1％BCA二钠盐 2％无水碳酸钠 0.16%酒石酸钠 0.4％氢氧化钠 0.95％碳酸氢钠混合调PH值至11.25。
形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
（二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。
（三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。 （2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。 （3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。 （4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。 本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。
（四）竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下： （1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。 （2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
（五）捕获法测IgM抗体 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下： （1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。 （2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 （3）加入特异性抗原试剂：
（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。
（六）应用亲和素和生物素的ELISA 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。 亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。 ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从而使溶液显色.
它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。
空白实验 空白实验是在不加样品的情况下，用测定样品相同的方法、步骤进行定量分析，把所得结果作为空白值，从样品的分析结果中扣除。这样可以消除由于试剂不纯或试剂干扰等所造成的系统误差。其是分析化学实验中常用的一种方法，它可以减小实验误差。比如在溴酸钾法测定苯酚的实验中，由于溴的易挥发性在相同的实验下，将溴酸钾（含有溴化钾）加入另一试剂瓶中，待测溶液苯酚用去离子水代替，其它条件保持不变。这样可以减少由于溴的挥发损失等因素而引起的误差
空白试验 试验中的“空白试验”,系指在不加供试品或以等量溶剂替代供试液的情况下,按同法操作所得的结果;含量测定中的“并将滴定的结果用空白试验校正”,系指按供试品所耗滴定液的量(ml)与空白试验中所耗滴定液量(ml)之差进行计算。
精密度试验包括：（先做重复性试验，再做中间精密度试验）
1.重复性系指在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度。
2.中间精密度系指在同一实验室，由于实验室内部条件(验证设计方案中的变动因素一般为时间、分析人员、仪器设备) 改变，测定结果的精密度。
3.重现性为不同实验室之间的精密度。
重复性 用于评价连续进样后，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5 次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%；采用内标法时，通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3 种不同浓度的溶液，分别至少进样2 次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%
测量方法确认技术分成以下几类。
(1)正确度试验(标准物质分析试验、回收率试验、不同方法的比对试验)。(2)精密度试验(室内重复性、中间精密度、协同试验、极差试验)。(3)检出限的确定。(4)测量范围试验。(5)影响结果因素的系统评价。(6)结果不确定度的评价。
根据测量方法预期用途的特定要求,选用以上至少两项确认试验或评价技术,以便得到与特定要求相关的技术指标。
在没有系统偏差或系统偏差不显著时,精密度好,则正确度高。否则精密度好,正确度不一定高。方法精密度好,才可能采用最少的重复测定次数得到准确的结果。从这个意义上说,方法的精密度对正确度有很大影响。因此,测量方法的精密度要优于正确度的限量,才能满足测量方法正确度的要求。
新制定的标准测量方法应首选实验室间协同试验来确定测量方法精密度,扩充和更改的标准测量方法应视情况选择其他精密度试验。
实践中通常把残留分析检测方法的精密度试验简化为高(略低于检测方法的最高限量)、中(检出限的两倍)、低(略高于检出限)3个浓度各进行不少于10次的测试。应用线性回归原理进行测量的方法一般在线性范围内选择包括检测低限、检测高限在内的6个质量水平样品分别进行不少于3次的测试。检测结果经统计应满足拟确认测量方法精密度的要求。化学分析方法一般采用Horwite方程：cM=2(1-0.5lgc)(%)(c为浓度水平,1,10,100,1000,,)评价方法的精密度。
对于组成不十分清楚的试样, 常采用加入回收法。在试样中加入已知量的被测组分与等量的另一份相同的试样平行进行分析, 求得加入的被测组分的回收率, 由回收率检查系统误差的大小。
提高试验精密度和采用回收试验，都是为了尽可能减少实验误差，使得试验更准确。
BSA代替干扰素 牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。它是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。
BSA在内切酶的缓冲液的作用 1.BSA[N,O-双三甲硅基乙酰胺]是酶的稳定剂，防止酶的分解和非特异性吸附; 2.BSA能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的至于作用机理我不是很清楚，可能是因为它结构中有34个二硫键，和一个巯基，巯基的化学反应很活泼，二硫键有抗氧化还原的作用，因此可与多种阳离子，阴离子和小分子结合; 3.BSA能防止酶吸附到管壁而损失。
BSA的作用 BSA一般做为稳定剂被用于限制酶或者修饰酶的保存溶液和反应液中，因为有些酶在低浓度下不稳定或活
性低。加入BSA后，它可能起到“保护”或“载体”作用，不少酶类添加 BSA后能使其活性大幅度提高。不需要加BSA的酶加入BSA一般不会受到什么影响。对多数底物DNA而言，BSA可以使酶切更完全，并可实现重复切割。在37℃，酶切反应超过1h时，BSA可以使酶更加稳定，因为在不含BSA的反应缓冲液中，许多限制性内切酶在37℃下只能存活10"20min甚至更短的时间。而BSA可以结合缓冲液或底物DNA中抑制限制性内切酶活性的金属离子和其它化学物质。
脂质体 由连续的双层或多层复合脂质组成的人工小球囊。借助超声处理使复合脂质在水溶液中膨胀，即可形成脂质体。可以作为生物膜的实验模型， 在临床上用于捕获外源性物质(如药物、酶或其他制剂)后将它们更有效地运送到靶细胞,经同细胞融合而释放。
脂质体脂质体（liposome）是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中，脂质体疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂质体，直径25~1000nm不等。脂质体可用于转基因，或制备的药物，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入细胞内部 生物学定义:当两性分子如磷脂和鞘脂分散于水相时，分子的疏水尾部倾向于聚集在一起，避开水相，而亲水头部暴露在水相，形成具有双分子层结构的的封闭囊泡，称为脂质体。 药剂学定义 脂质体 (liposome): 系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体。
恒量消除 是药物代谢动力学的一个概念，指一种药物消除类型（药物在体内转运或转化\处理）。即零级动力学消除，是指单位时间内药物按恒定的量进行消除，即单位时间消除的药量相等。当机体的消除功能低下或者用药量超过机体最大的消除能力时，药物按恒量方式消除。由于血药浓度按恒定的速率消除，与血药浓度无关，故而称零级动力学消除。按零级动力学消除时，半衰期是一个不恒定的数值，随血药浓度高底而变化，当药物浓度降至最大消除能力以下时，则转为一级动力学消除。
不论血浆药物浓度高低，单位时间内消除的药物量不变。 公式为：Ct=-kot+Co ko为常数
恒比消除 一级动力学消除。。在单位时间里,体内药物按恒定的比例衰减,称恒比消除。
一级速率消除 是指血中药物消除速率与血中药物浓度成正比，血药浓度高，单位时间内消除的药量多，当血药浓度降低后，药物消除速率也按比例下降，也称为定比消除。
公式 dVC／dt=-kVC 式中，k为常数，V为表观分布容积，C为药物浓度。 对上式积分得：C=C 0 e-kt 或 lnC=lnC0-kt C = 1/2C 0，t1/2 = 0.693/k。可见,将t时药物浓度的对数对时间作图,可得一条直线,其斜率为-K/2.303.
特点：（1）药物转运或消除速率与当时药量或一次方成正比。 （2）血药浓度-时间曲线为指数曲线，lnC对t作图为直线。 （3）t1/2恒定，与剂量无关。 （4）一次给药的血药浓度-时间曲线下面积（area under curve，AUC）与剂量成正比。 （5）一次给药，药物消除分数取决于t 1/2，约经5个t1/2时，药物基本消除完全；多次给药，约经5个t1/2血药浓度达稳态。 因此，按一级速率消除的药物半衰期与血药浓度高低无关，是恒定值。体内药物按瞬时血药浓度（或体内药量）以恒定的百分比消除，单位时间内实际消除的药量随时间递减。消除速率常数（k）的单位是h-1，它不表示单位时间内实际消除的实际药量，而是体内药物瞬时消除的百分率
复乳是由普通乳剂进一步乳化而形成的复杂乳剂体系，又称多层乳，如果是W/O型乳剂进一步乳化分散在水中，则形成W/O/W型复乳；O/W乳剂进一步乳化分散在油中，则形成O/W/O型复乳。 复乳中个项依次叫内相、中间项和外项，中间项也被称为液膜。 复乳的制备方法通常采用两步制备法，目前研究的较多的是W/O/W型复乳。 复乳是不稳定的体系，其主要表现为液膜破裂及内项外溢，以W/O/W为例，其稳定性主要受到3个因素的影响：1.内水项微滴的大小；2.内水项和外水项之间的渗透性；3.油膜的性质与厚度。
纳米药物好像挺时髦，实际上是一个伪名词，因为药物研究早半个世纪前就进入纳米时代了。药物学研究早已达到分子水平，例如根据药物的作用位点来设计药物的分子结构，很多药物的结构就是根据生物细胞上的膜蛋白、酶、离子通道、受体等大分子来设计的。你所说的“纳米脂质体”本来就叫做“脂质体”（Liposome），与纳米没什么关系，只是为了赶时髦才加上“纳米”这两个字。它是包裹了药物的脂质微球，主要用于癌症的治疗，由于包裹的药物毒性很高，必须要能够与癌细胞产生定向结合，并释放药物。理想的设计是在脂质体上镶嵌上某种能够于特定癌细胞的表面特征蛋白结合的抗体，这样就能够起到“导弹”的定向作用，在抗体与癌细胞抗原结合之后，脂质体与癌细胞的细胞膜融合，然后脂质体中的药物就可以进入癌细胞，产生细胞毒性作用而杀死癌细胞。