第10卷 第2期
2001年 6月
河南医学研究
HENAN MEDICAL RESEARCH
Vol.10 No.2June 2001
文章编号:10042437X(2001)0220112204
口腔粘膜上皮细胞体外培养的研究
邱长虹1,翟弘峰2,李森恺2
(11郑州市第一人民医院烧伤科 河南郑州 450004;21中国协和医科大学中国医学科学院整形外科医院 北京 100041)
摘要:目的:探索口腔粘膜上皮细胞体外培养的技术和方法,为进一步采用组织工程技术构建口腔粘膜组织奠定基础,同时可为口腔粘膜的生理、药理、毒理学及微生态研究提供实验模型。方法:取刚离乳的雄性新西兰幼兔口腔粘膜组织小块,酶消化成单细胞悬液,接种后静置培养,定期换液、传代。以相差显微镜每日动态观察细胞形态变化及生长增殖情况,细胞进行常规组化染色、免疫组化染色及流式细胞仪检查,并以电镜观察其超微结构。结果:整个上皮细胞生长期内无成纤维细胞混杂生长,均为单一的上皮细胞,并证实为二倍体细胞。细胞可传
11213代,成活50～60天。结论:新西兰幼兔口腔粘膜上皮细胞可在体外进行培养,在一定时间内保持增殖能力。
这不仅为组织工程化口腔粘膜构建奠定了基础,而且为口腔粘膜的体外研究提供了实验模型。关键词:口腔上皮细胞;饲细胞;细胞培养中图分类号:R622+.9 文献标识码:A
对于因肿瘤切除、车祸、创伤等原因所致口腔粘膜大面积缺损,临床上常以皮片移植或皮瓣转移修复,但皮片移植常因挛缩导致口腔狭窄、影响功能,局部皮瓣转移则常致局部臃肿,形态不佳,患者难以接受。而且,自体组织移植是以牺牲正常组织为代价的“以创伤修复损伤”的治疗模式,既增加了新的创伤,又增加了手术并发症的机率,且自体组织来源有限,限制了其临床应用。组织工程学是一门新兴的学科,它应用细胞生物学和工程学的原理,研究和开发能修复损伤组织和改善其功能的生物替代物,通过少量组织细胞体外培养扩增后构建具有生命力的活体组织,达到修复组织缺损的目的。本实验研究、探讨新西兰幼兔口腔粘膜上皮细胞的体外培养技术和方法,为进一步采用组织工程技术构建口腔粘膜组织奠定基础,同时可为口腔粘膜的生理、药理、毒理学及微生态研究提供实验模型。
1 材料与方法
111 新西兰幼兔口腔粘膜上皮细胞的原代培养 取
刚离乳的雄性新西兰幼兔,体重013kg,肌注复方氯胺酮0115mg全麻。术区酒精消毒三遍,牵开并充分暴露口腔,以眼科剪刀剪取颊部014cm×0.3cm大小菲
收稿日期:2000212206;修订日期:2001203207
作者简介:邱长虹(1966-),女,河南滑县人,医学学士,主治医师,从事上皮细胞培养的研究。
薄粘膜组织块。标本放入加青、链霉素、氟康唑的D2
Hanks液中,并以该液漂洗5～6次。加入214U/ml的DispaseⅡ消化液(德国GmbH公司),4℃消化16～18小时后取出粘膜块,用眼科镊将表层上皮与上皮下层分开,弃去上皮下层。用D2Hanks液冲洗上皮层,加入混合消化液中(01125%胰蛋白酶:0102%EDTA=1∶1),37℃振荡消化15分钟,加胎牛血清终止消化,用吸管吹打成单细胞悬液。D2Hanks液洗涤两次,弃上清,加入培养液(DMEM:F12=3∶1,加10%胎牛血清),以差速贴壁法排除成纤维细胞,台盼蓝染色,血球计数板计数活细胞。细胞悬液接种密度为215×104个细胞/cm2,接种于预涂胶原的24孔培养板中(美国Corning公司),置34℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱(美国Queue公司)中静置培养。第5天首次换液,以后每3天换液一次。112 新西兰幼兔口腔粘膜上皮细胞的传代培养 细胞生长、增殖至80%～90%融合时传代。吸去培养液,D2Hanks液冲洗2～3次,加入混合消化液,37℃消化3～5分钟,相差显微镜下见胞质回缩,细胞间隙增大后,加胎牛血清终止消化,D2Hanks液冲洗2～3次,加入培养液,反复吹打,使成单细胞悬液。计数后以1∶3或1∶4接种于新的培养板内。113 细胞形态学观察11311 相差显微镜(日本Nikon公司):每日动态观察细胞形态变化及生长、增殖状况。11312 光学显微镜(日本Olympus公司):将细胞接种于预涂胶原的盖玻片上,培养4～7天后,以pH7.4PBS
第2期口腔粘膜上皮细胞体外培养的研究・113・
液冲洗,95%酒精固定15min,HE染色,封片,光镜下
观察。
114 细胞超微结构观察 取生长有上皮细胞的盖玻
片,分别经3%戊二醛磷酸缓冲液、1%锇酸固定,脱水,干燥,喷金,进行Hitachi2300扫描电镜观察。另将生长成片的细胞从培养皿中刮下,戊二醛、锇酸固定,脱水,包埋,超薄切片,进行JEM21200EX透射电镜观察。
115 免疫组化染色 取生长有上皮细胞的盖玻片,PBS液漂洗,95%丙酮固定10～30min,采用广谱单克隆角蛋白抗体及SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德
生物工程有限公司),按试剂盒说明书进行免疫组化染色。分别设立实验组、阳性对照组(正常口腔粘膜组织石蜡切片)及阴性对照组(成纤维细胞铺片)。
2 结果
211 细胞生长特性的观察结果 相差显微镜下观察,
整个上皮细胞生长期间无成纤维细胞混杂生长,均为单一的上皮细胞。细胞可传11～13代,成活50～60天。21111 原代:细胞贴壁前为体积较小的圆形、类圆形细胞,胞浆均匀、透亮,轮廓清晰光滑,倒置相差显微镜下有立体感。
接种后12h,部分细胞下沉贴附于培养孔底,24～96h细胞继续贴壁,数量逐渐增多。细胞为折光性强的圆形细胞。随后细胞逐渐伸展,胞质逐渐展开,细胞扁平变大,折光性减低,整个细胞变暗,细胞核清晰可见,位于胞质中央。完全伸展的细胞呈扁平的卵圆形,胞核清晰。细胞大小是伸展前的2～3倍。此阶段细胞增殖不明显,核分裂相少见。接种5天后细胞加速增殖,核分裂相多见,细胞数量明显增多,开始进入指数生长期。上皮细胞逐渐生长融合成片,如铺路石状,细胞大小均一。原代培养10天左右细胞融合见图1、图2
。
图1 新西兰幼兔口腔粘膜上皮细胞原代培养4天 10×
10
图2 新西兰幼兔口腔粘膜上皮细胞原代培养10天 10×10
21112 传代:每代细胞生长至80%左右融合时传代。
传代细胞24小时左右即可贴壁伸展。第2～8代细胞形态良好,与原代无明显区别。自第9代起,细胞增长减慢,形态变化尚不明显。到第11～13代,细胞界限模糊,胞核散大,胞内出现小空泡及黑色小颗粒,细胞增殖进一步减缓,甚至生长停滞。细胞逐渐变老枯萎,最后从培养板底脱落、死亡。21113 分化:在培养过程中,细胞还表现出一定的分化现象。上皮细胞克隆在向外扩张的同时,从克隆中心开始出现分化,细胞表现为复层,出现时间约为接种培养后10～12天。克隆表层细胞连接紧密,细胞界限不清,开始时胞核清晰,随着分层的增加,相差显微镜下难以分辨单个细胞结构,克隆最外层仍为有增殖能力的单层细胞。21114 光镜观察结果:HE染色可见细胞为类圆形,胞核蓝染,胞浆粉红。细胞连接成片,呈铺路石状,可见各期核分裂相。212 细胞鉴定21211 形态学观察:生长良好的细胞为类圆形,细胞连接成片呈铺路石状。胞核较大,无异常核分裂相。21212 超微结构观察:透射电镜下,上皮细胞核大呈圆形或卵圆形,胞质内可见正常细胞器,胞浆内含大量的张力纤维,呈网状或束状排列,细胞表面有许多微绒毛,细胞之间有丰富的桥粒结构,可见张力丝进入桥粒的附着斑中,见图3。
扫描电镜下可见上皮细胞多呈镶嵌状排列,表面可见微绒毛和脊样胞浆皱褶,见图4。21213 免疫组化染色。
实验组:角蛋白染色阳性,胞浆染成黄色,染色均匀,高倍镜下呈细丝网状,苏木素衬染的核呈蓝色。
阳性对照组:新西兰幼兔正常口腔粘膜组织石蜡
・114・
河南医学研究
第10卷
切片上皮全层角蛋白染色阳性,胞浆染成黄棕色,从基底层到角化层染色逐渐增强。
阴性对照组:成纤维细胞角蛋白染色阴性
。
图3 体外培养新西兰幼兔口腔粘膜上皮传代细胞透射电镜检查,示桥
粒结构 ×10.
0K
图4 胶原/壳聚糖基材上体外培养新西兰幼兔口腔粘膜上皮传代细胞
扫描电镜形貌 ×3.5K
21214 流式细胞仪检查:培养的口腔粘膜上皮细胞100%为二倍体细胞,G2/G1:2100,DipS:13.82%,Dip%CV:12.78。
3 讨论
角化细胞是一种需要复杂营养的、在一般合成培养基中不易生长的细胞。国外文献报导体外培养口腔粘膜上皮细胞寿命较短,一般细胞可传2～4代,最长传7～9代[1]。尽管如此,如何建立一个稳定的体外培养体系,仍是人们研究的热点。本实验报道了口腔粘膜上皮细胞体外培养方法和技术,为进一步的研究奠定了基础。311 培养方法 原代粘膜上皮细胞的获取,有组织块培养法及消化法两种。前者简单易行,成功率高[2,3]。但由于组织块的原代细胞培养时间较长,且并非每一组织块都有细胞萌出,细胞传代次数和最终获取的细胞较少,因此,本实验采用酶消化法进行培养。
Dispase是一种快速、有效、作用温和的分离上皮与真皮的酶。它是从多粘杆菌中提取的中性蛋白酶。在分离上皮时,Dispase作用于基底膜,选择性地分解纤维连接素和Ⅳ型胶原,而保存上皮细胞活力及细胞连接。与胰蛋白酶相比,Dispase只是将上皮分离而不分解单个角化细胞,可在保留上皮细胞活力与连接的同时将上皮层与上皮下层自基底膜处完全分离,从而可得到单一的上皮细胞。
由于上皮细胞间质少,适于用胰蛋白酶进行消化分离[2,3]。但由于胰蛋白酶对细胞损伤较大,故我们采用胰蛋白酶和EDTA按比例混合消化。312 培养体系31211 3T3细胞和L929细胞:据报道,国外培养角化细胞大多采用3T3细胞作为滋养层[4]。3T3细胞是鼠胚胎成纤维细胞。由于经酶消化获取的角化细胞贴壁生长困难,而3T3细胞可使角化细胞贴壁并抑制成纤维细胞生长,从而得到广泛应用。但3T3细胞来源少,价格昂贵。L929细胞为小鼠成纤维细胞株,本实验首次应用L929细胞作为饲细胞,不仅可以大大提高角化细胞贴壁率,而且可抑制成纤维细胞生长,从而使角化细胞纯化。31212 底物:为促进角化细胞贴壁,文献上报道了多种角化细胞培养方法:①在培养皿底部涂布培养基质,如各种胶原、纤维连接蛋白(fibronectin)及层粘连蛋白(laminin);②选择培养基中最佳的钙离子浓度;③采用无血清培养液并添加最佳组合的营养成分;④选用两种以上的上述方法[5]。本实验以鼠尾胶原作为底物,成功地进行了口腔粘膜上皮细胞的体外培养,认为关键在于获取的原代细胞本身的活力。
第2期口腔粘膜上皮细胞体外培养的研究・115・
31213 培养基:角化细胞需复杂营养,在培养体系中
需提供与之共同生长的成纤维细胞、较高的胎牛血清浓度、较高的种植密度、多种辅加成分或这些因素的共
同作用。血清除了提供细胞生长的营养成分外,还能促进细胞DNA合成,并含有细胞增殖所必需的生长因子[6]。本实验应用10%胎牛血清,并在培养液内加入EGF、胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松、霍乱毒素等。采用该培养液细胞生长良好,增殖较快,细胞可传11～13代。313 细胞鉴定 口腔粘膜上皮细胞为类圆形,大小均一,如铺路石状密集排列,细胞核大。电镜下可见细胞内有大量的张力原纤维束,细胞间的桥粒连接是上皮细胞的典型结构,丰富的绒毛膜表明细胞活力良好。
角蛋白是上皮细胞的主要结构蛋白和分化的标志产物,是上皮细胞特异性表达蛋白,应用免疫组化方法检测角蛋白抗体阳性即可鉴定为上皮细胞[2]。本实验
采用广谱单克隆角蛋白抗体免疫组化染色,实验组细胞染色阳性,可证实培养细胞为上皮细胞。
参考文献
[1] DeLucaM,AlbaneseE,MegnaM,etal.Evidencethathumanoralepithe2
liumreconstitutedinvitroandtransplantedontopatientswithdefectsintheoralmucosaretainspropertiesoftheoriginaldonorsite[J].Transplanta2tion,1990,50(3):4542459.
[2] 鄂征1组织培养和分子生物学技术[M].北京:北京出版社,
[1**********].
[3] 司徒镇强,吴军正1细胞学[M]1世界图书出版公司[1**********].[4] MacCallumDK,LillieJH,JepsenA,etal.Thecultureoforalepithelium
[J].IntRevCytol,1987,109(3):3132329.
[5] IzumiK,TakacsG,TerashiH,etal.Exvivodevelopmentofacomposite
humenoralmucosalequivalent[J].JOralMaxillofacSurg,1999,57(5):5712577.
[6] MasudaI.Aninvitrooralmucosalmodelreconstructedfromnormalgingi2
valcells[J].KokubyoGakkaiZasshi,1996,63(2):3342353.
Thestudyoforalepitheliumcultureinvitro
QIUChang2hong,ZHAIHong2feng,LISen2kai
(DepartmentofBurns,TheZhengzhouFirstPeople’sHospital,Zhengzhou450004,China)
Abstract:Objective:Inthisarticlewestudythetechniqueandmethodoforalepitheliumcultureinvitro,playingabasicroleinfurtherstudyinreconstructingatissueengineeringoralmucosaandprovidinganexperimentalmodelinphysiological,patho2logical,toxicologicalandmicrobiologicalstudyinoralmucosa.Methods:TakingabitoforalmucosafromayoungmaleNewZealandharewhohasjustbeenoutofmilk,wedigestitintosinglecellsuspensionwithenzyme.Beingseeded,thecellsareculturedmotionlessly.Themediumischangedregularlyandthecellsaresubcultured.Results:Theculturedcellsareallep2ithelialcellswithoutfibroblasts.Whatismore,theyareprovedtobediploidcells.Thecellscanbesubcultured11213genera2tions,surviving50260days.Conclusion:TheoralepitheliumofyoungNewZealandharecanbeculturedinvitro,maintainingtheabilitytoproliferateinacertaintime.Thestudynotonlysetsaroleinreconstructingatissueengineeringoralmucosa,butalsoprovidesanexperimentalmodelfortheresearchoforalmucosainvitro.Keywords:oralepithelium;seedcell;cellculture
肝功能异常者行腹部成像术确诊率高
美国研究者称,住院病人肝功异常者接受腹部横切面成像术扫描有很高的诊断价值,时常改变了该患者的原治疗方案
(ArchInternMed2001,161:583)。
查的效益。如果图像提供了新的诊断信息和(或)改变了原治疗者,定为有益。
结果显示,在6994例腹部成像中,由于肝功异常适应证而实施检查的有856例。检查报告中有临床意义的解释部分占
37%,包括27%的阳性(扫描结果异常并阐明肝功异常原因)结
研究者注意到,肝功试验异常的住院患者时常接受腹部横切面成像检查。然而,该检测法对患者的诊断价值如何尚不明确。
美国Brigham和妇女医院Rothschild医师等回顾了27个月间的腹部成像图,并将图像与肝功异常作对比;将图像编辑排序,从有阳性图像的病历中随机取样,进行分析,以确定成像检
果。最常见的阳性诊断是胆道阻塞(25%)、胆囊炎(21%)、恶性肿瘤(20%)及肝硬化(14%)。
阳性报告提供新临床诊断的占63%,从而改变治疗方案的占42%。
摘自《中国医学论坛报》2001年4月26日3版
第10卷 第2期
2001年 6月
河南医学研究
HENAN MEDICAL RESEARCH
Vol.10 No.2June 2001
文章编号:10042437X(2001)0220112204
口腔粘膜上皮细胞体外培养的研究
邱长虹1,翟弘峰2,李森恺2
(11郑州市第一人民医院烧伤科 河南郑州 450004;21中国协和医科大学中国医学科学院整形外科医院 北京 100041)
摘要:目的:探索口腔粘膜上皮细胞体外培养的技术和方法,为进一步采用组织工程技术构建口腔粘膜组织奠定基础,同时可为口腔粘膜的生理、药理、毒理学及微生态研究提供实验模型。方法:取刚离乳的雄性新西兰幼兔口腔粘膜组织小块,酶消化成单细胞悬液,接种后静置培养,定期换液、传代。以相差显微镜每日动态观察细胞形态变化及生长增殖情况,细胞进行常规组化染色、免疫组化染色及流式细胞仪检查,并以电镜观察其超微结构。结果:整个上皮细胞生长期内无成纤维细胞混杂生长,均为单一的上皮细胞,并证实为二倍体细胞。细胞可传
11213代,成活50～60天。结论:新西兰幼兔口腔粘膜上皮细胞可在体外进行培养,在一定时间内保持增殖能力。
这不仅为组织工程化口腔粘膜构建奠定了基础,而且为口腔粘膜的体外研究提供了实验模型。关键词:口腔上皮细胞;饲细胞;细胞培养中图分类号:R622+.9 文献标识码:A
对于因肿瘤切除、车祸、创伤等原因所致口腔粘膜大面积缺损,临床上常以皮片移植或皮瓣转移修复,但皮片移植常因挛缩导致口腔狭窄、影响功能,局部皮瓣转移则常致局部臃肿,形态不佳,患者难以接受。而且,自体组织移植是以牺牲正常组织为代价的“以创伤修复损伤”的治疗模式,既增加了新的创伤,又增加了手术并发症的机率,且自体组织来源有限,限制了其临床应用。组织工程学是一门新兴的学科,它应用细胞生物学和工程学的原理,研究和开发能修复损伤组织和改善其功能的生物替代物,通过少量组织细胞体外培养扩增后构建具有生命力的活体组织,达到修复组织缺损的目的。本实验研究、探讨新西兰幼兔口腔粘膜上皮细胞的体外培养技术和方法,为进一步采用组织工程技术构建口腔粘膜组织奠定基础,同时可为口腔粘膜的生理、药理、毒理学及微生态研究提供实验模型。
1 材料与方法
111 新西兰幼兔口腔粘膜上皮细胞的原代培养 取
刚离乳的雄性新西兰幼兔,体重013kg,肌注复方氯胺酮0115mg全麻。术区酒精消毒三遍,牵开并充分暴露口腔,以眼科剪刀剪取颊部014cm×0.3cm大小菲
收稿日期:2000212206;修订日期:2001203207
作者简介:邱长虹(1966-),女,河南滑县人,医学学士,主治医师,从事上皮细胞培养的研究。
薄粘膜组织块。标本放入加青、链霉素、氟康唑的D2
Hanks液中,并以该液漂洗5～6次。加入214U/ml的DispaseⅡ消化液(德国GmbH公司),4℃消化16～18小时后取出粘膜块,用眼科镊将表层上皮与上皮下层分开,弃去上皮下层。用D2Hanks液冲洗上皮层,加入混合消化液中(01125%胰蛋白酶:0102%EDTA=1∶1),37℃振荡消化15分钟,加胎牛血清终止消化,用吸管吹打成单细胞悬液。D2Hanks液洗涤两次,弃上清,加入培养液(DMEM:F12=3∶1,加10%胎牛血清),以差速贴壁法排除成纤维细胞,台盼蓝染色,血球计数板计数活细胞。细胞悬液接种密度为215×104个细胞/cm2,接种于预涂胶原的24孔培养板中(美国Corning公司),置34℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱(美国Queue公司)中静置培养。第5天首次换液,以后每3天换液一次。112 新西兰幼兔口腔粘膜上皮细胞的传代培养 细胞生长、增殖至80%～90%融合时传代。吸去培养液,D2Hanks液冲洗2～3次,加入混合消化液,37℃消化3～5分钟,相差显微镜下见胞质回缩,细胞间隙增大后,加胎牛血清终止消化,D2Hanks液冲洗2～3次,加入培养液,反复吹打,使成单细胞悬液。计数后以1∶3或1∶4接种于新的培养板内。113 细胞形态学观察11311 相差显微镜(日本Nikon公司):每日动态观察细胞形态变化及生长、增殖状况。11312 光学显微镜(日本Olympus公司):将细胞接种于预涂胶原的盖玻片上,培养4～7天后,以pH7.4PBS
第2期口腔粘膜上皮细胞体外培养的研究・113・
液冲洗,95%酒精固定15min,HE染色,封片,光镜下
观察。
114 细胞超微结构观察 取生长有上皮细胞的盖玻
片,分别经3%戊二醛磷酸缓冲液、1%锇酸固定,脱水,干燥,喷金,进行Hitachi2300扫描电镜观察。另将生长成片的细胞从培养皿中刮下,戊二醛、锇酸固定,脱水,包埋,超薄切片,进行JEM21200EX透射电镜观察。
115 免疫组化染色 取生长有上皮细胞的盖玻片,PBS液漂洗,95%丙酮固定10～30min,采用广谱单克隆角蛋白抗体及SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德
生物工程有限公司),按试剂盒说明书进行免疫组化染色。分别设立实验组、阳性对照组(正常口腔粘膜组织石蜡切片)及阴性对照组(成纤维细胞铺片)。
2 结果
211 细胞生长特性的观察结果 相差显微镜下观察,
整个上皮细胞生长期间无成纤维细胞混杂生长,均为单一的上皮细胞。细胞可传11～13代,成活50～60天。21111 原代:细胞贴壁前为体积较小的圆形、类圆形细胞,胞浆均匀、透亮,轮廓清晰光滑,倒置相差显微镜下有立体感。
接种后12h,部分细胞下沉贴附于培养孔底,24～96h细胞继续贴壁,数量逐渐增多。细胞为折光性强的圆形细胞。随后细胞逐渐伸展,胞质逐渐展开,细胞扁平变大,折光性减低,整个细胞变暗,细胞核清晰可见,位于胞质中央。完全伸展的细胞呈扁平的卵圆形,胞核清晰。细胞大小是伸展前的2～3倍。此阶段细胞增殖不明显,核分裂相少见。接种5天后细胞加速增殖,核分裂相多见,细胞数量明显增多,开始进入指数生长期。上皮细胞逐渐生长融合成片,如铺路石状,细胞大小均一。原代培养10天左右细胞融合见图1、图2
。
图1 新西兰幼兔口腔粘膜上皮细胞原代培养4天 10×
10
图2 新西兰幼兔口腔粘膜上皮细胞原代培养10天 10×10
21112 传代:每代细胞生长至80%左右融合时传代。
传代细胞24小时左右即可贴壁伸展。第2～8代细胞形态良好,与原代无明显区别。自第9代起,细胞增长减慢,形态变化尚不明显。到第11～13代,细胞界限模糊,胞核散大,胞内出现小空泡及黑色小颗粒,细胞增殖进一步减缓,甚至生长停滞。细胞逐渐变老枯萎,最后从培养板底脱落、死亡。21113 分化:在培养过程中,细胞还表现出一定的分化现象。上皮细胞克隆在向外扩张的同时,从克隆中心开始出现分化,细胞表现为复层,出现时间约为接种培养后10～12天。克隆表层细胞连接紧密,细胞界限不清,开始时胞核清晰,随着分层的增加,相差显微镜下难以分辨单个细胞结构,克隆最外层仍为有增殖能力的单层细胞。21114 光镜观察结果:HE染色可见细胞为类圆形,胞核蓝染,胞浆粉红。细胞连接成片,呈铺路石状,可见各期核分裂相。212 细胞鉴定21211 形态学观察:生长良好的细胞为类圆形,细胞连接成片呈铺路石状。胞核较大,无异常核分裂相。21212 超微结构观察:透射电镜下,上皮细胞核大呈圆形或卵圆形,胞质内可见正常细胞器,胞浆内含大量的张力纤维,呈网状或束状排列,细胞表面有许多微绒毛,细胞之间有丰富的桥粒结构,可见张力丝进入桥粒的附着斑中,见图3。
扫描电镜下可见上皮细胞多呈镶嵌状排列,表面可见微绒毛和脊样胞浆皱褶,见图4。21213 免疫组化染色。
实验组:角蛋白染色阳性,胞浆染成黄色,染色均匀,高倍镜下呈细丝网状,苏木素衬染的核呈蓝色。
阳性对照组:新西兰幼兔正常口腔粘膜组织石蜡
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河南医学研究
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切片上皮全层角蛋白染色阳性,胞浆染成黄棕色,从基底层到角化层染色逐渐增强。
阴性对照组:成纤维细胞角蛋白染色阴性
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图3 体外培养新西兰幼兔口腔粘膜上皮传代细胞透射电镜检查,示桥
粒结构 ×10.
0K
图4 胶原/壳聚糖基材上体外培养新西兰幼兔口腔粘膜上皮传代细胞
扫描电镜形貌 ×3.5K
21214 流式细胞仪检查:培养的口腔粘膜上皮细胞100%为二倍体细胞,G2/G1:2100,DipS:13.82%,Dip%CV:12.78。
3 讨论
角化细胞是一种需要复杂营养的、在一般合成培养基中不易生长的细胞。国外文献报导体外培养口腔粘膜上皮细胞寿命较短,一般细胞可传2～4代,最长传7～9代[1]。尽管如此,如何建立一个稳定的体外培养体系,仍是人们研究的热点。本实验报道了口腔粘膜上皮细胞体外培养方法和技术,为进一步的研究奠定了基础。311 培养方法 原代粘膜上皮细胞的获取,有组织块培养法及消化法两种。前者简单易行,成功率高[2,3]。但由于组织块的原代细胞培养时间较长,且并非每一组织块都有细胞萌出,细胞传代次数和最终获取的细胞较少,因此,本实验采用酶消化法进行培养。
Dispase是一种快速、有效、作用温和的分离上皮与真皮的酶。它是从多粘杆菌中提取的中性蛋白酶。在分离上皮时,Dispase作用于基底膜,选择性地分解纤维连接素和Ⅳ型胶原,而保存上皮细胞活力及细胞连接。与胰蛋白酶相比,Dispase只是将上皮分离而不分解单个角化细胞,可在保留上皮细胞活力与连接的同时将上皮层与上皮下层自基底膜处完全分离,从而可得到单一的上皮细胞。
由于上皮细胞间质少,适于用胰蛋白酶进行消化分离[2,3]。但由于胰蛋白酶对细胞损伤较大,故我们采用胰蛋白酶和EDTA按比例混合消化。312 培养体系31211 3T3细胞和L929细胞:据报道,国外培养角化细胞大多采用3T3细胞作为滋养层[4]。3T3细胞是鼠胚胎成纤维细胞。由于经酶消化获取的角化细胞贴壁生长困难,而3T3细胞可使角化细胞贴壁并抑制成纤维细胞生长,从而得到广泛应用。但3T3细胞来源少,价格昂贵。L929细胞为小鼠成纤维细胞株,本实验首次应用L929细胞作为饲细胞,不仅可以大大提高角化细胞贴壁率,而且可抑制成纤维细胞生长,从而使角化细胞纯化。31212 底物:为促进角化细胞贴壁,文献上报道了多种角化细胞培养方法:①在培养皿底部涂布培养基质,如各种胶原、纤维连接蛋白(fibronectin)及层粘连蛋白(laminin);②选择培养基中最佳的钙离子浓度;③采用无血清培养液并添加最佳组合的营养成分;④选用两种以上的上述方法[5]。本实验以鼠尾胶原作为底物,成功地进行了口腔粘膜上皮细胞的体外培养,认为关键在于获取的原代细胞本身的活力。
第2期口腔粘膜上皮细胞体外培养的研究・115・
31213 培养基:角化细胞需复杂营养,在培养体系中
需提供与之共同生长的成纤维细胞、较高的胎牛血清浓度、较高的种植密度、多种辅加成分或这些因素的共
同作用。血清除了提供细胞生长的营养成分外,还能促进细胞DNA合成,并含有细胞增殖所必需的生长因子[6]。本实验应用10%胎牛血清,并在培养液内加入EGF、胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松、霍乱毒素等。采用该培养液细胞生长良好,增殖较快,细胞可传11～13代。313 细胞鉴定 口腔粘膜上皮细胞为类圆形,大小均一,如铺路石状密集排列,细胞核大。电镜下可见细胞内有大量的张力原纤维束,细胞间的桥粒连接是上皮细胞的典型结构,丰富的绒毛膜表明细胞活力良好。
角蛋白是上皮细胞的主要结构蛋白和分化的标志产物,是上皮细胞特异性表达蛋白,应用免疫组化方法检测角蛋白抗体阳性即可鉴定为上皮细胞[2]。本实验
采用广谱单克隆角蛋白抗体免疫组化染色,实验组细胞染色阳性,可证实培养细胞为上皮细胞。
参考文献
[1] DeLucaM,AlbaneseE,MegnaM,etal.Evidencethathumanoralepithe2
liumreconstitutedinvitroandtransplantedontopatientswithdefectsintheoralmucosaretainspropertiesoftheoriginaldonorsite[J].Transplanta2tion,1990,50(3):4542459.
[2] 鄂征1组织培养和分子生物学技术[M].北京:北京出版社,
[1**********].
[3] 司徒镇强,吴军正1细胞学[M]1世界图书出版公司[1**********].[4] MacCallumDK,LillieJH,JepsenA,etal.Thecultureoforalepithelium
[J].IntRevCytol,1987,109(3):3132329.
[5] IzumiK,TakacsG,TerashiH,etal.Exvivodevelopmentofacomposite
humenoralmucosalequivalent[J].JOralMaxillofacSurg,1999,57(5):5712577.
[6] MasudaI.Aninvitrooralmucosalmodelreconstructedfromnormalgingi2
valcells[J].KokubyoGakkaiZasshi,1996,63(2):3342353.
Thestudyoforalepitheliumcultureinvitro
QIUChang2hong,ZHAIHong2feng,LISen2kai
(DepartmentofBurns,TheZhengzhouFirstPeople’sHospital,Zhengzhou450004,China)
Abstract:Objective:Inthisarticlewestudythetechniqueandmethodoforalepitheliumcultureinvitro,playingabasicroleinfurtherstudyinreconstructingatissueengineeringoralmucosaandprovidinganexperimentalmodelinphysiological,patho2logical,toxicologicalandmicrobiologicalstudyinoralmucosa.Methods:TakingabitoforalmucosafromayoungmaleNewZealandharewhohasjustbeenoutofmilk,wedigestitintosinglecellsuspensionwithenzyme.Beingseeded,thecellsareculturedmotionlessly.Themediumischangedregularlyandthecellsaresubcultured.Results:Theculturedcellsareallep2ithelialcellswithoutfibroblasts.Whatismore,theyareprovedtobediploidcells.Thecellscanbesubcultured11213genera2tions,surviving50260days.Conclusion:TheoralepitheliumofyoungNewZealandharecanbeculturedinvitro,maintainingtheabilitytoproliferateinacertaintime.Thestudynotonlysetsaroleinreconstructingatissueengineeringoralmucosa,butalsoprovidesanexperimentalmodelfortheresearchoforalmucosainvitro.Keywords:oralepithelium;seedcell;cellculture
肝功能异常者行腹部成像术确诊率高
美国研究者称,住院病人肝功异常者接受腹部横切面成像术扫描有很高的诊断价值,时常改变了该患者的原治疗方案
(ArchInternMed2001,161:583)。
查的效益。如果图像提供了新的诊断信息和(或)改变了原治疗者,定为有益。
结果显示,在6994例腹部成像中,由于肝功异常适应证而实施检查的有856例。检查报告中有临床意义的解释部分占
37%,包括27%的阳性(扫描结果异常并阐明肝功异常原因)结
研究者注意到,肝功试验异常的住院患者时常接受腹部横切面成像检查。然而,该检测法对患者的诊断价值如何尚不明确。
美国Brigham和妇女医院Rothschild医师等回顾了27个月间的腹部成像图,并将图像与肝功异常作对比;将图像编辑排序,从有阳性图像的病历中随机取样,进行分析,以确定成像检
果。最常见的阳性诊断是胆道阻塞(25%)、胆囊炎(21%)、恶性肿瘤(20%)及肝硬化(14%)。
阳性报告提供新临床诊断的占63%,从而改变治疗方案的占42%。
摘自《中国医学论坛报》2001年4月26日3版