第七章 酶学分析技术
机体各种物质的代谢都是在酶的催化下完成的，酶的编码基因突变或表达异常，可导致酶分子缺陷，使代谢障碍，引起疾病；同样组织细胞的病变，也可导致酶活性的改变，因此酶学分析在临床诊断中具有重要意义。
第一节 酶活性测定的基本知识
酶是一种生物催化剂，其化学本质是蛋白质，它在体含量极微，每ml 仅为pg 水平，要直接测定其绝对量是十分困难的，目前是根据其催化反应速度来定量，称为相同对定量法。
一、酶活性的概念
酶活性是指在规定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即酶反应的速度。
如果在酶反应过程中测得的产物[P]或底物[S]的变化量对时间作图，可得到酶促反应时间进行曲线。
反应最新阶段，[S]过量，原始浓度很大。[P]或[S]的变化量随反应时间而线性地增减，即单位时间内[P]或[S]的变化量或反应速度是恒定的，此阶段称为零级反应期。
d [S ]d [P ]==K 0 dt dt
其反应速度（v ）与[S]、[P]无关，而以恒速进行。 ν=-
即 －d [S]=Ko dt
积分 ⎰[S ]t
[S ]0d [S ]=K 0⎰dt 0t
得 [S]o －[S]t = Ko t
以[S]o －[S]t 对t 作图可得一直线，其斜率为K o ，实际上[S]o －[S]t 也就是t 时产物[P]，故[P]和反应时间成正比，[P] = Ko t 。
一般情况下，产物和底物的变化量是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好，因产物是从无到有，只要测定方法足够灵敏，准确度很高。
二、酶活性单位
酶活性大小通常以单位来表示，单位是一个人为规定的标准，是指在规定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量，酶单位有三种表示方式。
1. 惯用单位 60年代前，各种酶活力的表示法和酶单位定义没有统一标准，一般由方法的设计者自行规定在某一特定条件下生成一定量的产物为一个单位。
这样，同一种酶由于测定方法不同，可有不同单位定义，如ALT 的比色测定法有金氏法、穆氏法、赖氏法，三种方法原理相同，但单位是定义不同，正常参考范围也不同。
King 法：每100ml 血清在37℃与底物作用60mim ，每生成1μmol 丙酮酸为一个酶活性单位。
Mohum 法：1ml 血清37℃与底物作用60mim 每产生5μg 丙酮酸为一个酶活性单位。
Reitmen 法：套用Karman 单位，在规定条件下（血清1ml ，反应液总量3ml ，25℃，作用1min ，内径1cm 比色杯）测定340nm 波长处，吸光度减少值，每减少0.001为一个酶活性单位。
2. 国际单位 1961年国际生化学会酶学委员会建议使用统一的国际单位（IU ）是指在规定条件下（如25℃，最适pH ，最适[S]时）每分钟催化1μmol 底物发生反应的酶量。
1965年改为30℃，1972年取消时温度的规定。
缺点：1）由惯用单位换算成IU 较麻烦
2）对分子量不明的底物无法计算其摩尔浓度。
3）同一种酶用不同的测定方法，换算成国际单位后仍不相同。
3. Katal单位 1972年国际酶学委员会又提出的一种新单位，是指在最适条件下，每秒钟催化1mol 底物发生变化的酶量。
1 Kat=60×106IU
1 nKat=0.06IU
1 IU=16.67nKat
三、酶活性单位的计算
酶活性单位的计算，实际上就是计算单位时间内底物或产物的变化量。计算方式
酶单位/升=产物生成量每一单位规定的保温时间1000（ml ）⨯⨯每一单位规定的产物生成量实际保温时间实际样品用量（ml ）如：血清淀粉酶测定（碘比色法）缓冲淀粉液，0.4g/L,用量1.0ml ，血清0.02ml 。
单位定义100ml 血清37℃，作用15mim 每水解5mg 淀粉为一个淀粉酶单位。 淀粉酶单位/升=A 对照-A 测定
A 对照⨯0. 4151000⨯⨯ 5. 07. 50. 02
如：已知产物或底物的吸光系数，可用下式计算：
终点法：
每单位规定保温时间V t 106
酶单位/升=（A 测定－A对照）⨯⨯⨯ 实际保温时间V s ε⋅L
速率法：
V R 106
IU /L =∆A /min ⨯⨯ V S ε⋅L
如ALT 测定速度法，NADH 在340nm 的摩尔吸光系数为6300，反应液（工作液）1.0ml ，血清0.1ml ，光径1cm 。
0. 1106
ALT (IU /L ) =∆A /min ⨯⨯=∆A /min ⨯1746 1. 16300⨯1
四、酶促反应底物动力学
（一）米—曼方程
酶的活性除了受温度pH ，抑制剂，激活剂等因素的影响外，还受底物浓度的影响，1913年Michaelis-Menten 根据酶作用的中间产物学说，定量地分析了酶反应速度与底物浓度的关系，其数学表达式为：
ν=V max[S ] Km +[S ]
Km 是3个速度常数的复合函数，在数值上相当于反应速度为最大速度一半时的底物浓度。
当ν=V max V max[S ]1 Km=[S] =V max 2Km +[S ]2
Km 可表示酶与底物的亲和力，Km 越大，表示E 与S 的亲和力越小反应，Km 越小表示酶与S 的亲和力越大。
Km 是酶的特征性常数之一，只与酶的结构底物性质以及反应条件（如温度、PH 、离子强度）有关，而与酶的浓度无关，各种酶的Km 一般在10－6～10－2mol/L之间
（二）Km 的应用
1. 计算不同[S]时v 为Vmax 的百分率，如[S]=10 Km时
V max ⋅10Km 10Km ν==·V max =0. 91V max Km +10Km 11Km
2. 确定酶反应中的底物浓度 为了使酶反应的速度接近Vmax 一般要求
[S] =10～20Km ，此时v =91％～95％Vmax
3. 作为鉴别酶的依据 如两种酶对同一底物（相同条件下）表现有相同的Km ，则这两种酶为同一种酶，否则为两种不同的酶。
4. 确定酶的天然底物 有些酶可有多种底物，其中Km 最小的底物是该酶的最适（天然）底物。
5. 判断酶的激活剂或抑制剂 凡能降低Km 的物质为激活剂，凡能增大Km 的物质为酶抑制剂。
6. 鉴别酶的抑制类型 根据抑制剂以对Km 和Vm 的不同影响，可区分抑
制类型
Vm
Km 竞争性抑制 不变 增大 反竞争性抑制 降低 减少 非竞争性抑制 降低 不变
（三）Vm 的意义和应用
Vm 是指酶完全被底物饱和时的反应速度，在[E]不变时，对于特定的S 、Vm 也是一个常数。
如果已知酶的总浓度，则可从Vm 来计算酶的转换率，转换率可代表酶的催化效率，指单位时间内每分子酶所能催化反应的次数。大多数酶的转换率为1-104秒1 －
（四）Km 和Vm 的测定
将[S]对v 作图不能求得Km 和Vm ，这是因为Vm 是一个渐近的极限值，不可能从实验中直接得到，由于Km 是v 为Vm 一半时的[S]，所以也不能得到Km ，一般都是将米一曼公式转变成直接方程，然后根据直线方程斜率用外推法求得Km 和Vm 。
第二节 酶活性的测定方法及酶学分析的类型
一、酶活性的测定方法
酶活性测定不论采用何种方法，都必须符合两个原则。
1. 在零级反应期测定 v = Vmax = 常数，即－[S]或[P]与反应时间成正比。保持过量底物。
2. 反应速度与酶量成线性关系。 [E ]=K
根据酶的时间，酶活性测定主要分两种类型。
（一）固定时间法
测定酶反应开始后某一段时间内(从t 1→t 2) 产物或底物的总变化量称为终点法。因t 1和t 2是反应历程中的两个点，故又称
两点法。
优点：简便，测定产物时，酶反应被终止，
显色剂的选择论考虑对酶活性的影响，分光光
度计不需保温装置。
缺点：无法了解这段时间的反应是否都是
零级反应，故难以保证结果的真实性。
（二）连续监测法
每隔一定时间（10～60s ）连续测定酶反应中
-[S ][P ] =K t t
某一产物或底物的变化量称为连续监测法，定两个时间点，该法进行多点连续测定。
省试剂。
S 则必须考虑它们对待测酶活性是否有影响。
二、工具酶
在酶学分析中，是以酶作为工具来进行分析的方法，酶学分析主要包括两个方面的内容。
借助酶来测定某些化合物 如测定体液中G 、TG 、Ch 等
酶学分析
借助酶来测定另一种酶活性 实际是用酶来测定待测酶的产物，如
ALP 、AST 、CK 、GGT 等
酶学分析特点：高效、专一性高、温和、灵敏、线性范围宽。
（一）工具酶的概念
作为试剂用于测定待测物浓度或待测酶活性的酶称为工具酶。
如： G +O 2+H 2O −GOD −−→葡萄糖酸+H 2O 2
H 2O 2+4-AAP +酚−−−→红色醌类化合物POD 缺点：分光光计必须有保温装置，而且P
常用品工具酶主要是氧化还原酶类，部分转移酶类和水解酶类。
（二）工具酶的质量要求
工具酶的用量一般较多，故要求工具酶来源广泛，价廉易得，纯度要求不太高，可降低制备成本，但对工具酶中的杂质也要有一定的限制，以保证工具酶有一定的比活性，减少或避免一些能干扰测定的副反应。
（三）固相酶
1. 固相酶的概念和特点 固相酶是水溶性的酶通过物理或化学方法，使其吸附、包埋或共价结合在固相载体上，成为不溶于水但仍保留酶活性的酶衍生物。
固相酶作为一种酶试剂，不仅具备有酶的高度专一性和高敏性，与水溶性酶相比，还具有以下特点。
1）可反复使用，降低成本。
2）稳定性好，能在较广的pH 范围和较高的温度下发挥作用。
3）抗干扰性强，对激活剂，抑制剂敏感性小。
4）机械强度大，不受搅拌，冲洗的影响。
2. 固相化方法
1） 吸附法 通过非共价健吸附到隋性载体上，如玻璃、石英、硅胶，氧化铝和离子交换树脂，方法简便，条件温和，易脱落，稳定性较差。
2）包埋法 将酶包埋在凝胶中（如淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶）酶通过凝胶的微孔发挥作用，简便，条件温和，不牢固。
3）共价结合法 酶通过交联剂与固相载体进行共价结合，常用的载体有葡聚糖，琼脂糖和纤维素衍生物，共价结合操作复杂，但结合牢固，稳定性好。
3. 固相酶在生检验中的应用 主要是两个方面。
1） 酶感应器 是将酶固相化在传感器上构成的一种生物传感器，如酶电极。
2）酶检测器 由固相酶装置（酶柱、酶管、酶膜）和检测器（可见紫外分光光度法、荧光法等），样品通过固相酶装置，经酶作用后流出液即可被自动检测。
三、酶偶联测定法
酶活性测定可采用直接测定法或酶偶联测定法。对于底物或产物可直接测定的酶促反应，可直接测定底物的减少量或产物的生成量测定酶活性。对于底物或产物不能直接测定的酶促反应，可用酶偶联法测定。例如：
Ex Ea Ei A −−→B −−→C −−→P
Ex 为待测酶，Ea 、Ei 为工具酶。按工具酶作用的不同，Ea 称辅助酶，Ei 称指示酶。C ——→P 称为指示反应。
如：C -P +ADP −−→C +ATP CK 为待测酶
HK ATP +G −−→G -6-P +ADP HK 为辅助酶 CK
6PD G -6-P +NADP +−G −−→6-磷酸葡萄糖酸+NADH G6PD 为指示酶
（三）常用工具酶及其指示反应。
1. NAD(P)+或NAD （P ）H 偶联的脱氢酶及指示反应 最常用的工具酶有LDH 、MDH 、GLDH 、G6PDH ，它们都以NAD(P)+或NAD （P ）H 为辅酶。NADH 和NADPH 在340nm 有光吸收特性，可用紫外分光光度计直接测定，另外，NAD(P)H还有强烈荧光，其激发光波长为365nm ，荧光波长为460nm ，荧光法的灵敏度比分光光度法高。
如：ALT 测定 工具酶是LDH
Ala +α-KG −ALT −−→Pyr +Glu
Pyr +NADH −−−→Lac +NAD LDH +
主要缺点：1）需要紫外分光光度计；
2）需高纯度的酶和辅酶
3）灵敏度较低 NADH+在340nm ，ε为6300L ·mol 1cm －－1
改进方法，在脱氢酶后再偶联一个心肌黄酶，用四氮唑衍生物作为受氢体，生成紫外的甲 化合物。
NADH ＋ H + ＋ 心肌黄酶-FAD ————→NAD + ＋ 心肌黄酶-FADH 2 心肌黄酶-FADH 2 + INT————→心肌黄酶 + 甲臢
INT 生成的甲 最大吸收峰492nm ，ε19400L ·mol －1cm －1约为NADH 在340nm
吸光系数的3倍。
2. 偶联H 2O 2的工具酶及指示反应 GOD 、尿酸酶、GlyOD 、ChOD 等工具酶可分别作用于G 、UA 、GLy 、Ch 使其氧化产生H 2O 2，H 2O 2在POD 的作用下，使无色的色原氧化成有色的色素。
常用的单一色原有：联苯胺、邻联甲苯胺、邻联茴香胺，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，有致癌作用，现已不用。
成对色原有：4-氨基安替比林和酚，是Trinder 1969年提出的故称为Trinder 反应，是目前最常用的指示反应。
H 2O 2+4-AAP +酚−POD −−→红色亚胺醌
其吸收峰为500nm ，ε13000L ·mol －1cm －1
优点：呈色稳定，线性范围宽，应用广。缺点：易受VitC 、胆红素、尿酸等还原性物干扰，这些物质能还原H 2O 2，使结果偏低。
二、酶学分析类型
四、底物浓度测定
1. 终点法 将待测底物和工具酶保温一定时间后，待测物全部转变为可直接检测的化合物，从而计算待测物浓度。
尿素+H 2O −脲酶−−→2NH 3+CO 2
产生的NH 3与尿素的浓度成正比。
由于体液中待测物浓度不高，一般在工具酶Km 附近，为了缩短反应时间，实现底物完全转变，可在反应体系中加入“陷阱试剂”使之与反应产物结合，减少逆反应。
2. 速率法 这种方法不要求将待测物全部转变为可检测的产物，而是利用工具酶的反应速度来测定待测物的浓度。
速率法较终止法简便、省时、干扰少，可测定低浓度物质，需自动分析仪。
第三节 同工酶测定
一、同工酶的概念
1971年国际生化学会（IUB ）提出同工酶是指同一种属中由不同基因位点或
等位基因编码的多肽链单体，纯聚体或杂交体，其理化及生物学性质不同，而能催化相同反应的酶。
同工酶的分布除了具有组织器官特异性外，在同一细胞的不同细胞器中也有不同的分布，这对于提高疾病的诊断有重要意义。
二、同工酶的测定方法
主要有5类方法
（一）电泳法
根据同工酶分子大小及等电点的不同，利用蛋白质电泳方法分离同工酶，再经特殊染色，在支持介质上呈现出同工酶谱。常用支持合质有醋纤膜、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶。
如琼脂糖凝胶电泳可将ALP 分为6个区带
ALP 1
肝胆疾病 ALP 2 肝 ALP 3 骨骼 ALP 4 胎盘 ALP 5 小肠 ALP 6 活动性溃疡结肠炎
评价：区带电泳具有简便有效，价廉，不需特殊设备，可广泛用于多种同工酶的分离和鉴定。
（二）层析法 主要有两种
1. 离子交换层析 利用同工酶表面电荷的不同，与离子交换树脂结合后，可用不同浓度或不同pH 的缓冲液进行分段洗脱。
如用DEAE-葡萄糖A50分离CK ，样品上柱后，用
0.05mol/L pH8.0 Tris缓冲液洗脱杂蛋白
0.1mol/L NaCl 洗脱负电荷最少的CK-MM
0.2mol/L NaCl 洗脱 CK-BM
0.5mol/L NaCl 洗脱负电荷最多的CK-BB
2. 亲和层析法 利用多基因位点的同工酶具有不同免疫学特性和不同底物专一性，将特异性配体（如抗体）用固相化技术结合在葡聚萄糖或琼脂糖凝胶上，样品通过层析柱时，凝胶就能选择性结合某一同工酶，而让其他同工酶通过，然后用洗脱剂洗脱。
评价：可用于同工酶的提纯制备，但费时。
（三）免疫化学法
利用同工酶的抗原性不同进行分离，主要适用于多基因位点的同工酶。
1. 免疫抑制法 利用同工酶的某一亚基与相应抗体结合后，酶活性受抑制，而不含这种亚基的同工酶不受影响，故测定加与不加抗体样品中酶活性的差别，可推算出该型同工酶的活性，如在CK 同工酶中加入足量的CK-MM 抗体，则：
CK-MM 活性全部被抑制
CK-MB 活性抑制50％
CK-BB 活性不受影响
2. 免疫沉淀法 在含有A 、B 两型同工酶的混合样品中，加入A （或B ）的抗体，使A （或B ）沉淀，离心后测定上清液中酶活性，可代表B （或A ）的酶活性，用加入抗体前测得的总活性减去上清液酶活性，即得出被沉淀酶活性。
3. 免疫测定酶蛋白法 酶是蛋白类抗原，可用各种免疫定量法来测定，如免疫扩散法，对流免疫电泳法、火箭电泳法、放射免疫法（RIA ）、酶免疫法（EIA ），其中后两者灵敏度可达10－9～10－12g 水平。
评价：RIA 、EIA 是目前测定同工酶最可靠、灵敏和特异的方法，但方法较复杂，前者有放射性污染。
（四）动力学法
1. 利用同工酶对底物专一性不同进行分离
如A 型醛缩酶（ALD-A ）对FDP 和F-1-P 的活性比值为50，而B 型醛缩酶（ALD-B ）对FDP 和F-1-P 的活性比值为1。根据此样品对FDP 和F-1-P 的活性比值，可大致反映其ALD-A 和ALD-B 的比例。
2. 利用同工酶有不同的最适pH 和不同底物的Km 进行分离，如AST 的最适pH 为7.4，当pH 为6.5时，胞浆AST （S-AST ）活性明显下降，而线性体AST （m-AST ）仍可保持，为一方面，m-AST 对L-Asp 的Km 为0.7mmol/L，远小于S-AST 的Km5.07mmol/L，因此在pH6.5，L-Asp 浓度为5mmol/L，测定的是m-AST 活性，而在pH7.4，L-Asp 浓度为200mmol/L，测定的是AST 总活性。
评价：简便、快速，不需特殊设备，也不需分离同工酶就可测定，但准确性较差。
（五）酶失活法
利用各型同工酶对热稳定性不同而设计的方法，如ALP 同工酶的热稳定性依次为：
ALP 4＞ALP 2＞ALP 5＞ALP 3
当血清在60℃加热30min ，只有ALP 4保留其活性。
在56℃加热10min ，ALP 2失活95%以上，ALP 5失活大部分，而ALP 4
仅失活5％。
评价：最简单易行，不需任何外加试剂和特殊仪器，但准确性差，不能准确定量，只能大致估计。
三、同工酶测定的临床意义
同工酶谱的改变能较准确地反映病变的部位和损伤程度，对提高疾病的诊断、治疗以及预后分析有重要价值。
第四节 酶学分析在临床诊断上的应用
血浆、消化液、脑脊液、尿液、羊水中的酶类统称为体液酶。其中血浆酶的
测定是临床生化检验的重要组成部分。
一、血清酶的来源与含量
（一）血浆特异酶（血浆功能性酶）
在血浆中发挥特异催化作用的酶称为血浆特异酶，如参与溶血、纤溶过程的有关酶，拟胆碱脂酶、铜蓝蛋白（CER ）、卵磷脂胆固醇脂酰转移酶（LCAT ）、脂蛋白脂肪酶（LPL ）、肾素等，除LPL 来自组织毛细血管内皮细胞，肾素来自肾小球旁器外，其余部分来自肝。
（二）外分泌酶
来源于外分泌腺，如唾液淀粉酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。由外分泌腺分泌至消化道，参与食物消化过程，正常血液含量极少。
（三）细胞酶
存在于组织细胞内参与物质代谢的酶，当细胞更新时释放入血液，在血浆中无重要催化作用，主要用于诊断，了解一些组织细胞的结构及功能状态。
主要血清酶的正常参考值（成人）
酶
乳酸脱氢酶（LDH ）
异柠檬酸脱氢酶（ICDH ）
γ-谷氨酰转肽酶（GGT ）
天冬氨酸氨基转移酶
（AST ）
丙氨酸氨基转移酶（ALT ）
肌酸激酶（CK ）
碱性磷酸酶（ALP ）
酸性磷酸酶（ACP ）
5′-核苷酸酶（5′-NT ）
α-淀粉酶（ASM ）
脂肪酶
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
（OCT ）
二、酶水平的组织专一性
血清中的酶种类很多，但并非所有的酶都能用于诊断，因很多酶可来自机体各组织细胞，无组织专一性，只有少数酶来自一种组织或少数几种组织，它们的活性测定可比较特异地反映相关组织细胞的病理过程，具有临床诊断价值。 方法 顺向比色法 逆向比色法 连续监测法 γ-谷氨酰-α-萘胺重氮比色法 γ-谷氨酰对硝基苯胺法 酶联连续监测法 赖氏法 酶联连续监测法 赖氏法 无机磷比色法 肌酸比色法 β-甘油磷酸法 磷酸苯二钠法 β-甘油磷酸法 磷酸苯二钠法 无机磷比色法 碘比色法 脂肪酸滴定法 瓜氨酸比色法 正常参考值（U ） 225～540 200～380 2～13 ＜40 男：37.3±48.6 女：15±17.7 8～35 8～28 8～57 5～25 0～40 0～3.2 2.5～6.5 3～13 0～1.1 0～4 2～15 42～215 ＜15 8～12mU
高度特异性的有：鸟氨酸氨基甲酰转移酶（OCT 肝）、山梨醇脱氢酶（SDH 肝）、醇脱氢酸（ADH 肝）、5′-核苷酸酶（5′-NT 肝、胆），谷氨酸脱氢酶（GLDH 肝）、淀粉酶（AMS 胰、唾液腺）、精氨酸酶（肝）、丙氨酸氨基转移酶（ALT 、肝、肾、心）。
中度特异性的有：肌酸激酶（CK 骨骼肌、心脑）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT 或GGT 、肝、胆、肾、小肠）。
低度特异性的有：乳酸脱氢酶（LDH 心、肾、骨骼肌、肝、肺）、碱性磷酸酶（ALP 、小肠、胎盘、肝、肾）。
三、血清酶在测定在临床诊断中的应用
（一）在诊断肝胆疾病中的应用
肝脏是物质代谢的中枢，酶类极丰富，当肝细胞损伤时，细胞内酶大量释放入血，或合成的酶减少，导致血清酶含量变化，因此，临床上应用肝组织专一性或相对专一性作为判断肝细胞损伤指标。
反映肝细胞结构与功能的ALT 、AST 、ADH 、ICDH 、GLDH 、OCT 的上升、ChE 、LCAT 下降。
反映胆道疾病（胆道阻塞）的ALP 、γ-GT 、5′-NT 上升。
判断肝纤维化程度的 MAO 上升
（二）在诊断心肌梗死中的应用
主要有AST 、LDH 1、CK-2或CK-MB ，AST 分布较广，但心肌含量最多（156000u/g湿组织），LDH 属低特异性酶类LDH 1在心肌中含量高（占LDH 总活性35%～70%），正常血清LDH 2＞LDH 1，心肌梗死，CK-2在血清活性可增高10～25倍，阳性率100%，CK-2是诊断心肌梗死的最佳指标。
（三）在诊断胰腺疾病中的应用
主要有α-AMS 、脂肪酶均来自胰腺泡分泌，急性胰腺炎、血清α-AMS ，2-12h 开始上升，12～72h 达高峰，4d 左右恢复正常，尿α-AMS 阳性率高于血清，特续时间长，脂肪酶在胰腺炎时与淀粉酶平行，但其他急腹症时该酶活性不升高，故特异性较高，但尿中检测不出脂肪酶。
（四）在诊断骨骼与骨骼肌疾病中的应用
主要是ALP ，各种骨疾病中血清ALP 均上升，特别是成骨肉瘤及' 畸形骨炎，可分别增至正常45倍与30倍，恶性肿瘤骨转移，骨质软化症，佝偻病等ALP 均上升。
骨骼肌疾病CK 、ALD （醛缩酶）、AST 、LDH ↑.
（五）在诊断前列腺疾病中的应用
主要是ACP ，成年男性，血清ACP 有1/3～1/2来自前列腺，特别是前列腺Ca 的诊断。
第五节 影响酶活性测定的因素
一、样品处理的影响
1. 溶血 RBC 中某些酶活性比血清高，如LDH 高150倍，AST 高15倍，ALT 高7.5倍。
2. 抗凝剂 某些酶可被抗凝剂抑制，如EDTA 、草酸盐，可抑制需Ca 2+的AMS 和需Mg 2+的CK 、5′-NT 、ALP 等，故酶活性测定都用血清。
3. 样品存放时间 各种血清酶稳定性不同，如ACP 、CK 在室温下迅速失活，AMS 、GGT 则很稳定。
二、测定条件的影响
1. 温度 温度对酶活性的影响包括两个方面，一方面是温度升高，反应速度加快，同一般化学反应，其关系符合Arrhenius 公式
E -K =Ae RT
另外一方面温度升高，会发生热变性，使酶活性降低。
1）温度的选择 37℃反应速度快，单位时间反应物质变化量大，测定灵敏度增加，保温时间短，25℃、30℃可使单位时间的散热较少，温度便于恒定，很多实验数据的物理化学校准是在30℃进行，IFCC 建议30℃作为参考方法的标准温度。
2）温度系数 将温度每升高10℃后反应速度相当于原来的倍数，称为温度系数（Q 10）,Q 10大表示温度对v 影响大。
2. pH
1）改变底物的解离状态，影响酶与底物结合
2）改变酶活性中心必需基团的解离状态，影响酶活性。
3）改变酶的三维空间构象，使酶变性。
4）使亚基解聚
3. 缓冲液性质 酶活性不仅受缓冲液pH 影响，也受缓冲液性质的影响，选择缓冲液应考虑的因素。
1）缓冲液中弱酸的解离数Pka 必须接近酶测定时的pH ，如ALT 测定7.4（磷酸K 2 6.7）LDH 测定8.8，（二乙醇胺8.8）ALP 测定10（碳酸K 2 10.32）
2）缓冲液对酶活性无抑制作用，如甘氨酸对LDH 、ALP 有抑制作用。
3）缓冲液在酶反应体系中不会发生降解或破坏
4）缓冲液在可见光区或紫外光区没有或仅有极低光吸收现象。
第七章 酶学分析技术
机体各种物质的代谢都是在酶的催化下完成的，酶的编码基因突变或表达异常，可导致酶分子缺陷，使代谢障碍，引起疾病；同样组织细胞的病变，也可导致酶活性的改变，因此酶学分析在临床诊断中具有重要意义。
第一节 酶活性测定的基本知识
酶是一种生物催化剂，其化学本质是蛋白质，它在体含量极微，每ml 仅为pg 水平，要直接测定其绝对量是十分困难的，目前是根据其催化反应速度来定量，称为相同对定量法。
一、酶活性的概念
酶活性是指在规定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的生成量，即酶反应的速度。
如果在酶反应过程中测得的产物[P]或底物[S]的变化量对时间作图，可得到酶促反应时间进行曲线。
反应最新阶段，[S]过量，原始浓度很大。[P]或[S]的变化量随反应时间而线性地增减，即单位时间内[P]或[S]的变化量或反应速度是恒定的，此阶段称为零级反应期。
d [S ]d [P ]==K 0 dt dt
其反应速度（v ）与[S]、[P]无关，而以恒速进行。 ν=-
即 －d [S]=Ko dt
积分 ⎰[S ]t
[S ]0d [S ]=K 0⎰dt 0t
得 [S]o －[S]t = Ko t
以[S]o －[S]t 对t 作图可得一直线，其斜率为K o ，实际上[S]o －[S]t 也就是t 时产物[P]，故[P]和反应时间成正比，[P] = Ko t 。
一般情况下，产物和底物的变化量是一致的，但测定产物的生成要比测定底物的减少为好，因产物是从无到有，只要测定方法足够灵敏，准确度很高。
二、酶活性单位
酶活性大小通常以单位来表示，单位是一个人为规定的标准，是指在规定条件下，使酶反应达到某一速度所需要的酶量，酶单位有三种表示方式。
1. 惯用单位 60年代前，各种酶活力的表示法和酶单位定义没有统一标准，一般由方法的设计者自行规定在某一特定条件下生成一定量的产物为一个单位。
这样，同一种酶由于测定方法不同，可有不同单位定义，如ALT 的比色测定法有金氏法、穆氏法、赖氏法，三种方法原理相同，但单位是定义不同，正常参考范围也不同。
King 法：每100ml 血清在37℃与底物作用60mim ，每生成1μmol 丙酮酸为一个酶活性单位。
Mohum 法：1ml 血清37℃与底物作用60mim 每产生5μg 丙酮酸为一个酶活性单位。
Reitmen 法：套用Karman 单位，在规定条件下（血清1ml ，反应液总量3ml ，25℃，作用1min ，内径1cm 比色杯）测定340nm 波长处，吸光度减少值，每减少0.001为一个酶活性单位。
2. 国际单位 1961年国际生化学会酶学委员会建议使用统一的国际单位（IU ）是指在规定条件下（如25℃，最适pH ，最适[S]时）每分钟催化1μmol 底物发生反应的酶量。
1965年改为30℃，1972年取消时温度的规定。
缺点：1）由惯用单位换算成IU 较麻烦
2）对分子量不明的底物无法计算其摩尔浓度。
3）同一种酶用不同的测定方法，换算成国际单位后仍不相同。
3. Katal单位 1972年国际酶学委员会又提出的一种新单位，是指在最适条件下，每秒钟催化1mol 底物发生变化的酶量。
1 Kat=60×106IU
1 nKat=0.06IU
1 IU=16.67nKat
三、酶活性单位的计算
酶活性单位的计算，实际上就是计算单位时间内底物或产物的变化量。计算方式
酶单位/升=产物生成量每一单位规定的保温时间1000（ml ）⨯⨯每一单位规定的产物生成量实际保温时间实际样品用量（ml ）如：血清淀粉酶测定（碘比色法）缓冲淀粉液，0.4g/L,用量1.0ml ，血清0.02ml 。
单位定义100ml 血清37℃，作用15mim 每水解5mg 淀粉为一个淀粉酶单位。 淀粉酶单位/升=A 对照-A 测定
A 对照⨯0. 4151000⨯⨯ 5. 07. 50. 02
如：已知产物或底物的吸光系数，可用下式计算：
终点法：
每单位规定保温时间V t 106
酶单位/升=（A 测定－A对照）⨯⨯⨯ 实际保温时间V s ε⋅L
速率法：
V R 106
IU /L =∆A /min ⨯⨯ V S ε⋅L
如ALT 测定速度法，NADH 在340nm 的摩尔吸光系数为6300，反应液（工作液）1.0ml ，血清0.1ml ，光径1cm 。
0. 1106
ALT (IU /L ) =∆A /min ⨯⨯=∆A /min ⨯1746 1. 16300⨯1
四、酶促反应底物动力学
（一）米—曼方程
酶的活性除了受温度pH ，抑制剂，激活剂等因素的影响外，还受底物浓度的影响，1913年Michaelis-Menten 根据酶作用的中间产物学说，定量地分析了酶反应速度与底物浓度的关系，其数学表达式为：
ν=V max[S ] Km +[S ]
Km 是3个速度常数的复合函数，在数值上相当于反应速度为最大速度一半时的底物浓度。
当ν=V max V max[S ]1 Km=[S] =V max 2Km +[S ]2
Km 可表示酶与底物的亲和力，Km 越大，表示E 与S 的亲和力越小反应，Km 越小表示酶与S 的亲和力越大。
Km 是酶的特征性常数之一，只与酶的结构底物性质以及反应条件（如温度、PH 、离子强度）有关，而与酶的浓度无关，各种酶的Km 一般在10－6～10－2mol/L之间
（二）Km 的应用
1. 计算不同[S]时v 为Vmax 的百分率，如[S]=10 Km时
V max ⋅10Km 10Km ν==·V max =0. 91V max Km +10Km 11Km
2. 确定酶反应中的底物浓度 为了使酶反应的速度接近Vmax 一般要求
[S] =10～20Km ，此时v =91％～95％Vmax
3. 作为鉴别酶的依据 如两种酶对同一底物（相同条件下）表现有相同的Km ，则这两种酶为同一种酶，否则为两种不同的酶。
4. 确定酶的天然底物 有些酶可有多种底物，其中Km 最小的底物是该酶的最适（天然）底物。
5. 判断酶的激活剂或抑制剂 凡能降低Km 的物质为激活剂，凡能增大Km 的物质为酶抑制剂。
6. 鉴别酶的抑制类型 根据抑制剂以对Km 和Vm 的不同影响，可区分抑
制类型
Vm
Km 竞争性抑制 不变 增大 反竞争性抑制 降低 减少 非竞争性抑制 降低 不变
（三）Vm 的意义和应用
Vm 是指酶完全被底物饱和时的反应速度，在[E]不变时，对于特定的S 、Vm 也是一个常数。
如果已知酶的总浓度，则可从Vm 来计算酶的转换率，转换率可代表酶的催化效率，指单位时间内每分子酶所能催化反应的次数。大多数酶的转换率为1-104秒1 －
（四）Km 和Vm 的测定
将[S]对v 作图不能求得Km 和Vm ，这是因为Vm 是一个渐近的极限值，不可能从实验中直接得到，由于Km 是v 为Vm 一半时的[S]，所以也不能得到Km ，一般都是将米一曼公式转变成直接方程，然后根据直线方程斜率用外推法求得Km 和Vm 。
第二节 酶活性的测定方法及酶学分析的类型
一、酶活性的测定方法
酶活性测定不论采用何种方法，都必须符合两个原则。
1. 在零级反应期测定 v = Vmax = 常数，即－[S]或[P]与反应时间成正比。保持过量底物。
2. 反应速度与酶量成线性关系。 [E ]=K
根据酶的时间，酶活性测定主要分两种类型。
（一）固定时间法
测定酶反应开始后某一段时间内(从t 1→t 2) 产物或底物的总变化量称为终点法。因t 1和t 2是反应历程中的两个点，故又称
两点法。
优点：简便，测定产物时，酶反应被终止，
显色剂的选择论考虑对酶活性的影响，分光光
度计不需保温装置。
缺点：无法了解这段时间的反应是否都是
零级反应，故难以保证结果的真实性。
（二）连续监测法
每隔一定时间（10～60s ）连续测定酶反应中
-[S ][P ] =K t t
某一产物或底物的变化量称为连续监测法，定两个时间点，该法进行多点连续测定。
省试剂。
S 则必须考虑它们对待测酶活性是否有影响。
二、工具酶
在酶学分析中，是以酶作为工具来进行分析的方法，酶学分析主要包括两个方面的内容。
借助酶来测定某些化合物 如测定体液中G 、TG 、Ch 等
酶学分析
借助酶来测定另一种酶活性 实际是用酶来测定待测酶的产物，如
ALP 、AST 、CK 、GGT 等
酶学分析特点：高效、专一性高、温和、灵敏、线性范围宽。
（一）工具酶的概念
作为试剂用于测定待测物浓度或待测酶活性的酶称为工具酶。
如： G +O 2+H 2O −GOD −−→葡萄糖酸+H 2O 2
H 2O 2+4-AAP +酚−−−→红色醌类化合物POD 缺点：分光光计必须有保温装置，而且P
常用品工具酶主要是氧化还原酶类，部分转移酶类和水解酶类。
（二）工具酶的质量要求
工具酶的用量一般较多，故要求工具酶来源广泛，价廉易得，纯度要求不太高，可降低制备成本，但对工具酶中的杂质也要有一定的限制，以保证工具酶有一定的比活性，减少或避免一些能干扰测定的副反应。
（三）固相酶
1. 固相酶的概念和特点 固相酶是水溶性的酶通过物理或化学方法，使其吸附、包埋或共价结合在固相载体上，成为不溶于水但仍保留酶活性的酶衍生物。
固相酶作为一种酶试剂，不仅具备有酶的高度专一性和高敏性，与水溶性酶相比，还具有以下特点。
1）可反复使用，降低成本。
2）稳定性好，能在较广的pH 范围和较高的温度下发挥作用。
3）抗干扰性强，对激活剂，抑制剂敏感性小。
4）机械强度大，不受搅拌，冲洗的影响。
2. 固相化方法
1） 吸附法 通过非共价健吸附到隋性载体上，如玻璃、石英、硅胶，氧化铝和离子交换树脂，方法简便，条件温和，易脱落，稳定性较差。
2）包埋法 将酶包埋在凝胶中（如淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶）酶通过凝胶的微孔发挥作用，简便，条件温和，不牢固。
3）共价结合法 酶通过交联剂与固相载体进行共价结合，常用的载体有葡聚糖，琼脂糖和纤维素衍生物，共价结合操作复杂，但结合牢固，稳定性好。
3. 固相酶在生检验中的应用 主要是两个方面。
1） 酶感应器 是将酶固相化在传感器上构成的一种生物传感器，如酶电极。
2）酶检测器 由固相酶装置（酶柱、酶管、酶膜）和检测器（可见紫外分光光度法、荧光法等），样品通过固相酶装置，经酶作用后流出液即可被自动检测。
三、酶偶联测定法
酶活性测定可采用直接测定法或酶偶联测定法。对于底物或产物可直接测定的酶促反应，可直接测定底物的减少量或产物的生成量测定酶活性。对于底物或产物不能直接测定的酶促反应，可用酶偶联法测定。例如：
Ex Ea Ei A −−→B −−→C −−→P
Ex 为待测酶，Ea 、Ei 为工具酶。按工具酶作用的不同，Ea 称辅助酶，Ei 称指示酶。C ——→P 称为指示反应。
如：C -P +ADP −−→C +ATP CK 为待测酶
HK ATP +G −−→G -6-P +ADP HK 为辅助酶 CK
6PD G -6-P +NADP +−G −−→6-磷酸葡萄糖酸+NADH G6PD 为指示酶
（三）常用工具酶及其指示反应。
1. NAD(P)+或NAD （P ）H 偶联的脱氢酶及指示反应 最常用的工具酶有LDH 、MDH 、GLDH 、G6PDH ，它们都以NAD(P)+或NAD （P ）H 为辅酶。NADH 和NADPH 在340nm 有光吸收特性，可用紫外分光光度计直接测定，另外，NAD(P)H还有强烈荧光，其激发光波长为365nm ，荧光波长为460nm ，荧光法的灵敏度比分光光度法高。
如：ALT 测定 工具酶是LDH
Ala +α-KG −ALT −−→Pyr +Glu
Pyr +NADH −−−→Lac +NAD LDH +
主要缺点：1）需要紫外分光光度计；
2）需高纯度的酶和辅酶
3）灵敏度较低 NADH+在340nm ，ε为6300L ·mol 1cm －－1
改进方法，在脱氢酶后再偶联一个心肌黄酶，用四氮唑衍生物作为受氢体，生成紫外的甲 化合物。
NADH ＋ H + ＋ 心肌黄酶-FAD ————→NAD + ＋ 心肌黄酶-FADH 2 心肌黄酶-FADH 2 + INT————→心肌黄酶 + 甲臢
INT 生成的甲 最大吸收峰492nm ，ε19400L ·mol －1cm －1约为NADH 在340nm
吸光系数的3倍。
2. 偶联H 2O 2的工具酶及指示反应 GOD 、尿酸酶、GlyOD 、ChOD 等工具酶可分别作用于G 、UA 、GLy 、Ch 使其氧化产生H 2O 2，H 2O 2在POD 的作用下，使无色的色原氧化成有色的色素。
常用的单一色原有：联苯胺、邻联甲苯胺、邻联茴香胺，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺，有致癌作用，现已不用。
成对色原有：4-氨基安替比林和酚，是Trinder 1969年提出的故称为Trinder 反应，是目前最常用的指示反应。
H 2O 2+4-AAP +酚−POD −−→红色亚胺醌
其吸收峰为500nm ，ε13000L ·mol －1cm －1
优点：呈色稳定，线性范围宽，应用广。缺点：易受VitC 、胆红素、尿酸等还原性物干扰，这些物质能还原H 2O 2，使结果偏低。
二、酶学分析类型
四、底物浓度测定
1. 终点法 将待测底物和工具酶保温一定时间后，待测物全部转变为可直接检测的化合物，从而计算待测物浓度。
尿素+H 2O −脲酶−−→2NH 3+CO 2
产生的NH 3与尿素的浓度成正比。
由于体液中待测物浓度不高，一般在工具酶Km 附近，为了缩短反应时间，实现底物完全转变，可在反应体系中加入“陷阱试剂”使之与反应产物结合，减少逆反应。
2. 速率法 这种方法不要求将待测物全部转变为可检测的产物，而是利用工具酶的反应速度来测定待测物的浓度。
速率法较终止法简便、省时、干扰少，可测定低浓度物质，需自动分析仪。
第三节 同工酶测定
一、同工酶的概念
1971年国际生化学会（IUB ）提出同工酶是指同一种属中由不同基因位点或
等位基因编码的多肽链单体，纯聚体或杂交体，其理化及生物学性质不同，而能催化相同反应的酶。
同工酶的分布除了具有组织器官特异性外，在同一细胞的不同细胞器中也有不同的分布，这对于提高疾病的诊断有重要意义。
二、同工酶的测定方法
主要有5类方法
（一）电泳法
根据同工酶分子大小及等电点的不同，利用蛋白质电泳方法分离同工酶，再经特殊染色，在支持介质上呈现出同工酶谱。常用支持合质有醋纤膜、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶。
如琼脂糖凝胶电泳可将ALP 分为6个区带
ALP 1
肝胆疾病 ALP 2 肝 ALP 3 骨骼 ALP 4 胎盘 ALP 5 小肠 ALP 6 活动性溃疡结肠炎
评价：区带电泳具有简便有效，价廉，不需特殊设备，可广泛用于多种同工酶的分离和鉴定。
（二）层析法 主要有两种
1. 离子交换层析 利用同工酶表面电荷的不同，与离子交换树脂结合后，可用不同浓度或不同pH 的缓冲液进行分段洗脱。
如用DEAE-葡萄糖A50分离CK ，样品上柱后，用
0.05mol/L pH8.0 Tris缓冲液洗脱杂蛋白
0.1mol/L NaCl 洗脱负电荷最少的CK-MM
0.2mol/L NaCl 洗脱 CK-BM
0.5mol/L NaCl 洗脱负电荷最多的CK-BB
2. 亲和层析法 利用多基因位点的同工酶具有不同免疫学特性和不同底物专一性，将特异性配体（如抗体）用固相化技术结合在葡聚萄糖或琼脂糖凝胶上，样品通过层析柱时，凝胶就能选择性结合某一同工酶，而让其他同工酶通过，然后用洗脱剂洗脱。
评价：可用于同工酶的提纯制备，但费时。
（三）免疫化学法
利用同工酶的抗原性不同进行分离，主要适用于多基因位点的同工酶。
1. 免疫抑制法 利用同工酶的某一亚基与相应抗体结合后，酶活性受抑制，而不含这种亚基的同工酶不受影响，故测定加与不加抗体样品中酶活性的差别，可推算出该型同工酶的活性，如在CK 同工酶中加入足量的CK-MM 抗体，则：
CK-MM 活性全部被抑制
CK-MB 活性抑制50％
CK-BB 活性不受影响
2. 免疫沉淀法 在含有A 、B 两型同工酶的混合样品中，加入A （或B ）的抗体，使A （或B ）沉淀，离心后测定上清液中酶活性，可代表B （或A ）的酶活性，用加入抗体前测得的总活性减去上清液酶活性，即得出被沉淀酶活性。
3. 免疫测定酶蛋白法 酶是蛋白类抗原，可用各种免疫定量法来测定，如免疫扩散法，对流免疫电泳法、火箭电泳法、放射免疫法（RIA ）、酶免疫法（EIA ），其中后两者灵敏度可达10－9～10－12g 水平。
评价：RIA 、EIA 是目前测定同工酶最可靠、灵敏和特异的方法，但方法较复杂，前者有放射性污染。
（四）动力学法
1. 利用同工酶对底物专一性不同进行分离
如A 型醛缩酶（ALD-A ）对FDP 和F-1-P 的活性比值为50，而B 型醛缩酶（ALD-B ）对FDP 和F-1-P 的活性比值为1。根据此样品对FDP 和F-1-P 的活性比值，可大致反映其ALD-A 和ALD-B 的比例。
2. 利用同工酶有不同的最适pH 和不同底物的Km 进行分离，如AST 的最适pH 为7.4，当pH 为6.5时，胞浆AST （S-AST ）活性明显下降，而线性体AST （m-AST ）仍可保持，为一方面，m-AST 对L-Asp 的Km 为0.7mmol/L，远小于S-AST 的Km5.07mmol/L，因此在pH6.5，L-Asp 浓度为5mmol/L，测定的是m-AST 活性，而在pH7.4，L-Asp 浓度为200mmol/L，测定的是AST 总活性。
评价：简便、快速，不需特殊设备，也不需分离同工酶就可测定，但准确性较差。
（五）酶失活法
利用各型同工酶对热稳定性不同而设计的方法，如ALP 同工酶的热稳定性依次为：
ALP 4＞ALP 2＞ALP 5＞ALP 3
当血清在60℃加热30min ，只有ALP 4保留其活性。
在56℃加热10min ，ALP 2失活95%以上，ALP 5失活大部分，而ALP 4
仅失活5％。
评价：最简单易行，不需任何外加试剂和特殊仪器，但准确性差，不能准确定量，只能大致估计。
三、同工酶测定的临床意义
同工酶谱的改变能较准确地反映病变的部位和损伤程度，对提高疾病的诊断、治疗以及预后分析有重要价值。
第四节 酶学分析在临床诊断上的应用
血浆、消化液、脑脊液、尿液、羊水中的酶类统称为体液酶。其中血浆酶的
测定是临床生化检验的重要组成部分。
一、血清酶的来源与含量
（一）血浆特异酶（血浆功能性酶）
在血浆中发挥特异催化作用的酶称为血浆特异酶，如参与溶血、纤溶过程的有关酶，拟胆碱脂酶、铜蓝蛋白（CER ）、卵磷脂胆固醇脂酰转移酶（LCAT ）、脂蛋白脂肪酶（LPL ）、肾素等，除LPL 来自组织毛细血管内皮细胞，肾素来自肾小球旁器外，其余部分来自肝。
（二）外分泌酶
来源于外分泌腺，如唾液淀粉酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。由外分泌腺分泌至消化道，参与食物消化过程，正常血液含量极少。
（三）细胞酶
存在于组织细胞内参与物质代谢的酶，当细胞更新时释放入血液，在血浆中无重要催化作用，主要用于诊断，了解一些组织细胞的结构及功能状态。
主要血清酶的正常参考值（成人）
酶
乳酸脱氢酶（LDH ）
异柠檬酸脱氢酶（ICDH ）
γ-谷氨酰转肽酶（GGT ）
天冬氨酸氨基转移酶
（AST ）
丙氨酸氨基转移酶（ALT ）
肌酸激酶（CK ）
碱性磷酸酶（ALP ）
酸性磷酸酶（ACP ）
5′-核苷酸酶（5′-NT ）
α-淀粉酶（ASM ）
脂肪酶
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
（OCT ）
二、酶水平的组织专一性
血清中的酶种类很多，但并非所有的酶都能用于诊断，因很多酶可来自机体各组织细胞，无组织专一性，只有少数酶来自一种组织或少数几种组织，它们的活性测定可比较特异地反映相关组织细胞的病理过程，具有临床诊断价值。 方法 顺向比色法 逆向比色法 连续监测法 γ-谷氨酰-α-萘胺重氮比色法 γ-谷氨酰对硝基苯胺法 酶联连续监测法 赖氏法 酶联连续监测法 赖氏法 无机磷比色法 肌酸比色法 β-甘油磷酸法 磷酸苯二钠法 β-甘油磷酸法 磷酸苯二钠法 无机磷比色法 碘比色法 脂肪酸滴定法 瓜氨酸比色法 正常参考值（U ） 225～540 200～380 2～13 ＜40 男：37.3±48.6 女：15±17.7 8～35 8～28 8～57 5～25 0～40 0～3.2 2.5～6.5 3～13 0～1.1 0～4 2～15 42～215 ＜15 8～12mU
高度特异性的有：鸟氨酸氨基甲酰转移酶（OCT 肝）、山梨醇脱氢酶（SDH 肝）、醇脱氢酸（ADH 肝）、5′-核苷酸酶（5′-NT 肝、胆），谷氨酸脱氢酶（GLDH 肝）、淀粉酶（AMS 胰、唾液腺）、精氨酸酶（肝）、丙氨酸氨基转移酶（ALT 、肝、肾、心）。
中度特异性的有：肌酸激酶（CK 骨骼肌、心脑）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT 或GGT 、肝、胆、肾、小肠）。
低度特异性的有：乳酸脱氢酶（LDH 心、肾、骨骼肌、肝、肺）、碱性磷酸酶（ALP 、小肠、胎盘、肝、肾）。
三、血清酶在测定在临床诊断中的应用
（一）在诊断肝胆疾病中的应用
肝脏是物质代谢的中枢，酶类极丰富，当肝细胞损伤时，细胞内酶大量释放入血，或合成的酶减少，导致血清酶含量变化，因此，临床上应用肝组织专一性或相对专一性作为判断肝细胞损伤指标。
反映肝细胞结构与功能的ALT 、AST 、ADH 、ICDH 、GLDH 、OCT 的上升、ChE 、LCAT 下降。
反映胆道疾病（胆道阻塞）的ALP 、γ-GT 、5′-NT 上升。
判断肝纤维化程度的 MAO 上升
（二）在诊断心肌梗死中的应用
主要有AST 、LDH 1、CK-2或CK-MB ，AST 分布较广，但心肌含量最多（156000u/g湿组织），LDH 属低特异性酶类LDH 1在心肌中含量高（占LDH 总活性35%～70%），正常血清LDH 2＞LDH 1，心肌梗死，CK-2在血清活性可增高10～25倍，阳性率100%，CK-2是诊断心肌梗死的最佳指标。
（三）在诊断胰腺疾病中的应用
主要有α-AMS 、脂肪酶均来自胰腺泡分泌，急性胰腺炎、血清α-AMS ，2-12h 开始上升，12～72h 达高峰，4d 左右恢复正常，尿α-AMS 阳性率高于血清，特续时间长，脂肪酶在胰腺炎时与淀粉酶平行，但其他急腹症时该酶活性不升高，故特异性较高，但尿中检测不出脂肪酶。
（四）在诊断骨骼与骨骼肌疾病中的应用
主要是ALP ，各种骨疾病中血清ALP 均上升，特别是成骨肉瘤及' 畸形骨炎，可分别增至正常45倍与30倍，恶性肿瘤骨转移，骨质软化症，佝偻病等ALP 均上升。
骨骼肌疾病CK 、ALD （醛缩酶）、AST 、LDH ↑.
（五）在诊断前列腺疾病中的应用
主要是ACP ，成年男性，血清ACP 有1/3～1/2来自前列腺，特别是前列腺Ca 的诊断。
第五节 影响酶活性测定的因素
一、样品处理的影响
1. 溶血 RBC 中某些酶活性比血清高，如LDH 高150倍，AST 高15倍，ALT 高7.5倍。
2. 抗凝剂 某些酶可被抗凝剂抑制，如EDTA 、草酸盐，可抑制需Ca 2+的AMS 和需Mg 2+的CK 、5′-NT 、ALP 等，故酶活性测定都用血清。
3. 样品存放时间 各种血清酶稳定性不同，如ACP 、CK 在室温下迅速失活，AMS 、GGT 则很稳定。
二、测定条件的影响
1. 温度 温度对酶活性的影响包括两个方面，一方面是温度升高，反应速度加快，同一般化学反应，其关系符合Arrhenius 公式
E -K =Ae RT
另外一方面温度升高，会发生热变性，使酶活性降低。
1）温度的选择 37℃反应速度快，单位时间反应物质变化量大，测定灵敏度增加，保温时间短，25℃、30℃可使单位时间的散热较少，温度便于恒定，很多实验数据的物理化学校准是在30℃进行，IFCC 建议30℃作为参考方法的标准温度。
2）温度系数 将温度每升高10℃后反应速度相当于原来的倍数，称为温度系数（Q 10）,Q 10大表示温度对v 影响大。
2. pH
1）改变底物的解离状态，影响酶与底物结合
2）改变酶活性中心必需基团的解离状态，影响酶活性。
3）改变酶的三维空间构象，使酶变性。
4）使亚基解聚
3. 缓冲液性质 酶活性不仅受缓冲液pH 影响，也受缓冲液性质的影响，选择缓冲液应考虑的因素。
1）缓冲液中弱酸的解离数Pka 必须接近酶测定时的pH ，如ALT 测定7.4（磷酸K 2 6.7）LDH 测定8.8，（二乙醇胺8.8）ALP 测定10（碳酸K 2 10.32）
2）缓冲液对酶活性无抑制作用，如甘氨酸对LDH 、ALP 有抑制作用。
3）缓冲液在酶反应体系中不会发生降解或破坏
4）缓冲液在可见光区或紫外光区没有或仅有极低光吸收现象。