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中华临床感染病杂志２００９年６月第２卷第３期 ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＩｎｆｅｃｔＤｉｓ，Ｊｕｎｅ２００９，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．３
·论著·
铜绿假单胞菌耐药性分析及耐药基因检测
周田美 余道军 董晓勤 沈强 汪涛 童文娟 方翔
【摘要】 目的 观察杭州市第一人民医院临床分离的铜绿假单胞菌的耐药性变迁及相关耐药
ＯＮＥＴ软件对２００３—２００７年临床分离的１４８９株铜绿假单胞菌的药物敏感性基因。方法 采用ＷＨ
试验结果进行统计分析；用琼脂稀释法测定１１种抗菌药物对３６株多药耐药铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度（ＭＩＣ）；用ＰＣＲ法检测β内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶等编码基因，并对ＰＣＲ扩增产物进行亚胺培南、头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林、哌拉西林／他唑测序分析。结果 铜绿假单胞菌对氨曲南、
巴坦、头孢哌酮／舒巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素和阿米卡星的耐药率由２００３年的１３４％、１０６％、８７％、７９％、１２７％、１２７％、６７％、１５８％、２０５％、２４７％和１０９％分别增至２００７年的３５３％、４０９％、１８４％、３２４％、３２９％、３２０％、２１９％、３７８％、３８６％、３９４％和３４８％；１１种抗菌药物对多药耐药铜绿假单胞菌的ＭＩＣ均≥１２８μｇ／ｍＬ。３６株多药耐药铜绿假单胞菌中，内酰胺酶β９０编码基因阳性占５８３％（２１／３６），氨基糖苷类修饰酶基因阳性占８８９％（３２／３６），ｏｐｒＤ２基因缺失率为８０６％（２９／３６）。结论 铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药率呈增高趋势，多药耐药情况严重，内酰胺酶编码基因及氨基糖苷类修饰临床上应给予高度重视。多药耐药铜绿假单胞菌携带多种β酶基因，ｏｐｒＤ２基因的缺失率高。
【关键词】 假单胞菌，铜绿； 抗菌药物； 抗药性； 耐药基因
ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｓｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＺＨＯＵＴｉａｎｍｅｉ，ＹＵＤａｏ，ＤＯＮＧＸｉａｏｑｉｎ，ＳＨＥＮＱｉａｎｇ，ＷＡＮＧＴａｏ，ＴＯＮＧＷｅｎｊｕａｎ，ＦＡＮＧＸｉａｎｇ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌｊｕｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＨａｎｇｚｈｏｕＦｉｒｓｔＰｅｏｐｌｅ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１０００６，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＺＨＯＵＴｉａｎｍｅｉ，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｏｕｔｍｈｚ０５７１＠１６３．ｃｏｍ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｔｒｅｎｄｏｆａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｔｈｅｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｓｉｎＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＨａｎｇｚｈｏｕＦｉｒｓｔＰｅｏｐｌｅ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ．ＭｅｔｈｏｄｓＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆ１４８９Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ２００３ｔｏ２００７ｗｅｒｅｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇＷＨＯＮＥＴ．ＭＩＣｓｏｆ１１ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｔｏ３６ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙａｇａｒｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｇｅｎｅｓｏｆβｌａｃｔａｍａｓｅｓ（ＢＬＡ）ａｎｄａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓ
ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｍｏｄｉｆｙｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓ（ＡＭＥｓ）ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲａｎｄｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｒａｔｅｓｔｏａｚｔｒｅｏｎａｍ，ｉｍｉｐｅｎｅｍ，ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ，ｃｅｆｅｐｉｍｅ，ｐｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ，ｐｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ／ｔａｚｏｂａｃｔａｍ，ｃｅｆｏｐｅｒａｚｏｎｅ／ｓｕｌｂａｃｔａｍ，ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎａｎｄａｍｉｋａｃｉｎｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｒｏｍ１３４％，１０６％，８７％，７９％，１２７％，１２７％，６７％，１５８％，２０５％，２４７％ａｎｄ１０９％
４０９％，１８４％，３２４％，３２９％，３２０％，２１９％，３７８％，３８６％，３９４％ａｎｄｉｎ２００３ｔｏ３５３％，，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＨｉｇｈＭＩＣｓｏｆ１１ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｆｏｒｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ３４８％ｉｎ２００７
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｗｉｔｈＭＩＣ２８μｇ／ｍＬ．Ｉｎ３６ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ９０≥１ｓｔｒａｉｎｓ，２１（５８３％）ｓｔｒａｉｎｓｃａｒｒｉｅｄβｌａｃｔａｍａｓｅｇｅｎｅｓａｎｄ３２ｓｔｒａｉｎｓ（８８９％）ｃａｒｒｉｅｄａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ
，ｗｈｉｌｅｔｈｅｄｅｌｅｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｏｐｒＤ２ｗａｓ８０６％（２９／３６）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｍｏｄｉｆｙｉｎｇｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅｓ
ｒａｔｅｓｔｏｃｏｍｍｏｎａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｈａｖｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．ＧｅｎｅｓｏｆβｌａｃｔａｍａｓｅｓａｎｄａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｍｏｄｉｆｙｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓａｒｅｐｒｅｖａｌｅｎｔｉｎｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓｔｒａｉｎｓ，ｗｉｔｈｔｈｅｃｏｍｍｏｎｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｏｐｒＤ２．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ； Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ； Ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ； Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ
铜绿假单胞菌为条件致病菌，当机体免疫力低下时可引起各种感染。近年来，由于β内酰胺类抗
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４２３９７．２００９．０３．００７基金项目：浙江省医药卫生科技计划项目（２００８Ａ１２９）作者单位：３１０００６杭州市第一人民医院检验科通信作者：周田美，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｏｕｔｍｈｚ０５７１＠１６３．ｃｏｍ
菌药物、免疫抑制剂及肿瘤化疗药物等广泛应用，该菌引起的医院感染日益严重，其多药耐药性给临床
１］
治疗带来了极大困难［。２００７年，中国ＣＨＩＮＥＴ细
２家医院调查发现，铜绿假单菌耐药性监测网所属１
２］胞菌的临床分离率居第２位［。由于各地医师的用
药习惯和抗菌药物使用频率不同，使得不同地区细
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菌的耐药性及耐药基因流行特点也不尽相同。及时了解本地区铜绿假单胞菌的耐药变迁及相关耐药机制，对指导临床更合理地使用抗菌药物，有效治疗和控制该菌引起的感染具有重要意义。为此，笔者对杭州市第一人民医院临床分离的铜绿假单胞菌的药６株多药物敏感性试验结果进行了统计分析，并对３耐药铜绿假单胞菌进行了耐药基因检测。１ 材料与方法
１．１ 菌株来源 １４８９株铜绿假单胞菌来自２００３年１月—２００７年１２月杭州市第一人民医院住院患者送检的痰、血液、尿液、胆汁和脓液等样本（同一患者相同样本重复菌株已剔除），其中２００３—２００７年分别为１７９、１９０、２３９、３６５和５１６株。
１．２ 抗菌药物及试剂 抗菌药物有氨曲南（上海新先锋药业公司）、亚胺培南（杭州默沙东公司）、头孢他啶（葛兰素史克公司）、头孢吡肟（上海施贵宝公司）、哌拉西林（齐鲁制药有限公司）、哌拉西林／他唑巴坦（美国ＷｙｅｔｈＡｙｅｒｓｔ公司）、头孢哌酮／舒巴坦（辉瑞制药有限公司）、环丙沙星（广州南新制药有限公司）、左氧氟沙星（第一制药北京有限公司）、庆大霉素（浙江瑞新药业股份有限公司）和阿米卡星（齐鲁制药有限公司），１１种药敏纸片均购自ｘｏｉｄ公司，ＭＨ琼脂为法国生物梅里埃公司英国Ｏ
产品，ＰＣＲ试剂购自ＴａＫａＲａ宝成生物工程（大连）
ＡＢＩ９７００型ＰＣＲ扩增仪为美国应用生物有限公司，系统公司产品。１．３ 实验方法
１．３．１ 菌株分离鉴定及药物敏感性试验 按《全
［３］
进行菌株分离鉴定，采用国临床检验操作规程》
ＫＢ法进行药物敏感性试验，质控菌株为铜绿假单胞菌ＡＴＣＣ２７８５３，判断标准依据美国临床实验室标
４］
准化研究所（ＣＬＳＩ）２００７版文件［。
１．３．２ 最低抑菌浓度（ＭＩＣ）测定 用琼脂稀释法测定３６株多药耐药铜绿假单胞菌的ＭＩＣ，以铜绿假ＴＣＣ２７８５３为质控菌株，将菌液接种到含单胞菌Ａ
４不同抗菌药物的ＭＨ平皿上，接种量约１０ＣＦＵ／点，
３５℃孵育１８ｈ，观察结果。
１．３．３ 耐药基因检测 根据参考文献［５１０］设计引物，引物序列见表１。模板ＤＮＡ采用煮沸法制备。ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５６℃退火３０ｓ，７２℃延伸４０ｓ，共３０个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。１％琼脂糖凝胶电泳鉴定，用紫外线检测仪检查分析结果，并用凝胶图像处理系统照相，ＰＣＲ扩增产物送英俊（上海）生物公司进行正反向测序，测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ进行比对以明确基因型。
１．４ 统计学方法 用ＷＨＯＮＥＴ软件统计菌株数和
２
ＰＳＳ１３．０软件进行χ检验，Ｐ＜００５为耐药率，用Ｓ
差异具有统计学意义。
表１ 耐药基因ＰＣＲ引物序列
Ｔａｂｌｅ１ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓ
基因名称ＴＥＭＳＨＶＤＨＡＣＴＸＭ１ＣＴＸＭ２ＣＴＸＭ９ＯＸＡ２ＯＸＡ１０ＩＭＰｏｐｒＤ２ＶＩＭＳＰＭＧＩＭＳＩＭａａｃ（３）Ⅱａａｃ（６′）Ⅰａａｃ（６′）Ⅱａｎｔ（３″）Ⅰａｎｔ（２″）Ⅰ
引物序列（５′′）→３
Ｐ１：ＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＴＴＣＡＡＣＡＰ１：ＧＧＣＴＡＴＧＣＧＴＴＡＴＡＴＴＣＧＣＣＰ１：ＡＡＣＴＴＴＣＡＣＡＧＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＴＰ１：ＡＴＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＣＧＣＰ１：ＧＣＧＡＣＣＴＧＧＴＴＡＡＣＴＡＣＡＡＴＣＣＰ１：ＣＡＧＧＣＧＣＴＧＴＴＣＧＣＧＡＴＧＡＧＴＴＰ１：ＧＴＣＴＴＴＣＧＡＧＴＡＣＧＧＣＡＴＴＡＰ１：ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＧＧＣＴＴＴＰ１：ＧＣＧＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＴＧＰ１：ＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＴＣＧＣＡＴＡＴＣＰ１：ＣＴＧＣＴＴＧＧＡＴＴＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＰ１：ＣＴＴＧＴＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＧＣＴＴＴＡＰ１：ＴＡＣＡＡＧＧＧＡＴＴＣＧＧＣＡＴＣＧＰ１：ＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＡＣＧＣＧＴＣＰ１：ＴＡＴＧＡＧＴＧＧＣＴＡＡＡＴＣＧＡＰ１：ＴＴＣＡＴＧＴＣＣＧＣＧＡＧＣＡＣＣＣＣＰ１：ＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＣＰ１：ＧＡＧＣＧＡＡＡＴＣＴＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧ
Ｐ２：ＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＰ２：ＧＧＴＴＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＧＴＧＣＰ２：ＣＣＧＴＡＣＧＣＡＴＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＰ２：ＴＣＣＣＧＡＣＧＧＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＴＰ２：ＣＧＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＣＴＴＡＡＧＣＣＰ２：ＧＣＣＣＴＣＴＡＴＣＣＡＧＴＡＡＴＣＧＣＣＰ２：ＧＡＴＴＴＴＣＴＴＡＧＣＧＧＣＡＡＣＴＴＡＰ２：ＡＡＣＣＡＧＴＴＴＴＧＣＣＴＴＡＣＣＡＴＰ２：ＧＣＣＡＣＧＣＧＡＴＴＴＧＡＣＧＧＡＧＰ２：ＴＧＧＧＣＣＡＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＰ２：ＣＣＴＴＴＴＣＣＧＣＧＡＣＣＴＴＧＡＴＣＧＰ２：ＣＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＴＴＧＡＧＧＰ２：ＴＡＡＴＧＧＣＣＴＧＴＴＣＣＣＡＴＧＴＧＰ２：ＣＴＣＣＧＴＣＡＧＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＡＰ２：ＣＣＣＧＣＴＴＴＣＴＣＧＴＡＧＣＡＰ２：ＧＡＣＴＣＴＴＣＣＧＣＣＡＴＣＧＣＴＣＴＰ２：ＣＧＣＴＡＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＴＴＴＧＰ２：ＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＧＧＡＣＴＧＧＣＣＧＣ
产物长度（ｂｐ）
５３５８６７４０５８３３３５１８７７２３３８２２５８７１９３５１０７８６５６２５５１２３７３９４１７８２８４３２０
Ｐ１：ＧＴＴＡＣＡＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＧＡＴＧＡＴＴＣＰ２：ＧＣＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＡＧＴＧＣＡＡ
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２ 结果
２．１ 铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药情况 所有铜绿假单胞菌对１１种常用抗菌药物耐药率较舒巴坦，２００７年耐药率低的有头孢他啶、头孢哌酮／分别是１８４％和２１９％；其余抗菌药物２００７年耐药率均＞３０％。２００３—２００７年，铜绿假单胞菌对１１种抗菌药物的耐药率都呈上升趋势。其中，对亚胺培南的耐药率上升最为明显（表２）。
２２ 多药耐药铜绿假单胞菌的分离率 ２００３—２００７年多药耐药铜绿假单胞菌的分离率呈现逐年增加趋势，分别为８９％（１６／１７９）、１５３％（２９／１９０）、２５１％（６０／２３９）、２８２％（１０３／３６５）和３２６（１６８／５１６），２００７年与２００３年比较差异具有统计学
２意义（３８０８８，Ｐ＝００００）。χ＝２．３ １１种常用抗菌药物对多药耐药铜绿假单胞菌
型，９株ＣＴＸＭ１组ＰＣＲ阳性菌株中６株为ＣＴＸＭ３型，３株为ＣＴＸＭ２２型，ＶＩＭ为ＶＩＭ２型，ＤＨＡ为ＤＨＡ１型，其余为ＯＸＡ１０、ＯＸＡ２型。氨基糖苷８９％（３２／３６），ａａｃ（６′）类修饰酶基因阳性占８Ⅰ、ａａｃ（６′）Ｉ、ａａｃ（３）ＩＩ和ａｎｔ（２″）Ⅰ阳性率分别为
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铜绿假单胞菌耐药性分析及耐药基因检测
周田美 余道军 董晓勤 沈强 汪涛 童文娟 方翔
【摘要】 目的 观察杭州市第一人民医院临床分离的铜绿假单胞菌的耐药性变迁及相关耐药
ＯＮＥＴ软件对２００３—２００７年临床分离的１４８９株铜绿假单胞菌的药物敏感性基因。方法 采用ＷＨ
试验结果进行统计分析；用琼脂稀释法测定１１种抗菌药物对３６株多药耐药铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度（ＭＩＣ）；用ＰＣＲ法检测β内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶等编码基因，并对ＰＣＲ扩增产物进行亚胺培南、头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林、哌拉西林／他唑测序分析。结果 铜绿假单胞菌对氨曲南、
巴坦、头孢哌酮／舒巴坦、环丙沙星、左氧氟沙星、庆大霉素和阿米卡星的耐药率由２００３年的１３４％、１０６％、８７％、７９％、１２７％、１２７％、６７％、１５８％、２０５％、２４７％和１０９％分别增至２００７年的３５３％、４０９％、１８４％、３２４％、３２９％、３２０％、２１９％、３７８％、３８６％、３９４％和３４８％；１１种抗菌药物对多药耐药铜绿假单胞菌的ＭＩＣ均≥１２８μｇ／ｍＬ。３６株多药耐药铜绿假单胞菌中，内酰胺酶β９０编码基因阳性占５８３％（２１／３６），氨基糖苷类修饰酶基因阳性占８８９％（３２／３６），ｏｐｒＤ２基因缺失率为８０６％（２９／３６）。结论 铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药率呈增高趋势，多药耐药情况严重，内酰胺酶编码基因及氨基糖苷类修饰临床上应给予高度重视。多药耐药铜绿假单胞菌携带多种β酶基因，ｏｐｒＤ２基因的缺失率高。
【关键词】 假单胞菌，铜绿； 抗菌药物； 抗药性； 耐药基因
ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｓｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＺＨＯＵＴｉａｎｍｅｉ，ＹＵＤａｏ，ＤＯＮＧＸｉａｏｑｉｎ，ＳＨＥＮＱｉａｎｇ，ＷＡＮＧＴａｏ，ＴＯＮＧＷｅｎｊｕａｎ，ＦＡＮＧＸｉａｎｇ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌｊｕｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＨａｎｇｚｈｏｕＦｉｒｓｔＰｅｏｐｌｅ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１０００６，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＺＨＯＵＴｉａｎｍｅｉ，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｏｕｔｍｈｚ０５７１＠１６３．ｃｏｍ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｔｒｅｎｄｏｆａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｔｈｅｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｏｆｒｅｓｉｓｔａｎｔｇｅｎｅｓｉｎＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＨａｎｇｚｈｏｕＦｉｒｓｔＰｅｏｐｌｅ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ．ＭｅｔｈｏｄｓＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆ１４８９Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ２００３ｔｏ２００７ｗｅｒｅｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇＷＨＯＮＥＴ．ＭＩＣｓｏｆ１１ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｔｏ３６ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙａｇａｒｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．Ｇｅｎｅｓｏｆβｌａｃｔａｍａｓｅｓ（ＢＬＡ）ａｎｄａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓ
ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｍｏｄｉｆｙｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓ（ＡＭＥｓ）ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＰＣＲａｎｄｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｒａｔｅｓｔｏａｚｔｒｅｏｎａｍ，ｉｍｉｐｅｎｅｍ，ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ，ｃｅｆｅｐｉｍｅ，ｐｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ，ｐｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ／ｔａｚｏｂａｃｔａｍ，ｃｅｆｏｐｅｒａｚｏｎｅ／ｓｕｌｂａｃｔａｍ，ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎａｎｄａｍｉｋａｃｉｎｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｒｏｍ１３４％，１０６％，８７％，７９％，１２７％，１２７％，６７％，１５８％，２０５％，２４７％ａｎｄ１０９％
４０９％，１８４％，３２４％，３２９％，３２０％，２１９％，３７８％，３８６％，３９４％ａｎｄｉｎ２００３ｔｏ３５３％，，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＨｉｇｈＭＩＣｓｏｆ１１ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｆｏｒｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ３４８％ｉｎ２００７
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｗｉｔｈＭＩＣ２８μｇ／ｍＬ．Ｉｎ３６ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ９０≥１ｓｔｒａｉｎｓ，２１（５８３％）ｓｔｒａｉｎｓｃａｒｒｉｅｄβｌａｃｔａｍａｓｅｇｅｎｅｓａｎｄ３２ｓｔｒａｉｎｓ（８８９％）ｃａｒｒｉｅｄａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ
，ｗｈｉｌｅｔｈｅｄｅｌｅｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｏｐｒＤ２ｗａｓ８０６％（２９／３６）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｍｏｄｉｆｙｉｎｇｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅｓ
ｒａｔｅｓｔｏｃｏｍｍｏｎａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｏｆＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｈａｖｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．ＧｅｎｅｓｏｆβｌａｃｔａｍａｓｅｓａｎｄａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｍｏｄｉｆｙｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓａｒｅｐｒｅｖａｌｅｎｔｉｎｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｓｔｒａｉｎｓ，ｗｉｔｈｔｈｅｃｏｍｍｏｎｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｏｐｒＤ２．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ； Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ； Ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ； Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ
铜绿假单胞菌为条件致病菌，当机体免疫力低下时可引起各种感染。近年来，由于β内酰胺类抗
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４２３９７．２００９．０３．００７基金项目：浙江省医药卫生科技计划项目（２００８Ａ１２９）作者单位：３１０００６杭州市第一人民医院检验科通信作者：周田美，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｏｕｔｍｈｚ０５７１＠１６３．ｃｏｍ
菌药物、免疫抑制剂及肿瘤化疗药物等广泛应用，该菌引起的医院感染日益严重，其多药耐药性给临床
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治疗带来了极大困难［。２００７年，中国ＣＨＩＮＥＴ细
２家医院调查发现，铜绿假单菌耐药性监测网所属１
２］胞菌的临床分离率居第２位［。由于各地医师的用
药习惯和抗菌药物使用频率不同，使得不同地区细
中华临床感染病杂志２００９年６月第２卷第３期 ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＩｎｆｅｃｔＤｉｓ，Ｊｕｎｅ２００９，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．３
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菌的耐药性及耐药基因流行特点也不尽相同。及时了解本地区铜绿假单胞菌的耐药变迁及相关耐药机制，对指导临床更合理地使用抗菌药物，有效治疗和控制该菌引起的感染具有重要意义。为此，笔者对杭州市第一人民医院临床分离的铜绿假单胞菌的药６株多药物敏感性试验结果进行了统计分析，并对３耐药铜绿假单胞菌进行了耐药基因检测。１ 材料与方法
１．１ 菌株来源 １４８９株铜绿假单胞菌来自２００３年１月—２００７年１２月杭州市第一人民医院住院患者送检的痰、血液、尿液、胆汁和脓液等样本（同一患者相同样本重复菌株已剔除），其中２００３—２００７年分别为１７９、１９０、２３９、３６５和５１６株。
１．２ 抗菌药物及试剂 抗菌药物有氨曲南（上海新先锋药业公司）、亚胺培南（杭州默沙东公司）、头孢他啶（葛兰素史克公司）、头孢吡肟（上海施贵宝公司）、哌拉西林（齐鲁制药有限公司）、哌拉西林／他唑巴坦（美国ＷｙｅｔｈＡｙｅｒｓｔ公司）、头孢哌酮／舒巴坦（辉瑞制药有限公司）、环丙沙星（广州南新制药有限公司）、左氧氟沙星（第一制药北京有限公司）、庆大霉素（浙江瑞新药业股份有限公司）和阿米卡星（齐鲁制药有限公司），１１种药敏纸片均购自ｘｏｉｄ公司，ＭＨ琼脂为法国生物梅里埃公司英国Ｏ
产品，ＰＣＲ试剂购自ＴａＫａＲａ宝成生物工程（大连）
ＡＢＩ９７００型ＰＣＲ扩增仪为美国应用生物有限公司，系统公司产品。１．３ 实验方法
１．３．１ 菌株分离鉴定及药物敏感性试验 按《全
［３］
进行菌株分离鉴定，采用国临床检验操作规程》
ＫＢ法进行药物敏感性试验，质控菌株为铜绿假单胞菌ＡＴＣＣ２７８５３，判断标准依据美国临床实验室标
４］
准化研究所（ＣＬＳＩ）２００７版文件［。
１．３．２ 最低抑菌浓度（ＭＩＣ）测定 用琼脂稀释法测定３６株多药耐药铜绿假单胞菌的ＭＩＣ，以铜绿假ＴＣＣ２７８５３为质控菌株，将菌液接种到含单胞菌Ａ
４不同抗菌药物的ＭＨ平皿上，接种量约１０ＣＦＵ／点，
３５℃孵育１８ｈ，观察结果。
１．３．３ 耐药基因检测 根据参考文献［５１０］设计引物，引物序列见表１。模板ＤＮＡ采用煮沸法制备。ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５６℃退火３０ｓ，７２℃延伸４０ｓ，共３０个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。１％琼脂糖凝胶电泳鉴定，用紫外线检测仪检查分析结果，并用凝胶图像处理系统照相，ＰＣＲ扩增产物送英俊（上海）生物公司进行正反向测序，测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ进行比对以明确基因型。
１．４ 统计学方法 用ＷＨＯＮＥＴ软件统计菌株数和
２
ＰＳＳ１３．０软件进行χ检验，Ｐ＜００５为耐药率，用Ｓ
差异具有统计学意义。
表１ 耐药基因ＰＣＲ引物序列
Ｔａｂｌｅ１ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅｓ
基因名称ＴＥＭＳＨＶＤＨＡＣＴＸＭ１ＣＴＸＭ２ＣＴＸＭ９ＯＸＡ２ＯＸＡ１０ＩＭＰｏｐｒＤ２ＶＩＭＳＰＭＧＩＭＳＩＭａａｃ（３）Ⅱａａｃ（６′）Ⅰａａｃ（６′）Ⅱａｎｔ（３″）Ⅰａｎｔ（２″）Ⅰ
引物序列（５′′）→３
Ｐ１：ＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＴＴＣＡＡＣＡＰ１：ＧＧＣＴＡＴＧＣＧＴＴＡＴＡＴＴＣＧＣＣＰ１：ＡＡＣＴＴＴＣＡＣＡＧＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＴＰ１：ＡＴＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＣＧＣＰ１：ＧＣＧＡＣＣＴＧＧＴＴＡＡＣＴＡＣＡＡＴＣＣＰ１：ＣＡＧＧＣＧＣＴＧＴＴＣＧＣＧＡＴＧＡＧＴＴＰ１：ＧＴＣＴＴＴＣＧＡＧＴＡＣＧＧＣＡＴＴＡＰ１：ＣＧＧＣＣＴＣＡＧＧＡＧＣＧＧＣＴＴＴＰ１：ＧＣＧＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＴＧＰ１：ＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＧＴＣＧＣＡＴＡＴＣＰ１：ＣＴＧＣＴＴＧＧＡＴＴＣＡＴＧＧＧＣＧＣＧＰ１：ＣＴＴＧＴＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＧＣＴＴＴＡＰ１：ＴＡＣＡＡＧＧＧＡＴＴＣＧＧＣＡＴＣＧＰ１：ＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＡＣＧＣＧＴＣＰ１：ＴＡＴＧＡＧＴＧＧＣＴＡＡＡＴＣＧＡＰ１：ＴＴＣＡＴＧＴＣＣＧＣＧＡＧＣＡＣＣＣＣＰ１：ＴＧＡＴＴＴＧＣＴＧＧＴＴＡＣＧＧＴＧＡＣＰ１：ＧＡＧＣＧＡＡＡＴＣＴＧＣＣＧＣＴＣＴＧＧ
Ｐ２：ＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＰ２：ＧＧＴＴＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＧＴＧＣＰ２：ＣＣＧＴＡＣＧＣＡＴＡＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＰ２：ＴＣＣＣＧＡＣＧＧＣＴＴＴＣＣＧＣＣＴＴＰ２：ＣＧＧＴＡＧＴＡＴＴＧＣＣＣＴＴＡＡＧＣＣＰ２：ＧＣＣＣＴＣＴＡＴＣＣＡＧＴＡＡＴＣＧＣＣＰ２：ＧＡＴＴＴＴＣＴＴＡＧＣＧＧＣＡＡＣＴＴＡＰ２：ＡＡＣＣＡＧＴＴＴＴＧＣＣＴＴＡＣＣＡＴＰ２：ＧＣＣＡＣＧＣＧＡＴＴＴＧＡＣＧＧＡＧＰ２：ＴＧＧＧＣＣＡＴＴＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＰ２：ＣＣＴＴＴＴＣＣＧＣＧＡＣＣＴＴＧＡＴＣＧＰ２：ＣＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＡＡＴＴＧＡＧＧＰ２：ＴＡＡＴＧＧＣＣＴＧＴＴＣＣＣＡＴＧＴＧＰ２：ＣＴＣＣＧＴＣＡＧＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＡＰ２：ＣＣＣＧＣＴＴＴＣＴＣＧＴＡＧＣＡＰ２：ＧＡＣＴＣＴＴＣＣＧＣＣＡＴＣＧＣＴＣＴＰ２：ＣＧＣＴＡＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＴＴＴＴＧＰ２：ＣＴＧＴＴＡＣＡＡＣＧＧＡＣＴＧＧＣＣＧＣ
产物长度（ｂｐ）
５３５８６７４０５８３３３５１８７７２３３８２２５８７１９３５１０７８６５６２５５１２３７３９４１７８２８４３２０
Ｐ１：ＧＴＴＡＣＡＧＣＣＣＴＴＣＧＧＣＧＡＴＧＡＴＴＣＰ２：ＧＣＧＣＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＡＧＴＧＣＡＡ
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中华临床感染病杂志２００９年６月第２卷第３期 ＣｈｉｎＪＣｌｉｎＩｎｆｅｃｔＤｉｓ，Ｊｕｎｅ２００９，Ｖｏｌ．２，Ｎｏ．３
２ 结果
２．１ 铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药情况 所有铜绿假单胞菌对１１种常用抗菌药物耐药率较舒巴坦，２００７年耐药率低的有头孢他啶、头孢哌酮／分别是１８４％和２１９％；其余抗菌药物２００７年耐药率均＞３０％。２００３—２００７年，铜绿假单胞菌对１１种抗菌药物的耐药率都呈上升趋势。其中，对亚胺培南的耐药率上升最为明显（表２）。
２２ 多药耐药铜绿假单胞菌的分离率 ２００３—２００７年多药耐药铜绿假单胞菌的分离率呈现逐年增加趋势，分别为８９％（１６／１７９）、１５３％（２９／１９０）、２５１％（６０／２３９）、２８２％（１０３／３６５）和３２６（１６８／５１６），２００７年与２００３年比较差异具有统计学
２意义（３８０８８，Ｐ＝００００）。χ＝２．３ １１种常用抗菌药物对多药耐药铜绿假单胞菌
型，９株ＣＴＸＭ１组ＰＣＲ阳性菌株中６株为ＣＴＸＭ３型，３株为ＣＴＸＭ２２型，ＶＩＭ为ＶＩＭ２型，ＤＨＡ为ＤＨＡ１型，其余为ＯＸＡ１０、ＯＸＡ２型。氨基糖苷８９％（３２／３６），ａａｃ（６′）类修饰酶基因阳性占８Ⅰ、ａａｃ（６′）Ｉ、ａａｃ（３）ＩＩ和ａｎｔ（２″）Ⅰ阳性率分别为