食品微生物检验的任务和内容
任务
通过测定微生物指标，判断食品在加工环境和食品原料及其在加工过程中被微生物污染及生长的情况，为食品环境卫生管理和食品生产管理及某些传染病的防疫措施提供科学依据。 检验的范围
1、生产环境的检验 2、原辅料的检验 3、食品加工、储藏、销售环节的检验 4、食品检验（重点）
食品微生物检验的指标
食品微生物检验的指标就是根据食品卫生的要求，从微生物学的角度，对不同食品所提出的与食品有关的具体指标要求。我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。
菌落总数：清洁状态的标志；预测食品可能存放的期限.
大肠菌群(MPN/100ml):较为理想的粪便污染的指标菌群；作为肠道致病菌污染食品的指示菌.
致病菌(不得检出）：沙门氏菌、肉毒梭菌、志贺氏菌、变形杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌、霉菌
霉菌及其毒素：我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。例如：曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等，青酶属的桔青酶、岛青酶等，镰刀酶属的串珠镰刀酶，禾谷镰刀酶等等。
其它指标：微生物指标还应包括病毒，肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克氏病毒、口蹄疫病毒，狂犬病病毒，猪水泡病毒等；
另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标：如旋毛虫，囊尾蚴，住肉孢子虫、蛔虫，肺吸虫，弓形体，螨，姜片吸虫，中华分枝睾吸虫等.
微生物检验流程图：无菌取样—样品均质—样液稀释—样品接种—恒温培养—结果观察食品微生物检验条件
学习目标：
1、了解微生物检验室的基本要求，通过学习，能独立建设一般的食品微生物检验室。
2、认识和熟悉微生物检验中常用仪器设备（尤其是普通光学显微镜）及其结构与性能，能正确使用和进行一般的维护。
3、认识和熟悉微生物检验中常用玻璃器皿，掌握灭菌消毒的技术要求。
微生物检验室：
微生物检验室要求高度清洁卫生，要尽可能地为其创造无菌条件。为达此目的，房屋的墙壁和地板，使用的各种家具都要符合便于清洗的要求。
实验室管理制度：
1．实验室应制定仪器配备管理使用制度，药品管理使用制度，玻璃器皿管理使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。
2．进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。
3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。
4．各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出，应严格执行《菌种保管制度》。
5．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按
有关要求执行。
实验注意事项
..每次实验前了解实验目的、原理和方法。初步熟悉实验操作的主要步骤和环节，对整个实验的安排做到先后有序、有条不紊和避免差错。
..非必要的物品不要带进实验室，必须带进的物品（包括帽子、围巾等）应放在不影响实验操作的地方
..每次实验前须用湿布擦净台面，必要时可用0.1％ “新洁尔灭”溶液擦。实验前要洗手以减少染菌的概率。
微生物实验中最重要的一环，就是要严格地进行无菌操作，防止杂菌污染。为此，在实验过程中，每个人要严格做到以下几点：
–操作时要预防空气对流：在进行微生物实验操作时，要关闭门窗，以防空气对流。 –接种时不要走动和讲话：接种时尽量不要走动和讲话，以免因尘埃飞扬和唾沫四溅而导致杂菌污染。
–含菌器具要消毒后清洗：凡用过的带菌移液管、滴管或涂布棒等，在实验后应立即投入5%石炭酸或其他消毒液中浸泡20min，然后再取出清洗，以免污染环境。
–含培养物的器皿要杀菌后清洗：在清洗带菌的培养皿、三角瓶或试管等之前，应先煮沸10min或进行加压蒸汽灭菌。
–要穿干净的白色工作服：微生物学工作者在进行实验操作时应穿上白色工作服，离开时脱去，并经常洗涤以保持清洁。
.凡须进行培养的材料，都应注明菌名、接种日期及操作者姓名（或组别），放在指定的温箱中进行培养，按时观察并如实地记录实验结果，按时交实验报告。
.实验室内严禁吸烟，不准吃东西，切忌用舌舔标签、笔尖或手指等物，以免感染。 .节约药品、器材和水、电、煤气。
.各种仪器应按要求操作，用毕按原样放置妥当。实验完毕，整理和擦净台面，离开实验室之前要用肥皂洗手。
实验注意事项
..冷静处理意外事故：
打碎玻璃器皿：如遇因打碎玻璃器皿而把菌液洒到桌面或地上时，应立即以5%石炭酸液或0.1%新洁尔灭溶液覆盖，30min后擦净。若遇皮肤破伤，可先去除玻璃碎片，再用蒸馏水洗净后，涂上碘酒或红贡。 菌液污染手部皮肤：先用70%乙醇棉花拭净，再用肥皂水洗净。如污染了致病菌，应将手浸于2％～3％来苏尔或0.1%新洁尔灭溶液中，经10～20min后洗净。
菌液吸入口中：应立即吐出，并用大量自来水漱口多次，再根据该菌的致病程度作进一步处理：
非致病菌：用0.1％高锰酸钾溶液漱口。
一般致病菌（葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌等）：用 3％H2O2、0.1％高锰酸钾溶液0.02％米他芬液漱口。
致病菌：如吸入白喉棒杆菌，在用②法处理后，在注射1000U白喉抗毒素作紧急预防；若吸入伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌或霍乱弧菌等肠道致病菌，在经②法处理后，可注射抗生素预防发病。
..衣服或易燃品着火：应先断绝火源或电源，搬走易燃物品 (乙醚、汽油等)，再用湿布掩盖灭火，或将身体靠墙或着地滚动灭火，必要时可用灭火器。
..皮肤烫伤：可用5％鞣酸、2％苦味酸（苦味酸氨苯甲酸丁酯油膏）或2％龙胆紫液涂抹伤口。
..化学药品灼伤
.强酸、溴、氯、磷等酸性药剂：先用大量清水洗涤，再用5％NaHCO3或5%NaOH中和。 .NaOH、金属钠（钾）、强碱性药剂：先用大量清水洗涤，再用5％硼酸或5％乙酸中和 .石炭酸：用95％乙醇洗涤
.如遇眼睛灼伤：则应先用大量清水冲洗，再根据化学品的性质作分别处理，例如，遇碱灼烧可用5％硼酸洗涤，遇酸灼烧可用5％NaHCO3洗涤，在此基础上再滴入1～2滴橄榄油或液体石蜡加以润湿即可。
检验室建设要求
.选址与规模
（1）化验室应建设在远离粉尘、噪声、散发异味气体等地点，电源电压应当相对稳定的地点。根据企业规模和产品种类，应建设不同要求的化验室。但是，最小建筑面积：理化检验室不能小于30平方米；微生物检验室（无菌室）不能小于8平方米。这样有助于仪器设备的合理摆放，便于操作，便于样品流通和空气流通。
（2）室内应有足够的照明条件。
（3）室内必须配置干粉或二氧化碳灭火器，以备电器或化学品燃烧灭火使用。
室内的布局
(1)动仪器与静仪器分开：精密仪器（如光度计、天平、比色计、酸度计、色谱仪等）应必须与震动仪器（如震荡器、验粉筛、离心机、搅拌器等）。
(2)常温与热源设备分开：热源仪器（如电热蒸馏水器、恒温干燥箱、高温电阻炉、恒温培养箱、水浴锅、电炉等）必须与其它一切设备分开，不然会影响其它设备的正常使用，严重的会造成热蒸汽腐蚀其它设备，影响其使用寿命。
(3)化学分析台与热源设备分开：化学分析台面上应尽量少放易燃和腐蚀性试剂。使用电炉或酒精灯加热时应坚持有人看管和监视。化学分析台的摆放应远离热源设备。
1.办公台2.文件柜 3.样品柜 4.通风橱5.实验边台6，7.无菌台8.天平台
9.在落地仪器区再加个高温仪器台，放高压灭菌锅、干燥箱、水浴锅、电热板等
微生物实验室主要设备和器具
1、无菌室（接种室）或接种箱2、恒温箱3、电烘箱（干燥箱）4、冰箱5、高压蒸汽灭菌锅 6、离心机 7、接种针 8、天平 9、酒精灯 10、显微镜 11、常用玻璃器皿 12、均质器、试管夹，吸管，移液枪，脱脂棉，牛皮纸，棉绳，纱布，剪刀
第二章 食品微生物检验常用的仪器
一、常用仪器及其使用
.显微镜 .冰箱 .超净工作台、杀菌锅 .离心机 .水浴锅、培养箱 .烘箱或干燥箱 .各种玻璃器材
（一）显微镜
普通显微镜的保养
1、观察完后，移去观察的载玻片标本。
2、用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着擦镜液擦拭2—3 3次，最后
再用擦镜纸将二擦镜液苯擦去。
3、转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。
4、将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。
1.普通光学显微镜：
通常以自然光或灯光为光源， (其波长约 0.5μm。在最佳条件下，显微镜的最大分辨率为波长的一半，即0.25μm，而肉眼所能看到的最小形象为0.2mm，故在普通光学显微镜下用
油镜放大1000倍，可将0.25 μm的微粒放大到0.25mm，肉眼便可以看清，一般细菌大于0.25μm，)故用普通光学显微镜均能清楚看到。
2.暗视野显微镜：
用特制的暗视野集光器代替普通光学显微镜上的明视野集光器，背景视野黑暗无光，而从集光器四周边缘斜射到标本部位的光线，经菌体散射后而进入物镜。故在强光的照射下，可以在黑暗的背景中看到发亮的菌体，犹如夜空中的明亮星星。多用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。
3.相差显微镜：
在进行未染色标本检查时，由于细菌的折旋光性与周围环境的折旋光性相近，明暗对比不明显。在普通光学显微镜下不易看清，用暗视野显微镜只能看到发亮的菌体轮廓，看不清内部结构。而相差显微镜依据光波穿过标本中密度不同的部位时，引起光相差异的原理，利用相差板的光栅作用，改变直射光的光相和振幅，将光相的差异转换成光的强度的差异，使细菌中的某部分结构比其他部分深暗，衬托出鲜明的对比。 主要用于检查不染色活细菌的形态及某些内部结构。
4.荧光显微镜：
荧光显微镜以紫外光或蓝紫光为光源，能激发荧光物质发光使之成为可见光。细菌经荧光色素染色后，置于荧光显微镜下，即可激发荧光，因此在暗色的背景下可以看到发射荧光的细菌。 由于紫外光与蓝紫光的波长较短（0.3～0.4 μm），故分辨率得到进一步提高。荧光显微镜还广泛应用于免疫荧光技术中。
5.电子显微镜：
电子显微镜以电子流代替光源，其波长极短（约为0.005nm），分辨能力大大提高，电磁圈代替普通显微镜的光学放大系统，放大倍数可达数万至数十万倍，能分辨lnm的物体，细菌的表面形态和内部超微结构均能清楚地显现。
（二）、培养箱
1.智能隔水恒温培养箱 2.隔水培养箱 3.电热培养箱 4.生化培养箱
智能培养箱
微电脑智能化双目控温系统具有控温保护、准确、可靠。工作温度任意调节并具有偏差报警功能，镜面不锈钢内胆，外门内层用一层门，观察箱内情况时不影响箱内温度。9000系列隔水式加热方式，具有温度均匀且断电后仍能保持较长时间恒温。
隔水式培养箱
数字控温，不锈钢内胆，俗称水夹套培养箱。温度均匀，断电后仍能保持较长时间恒温。 电热恒温培养箱
2、生化培养箱
3、二氧化碳培养箱
培养箱的配置和使用
配置：22（℃）、30（℃）、37（℃）培养箱各一个
使用注意事项：
(1)箱内不能放入过热或过冷的物品，取放物品时应快速进行并做到随手关闭箱门。
(2)内放一杯水，以保持湿度。
(3)培养物不能放在最底层，也不得放置过于拥挤。
(4)每月消毒一次，先用3%的来苏尔液涂布消毒，再用清水擦净。
(5))不得当烘箱使用。
（1）37℃和42℃水浴锅24小时工作；
（2）其余水涡锅用后关掉电源；
（3）水浴锅内应注加蒸馏水而非自来水，使用时请注意水位。
配置： 37℃、42℃、56℃各一个
（三）匀质器
无菌均质器 该均质器广泛用于动物组织、生物样品、食品、化妆品的均质处理，特别适合于微生物检测样本的制备，具有均质柔和、样品无污染、无损伤、不升温、不需灭菌处理、不需洗刷器皿的特点，样本装在特制的一次性无菌均质袋中，不与仪器接触，预防交叉污染。 高速匀浆机
（四）超净工作台
三大类型：侧流式、直流式和外流式(根据气流的方向)。
垂直流工作台由于风机在顶部所以噪音较大但是风垂直吹多用在医药工程这样保证人的身体健康；
.水平流工作台噪音比较小风向往外所以多用在电子行业，对身体健康影响不大。 根据操作结构分为单边操作及双边操作两种形式，按其用途又可分为普通超净工作台和生物(医药)超净工作台。
超净台的使用和注意事项
1、使用前先打开紫外灯照射，紫外线照射时间40~60分钟；
2、使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭；
3、保持超净台整洁，不要堆积杂物；
4、使用完毕，勿忘关闭煤气开关或酒精灯；
5、学期开始做无菌试验一次，以保证净化台正常使用。平时可根据情况，定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。
（五）、离心机
.离心机的类型：
.普通离心机
.高速离心机
.超速离心机
转子
许多离心机可以配用不同大小的离心管，只需要改变转子或使用一个与不同的吊桶/适配器相配的转子。
1．水平转子：盛样品的离心管放在吊桶内，以转子的加速度运转。水平转子用于低速离心机，其主要缺陷是延长了沉淀的路径。同时，减速过程中产生的对流会引起沉淀物的重新悬浮。
2．角式转子：许多高速离心机及微量离心机安装。由于沉降路径短，沉淀颗粒时角式转子比水平转子的效率更高。
3．垂直管转子：用于高速及超高速离心机进行等密度梯度离心时。这种转子在沉淀没有形成之前不能用来收集悬浮液中的颗粒。
（六）、灭菌器
.干热灭菌器
.湿热灭菌器
1、电烘箱（干燥箱）
用途：①用于玻璃器皿等耐热物品的烤干和灭菌。②玻璃器皿等物的灭菌，温度160~165℃，灭菌 2小时。
玻璃器材的干热灭菌方法
(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用报纸包好，或装入特制的铁筒中。
(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。
(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。
(4)待箱内空气排出到一定程度时，关闭上排气孔，继续加热至一定温度后，调节温度控制旋钮固定温度，在160℃—165℃保持2小时即可。
(5)待自然降温冷却后(60℃以下)才能开门取出玻璃器皿。
2、高压灭菌锅
.用途：培养基、生理盐水、废弃物、采样器、纱布、衣物的灭菌。
.种类：手提式、立式、卧式杀菌锅
使用高压蒸汽杀菌锅的注意事项
A：为避免烫伤，温度降低到70℃以下时小心的打开消毒锅门。
B：为避免消毒锅冷却后消毒室内产生负压而打不开消毒锅门，所以当消毒室温度低于70℃时就可慢慢把门打开。
C：根据消毒物品选择排气方式：
（1）.如有液体（营养液等）请选择慢排。
（2）.如只有废品等可选择快排。
手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法：
（1）、关好排水阀门放入清水至标度为止。
（2）、将要灭菌的物品用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中，关上器盖。
（3）、通电加温，同时打开排气活门，排尽锅内的空气，再关闭活门。
（4）、当达到所需温度时开始计时，并在此温度下保持所需的时间。
（5）、稍微打开一点排气活门，使锅内蒸气缓慢排除。
（6）、当压力表指针降到零、锅内蒸气完全排尽时，立即打开锅盖取出物品。
（7）、最后将高压灭菌器内的剩余水排出。
3、滤菌器
①用以除去细菌的器具
②它含有微细小孔，只允许液体及气体通过，而大于孔径的物体不能通过。
③滤菌器可以除去细菌，但不能除去病毒、支原体、衣原体及细菌L型等微生物。
（七）、普通冰箱冰柜
1、取用冰箱冰柜内物品尽可能快，取完后及时将有用物品放回原处；
2、关冰柜门时应轻轻合上，同时将门轻轻往外拉一下检查是否关好;
3、冰柜内的不要样品应及时清理。
快速自动菌数导电测定仪：1、可直接测读菌体本身在培养液中造成的导电度变化，或利用菌体在代谢过程中的产物所造成的导电度变化，快速测定样品中细菌含量数目。
2、适用于各种食品，制药，石化工厂的微生物品质管理，取代传统方法将侦测时间由3-5天减到几个小时。亦可用于做样品的抗菌性试验。
二、常用玻璃仪器及用具
（一）量器类
1、移液管：1ml，2ml，5ml，10ml，25ml
2、容量瓶：50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml
3、量筒 容量: 10ml、25ml、50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml等
4、微量取样器
数字型可调移液器P型 、固定体积移液器
（二）、其他常用玻璃器皿
1、培养皿
2、试管
各种试管的使用 ：
13mmX100mm：生化反应及凝集反应
15mmX150mm：斜面培养
18mmX180mm：检样稀释
3、三角瓶
烧杯 容量（ml）： 30、50、100、150、250、400、600、1000、2000、3000
三、玻璃器皿的清洗和灭菌
(一)、新购的玻璃器皿
1、先用热肥皂水刷洗，流水冲净。
2、再浸泡于１～２％的盐酸中数小时，最后用流水冲净。
(二)、用过的玻璃器皿
1、含油脂器材的清洗
（1）、单独高压灭菌；
（2）、趁热倒去污物；
（3）、倒放在铺有吸水纸的篮子上，置 100℃烘箱中烤0.5h;
（4）、再用5%的碳酸氢钠水煮两次，再用肥皂水刷洗干净。
2、含菌试管的清洗
.高压灭菌后，肥皂水刷洗干净，烘干或晾干备用。
3、含菌平皿的灭菌
（1）、底盖分开放，放入桶中，高压灭菌；
（2）、趁热倒去污物；
（3）、肥皂水刷洗干净，烘干或晾干备用。
4、含菌吸管的清洗
（1）、把含菌吸管投入3%的来苏尔液内浸泡30min以上杀菌；
（2）、用肥皂水洗涤一次；
（3）、最后用清水冲洗干净即可。
5、载玻片及盖玻片的清洗
（1）将载玻片及盖玻片分别浸入5%的来苏尔液内浸泡过夜，取出水洗干净；
（2）盖片用软布擦干即可；
（3）染色用的载玻片要放入肥皂水中煮沸10min，再用肥皂水刷洗干净，最后用9%的酒精浸泡片刻，晾干备用。
（三）、玻璃器材的灭菌
（1）清洗后烘干；
（2）加塞包扎；
（3）灭菌:
干热灭菌:160-165℃烘箱中烤2h
湿热灭菌:121℃ 20min
细菌形态学检验技术
..细菌形态学检验内容：菌体形态、大小、排列、特殊结构
..细菌形态学检查方法：不染色细菌标本检查法和染色细菌标本检查法
..不染色的细菌标本的镜检可直接观察到细菌活体的形态、大小、运动（了解菌是否有鞭毛） ..悬滴法和压滴法
不染色细菌标本检查法－－悬滴法
制备菌液:从幼龄菌斜面上，挑数环菌于盛有1－2ml无菌水的试管中，制成轻度浑浊的菌悬液。
涂凡士林：取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林。
滴加菌液：：加1滴菌液于盖玻片的中央，并用削尖的记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。
盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘合在一起，然后翻转凹玻片，菌液正好悬在凹槽的中央，再用火柴棒轻压盖玻片使四周边缘闭合，以防菌液干燥。
镜检:先用低倍镜找到标记，再稍移凹玻片即可找到菌悬滴的边缘，然后将菌液移到视野中央。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器，以增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动）
不染色细菌标本检查法－－压滴法（水封片法）
制水封片：加1滴菌液于洁净无油的载玻片中央，然后取1滴洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，再慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。若镜检好氧菌时，应在水封片中留1～2个小气泡，然后再观察气泡四周细菌的运动能力，否则因盖玻片内供氧不足而抑制了细菌的运动。
镜检：先用低倍镜观察，然后再转至高倍镜或油镜下观察，观察的要求同悬滴法。 不染色细菌标本检查法－－注意事项
结果记录 菌名
普通变形杆菌
铜绿假单胞菌
黄色金葡萄球菌 悬滴法或水封片法 细菌的运动方式 判断有、无鞭毛
注意事项
1、检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动
2、制水封片时，菌液不可加得太多，因过多的菌液会盖玻片下流动，从而影响了对细菌正常运动的观察。
染色细菌标本检查法－－染料
细菌染色用的染料
酸性染料（阴离子染料）：染色离子带阴电荷，能与带阳电的物质结合，使之着色。降低菌液的pH而使细菌带阳电时，就可用酸性染料染色。（伊红、刚果红）
碱性染料（阳离子染料）：与带负电的物质结合，细菌一般带负电，，所以细菌染色所用的染料，常用碱性染料（碱性复红、美蓝）。
复合染料：碱性染料与酸性染料的结合物（伊红美蓝、伊红天青）。
单纯染料：不能与被染物生成盐类
影响染色的因素
细菌的结构：细胞壁的结构、细胞膜的通透性、膜孔的大小
培养基：组成、菌龄、pH等
染色细菌标本检查法－－制片方法
制片：（制片是染色的关键，如不注意菌体涂布的均匀度，会造成染料的大面积堆积，而使观察结果不理想）
.制片：在干净的载波片（平时放在95%酒精中)上滴一滴蒸馏水或无菌水，用接种工具进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中与水混合做成悬液，并涂成直径约1cm的薄
层。若材料为液体培养物或自固体培养物中洗下制备的菌液，则可直接涂布于载玻片上。涂布要均匀，菌体间少重叠。
. 干燥：涂布最好在室温下使其干燥，有时为之使之干燥得快些，小心地在酒精灯火焰高处微微加热。
. 固定：标本干燥后即进行固定，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快地来回通过3～4次，共2～3s，并不时以载玻片的加热面触及皮肤，其目的：杀死微生物，固定细胞结构；保证菌体能牢固地黏附在载玻片上，防止标本被水洗掉；改变染料对细胞的通透性，因为死细胞的原生质比活细胞的原生质易于染色。
注意事项：
..载玻片要洁净无油，否则菌液涂不开，且固定效果不好，水洗时易被水冲掉。
..为避免因菌数过多聚成团而不利于观察个体形态，可在载玻片一端加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于水滴中进行稀释，涂布成薄层。
..干燥时，切勿靠火焰太近或加热时间过长，以防标本烤枯而使菌体变形。染色细菌标本检查法－－染色分类
. 单染色法：用一种染色剂对涂片进行染色。该法简便易行，但仅能显示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构，适用于微生物的形态观察。
. 复染色法：主要的复杂染色法有革兰氏法和抗酸性及特殊染色法。因为细菌除了具有细胞壁、细胞膜、原生质和核等基本构造外,某些细菌还具有荚膜、芽孢、鞭毛和异染颗粒等特殊结构，这些结构不能被一般染色方法着色，必须用特殊的方法才能着色。
. 负染色法：负染色法是一种特殊的染色方法，是指背景着色而细菌本身不着色。一般使用酸性染料，如刚果红或水溶性苯胺黑。固定染色涂片可浸于酸性酒精中，因刚果红经酸性酒精处理后，涂片的背景便从红色（盐类的颜色）转变为蓝色（即刚果红游离的颜 色），这样可使对比性更为鲜明。
负染色法除用于观察细胞形态外，还可区别死菌与活菌，因死菌可被酸性染料着色，部分自溶的细菌也能轻度染上酸性染料，而活菌却不着色。
染色细菌标本检查法－－简单染色方法
染色细菌标本检查法－－革兰氏染色法
注意事项：
1、单一菌落染色后看到红色杆菌和紫色杆菌共存的情况，特别明显既有红色的，也有紫色的？
（脱色时间：受涂片之厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。
菌龄：选用培养18～24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应）
显微镜观察：紫和红好象都是，焦距调的稍近时紫色，调的稍远时红色，两种情况下形状都看的挺清楚，杆状。关于颜色怎么确定的？
（对照：当确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合图片）
染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应甩去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
染色细菌标本检查法－－芽孢染色法
原理：
细菌的芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁较厚，对染料的透性差，不易着色，但是一旦着
色又难以脱色。芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿在加热条件下进行。染色完毕，用自来水冲洗。因孔雀绿是弱碱性染料，与菌体结合力较差，因此易被水洗掉，而进入芽孢中的孔雀绿却难以溶出。水洗后，再用一种呈红色的碱性染料复染使菌体和芽孢呈现不同的颜色。 方法与步骤
..制片：将培养24小时的细菌涂片、干燥、固定
..染色：将孔雀绿染色液滴加3～5滴于标本上。用试管夹夹住载玻片在火焰上加热约5min（当染料冒蒸汽时开始计时）。在加热过程中要随时加染色液，切勿煮沸或使样本干涸。 ..水洗：待载玻片冷却后，用自来水冲洗
..复染：用番茄红染色液染色1min。
..水洗、干燥，置于油镜下观察并绘图说明。
..结果
染色细菌标本检查法－－芽孢染色法
改良方法：.
制备菌液：加1～2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环的菌苔于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。
加染色液：加5％孔雀绿染色液2～3滴于小试管中，用接种环搅拌使染色液与菌液充分混合。
加热：将此试管浸于沸水浴中，加热15～20min。
涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的玻片上，并涂成薄膜。
固定：将玻片通过微火3次。
脱色：用水洗，直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
复染：加沙黄染色液，染2～3min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水吸干。 镜检：用油镜观察
结果纪录
染色细菌标本检查法－－芽孢染色法
注意事项：
1、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体内。巨大芽孢杆菌在37 ℃条件下培养12～14h效果最佳。
2、改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规法优越，可优先使用。
3、用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次从小试管中挑取被染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。
第三章 培养基和实验基本操作技术
第一节 培养基
一、培养基中的主要成分及其作用
（一）、营养物质 ：N源、C源、无机盐、生长因子、水
1、常用的N源物质
蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏
2、糖、醇类物质
单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖
双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖
多糖：淀粉、纤维素
醇类：甘露醇、甘油
（二）、水：用蒸馏水或离子交换水。
（三）、凝固剂
琼脂、明胶、血清等
要求：清一色、杂质少
（四）、抑制剂
1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率
2、种类：
盐类：氯化钠等
染色剂类：煌绿、结晶紫、孔雀绿、孟加拉
胆盐类：猪（牛、羊）胆盐
抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素
（五）、指示剂
1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。
2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等
二、培养基的类型
在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基(Media)。
由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。
（一）、根据培养基的物理状态来区分
固体培养基、液体培养基、半固体培养基
1、液体培养基
主要用于增菌培养、鉴别性培养主要用于增菌培养、鉴别性培养
2、固体培养基
用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等
3、半固体培养基
观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。
（二）、根据培养基的用途来区分
增殖培养基 、选择培养基 、鉴别培养基
1、增殖培养基
在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。
2、选择培养基
在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。
3、鉴别培养基
在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。
（三）培养基制备的基本方法和注意事项
1、培养基的制备记录 2、培养基成分的称取 3、培养基各成份的混合和溶化 4、培养基pH的初步调正 5、培养基的过滤澄清 6、培养基的分装 7、培养基的灭菌 8、培养基的质量测试 9、培养基的保存
1、培养基的制备记录
每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等。
记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。
2、培养基成分的称取
培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。
3、培养基各成份的混合和溶化
指示剂应在调节好PH值后再加入；煮溶后要补加足水份；不能把培养基煮焦，焦化的不能使用。
4、培养基pH的校正
灭菌后PH值会下降0.1～0.2，在做培养基校正PH值时，应比实际值高0.1～0.2；PH调整后，还应将培养基煮沸。
5、培养基的过滤澄清
液体培养基可用滤纸过滤法
琼脂培养基,可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤
６、培养基的分装
斜面： 1/5管
半固体培养基：1/3管
高层斜面：1/4～1/3管
平板：13-15ml
7、培养基的灭菌
（1）含糖类或明胶的培养基： 113℃灭菌15分钟或115灭菌10钟。
（2）无糖培养基： 121℃灭菌15~20分钟。
（3）血液、体液和抗生素等以无菌操作技术抽取后再加入冷却至约50℃左右的培养基中。
（4）琼脂斜面培养基应在灭菌后冷至55℃--60℃时取出，再摆置成适当斜面。
8、培养基的质量测试
（１）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。
（２）将全部培养基放入 36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。
（３）用有关的标准菌株接种 1~2管或瓶培养基，培养24～48小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。
9、培养基的保存
（1）基础培养基不能超过两周
（2）生化试验培养基不宜超过一周，
（3）选择性或鉴别性培养最好当天使用，倾注的平板培养基不宜超过3天。
第二节、微生物检验的基本操作技术
主要内容
.无菌技术
.微生物的接种与分离技术
.微生物的培养方法
.微生物的生长现象与观察
一、无菌技术
（一）什么是无菌技术
指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。
（二）无菌环境
无菌室 、无菌柜 、超净工作台
1、无菌室
（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间
（2）无菌室的消毒和防污染
.每日------紫外线照射。
.每周------甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）。
.每月------新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。
2、超净工作台
超净台的使用与保养:
（三）无菌器材
.灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等.
.消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等
（四）无菌操作
1、目的：
（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；
（2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。
2、进入无菌室前的准备
（1）、定期检查无菌环境的空气是否符合规定；
（2）、用紫外线灭菌处理30~60分钟；
（3）、检查无菌器材是否完备；
（4）、洗手消毒；
（5）、手部消毒后，再穿戴无菌工作服。
3、检验操作过程的无菌操作要求
（）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；
（）、使用玻璃器皿应轻取轻放。
（）、在正火焰上方操作；
（）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；
（）、在接种培养物时，协作应轻、准。
（）、不能用嘴直接吸吹吸管。
（）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。 无菌操作 –取菌技巧 1
1.接种环前端铁丝部分以酒精灯烧红来菌，后端铁棒部分过火
2.试管管前端过火
3.打开试管盖
4.试管傾斜，放入接种环
5.试管前端过火，盖上试管盖
6.接种环烧红灭菌
5.试管前端过火，盖上试管盖
6.接种环烧红灭菌
二、微生物的接种与分离技术
（一）、接种
.将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
１、接种工具和方法
1．接种针
2.接种环
3.接种钩
4.5.玻璃涂棒
6.接种圈
7.接种锄
8.小解剖刀
１）划线接种：在固体培养基表面作来回直线形的移动
２）三点接种：研究霉菌形态.把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它自独立形成菌落后，观察、研究它们的形态。
３）穿刺接种：保藏厌氧菌种或研究微生物的动力。
用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种：将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却固体培养基，迅速轻轻摇匀，培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种
６）液体接种
７）注射接种：用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种
８）活体接种：专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法
(二)、分离纯化
３、平板划线法
平板划线分离法
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
平板划线法： 1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。
2、划线方法
稀释混合平板法：
1、先加菌 2、倒平板时注意培养基温度 3、混合均匀
三、微生物的培养方法
1、一般培养法（需氧培养） 2、厌氧培养法 3、CO2培养法
（一）、一般培养法（需氧培养）
培养温度: 25~37℃
四、微生物培养特性观察与记录
在固体培养基上，观察：菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等；
在液体培养中：表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。
半固体培养基穿刺接种：观察运动、扩散情况。
思考题
1什么是无菌技术？
2如何做好无菌室的消毒和防污染工作？
3如何做好超净台的使用与保养？
4无菌操作的目的是什么？
5进入无菌室前要做好哪些准备工作？
6验操作过程的无菌操作要求包括哪些内容？
第四章 微生物的生化试验和血清学试验
第一节 细菌的生化试验
一、概述
（一）、什么是生化试验?
指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。
（二）检验细菌的生化试验范围
1糖（醇）类代谢试验2氨基酸和蛋白质代谢试验3有机酸盐和铵盐的利用试验4呼吸酶类试验5毒性酶类试验
（三）生化试验的方法
1.在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的PH值变化。 2在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。
3.根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。
4.根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。
（四）生化试验的注意事项
1、待检菌应是新鲜培养物。培养18~24h。
2、待检菌应是纯种培养物。
3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。
4、应做必要的对照试验。
5、提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进行试验。
二、糖醇类代谢试验
（一）糖醇类发酵试验
（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验
（三）V-P试验
（四）甲基红（Methyl Red）试验 MR
（五）七叶苷水解试验
（六）甘油品红试验
（一）糖醇类发酵试验
1.原理：
不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇），有的只能分解1~2种糖醇，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。
常用的糖醇
单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖
双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖
三糖：棉子糖
多糖：菊糖、肝糖、淀粉
醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇
2、试验方法：
用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃培养1~3天，每天观察结果。
3、结果观察和记录
记录：
.产酸不产气，阳性，以“+”表示
.产酸产气，阳性，以“⊕”表示
.不产酸产气，阴性，以“-”表示
（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验
1、原理：
细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。
氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；
发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；
不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。
根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。
2、方法
.取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1Cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37℃培养2~4天，每天观察结果。
3、结果观察与记录
（三） V-P试验
1、原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。
某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。
.主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。
. 本试验常与MR试验一起使用，一般情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。但肠杆菌科细菌不一定都这样规律，如蜂房哈夫尼亚菌和奇异变形杆菌的VP试验和MR试验常同为阳性。
3、结果观察与记录
（1）发酵管出现红色者，为阳性，记 V-P +
（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记 V-P-
（四）甲基红试验（MR）
1、原理
细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降至 pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液 pH较高，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。
2、试验方法：
挑取新鲜的待试培养物少许，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃或30℃（以30℃较好）培养3~5天，从第48h起，每日取培养液1ml，加入甲基红指示剂1~2滴，立即观察结果。
3、结果观察与记录
（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR +；
（2）呈橘黄色或黄色为阴性，记 MR -，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。
复习题
1、什么是生化试验?
2、做生化试验要注意哪些事项？
3、简述糖醇类发酵试验的原理，写出其试验方法和结果的记录
5、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结果的记录
三、氨基酸和蛋白质代谢试验
（一）靛基质（吲哚）试验
（二）H2S试验
（三）尿素酶试验
（四）氨基酸脱羧酶试验
（五）苯丙氨酸脱氨酶试验
(六)明胶（Gelatin）液化试验
（一）靛基质试验
1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。
2、试验方法：
所用试剂:
（1）柯凡克(Kovacs)试剂;或（2）欧—波试剂
将待检菌小量接种于培养基中，于 36±1℃培养24~48h时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约 0.5ml覆盖液面两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。
3、结果观察与记录
呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+
无红色者，为阴性反应，记-
（二）硫化氢（H2S）试验
1、原理：
某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物 PbS或FeS，以此鉴别细菌。
2、试验方法：
挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养上，于36±1℃培养 24~48h，观察结果。
3、结果观察与记录
.培养基底部呈黑色，为阳性，记+
.培养基底部无黑色，为阴性，记-
（三）尿素酶试验
1、原理：
某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。
2、试验方法：
挑取大量培养18~~24h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。
3、结果观察与记录
.培养基变呈粉红色，为阳性，记 +
.培养基颜色不变，为阴性，记 -
复习题
1、简述靛基质试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项
2、简述硫化氢试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项
四、有机酸盐和铵盐的利用试验
1枸橼酸盐利用试验
2丙二酸盐利用试验
（一）枸橼酸盐利用试验
1、原理：
某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。
2、试验方法
挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种，在36±1℃培养1~4天，每天观察结果。
3、结果观察与记录
.斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+；
.无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-;
五、呼吸酶类试验
1.氧化酶试验 2.过氧化氢酶试验 3.硝酸盐还原试验 4.氰化钾试验
（一）氧化酶试验
1.原理:
氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和α-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。 试剂 ：1% α-萘酚-乙醇液 、1%盐酸二甲基对苯二胺
2、试验方法
用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺试剂1~2滴在培养物上,再加入1% α-萘酚-乙醇液1~2滴,在30秒内判定试验结果。
3、结果观察与记录
.在30秒内呈蓝色反应,为阳性,记 +
.不变色或为红色者,为阴性,记 -
（二）过氧化氢酶试验
1.原理：
某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。
2、试验方法
.挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。
（四）氰化钾试验
1.原理：
氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌.
2、试验方法
取培养20～24h的营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧， 36±1℃培养24～ 48h，观察结果。
3、结果观察与记录
.对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性，记+。
.对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴性。记-。
七、三糖铁（TSI）试验
1、三糖铁试验的原理
如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。
如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。
2、试验方法
以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置 36±1℃培养18~24h，观察结果。
1、该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1
2、只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。
3、发酵乳糖的细菌，产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如培养基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。
4、志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S。沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S，多数产气。
思考题
1.志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。在培养基上应该产生什么现象？
2.大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S。在培养基上应该是什么现象？
3.沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S，多数产气，在培养基上应该是什么现象？
复习题
1、什么是生化试验?
2、做生化试验要注意哪些事项？
3、简述糖酵解试验的原理，写出其试验方法和结果的记录
4、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结果的记录
5、简述靛基质（Imdole）(吲哚)试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项
6、简述硫化氢（H2S）试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项
第二节血清学试验
血清学反应：
指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，所出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。
第五章 食品微生物检验的基本程序
本章的主要内容
一、食品微生物检验的一般步骤 二、检验前的准备 三、样品的采集 四、样品的送检
五、样品的处理方法 六、致病菌检验参考菌群的选择 七、样品的检验 八、检验结果的报告
一.食品微生物检验的一般步骤
二.检验前的准备
1.准备好所需的各种仪器。
2.按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。
3.准备好所用的各种试剂，做好普通营养琼脂或其他选择必培养基。
4.做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前1h灭菌30~60min.
5.工作衣、鞋、帽、等灭菌后备用。
6.工作人员进入无菌室后，实验没有完成之前不得随便出入无菌室。
三.样品的采集
（一）采样的目的和意义
1.便于食品卫生质量监督管理
2.鉴别食品中是否存在有毒有害物质。
3.为新产品、新资源利用、新食品化工产品、新工艺投产前进行卫生鉴定。
（二）样品的种类
1.大样，就是一整批；
2.中样，是从样品中各部分取得的混合样品，一般为200g；
3.小样，也称检样，做分析用的，一般为 25g。
（三）采样的步骤
采样前调查→现场观察→确定采样方案→采样 →样品封存 →开具采样证明
（四）采样的要求
1、严格遵守样品采集的操作规程。
2、所采样品必须具有代表性。
3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。
4、不得加入防腐剂、固定剂等。
5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加。
（五）食品微生物检验的采样方案
1、食品卫生学微生物检验的取样方案
检验目的：检验食品的微生物卫生指标是否合格。
取样方案有：
① ICMSF取样方案；
②美国FDA的取样方案；
③世界粮农组织（FAO）取样方案；
④我国的食品取样方案。
2、食物中毒微生物检验的取样
检验目的：查找食物中有何病原菌。
3、人畜共患病病原菌检验的取样
检验目的：鉴定畜禽及其产品是否带有人兽共患的病原菌。
（六）食品微生物检验采样方法
采样原则：上能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取样.
1、液体样品采样方法
充分混匀后，无菌操作打开包装，用10mL无菌注射器抽取,注入无菌盛样容器.
2、半固体样品采样方法
.无菌操作打开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。
3、固体样品采样方法.
大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，并注意其代表性；
. 小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。
. 若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。
4、冷冻食品采样方法
.大包装小块冷冻食品按小块个体采取；
.大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。 .若为检验食品污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质情况，应从深部取样。
5、生产工序监测采样
① 车间用水：从车间各龙头采样；
② 车间台面、用具、及加工售货员手的卫生监测：用5cm2孔无菌采样板和5支无菌棉签擦拭25cm2面积，擦拭后立即用无菌剪刀将棉签头剪入无菌容器中。
③ 车间空气采样：将5个直径90mm的普通琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖 5min，然后盖盖送检。
（七）采样标签的填写
标签内容主要：
编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。
四.样品的送检要求
1、要快速运送：不要超过3小时；
2、若路途遥远，可在1~5℃低温下运送；
3、要注意防污染、防散漏、防变质；
4、要填写检验申请单。
五.样品的处理方法
（一）液体样品 （二）固体样品 （三）冷冻样品
(一)液体样品的处理
1.瓶装液体样品的处理
2.盒装或软塑料包装样品的处理
1.瓶装液体样品的处理
用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入 500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样 25mL检验。
2.盒装或软塑料包装样品的处理
将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品 25mL，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。
（二）固体样品的处理
1捣碎均质法 、2碎振摇法 、3研磨法 、4整粒振摇法 、5胃蠕动均质法
1.捣碎均质法
将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，8000~10000r/min均质1~2min即可。
2.剪碎振摇法
将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带 225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。
3.研磨法
将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。
4.整粒振摇法
直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶
中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。
（三）冷冻样品
冷冻样品，先将中样在0~4℃下解冻，时间不能超过18h，或在45 ℃下解冻，时间不能超过15min。再取检样25g做稀释处理。
六.致病菌检验参考菌群的选择
蛋及蛋制品：沙门氏菌、葡萄球菌、变形杆菌等
水产品海产品：链球菌、副溶血性弧菌
乳制品：沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、 蜡样芽胞杆菌
畜禽肉类：肠道致病菌和致病性球菌
米面类：蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、酵母霉菌等
罐头：耐热性芽胞杆菌、嗜热脂肪杆菌、大芽胞杆菌、凝值芽胞杆菌
七.样品的检验
（一）、收样：
1、收到样品后逐一核对验收，登记编号；
2、立即将样品放在冰箱或冰盒中，并积极做好准备工作。极做好准备工作。
（二）、检验
1、选择检验方法：
国内：国家标准
国外：国际标准：如FAO标准、WHO标准；
每个进口国的标准：如美国FDA标准、日本厚生省标准、欧共体标准等
2、检验要求
（1）按照标准操作规程进行检验操作，边工作边做原始记录。
（2）检测结束，连同结果一起交同条线技术人员复核。复核过程中发现错误，复核人应通知检测人更正，然后重新复核。
（3）检测人和复核人在原始记录上签名，并编写 “检测报告底稿”
（4）所有检测项目完成后，检测人员将原始记录、样品卡、报告书底稿交科主任作全面校核。
3、样品的保留
（1）阴性样品：在发出报告可及时处理；
（2）阳性样品：在发出报告以后3天才能处理样品；
（3）进口食品的阳性样品：要保留6个月才能处理。
（4）微生物检验不进行复检
八、检验结果的报告
1. 经审核后的报告底稿、样品卡、原始记录，上交打印正式报告二份。
2. 将报告正本交审核人及批准人签名，并在报告书上盖上“检验专用章”CMA章和中心公章后对外发文。
3.收文科室或收文人要在检测申请书上收件人一栏内签字，以示收到该报告的正式文本。
4. 在报告正式文本发出前，任何有关检测的数据、结果、原始记录都不得外传，否则作为违反保密制度论处。
复习题
1、在微生物检验中，检验前要做好哪些准备工作？
2、在微生物检验中，采样时要遵守哪些要求？
3、在微生物检验中，样品的送检有哪些要求？
4、在微生物检验中，如何进行样品的保留？
第六章 食品的卫生细菌学检验
二、菌落总数测定的意义
1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。。
2、预测食品存用的期限长短。、预测食品存用的期限长短。
3、了解细菌在食品中的繁殖动态。、了解细菌在食品中的繁殖动态。
三、菌落总数测定的方法
平板倾注法平板倾注法、平板表面涂布法平板表面涂布法、平板表面点滴法平板表面点滴法
四、平板倾注法测定菌落总
检验步骤检验步骤(程序程序)：
检样检样→稀释处理→做平板→培养→菌落计数→报告结果
（一）、样品稀释及做平板
检样从开始稀释到倾注最后一个平皿检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。
（二）培养
普通食品普通食品:37℃ 48h倒放平板
清凉饮料、调味品、糕点、酒类： 37℃ 24h
水产品: 30℃ 48h
（三）计数和报告
到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过 24h。
1、菌落的选择、菌落的选择
（1）单个菌做一个菌落计
（2）呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。
（3）如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。
2、平板菌落计数的选择
（1）选取菌落数在30～300之间的平板之间的平板（SN标准要求为25～250个菌落），若有二个稀释度均在30～300之间时，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较则其较小数字。
（2）如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数，乘以稀释倍数报告
（3）如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘，稀释倍数报告
（4）如菌落数有的大于300，有的又小于，有的又小于30，不在30～300之间，以最接近之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告
（5）如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。
3、菌落数的报告
菌落数在1～100时，按实有数字报告，
1)如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算
2)固体检样以克（g)为单位报告，为单位报告，
3)液体检样以毫升（ml）为单位报告，
4)表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。
(四)、检验注意事项
1、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；
2、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分；
3、吸管插入试样液内的深度不得小于2.5cm,调整时要使管尖与容器内壁紧贴时;
4、进行稀释时,吸管口不得与稀释液接触;
5、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min.
6、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。
复习题
1、什么是菌落总数？
2、测定食品、饮料等产品的菌落总数有什么意义？
3、在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？
5、在菌落总数的检验中，要注意哪些事项？
6、在菌落总数的检验中，如何根据样品的特性选择培养温度和时间？
第二节食品中大肠菌群的检验
一、大肠菌群
1、什么是大肠菌群？
指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。
2、大肠菌群的组成:
大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。
11、粪便污染的指标菌：、粪便污染的指标菌：
大肠菌群或大肠杆菌大肠菌群或大肠杆菌
二、大肠菌群的测定意义
1、粪便污染的指标菌：
大肠菌群或大肠杆菌
2、以大肠菌群作为粪便指标菌原因
1)在粪便中数量最大；
2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；
3)检测方法简便容易。
3、大肠菌群的测定意义
（1）、判断食品中否受到粪便污染。
（2）、有利于控制肠道传染病的发生和流行。
（3）、有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。
三、大肠菌群的生物学特性
1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。
2.发酵乳糖产酸产气
3.培养特性：在ＥＭＢ琼脂上的典型菌落培养特性：呈深紫黑呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表色光滑，常有金属光泽；
在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润
大肠杆菌、大肠菌群选择性显色培养基--COLI ID：用于在37℃下对食品中大肠菌群和大肠杆菌进行检测、计数及大肠杆菌的鉴定
四、大肠菌群检验方法及操作方法
国家标准：
三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)
行业标准：
两步法：推测试验→证实试验
五、粪大肠菌群的检验
粪大肠菌群粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产
六、检验注意事项
1、从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
2、对产酸但未看到气泡的乳糖发酵，用手轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。
3、挑选菌落进行证实试验时，最少要挑2个以上的典型菌落或非典型菌落进行接种。
4、不可用其他胆盐代替指定的胆盐。
第七章 肠道致病菌的检验与鉴定
第一节 概述
一、食品中常见的肠道致病菌：沙门氏菌
二、生物学特性
1、形态与染色
均为革兰氏阴性杆菌，中等大小，无芽胞，多数具有周身鞭毛，能运动，志贺氏菌属无鞭毛无动力。
2、培养和生化反应
（1）、需氧或兼性厌氧，菌落中等大小，表面光滑，液体培养基混浊生长。
（2）、肠道致病菌一般不分解乳糖，而非致病菌多能分解乳糖、葡萄糖产酸或产酸产气。
（3）、可还原硝酸盐为亚硝酸盐。
三、抗原类型
四、致病性
（一）、致病物质
1、内毒素：能引起机体发热，白细胞减少，低血糖，血压降低，严重者休克。
2、外毒素：对小肠粘膜细胞具有物殊毒害作用，引起腹泻。
（二）、所致病疾
1、伤寒和副伤寒 、2、食物中毒 、3、细菌性痢疾
五、微生物检验的基本程序
检样→处理→增菌培养→分离培养→生化试验→血清学鉴定→报告
思考题
1、肠道致病菌具有哪些生物学特性?
2、肠道致病菌具有哪些抗原？又称为什么？有什么特点？
3、写出肠道致病菌检验的基本程序
第二节、沙门氏菌检验
一、概况
（一）沙门氏菌的发现与食物中毒
（二）沙门氏菌的命名
根据所致疾病命名、根据菌的发现地区命名、以发现者的名字命名
（三）沙门氏菌的抵抗力
60℃30′可杀死
（四）沙门氏菌的分类地位及定义
1、地位：是肠杆菌科、埃希氏菌族、沙门氏、菌属中的细菌
2、定义：是肠杆菌科中形态和培养特征，生化反应及抗原结构相似，被O1噬菌体裂解的一群革兰氏阴性杆菌。
二、生物学特性
（一）、形态与染色：
革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽胞，多数有鞭毛，有动力，短小杆菌。
（二）、培养特性
1、需氧或兼性厌氧，最适温度37℃，PH7.2~7.4
2、对营养要求不高，在普通培养基生长良好，37℃，24h，能形成菌落中等大小，直径2～3mm，圆形或卵形，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐的菌落
（三）、生化特性
1、发酵GLU，甘露醇，山梨醇产酸产气（伤寒鸡伤寒沙门氏菌少数不产气）
2、不发酵乳糖，蔗糖，侧金黄花醇
3、多数产生、多数产生H2S（+），不产靛基质（-），不分解尿素（-），不产生乙酰甲基甲醇（V—P）（-），
4、能还原硝酸盐为亚硝酸盐（+）
5、在KCN培养基中生长（-），苯丙氨酸脱氨酸（-）
（四）、抗原结构
主要两种：A、O抗原 B、H抗原 C、表面抗原（K抗原） D、菌毛抗原
2、O抗原
（1）O抗原的表示方法
共有58种，用字母O和阿拉伯数字标记：O1、O2、O3、O44
如：伤寒杆菌：O9、O12
（2）沙门氏菌的分群及表示方法
用大写字母及相关符号表示：A、B、C、D、E、F„„Z、O51 ~O63、O65~ O67
（3）沙门氏菌中的主要菌群及其群特异性抗原
A群-O2 ；B群-O4；C群-O6 ：C1群-O7、C2群-O6 O8、C3群-O8、C4群-O6 O7 O14 ；D群-O9 ；F群-O11 ；E群-O3 ：E2群-O3、O10族、E3群-O3、O15 、E4群-O1、O3、O19
3、H抗原（鞭毛抗原）
耐热性差：60℃15′或酒精处理可破坏
沙门氏H抗原有两种：
第1相：特异相，用英文小写字母表示相：a、b、c„„z z1~z55
第2相：非特异相，用阿拉伯数字表示：1、2、3„„其中也有用小写字母a、n、x等表示。
4、表面抗原：
沙门氏菌有三种：Vi、M、5抗原、K抗原
Vi抗原位于菌体的最表层，包围了O抗原，可阻碍O抗原的血清学凝集试验。破坏Vi抗原：60℃ 30′，100 ℃5′
含有含有ViVi 抗原的抗原的沙门氏沙门氏菌：菌：
伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌
三、沙门氏菌食物中毒
（一）、引起食物中毒最常见的沙门氏菌：
鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌
（二）、易引起沙门氏菌中毒的食品
肉、蛋、乳类食品
行业关注：美国两种花生酱含沙门氏菌
(三)、中毒原因
1、食用病畜禽的肉制品食品、食用病畜禽的肉制品食品
2、病畜禽、带菌人和动物使食品受污染、病畜禽、带菌人和动物使食品受污染
3、用不洁净水外理食品、用不洁净水外理食品
(三)、中毒原因
1、食用病畜禽的肉制品食品
2、病畜禽、带菌人和动物使食品受污染
3、用不洁净水外理食品
（四）、临床病状（所致病菌）
1、肠热病：伤寒与副伤寒病，为慢性发热的菌血病。
由伤寒与副伤寒菌引起，潜伏期7~20天
2、急性肠胃类：主要症状：头痛、发热、恶心、呕吐、腹泻、出冷汗、及全身不适，病程腹泻、出冷汗、及全身不适，病程2~3天
3、败血病：高烧、寒战、厌食、局部发炎、由猪霍乱沙门氏菌等引起门氏菌等引起
四、微生物检验
（一）、基本步骤（程序）
检样→增菌（前增菌）→分离培养→生化试验初步鉴定→血清学反应最后鉴定→报告
1、前增菌：用无选择性的培养基使处于濒死状态的M恢复活力;
2、选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，基它细菌变到、选择性增菌抑制;
3、选择性平板分离培养：分离出所需的细菌;
4、生化试验：鉴定分离出来的细菌是否符合所检项目的细菌;
5、血清学鉴定：进一步鉴定。
（二）、检验操作关键点
1、增菌：使待检菌复壮，抑制杂菌生长，提高检出率。
前增菌：用于加工过的食品，37℃4~8h或18~24h，长有杂菌。
增菌培养基：增菌液一般用增菌培养基：MM和SC两种，如可能是伤寒沙门氏菌用TTB，用42℃培养。
2、平板分离
选择性培养基BS、DHL、HE、WS、SS BS中最好，DHL、HE、WS很好，SS最差
一般要用：BS和WS/SS两个平板，BS主要用于伤寒沙门氏菌的分离
3、五项生化试验
H2S、靛基质、PH7.2尿素酶、KCN、赖氨酸脱羧酶
（1）三糖铁培养的培养
典型沙门氏菌在三糖铁培养上的特征：
表面（-）粉红色、底层（+）黄色、H2S （+）底层有黑色、动力。
在TSI培养基中：表面（+）黄色、H2S （-）的培养物可排除，其它培养物均有可能是沙门氏菌。
（2）其余四项生化实验
靛基质靛基质、PH7.2尿素酶、KCNK、赖氨酸脱羧酶
反应序号A1A2多见，B1少见
（3）、典型沙门氏菌的五项生化反应及其检验的利用
A、典型五项生化反应：A1
H2S（+）靛基质（-）PH7.2尿素酶（-）KCN（-）赖氨酸脱羧E（+）
B、利用五项生化反应鉴定沙门氏菌的最简单方案
a、对于H2S阳性菌，利用五项生化反应试验可判别沙门氏菌和柠檬酸杆菌。
b、对于H2S阴性菌，查到B1时即：
H2S（-）靛基质（-）PH7.2尿素酶（-）KCN（-）
赖氨酸脱羧E（+），补做ONPE试验，可判定沙门氏菌属和埃希氏菌属（ONPE（-）为沙门氏菌，ONPE（+）大肠艾希氏菌
5、血清学试验（最后鉴定）
（1）、沙门氏菌诊断血清的种类：）
10种组合血清：主要用于伤寒和副伤寒沙门氏菌鉴定
26种组合血清：常见致病菌的定群与分型
57种组合血清：常见定型，初步鉴定A—F群以外的菌型
144种组合血清：全套装
（2）、血清学检验步骤
抗原准备→A-F多价血清检验（判定是否是沙门氏菌）→群特异性抗体血清（如O2、O4、 O3、O7、O8、O9、O10、O11（判定O群别）→O单因子血清检查→H因子血清检查（分型）→报告
五、检验结果的报告
1、凡血清学鉴定与生化反应均符合者，报告发现沙门氏菌。
经检验××××食品发现有沙门氏菌
2、凡血清学鉴定与生化反应均不符合者，报告未发现沙门氏菌。
思考题：
1、典型沙门氏菌的五项生化试验结果如何？
2、沙门氏菌的形态特征，培养特性是什么？
3、沙门氏菌检验时为什么要进行前增菌和增菌？
4、沙门氏菌有哪些抗原？各有何特点？O、H抗原如何表示，A—F群沙门氏菌中，代表每群O特异性抗原的独特因子是什么？
第八章 食品中霉菌、酵母菌数的测定
一、检验程序
检样→处理→稀释→平板分离培养 →菌落计数→报告
二、操作要点
（一）、采样
1、粮食（包括粮库贮粮，粮店或家庭小量存粮)
根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，一般可分三层五点，或分层随机采取不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检。小量存粮可使用金属小勺采取上、中、下各部位的混合样品。
2、海运进口粮、
.每一船仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓盛粮超过10000t，则应加采一个样品。必要时采取有疑问，的样品送检。
3、谷物加工制品(包括熟饭、糕点、面包等)、发酵食品、乳及乳制品以及其他液体 用灭菌工具采集可疑霉变食品250g，装入灭菌容器内送检。
（二）、样品处理（稀释）
1、以无菌操作称取检样、25g(或25mL)，放入含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。
2、用灭菌吸管吸取1∶10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。
3、取1mL1∶10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为1∶100稀释液。
（三）、培养
倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察，共培养5d。
（四）、计数
选取菌落数10～150之间的平板进行计数。（稀释度选择和菌落报告方式参考菌落总数的测定）
食品微生物检验的任务和内容
任务
通过测定微生物指标，判断食品在加工环境和食品原料及其在加工过程中被微生物污染及生长的情况，为食品环境卫生管理和食品生产管理及某些传染病的防疫措施提供科学依据。 检验的范围
1、生产环境的检验 2、原辅料的检验 3、食品加工、储藏、销售环节的检验 4、食品检验（重点）
食品微生物检验的指标
食品微生物检验的指标就是根据食品卫生的要求，从微生物学的角度，对不同食品所提出的与食品有关的具体指标要求。我国卫生部颁布的食品微生物指标有菌落总数、大肠菌群和致病菌三项。
菌落总数：清洁状态的标志；预测食品可能存放的期限.
大肠菌群(MPN/100ml):较为理想的粪便污染的指标菌群；作为肠道致病菌污染食品的指示菌.
致病菌(不得检出）：沙门氏菌、肉毒梭菌、志贺氏菌、变形杆菌、副溶血性弧菌、葡萄球菌、霉菌
霉菌及其毒素：我国还没有制定出霉菌的具体指标，鉴于有很多霉菌能够产生毒素，引起疾病，故应该对产毒霉菌进行检验。例如：曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等，青酶属的桔青酶、岛青酶等，镰刀酶属的串珠镰刀酶，禾谷镰刀酶等等。
其它指标：微生物指标还应包括病毒，肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马立克氏病毒、口蹄疫病毒，狂犬病病毒，猪水泡病毒等；
另外，从食品检验的角度考虑，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标：如旋毛虫，囊尾蚴，住肉孢子虫、蛔虫，肺吸虫，弓形体，螨，姜片吸虫，中华分枝睾吸虫等.
微生物检验流程图：无菌取样—样品均质—样液稀释—样品接种—恒温培养—结果观察食品微生物检验条件
学习目标：
1、了解微生物检验室的基本要求，通过学习，能独立建设一般的食品微生物检验室。
2、认识和熟悉微生物检验中常用仪器设备（尤其是普通光学显微镜）及其结构与性能，能正确使用和进行一般的维护。
3、认识和熟悉微生物检验中常用玻璃器皿，掌握灭菌消毒的技术要求。
微生物检验室：
微生物检验室要求高度清洁卫生，要尽可能地为其创造无菌条件。为达此目的，房屋的墙壁和地板，使用的各种家具都要符合便于清洗的要求。
实验室管理制度：
1．实验室应制定仪器配备管理使用制度，药品管理使用制度，玻璃器皿管理使用制度，并根据安全制度和环境条件的要求，本室工作人员应严格掌握，认真执行。
2．进入实验室必须穿工作服，进入无菌室换无菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。
3．实验室内物品摆放整齐，试剂定期检查并有明晰标签，仪器定期检查、保养、检修, 严禁在冰箱内存放和加工私人食品。
4．各种器材应建立请领消耗记录，贵重仪器有使用记录，破损遗失应填写报告；药品、器材、菌种不经批准不得擅自外借和转让，更不得私自拿出，应严格执行《菌种保管制度》。
5．禁止在实验室内吸烟、进餐、会客、喧哗，实验室内不得带入私人物品，离开实验室前认真检查水、电、暖气、门窗，对于有毒、有害、易燃、污染、腐蚀的物品和废弃物品应按
有关要求执行。
实验注意事项
..每次实验前了解实验目的、原理和方法。初步熟悉实验操作的主要步骤和环节，对整个实验的安排做到先后有序、有条不紊和避免差错。
..非必要的物品不要带进实验室，必须带进的物品（包括帽子、围巾等）应放在不影响实验操作的地方
..每次实验前须用湿布擦净台面，必要时可用0.1％ “新洁尔灭”溶液擦。实验前要洗手以减少染菌的概率。
微生物实验中最重要的一环，就是要严格地进行无菌操作，防止杂菌污染。为此，在实验过程中，每个人要严格做到以下几点：
–操作时要预防空气对流：在进行微生物实验操作时，要关闭门窗，以防空气对流。 –接种时不要走动和讲话：接种时尽量不要走动和讲话，以免因尘埃飞扬和唾沫四溅而导致杂菌污染。
–含菌器具要消毒后清洗：凡用过的带菌移液管、滴管或涂布棒等，在实验后应立即投入5%石炭酸或其他消毒液中浸泡20min，然后再取出清洗，以免污染环境。
–含培养物的器皿要杀菌后清洗：在清洗带菌的培养皿、三角瓶或试管等之前，应先煮沸10min或进行加压蒸汽灭菌。
–要穿干净的白色工作服：微生物学工作者在进行实验操作时应穿上白色工作服，离开时脱去，并经常洗涤以保持清洁。
.凡须进行培养的材料，都应注明菌名、接种日期及操作者姓名（或组别），放在指定的温箱中进行培养，按时观察并如实地记录实验结果，按时交实验报告。
.实验室内严禁吸烟，不准吃东西，切忌用舌舔标签、笔尖或手指等物，以免感染。 .节约药品、器材和水、电、煤气。
.各种仪器应按要求操作，用毕按原样放置妥当。实验完毕，整理和擦净台面，离开实验室之前要用肥皂洗手。
实验注意事项
..冷静处理意外事故：
打碎玻璃器皿：如遇因打碎玻璃器皿而把菌液洒到桌面或地上时，应立即以5%石炭酸液或0.1%新洁尔灭溶液覆盖，30min后擦净。若遇皮肤破伤，可先去除玻璃碎片，再用蒸馏水洗净后，涂上碘酒或红贡。 菌液污染手部皮肤：先用70%乙醇棉花拭净，再用肥皂水洗净。如污染了致病菌，应将手浸于2％～3％来苏尔或0.1%新洁尔灭溶液中，经10～20min后洗净。
菌液吸入口中：应立即吐出，并用大量自来水漱口多次，再根据该菌的致病程度作进一步处理：
非致病菌：用0.1％高锰酸钾溶液漱口。
一般致病菌（葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌等）：用 3％H2O2、0.1％高锰酸钾溶液0.02％米他芬液漱口。
致病菌：如吸入白喉棒杆菌，在用②法处理后，在注射1000U白喉抗毒素作紧急预防；若吸入伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌或霍乱弧菌等肠道致病菌，在经②法处理后，可注射抗生素预防发病。
..衣服或易燃品着火：应先断绝火源或电源，搬走易燃物品 (乙醚、汽油等)，再用湿布掩盖灭火，或将身体靠墙或着地滚动灭火，必要时可用灭火器。
..皮肤烫伤：可用5％鞣酸、2％苦味酸（苦味酸氨苯甲酸丁酯油膏）或2％龙胆紫液涂抹伤口。
..化学药品灼伤
.强酸、溴、氯、磷等酸性药剂：先用大量清水洗涤，再用5％NaHCO3或5%NaOH中和。 .NaOH、金属钠（钾）、强碱性药剂：先用大量清水洗涤，再用5％硼酸或5％乙酸中和 .石炭酸：用95％乙醇洗涤
.如遇眼睛灼伤：则应先用大量清水冲洗，再根据化学品的性质作分别处理，例如，遇碱灼烧可用5％硼酸洗涤，遇酸灼烧可用5％NaHCO3洗涤，在此基础上再滴入1～2滴橄榄油或液体石蜡加以润湿即可。
检验室建设要求
.选址与规模
（1）化验室应建设在远离粉尘、噪声、散发异味气体等地点，电源电压应当相对稳定的地点。根据企业规模和产品种类，应建设不同要求的化验室。但是，最小建筑面积：理化检验室不能小于30平方米；微生物检验室（无菌室）不能小于8平方米。这样有助于仪器设备的合理摆放，便于操作，便于样品流通和空气流通。
（2）室内应有足够的照明条件。
（3）室内必须配置干粉或二氧化碳灭火器，以备电器或化学品燃烧灭火使用。
室内的布局
(1)动仪器与静仪器分开：精密仪器（如光度计、天平、比色计、酸度计、色谱仪等）应必须与震动仪器（如震荡器、验粉筛、离心机、搅拌器等）。
(2)常温与热源设备分开：热源仪器（如电热蒸馏水器、恒温干燥箱、高温电阻炉、恒温培养箱、水浴锅、电炉等）必须与其它一切设备分开，不然会影响其它设备的正常使用，严重的会造成热蒸汽腐蚀其它设备，影响其使用寿命。
(3)化学分析台与热源设备分开：化学分析台面上应尽量少放易燃和腐蚀性试剂。使用电炉或酒精灯加热时应坚持有人看管和监视。化学分析台的摆放应远离热源设备。
1.办公台2.文件柜 3.样品柜 4.通风橱5.实验边台6，7.无菌台8.天平台
9.在落地仪器区再加个高温仪器台，放高压灭菌锅、干燥箱、水浴锅、电热板等
微生物实验室主要设备和器具
1、无菌室（接种室）或接种箱2、恒温箱3、电烘箱（干燥箱）4、冰箱5、高压蒸汽灭菌锅 6、离心机 7、接种针 8、天平 9、酒精灯 10、显微镜 11、常用玻璃器皿 12、均质器、试管夹，吸管，移液枪，脱脂棉，牛皮纸，棉绳，纱布，剪刀
第二章 食品微生物检验常用的仪器
一、常用仪器及其使用
.显微镜 .冰箱 .超净工作台、杀菌锅 .离心机 .水浴锅、培养箱 .烘箱或干燥箱 .各种玻璃器材
（一）显微镜
普通显微镜的保养
1、观察完后，移去观察的载玻片标本。
2、用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着擦镜液擦拭2—3 3次，最后
再用擦镜纸将二擦镜液苯擦去。
3、转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。
4、将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。
1.普通光学显微镜：
通常以自然光或灯光为光源， (其波长约 0.5μm。在最佳条件下，显微镜的最大分辨率为波长的一半，即0.25μm，而肉眼所能看到的最小形象为0.2mm，故在普通光学显微镜下用
油镜放大1000倍，可将0.25 μm的微粒放大到0.25mm，肉眼便可以看清，一般细菌大于0.25μm，)故用普通光学显微镜均能清楚看到。
2.暗视野显微镜：
用特制的暗视野集光器代替普通光学显微镜上的明视野集光器，背景视野黑暗无光，而从集光器四周边缘斜射到标本部位的光线，经菌体散射后而进入物镜。故在强光的照射下，可以在黑暗的背景中看到发亮的菌体，犹如夜空中的明亮星星。多用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运动观察。
3.相差显微镜：
在进行未染色标本检查时，由于细菌的折旋光性与周围环境的折旋光性相近，明暗对比不明显。在普通光学显微镜下不易看清，用暗视野显微镜只能看到发亮的菌体轮廓，看不清内部结构。而相差显微镜依据光波穿过标本中密度不同的部位时，引起光相差异的原理，利用相差板的光栅作用，改变直射光的光相和振幅，将光相的差异转换成光的强度的差异，使细菌中的某部分结构比其他部分深暗，衬托出鲜明的对比。 主要用于检查不染色活细菌的形态及某些内部结构。
4.荧光显微镜：
荧光显微镜以紫外光或蓝紫光为光源，能激发荧光物质发光使之成为可见光。细菌经荧光色素染色后，置于荧光显微镜下，即可激发荧光，因此在暗色的背景下可以看到发射荧光的细菌。 由于紫外光与蓝紫光的波长较短（0.3～0.4 μm），故分辨率得到进一步提高。荧光显微镜还广泛应用于免疫荧光技术中。
5.电子显微镜：
电子显微镜以电子流代替光源，其波长极短（约为0.005nm），分辨能力大大提高，电磁圈代替普通显微镜的光学放大系统，放大倍数可达数万至数十万倍，能分辨lnm的物体，细菌的表面形态和内部超微结构均能清楚地显现。
（二）、培养箱
1.智能隔水恒温培养箱 2.隔水培养箱 3.电热培养箱 4.生化培养箱
智能培养箱
微电脑智能化双目控温系统具有控温保护、准确、可靠。工作温度任意调节并具有偏差报警功能，镜面不锈钢内胆，外门内层用一层门，观察箱内情况时不影响箱内温度。9000系列隔水式加热方式，具有温度均匀且断电后仍能保持较长时间恒温。
隔水式培养箱
数字控温，不锈钢内胆，俗称水夹套培养箱。温度均匀，断电后仍能保持较长时间恒温。 电热恒温培养箱
2、生化培养箱
3、二氧化碳培养箱
培养箱的配置和使用
配置：22（℃）、30（℃）、37（℃）培养箱各一个
使用注意事项：
(1)箱内不能放入过热或过冷的物品，取放物品时应快速进行并做到随手关闭箱门。
(2)内放一杯水，以保持湿度。
(3)培养物不能放在最底层，也不得放置过于拥挤。
(4)每月消毒一次，先用3%的来苏尔液涂布消毒，再用清水擦净。
(5))不得当烘箱使用。
（1）37℃和42℃水浴锅24小时工作；
（2）其余水涡锅用后关掉电源；
（3）水浴锅内应注加蒸馏水而非自来水，使用时请注意水位。
配置： 37℃、42℃、56℃各一个
（三）匀质器
无菌均质器 该均质器广泛用于动物组织、生物样品、食品、化妆品的均质处理，特别适合于微生物检测样本的制备，具有均质柔和、样品无污染、无损伤、不升温、不需灭菌处理、不需洗刷器皿的特点，样本装在特制的一次性无菌均质袋中，不与仪器接触，预防交叉污染。 高速匀浆机
（四）超净工作台
三大类型：侧流式、直流式和外流式(根据气流的方向)。
垂直流工作台由于风机在顶部所以噪音较大但是风垂直吹多用在医药工程这样保证人的身体健康；
.水平流工作台噪音比较小风向往外所以多用在电子行业，对身体健康影响不大。 根据操作结构分为单边操作及双边操作两种形式，按其用途又可分为普通超净工作台和生物(医药)超净工作台。
超净台的使用和注意事项
1、使用前先打开紫外灯照射，紫外线照射时间40~60分钟；
2、使用中，有机玻璃罩受到污染，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭；
3、保持超净台整洁，不要堆积杂物；
4、使用完毕，勿忘关闭煤气开关或酒精灯；
5、学期开始做无菌试验一次，以保证净化台正常使用。平时可根据情况，定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。
（五）、离心机
.离心机的类型：
.普通离心机
.高速离心机
.超速离心机
转子
许多离心机可以配用不同大小的离心管，只需要改变转子或使用一个与不同的吊桶/适配器相配的转子。
1．水平转子：盛样品的离心管放在吊桶内，以转子的加速度运转。水平转子用于低速离心机，其主要缺陷是延长了沉淀的路径。同时，减速过程中产生的对流会引起沉淀物的重新悬浮。
2．角式转子：许多高速离心机及微量离心机安装。由于沉降路径短，沉淀颗粒时角式转子比水平转子的效率更高。
3．垂直管转子：用于高速及超高速离心机进行等密度梯度离心时。这种转子在沉淀没有形成之前不能用来收集悬浮液中的颗粒。
（六）、灭菌器
.干热灭菌器
.湿热灭菌器
1、电烘箱（干燥箱）
用途：①用于玻璃器皿等耐热物品的烤干和灭菌。②玻璃器皿等物的灭菌，温度160~165℃，灭菌 2小时。
玻璃器材的干热灭菌方法
(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用报纸包好，或装入特制的铁筒中。
(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。
(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。
(4)待箱内空气排出到一定程度时，关闭上排气孔，继续加热至一定温度后，调节温度控制旋钮固定温度，在160℃—165℃保持2小时即可。
(5)待自然降温冷却后(60℃以下)才能开门取出玻璃器皿。
2、高压灭菌锅
.用途：培养基、生理盐水、废弃物、采样器、纱布、衣物的灭菌。
.种类：手提式、立式、卧式杀菌锅
使用高压蒸汽杀菌锅的注意事项
A：为避免烫伤，温度降低到70℃以下时小心的打开消毒锅门。
B：为避免消毒锅冷却后消毒室内产生负压而打不开消毒锅门，所以当消毒室温度低于70℃时就可慢慢把门打开。
C：根据消毒物品选择排气方式：
（1）.如有液体（营养液等）请选择慢排。
（2）.如只有废品等可选择快排。
手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法：
（1）、关好排水阀门放入清水至标度为止。
（2）、将要灭菌的物品用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中，关上器盖。
（3）、通电加温，同时打开排气活门，排尽锅内的空气，再关闭活门。
（4）、当达到所需温度时开始计时，并在此温度下保持所需的时间。
（5）、稍微打开一点排气活门，使锅内蒸气缓慢排除。
（6）、当压力表指针降到零、锅内蒸气完全排尽时，立即打开锅盖取出物品。
（7）、最后将高压灭菌器内的剩余水排出。
3、滤菌器
①用以除去细菌的器具
②它含有微细小孔，只允许液体及气体通过，而大于孔径的物体不能通过。
③滤菌器可以除去细菌，但不能除去病毒、支原体、衣原体及细菌L型等微生物。
（七）、普通冰箱冰柜
1、取用冰箱冰柜内物品尽可能快，取完后及时将有用物品放回原处；
2、关冰柜门时应轻轻合上，同时将门轻轻往外拉一下检查是否关好;
3、冰柜内的不要样品应及时清理。
快速自动菌数导电测定仪：1、可直接测读菌体本身在培养液中造成的导电度变化，或利用菌体在代谢过程中的产物所造成的导电度变化，快速测定样品中细菌含量数目。
2、适用于各种食品，制药，石化工厂的微生物品质管理，取代传统方法将侦测时间由3-5天减到几个小时。亦可用于做样品的抗菌性试验。
二、常用玻璃仪器及用具
（一）量器类
1、移液管：1ml，2ml，5ml，10ml，25ml
2、容量瓶：50ml，100ml，250ml，500ml，1000ml
3、量筒 容量: 10ml、25ml、50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml等
4、微量取样器
数字型可调移液器P型 、固定体积移液器
（二）、其他常用玻璃器皿
1、培养皿
2、试管
各种试管的使用 ：
13mmX100mm：生化反应及凝集反应
15mmX150mm：斜面培养
18mmX180mm：检样稀释
3、三角瓶
烧杯 容量（ml）： 30、50、100、150、250、400、600、1000、2000、3000
三、玻璃器皿的清洗和灭菌
(一)、新购的玻璃器皿
1、先用热肥皂水刷洗，流水冲净。
2、再浸泡于１～２％的盐酸中数小时，最后用流水冲净。
(二)、用过的玻璃器皿
1、含油脂器材的清洗
（1）、单独高压灭菌；
（2）、趁热倒去污物；
（3）、倒放在铺有吸水纸的篮子上，置 100℃烘箱中烤0.5h;
（4）、再用5%的碳酸氢钠水煮两次，再用肥皂水刷洗干净。
2、含菌试管的清洗
.高压灭菌后，肥皂水刷洗干净，烘干或晾干备用。
3、含菌平皿的灭菌
（1）、底盖分开放，放入桶中，高压灭菌；
（2）、趁热倒去污物；
（3）、肥皂水刷洗干净，烘干或晾干备用。
4、含菌吸管的清洗
（1）、把含菌吸管投入3%的来苏尔液内浸泡30min以上杀菌；
（2）、用肥皂水洗涤一次；
（3）、最后用清水冲洗干净即可。
5、载玻片及盖玻片的清洗
（1）将载玻片及盖玻片分别浸入5%的来苏尔液内浸泡过夜，取出水洗干净；
（2）盖片用软布擦干即可；
（3）染色用的载玻片要放入肥皂水中煮沸10min，再用肥皂水刷洗干净，最后用9%的酒精浸泡片刻，晾干备用。
（三）、玻璃器材的灭菌
（1）清洗后烘干；
（2）加塞包扎；
（3）灭菌:
干热灭菌:160-165℃烘箱中烤2h
湿热灭菌:121℃ 20min
细菌形态学检验技术
..细菌形态学检验内容：菌体形态、大小、排列、特殊结构
..细菌形态学检查方法：不染色细菌标本检查法和染色细菌标本检查法
..不染色的细菌标本的镜检可直接观察到细菌活体的形态、大小、运动（了解菌是否有鞭毛） ..悬滴法和压滴法
不染色细菌标本检查法－－悬滴法
制备菌液:从幼龄菌斜面上，挑数环菌于盛有1－2ml无菌水的试管中，制成轻度浑浊的菌悬液。
涂凡士林：取洁净无油的盖玻片1块，在其四周涂少量的凡士林。
滴加菌液：：加1滴菌液于盖玻片的中央，并用削尖的记号笔在菌液的边缘做一记号，以便在显微镜观察时，易于寻找菌液的位置。
盖凹玻片：将凹玻片的凹槽对准盖玻片中央的菌液，并轻轻地盖在盖玻片上，使两者粘合在一起，然后翻转凹玻片，菌液正好悬在凹槽的中央，再用火柴棒轻压盖玻片使四周边缘闭合，以防菌液干燥。
镜检:先用低倍镜找到标记，再稍移凹玻片即可找到菌悬滴的边缘，然后将菌液移到视野中央。由于菌体是透明的，镜检时可适当缩小光圈或降低聚光器，以增大反差，便于观察。镜检时要仔细辨别是细菌的运动还是分子运动（即布朗运动）
不染色细菌标本检查法－－压滴法（水封片法）
制水封片：加1滴菌液于洁净无油的载玻片中央，然后取1滴洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，再慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。若镜检好氧菌时，应在水封片中留1～2个小气泡，然后再观察气泡四周细菌的运动能力，否则因盖玻片内供氧不足而抑制了细菌的运动。
镜检：先用低倍镜观察，然后再转至高倍镜或油镜下观察，观察的要求同悬滴法。 不染色细菌标本检查法－－注意事项
结果记录 菌名
普通变形杆菌
铜绿假单胞菌
黄色金葡萄球菌 悬滴法或水封片法 细菌的运动方式 判断有、无鞭毛
注意事项
1、检查细菌运动的载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则将影响细菌的运动
2、制水封片时，菌液不可加得太多，因过多的菌液会盖玻片下流动，从而影响了对细菌正常运动的观察。
染色细菌标本检查法－－染料
细菌染色用的染料
酸性染料（阴离子染料）：染色离子带阴电荷，能与带阳电的物质结合，使之着色。降低菌液的pH而使细菌带阳电时，就可用酸性染料染色。（伊红、刚果红）
碱性染料（阳离子染料）：与带负电的物质结合，细菌一般带负电，，所以细菌染色所用的染料，常用碱性染料（碱性复红、美蓝）。
复合染料：碱性染料与酸性染料的结合物（伊红美蓝、伊红天青）。
单纯染料：不能与被染物生成盐类
影响染色的因素
细菌的结构：细胞壁的结构、细胞膜的通透性、膜孔的大小
培养基：组成、菌龄、pH等
染色细菌标本检查法－－制片方法
制片：（制片是染色的关键，如不注意菌体涂布的均匀度，会造成染料的大面积堆积，而使观察结果不理想）
.制片：在干净的载波片（平时放在95%酒精中)上滴一滴蒸馏水或无菌水，用接种工具进行无菌操作，挑取培养物少许，置载玻片的水滴中与水混合做成悬液，并涂成直径约1cm的薄
层。若材料为液体培养物或自固体培养物中洗下制备的菌液，则可直接涂布于载玻片上。涂布要均匀，菌体间少重叠。
. 干燥：涂布最好在室温下使其干燥，有时为之使之干燥得快些，小心地在酒精灯火焰高处微微加热。
. 固定：标本干燥后即进行固定，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快地来回通过3～4次，共2～3s，并不时以载玻片的加热面触及皮肤，其目的：杀死微生物，固定细胞结构；保证菌体能牢固地黏附在载玻片上，防止标本被水洗掉；改变染料对细胞的通透性，因为死细胞的原生质比活细胞的原生质易于染色。
注意事项：
..载玻片要洁净无油，否则菌液涂不开，且固定效果不好，水洗时易被水冲掉。
..为避免因菌数过多聚成团而不利于观察个体形态，可在载玻片一端加一滴水，从已涂布的菌液中再取一环于水滴中进行稀释，涂布成薄层。
..干燥时，切勿靠火焰太近或加热时间过长，以防标本烤枯而使菌体变形。染色细菌标本检查法－－染色分类
. 单染色法：用一种染色剂对涂片进行染色。该法简便易行，但仅能显示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构，适用于微生物的形态观察。
. 复染色法：主要的复杂染色法有革兰氏法和抗酸性及特殊染色法。因为细菌除了具有细胞壁、细胞膜、原生质和核等基本构造外,某些细菌还具有荚膜、芽孢、鞭毛和异染颗粒等特殊结构，这些结构不能被一般染色方法着色，必须用特殊的方法才能着色。
. 负染色法：负染色法是一种特殊的染色方法，是指背景着色而细菌本身不着色。一般使用酸性染料，如刚果红或水溶性苯胺黑。固定染色涂片可浸于酸性酒精中，因刚果红经酸性酒精处理后，涂片的背景便从红色（盐类的颜色）转变为蓝色（即刚果红游离的颜 色），这样可使对比性更为鲜明。
负染色法除用于观察细胞形态外，还可区别死菌与活菌，因死菌可被酸性染料着色，部分自溶的细菌也能轻度染上酸性染料，而活菌却不着色。
染色细菌标本检查法－－简单染色方法
染色细菌标本检查法－－革兰氏染色法
注意事项：
1、单一菌落染色后看到红色杆菌和紫色杆菌共存的情况，特别明显既有红色的，也有紫色的？
（脱色时间：受涂片之厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。
菌龄：选用培养18～24h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应）
显微镜观察：紫和红好象都是，焦距调的稍近时紫色，调的稍远时红色，两种情况下形状都看的挺清楚，杆状。关于颜色怎么确定的？
（对照：当确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合图片）
染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应甩去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
染色细菌标本检查法－－芽孢染色法
原理：
细菌的芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁较厚，对染料的透性差，不易着色，但是一旦着
色又难以脱色。芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿在加热条件下进行。染色完毕，用自来水冲洗。因孔雀绿是弱碱性染料，与菌体结合力较差，因此易被水洗掉，而进入芽孢中的孔雀绿却难以溶出。水洗后，再用一种呈红色的碱性染料复染使菌体和芽孢呈现不同的颜色。 方法与步骤
..制片：将培养24小时的细菌涂片、干燥、固定
..染色：将孔雀绿染色液滴加3～5滴于标本上。用试管夹夹住载玻片在火焰上加热约5min（当染料冒蒸汽时开始计时）。在加热过程中要随时加染色液，切勿煮沸或使样本干涸。 ..水洗：待载玻片冷却后，用自来水冲洗
..复染：用番茄红染色液染色1min。
..水洗、干燥，置于油镜下观察并绘图说明。
..结果
染色细菌标本检查法－－芽孢染色法
改良方法：.
制备菌液：加1～2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2～3环的菌苔于试管中并充分打匀，制成浓稠的菌液。
加染色液：加5％孔雀绿染色液2～3滴于小试管中，用接种环搅拌使染色液与菌液充分混合。
加热：将此试管浸于沸水浴中，加热15～20min。
涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的玻片上，并涂成薄膜。
固定：将玻片通过微火3次。
脱色：用水洗，直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
复染：加沙黄染色液，染2～3min后，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水吸干。 镜检：用油镜观察
结果纪录
染色细菌标本检查法－－芽孢染色法
注意事项：
1、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体内。巨大芽孢杆菌在37 ℃条件下培养12～14h效果最佳。
2、改良法在节约染料、简化操作及提高标本质量等方面都较常规法优越，可优先使用。
3、用改良法时，欲得到好的涂片，首先要制备浓稠的菌液，其次从小试管中挑取被染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片时菌体太少。
第三章 培养基和实验基本操作技术
第一节 培养基
一、培养基中的主要成分及其作用
（一）、营养物质 ：N源、C源、无机盐、生长因子、水
1、常用的N源物质
蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏
2、糖、醇类物质
单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖
双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖
多糖：淀粉、纤维素
醇类：甘露醇、甘油
（二）、水：用蒸馏水或离子交换水。
（三）、凝固剂
琼脂、明胶、血清等
要求：清一色、杂质少
（四）、抑制剂
1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率
2、种类：
盐类：氯化钠等
染色剂类：煌绿、结晶紫、孔雀绿、孟加拉
胆盐类：猪（牛、羊）胆盐
抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素
（五）、指示剂
1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。
2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等
二、培养基的类型
在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基(Media)。
由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。
（一）、根据培养基的物理状态来区分
固体培养基、液体培养基、半固体培养基
1、液体培养基
主要用于增菌培养、鉴别性培养主要用于增菌培养、鉴别性培养
2、固体培养基
用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等
3、半固体培养基
观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。
（二）、根据培养基的用途来区分
增殖培养基 、选择培养基 、鉴别培养基
1、增殖培养基
在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。
2、选择培养基
在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。
3、鉴别培养基
在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。
（三）培养基制备的基本方法和注意事项
1、培养基的制备记录 2、培养基成分的称取 3、培养基各成份的混合和溶化 4、培养基pH的初步调正 5、培养基的过滤澄清 6、培养基的分装 7、培养基的灭菌 8、培养基的质量测试 9、培养基的保存
1、培养基的制备记录
每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等。
记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。
2、培养基成分的称取
培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。
3、培养基各成份的混合和溶化
指示剂应在调节好PH值后再加入；煮溶后要补加足水份；不能把培养基煮焦，焦化的不能使用。
4、培养基pH的校正
灭菌后PH值会下降0.1～0.2，在做培养基校正PH值时，应比实际值高0.1～0.2；PH调整后，还应将培养基煮沸。
5、培养基的过滤澄清
液体培养基可用滤纸过滤法
琼脂培养基,可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤
６、培养基的分装
斜面： 1/5管
半固体培养基：1/3管
高层斜面：1/4～1/3管
平板：13-15ml
7、培养基的灭菌
（1）含糖类或明胶的培养基： 113℃灭菌15分钟或115灭菌10钟。
（2）无糖培养基： 121℃灭菌15~20分钟。
（3）血液、体液和抗生素等以无菌操作技术抽取后再加入冷却至约50℃左右的培养基中。
（4）琼脂斜面培养基应在灭菌后冷至55℃--60℃时取出，再摆置成适当斜面。
8、培养基的质量测试
（１）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。
（２）将全部培养基放入 36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。
（３）用有关的标准菌株接种 1~2管或瓶培养基，培养24～48小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。
9、培养基的保存
（1）基础培养基不能超过两周
（2）生化试验培养基不宜超过一周，
（3）选择性或鉴别性培养最好当天使用，倾注的平板培养基不宜超过3天。
第二节、微生物检验的基本操作技术
主要内容
.无菌技术
.微生物的接种与分离技术
.微生物的培养方法
.微生物的生长现象与观察
一、无菌技术
（一）什么是无菌技术
指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。
（二）无菌环境
无菌室 、无菌柜 、超净工作台
1、无菌室
（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间
（2）无菌室的消毒和防污染
.每日------紫外线照射。
.每周------甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）。
.每月------新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。
2、超净工作台
超净台的使用与保养:
（三）无菌器材
.灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等.
.消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等
（四）无菌操作
1、目的：
（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；
（2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。
2、进入无菌室前的准备
（1）、定期检查无菌环境的空气是否符合规定；
（2）、用紫外线灭菌处理30~60分钟；
（3）、检查无菌器材是否完备；
（4）、洗手消毒；
（5）、手部消毒后，再穿戴无菌工作服。
3、检验操作过程的无菌操作要求
（）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；
（）、使用玻璃器皿应轻取轻放。
（）、在正火焰上方操作；
（）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；
（）、在接种培养物时，协作应轻、准。
（）、不能用嘴直接吸吹吸管。
（）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。 无菌操作 –取菌技巧 1
1.接种环前端铁丝部分以酒精灯烧红来菌，后端铁棒部分过火
2.试管管前端过火
3.打开试管盖
4.试管傾斜，放入接种环
5.试管前端过火，盖上试管盖
6.接种环烧红灭菌
5.试管前端过火，盖上试管盖
6.接种环烧红灭菌
二、微生物的接种与分离技术
（一）、接种
.将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
１、接种工具和方法
1．接种针
2.接种环
3.接种钩
4.5.玻璃涂棒
6.接种圈
7.接种锄
8.小解剖刀
１）划线接种：在固体培养基表面作来回直线形的移动
２）三点接种：研究霉菌形态.把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它自独立形成菌落后，观察、研究它们的形态。
３）穿刺接种：保藏厌氧菌种或研究微生物的动力。
用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种：将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却固体培养基，迅速轻轻摇匀，培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种
６）液体接种
７）注射接种：用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种
８）活体接种：专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法
(二)、分离纯化
３、平板划线法
平板划线分离法
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
平板划线法： 1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。
2、划线方法
稀释混合平板法：
1、先加菌 2、倒平板时注意培养基温度 3、混合均匀
三、微生物的培养方法
1、一般培养法（需氧培养） 2、厌氧培养法 3、CO2培养法
（一）、一般培养法（需氧培养）
培养温度: 25~37℃
四、微生物培养特性观察与记录
在固体培养基上，观察：菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等；
在液体培养中：表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。
半固体培养基穿刺接种：观察运动、扩散情况。
思考题
1什么是无菌技术？
2如何做好无菌室的消毒和防污染工作？
3如何做好超净台的使用与保养？
4无菌操作的目的是什么？
5进入无菌室前要做好哪些准备工作？
6验操作过程的无菌操作要求包括哪些内容？
第四章 微生物的生化试验和血清学试验
第一节 细菌的生化试验
一、概述
（一）、什么是生化试验?
指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。
（二）检验细菌的生化试验范围
1糖（醇）类代谢试验2氨基酸和蛋白质代谢试验3有机酸盐和铵盐的利用试验4呼吸酶类试验5毒性酶类试验
（三）生化试验的方法
1.在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的PH值变化。 2在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。
3.根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。
4.根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。
（四）生化试验的注意事项
1、待检菌应是新鲜培养物。培养18~24h。
2、待检菌应是纯种培养物。
3、遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。
4、应做必要的对照试验。
5、提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进行试验。
二、糖醇类代谢试验
（一）糖醇类发酵试验
（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验
（三）V-P试验
（四）甲基红（Methyl Red）试验 MR
（五）七叶苷水解试验
（六）甘油品红试验
（一）糖醇类发酵试验
1.原理：
不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇），有的只能分解1~2种糖醇，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。
常用的糖醇
单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖
双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖
三糖：棉子糖
多糖：菊糖、肝糖、淀粉
醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇
2、试验方法：
用接种针或环移取纯培养物少许，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃培养1~3天，每天观察结果。
3、结果观察和记录
记录：
.产酸不产气，阳性，以“+”表示
.产酸产气，阳性，以“⊕”表示
.不产酸产气，阴性，以“-”表示
（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验
1、原理：
细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。
氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；
发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；
不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。
根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。
2、方法
.取待检菌，以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上，在其中一管加入一层（约1Cm）灭菌的液体石蜡以隔绝空气，在37℃培养2~4天，每天观察结果。
3、结果观察与记录
（三） V-P试验
1、原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。
某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。
.主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。
. 本试验常与MR试验一起使用，一般情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。但肠杆菌科细菌不一定都这样规律，如蜂房哈夫尼亚菌和奇异变形杆菌的VP试验和MR试验常同为阳性。
3、结果观察与记录
（1）发酵管出现红色者，为阳性，记 V-P +
（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记 V-P-
（四）甲基红试验（MR）
1、原理
细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降至 pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液 pH较高，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。
2、试验方法：
挑取新鲜的待试培养物少许，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃或30℃（以30℃较好）培养3~5天，从第48h起，每日取培养液1ml，加入甲基红指示剂1~2滴，立即观察结果。
3、结果观察与记录
（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR +；
（2）呈橘黄色或黄色为阴性，记 MR -，迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。
复习题
1、什么是生化试验?
2、做生化试验要注意哪些事项？
3、简述糖醇类发酵试验的原理，写出其试验方法和结果的记录
5、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结果的记录
三、氨基酸和蛋白质代谢试验
（一）靛基质（吲哚）试验
（二）H2S试验
（三）尿素酶试验
（四）氨基酸脱羧酶试验
（五）苯丙氨酸脱氨酶试验
(六)明胶（Gelatin）液化试验
（一）靛基质试验
1、原理：某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。
2、试验方法：
所用试剂:
（1）柯凡克(Kovacs)试剂;或（2）欧—波试剂
将待检菌小量接种于培养基中，于 36±1℃培养24~48h时后，加入柯凡克试剂数滴，轻摇试管，呈红色者为阳性。或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约 0.5ml覆盖液面两液接触处呈现玫瑰红色者，为阳性反应，无红色者为阴性反应。
3、结果观察与记录
呈现玫瑰红色，为阳性反应，记+
无红色者，为阴性反应，记-
（二）硫化氢（H2S）试验
1、原理：
某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物 PbS或FeS，以此鉴别细菌。
2、试验方法：
挑取待检菌，用穿刺接种法接种于三糖铁培养上，于36±1℃培养 24~48h，观察结果。
3、结果观察与记录
.培养基底部呈黑色，为阳性，记+
.培养基底部无黑色，为阴性，记-
（三）尿素酶试验
1、原理：
某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。
2、试验方法：
挑取大量培养18~~24h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。
3、结果观察与记录
.培养基变呈粉红色，为阳性，记 +
.培养基颜色不变，为阴性，记 -
复习题
1、简述靛基质试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项
2、简述硫化氢试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项
四、有机酸盐和铵盐的利用试验
1枸橼酸盐利用试验
2丙二酸盐利用试验
（一）枸橼酸盐利用试验
1、原理：
某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。
2、试验方法
挑取待检菌，在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种，在36±1℃培养1~4天，每天观察结果。
3、结果观察与记录
.斜面有菌苔生长，培养基斜面变为蓝色或深蓝色，为阳性，记+；
.无菌苔生长，培养基斜面仍为绿色者，为阴性，记-;
五、呼吸酶类试验
1.氧化酶试验 2.过氧化氢酶试验 3.硝酸盐还原试验 4.氰化钾试验
（一）氧化酶试验
1.原理:
氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和α-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。 试剂 ：1% α-萘酚-乙醇液 、1%盐酸二甲基对苯二胺
2、试验方法
用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺试剂1~2滴在培养物上,再加入1% α-萘酚-乙醇液1~2滴,在30秒内判定试验结果。
3、结果观察与记录
.在30秒内呈蓝色反应,为阳性,记 +
.不变色或为红色者,为阴性,记 -
（二）过氧化氢酶试验
1.原理：
某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。
2、试验方法
.挑取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。
（四）氰化钾试验
1.原理：
氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌.
2、试验方法
取培养20～24h的营养肉汤培养液或菌落1环，接种至对照培养基及氰化钾培养基内，立即以橡胶塞塞紧， 36±1℃培养24～ 48h，观察结果。
3、结果观察与记录
.对照管有菌生长，试验管有菌生长为阳性，记+。
.对照管有菌生长，试验管无菌生长为阴性。记-。
七、三糖铁（TSI）试验
1、三糖铁试验的原理
如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。
如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。
2、试验方法
以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置 36±1℃培养18~24h，观察结果。
1、该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1
2、只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。
3、发酵乳糖的细菌，产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如培养基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。
4、志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S。沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S，多数产气。
思考题
1.志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。在培养基上应该产生什么现象？
2.大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S。在培养基上应该是什么现象？
3.沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S，多数产气，在培养基上应该是什么现象？
复习题
1、什么是生化试验?
2、做生化试验要注意哪些事项？
3、简述糖酵解试验的原理，写出其试验方法和结果的记录
4、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结果的记录
5、简述靛基质（Imdole）(吲哚)试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项
6、简述硫化氢（H2S）试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项
第二节血清学试验
血清学反应：
指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，所出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。
第五章 食品微生物检验的基本程序
本章的主要内容
一、食品微生物检验的一般步骤 二、检验前的准备 三、样品的采集 四、样品的送检
五、样品的处理方法 六、致病菌检验参考菌群的选择 七、样品的检验 八、检验结果的报告
一.食品微生物检验的一般步骤
二.检验前的准备
1.准备好所需的各种仪器。
2.按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。
3.准备好所用的各种试剂，做好普通营养琼脂或其他选择必培养基。
4.做好无菌室或超净工作台的灭菌工作，提前1h灭菌30~60min.
5.工作衣、鞋、帽、等灭菌后备用。
6.工作人员进入无菌室后，实验没有完成之前不得随便出入无菌室。
三.样品的采集
（一）采样的目的和意义
1.便于食品卫生质量监督管理
2.鉴别食品中是否存在有毒有害物质。
3.为新产品、新资源利用、新食品化工产品、新工艺投产前进行卫生鉴定。
（二）样品的种类
1.大样，就是一整批；
2.中样，是从样品中各部分取得的混合样品，一般为200g；
3.小样，也称检样，做分析用的，一般为 25g。
（三）采样的步骤
采样前调查→现场观察→确定采样方案→采样 →样品封存 →开具采样证明
（四）采样的要求
1、严格遵守样品采集的操作规程。
2、所采样品必须具有代表性。
3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。
4、不得加入防腐剂、固定剂等。
5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加。
（五）食品微生物检验的采样方案
1、食品卫生学微生物检验的取样方案
检验目的：检验食品的微生物卫生指标是否合格。
取样方案有：
① ICMSF取样方案；
②美国FDA的取样方案；
③世界粮农组织（FAO）取样方案；
④我国的食品取样方案。
2、食物中毒微生物检验的取样
检验目的：查找食物中有何病原菌。
3、人畜共患病病原菌检验的取样
检验目的：鉴定畜禽及其产品是否带有人兽共患的病原菌。
（六）食品微生物检验采样方法
采样原则：上能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取样.
1、液体样品采样方法
充分混匀后，无菌操作打开包装，用10mL无菌注射器抽取,注入无菌盛样容器.
2、半固体样品采样方法
.无菌操作打开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。
3、固体样品采样方法.
大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，并注意其代表性；
. 小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。
. 若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。
4、冷冻食品采样方法
.大包装小块冷冻食品按小块个体采取；
.大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。 .若为检验食品污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质情况，应从深部取样。
5、生产工序监测采样
① 车间用水：从车间各龙头采样；
② 车间台面、用具、及加工售货员手的卫生监测：用5cm2孔无菌采样板和5支无菌棉签擦拭25cm2面积，擦拭后立即用无菌剪刀将棉签头剪入无菌容器中。
③ 车间空气采样：将5个直径90mm的普通琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖 5min，然后盖盖送检。
（七）采样标签的填写
标签内容主要：
编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。
四.样品的送检要求
1、要快速运送：不要超过3小时；
2、若路途遥远，可在1~5℃低温下运送；
3、要注意防污染、防散漏、防变质；
4、要填写检验申请单。
五.样品的处理方法
（一）液体样品 （二）固体样品 （三）冷冻样品
(一)液体样品的处理
1.瓶装液体样品的处理
2.盒装或软塑料包装样品的处理
1.瓶装液体样品的处理
用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入 500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样 25mL检验。
2.盒装或软塑料包装样品的处理
将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品 25mL，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。
（二）固体样品的处理
1捣碎均质法 、2碎振摇法 、3研磨法 、4整粒振摇法 、5胃蠕动均质法
1.捣碎均质法
将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，8000~10000r/min均质1~2min即可。
2.剪碎振摇法
将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带 225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。
3.研磨法
将中样(≥100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。
4.整粒振摇法
直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶
中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。
（三）冷冻样品
冷冻样品，先将中样在0~4℃下解冻，时间不能超过18h，或在45 ℃下解冻，时间不能超过15min。再取检样25g做稀释处理。
六.致病菌检验参考菌群的选择
蛋及蛋制品：沙门氏菌、葡萄球菌、变形杆菌等
水产品海产品：链球菌、副溶血性弧菌
乳制品：沙门氏菌、志贺氏菌、葡萄球菌、链球菌、 蜡样芽胞杆菌
畜禽肉类：肠道致病菌和致病性球菌
米面类：蜡样芽胞杆菌、变形杆菌、酵母霉菌等
罐头：耐热性芽胞杆菌、嗜热脂肪杆菌、大芽胞杆菌、凝值芽胞杆菌
七.样品的检验
（一）、收样：
1、收到样品后逐一核对验收，登记编号；
2、立即将样品放在冰箱或冰盒中，并积极做好准备工作。极做好准备工作。
（二）、检验
1、选择检验方法：
国内：国家标准
国外：国际标准：如FAO标准、WHO标准；
每个进口国的标准：如美国FDA标准、日本厚生省标准、欧共体标准等
2、检验要求
（1）按照标准操作规程进行检验操作，边工作边做原始记录。
（2）检测结束，连同结果一起交同条线技术人员复核。复核过程中发现错误，复核人应通知检测人更正，然后重新复核。
（3）检测人和复核人在原始记录上签名，并编写 “检测报告底稿”
（4）所有检测项目完成后，检测人员将原始记录、样品卡、报告书底稿交科主任作全面校核。
3、样品的保留
（1）阴性样品：在发出报告可及时处理；
（2）阳性样品：在发出报告以后3天才能处理样品；
（3）进口食品的阳性样品：要保留6个月才能处理。
（4）微生物检验不进行复检
八、检验结果的报告
1. 经审核后的报告底稿、样品卡、原始记录，上交打印正式报告二份。
2. 将报告正本交审核人及批准人签名，并在报告书上盖上“检验专用章”CMA章和中心公章后对外发文。
3.收文科室或收文人要在检测申请书上收件人一栏内签字，以示收到该报告的正式文本。
4. 在报告正式文本发出前，任何有关检测的数据、结果、原始记录都不得外传，否则作为违反保密制度论处。
复习题
1、在微生物检验中，检验前要做好哪些准备工作？
2、在微生物检验中，采样时要遵守哪些要求？
3、在微生物检验中，样品的送检有哪些要求？
4、在微生物检验中，如何进行样品的保留？
第六章 食品的卫生细菌学检验
二、菌落总数测定的意义
1、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量、判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。。
2、预测食品存用的期限长短。、预测食品存用的期限长短。
3、了解细菌在食品中的繁殖动态。、了解细菌在食品中的繁殖动态。
三、菌落总数测定的方法
平板倾注法平板倾注法、平板表面涂布法平板表面涂布法、平板表面点滴法平板表面点滴法
四、平板倾注法测定菌落总
检验步骤检验步骤(程序程序)：
检样检样→稀释处理→做平板→培养→菌落计数→报告结果
（一）、样品稀释及做平板
检样从开始稀释到倾注最后一个平皿检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。
（二）培养
普通食品普通食品:37℃ 48h倒放平板
清凉饮料、调味品、糕点、酒类： 37℃ 24h
水产品: 30℃ 48h
（三）计数和报告
到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过 24h。
1、菌落的选择、菌落的选择
（1）单个菌做一个菌落计
（2）呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算。
（3）如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。
2、平板菌落计数的选择
（1）选取菌落数在30～300之间的平板之间的平板（SN标准要求为25～250个菌落），若有二个稀释度均在30～300之间时，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较则其较小数字。
（2）如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数，乘以稀释倍数报告
（3）如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘，稀释倍数报告
（4）如菌落数有的大于300，有的又小于，有的又小于30，不在30～300之间，以最接近之间，以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告
（5）如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。
3、菌落数的报告
菌落数在1～100时，按实有数字报告，
1)如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算
2)固体检样以克（g)为单位报告，为单位报告，
3)液体检样以毫升（ml）为单位报告，
4)表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。
(四)、检验注意事项
1、对照平板出现几个菌落时，要追加对照平板；
2、吸管进出瓶子或试管时，吸管口不得触及瓶口、管口的外围部分；
3、吸管插入试样液内的深度不得小于2.5cm,调整时要使管尖与容器内壁紧贴时;
4、进行稀释时,吸管口不得与稀释液接触;
5、检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min.
6、稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，不可作为检样计数报告的依据。
复习题
1、什么是菌落总数？
2、测定食品、饮料等产品的菌落总数有什么意义？
3、在测定菌落总数时，如何选择菌落进行计数？
5、在菌落总数的检验中，要注意哪些事项？
6、在菌落总数的检验中，如何根据样品的特性选择培养温度和时间？
第二节食品中大肠菌群的检验
一、大肠菌群
1、什么是大肠菌群？
指一群需氧及兼性厌氧，在37℃能分解乳糖产酸、产气的革兰氏染色阴性无芽胞杆菌。
2、大肠菌群的组成:
大肠埃希氏菌发属、柠檬酸杆菌属、产气克雷伯氏菌属和阴沟肠杆菌。
11、粪便污染的指标菌：、粪便污染的指标菌：
大肠菌群或大肠杆菌大肠菌群或大肠杆菌
二、大肠菌群的测定意义
1、粪便污染的指标菌：
大肠菌群或大肠杆菌
2、以大肠菌群作为粪便指标菌原因
1)在粪便中数量最大；
2)在外环境中存活的时间与致病菌大体相同；
3)检测方法简便容易。
3、大肠菌群的测定意义
（1）、判断食品中否受到粪便污染。
（2）、有利于控制肠道传染病的发生和流行。
（3）、有利于控制食品在生产加工、运输、保存等过程中的卫生状况。
三、大肠菌群的生物学特性
1.形态与染色：革兰氏染色阴性，无芽胞杆菌。
2.发酵乳糖产酸产气
3.培养特性：在ＥＭＢ琼脂上的典型菌落培养特性：呈深紫黑呈深紫黑色或中心深紫色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表色光滑，常有金属光泽；
在麦康凯琼脂上的典型菌落:呈桃红色或中心桃红、圆形，扁平，光滑湿润
大肠杆菌、大肠菌群选择性显色培养基--COLI ID：用于在37℃下对食品中大肠菌群和大肠杆菌进行检测、计数及大肠杆菌的鉴定
四、大肠菌群检验方法及操作方法
国家标准：
三步法：乳糖胆盐发酵试验→分离培养→证实试验(乳糖发酵试验)
行业标准：
两步法：推测试验→证实试验
五、粪大肠菌群的检验
粪大肠菌群粪大肠菌群：系一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24h内能发酵乳糖产酸产
六、检验注意事项
1、从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
2、对产酸但未看到气泡的乳糖发酵，用手轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，应作进一步试验。
3、挑选菌落进行证实试验时，最少要挑2个以上的典型菌落或非典型菌落进行接种。
4、不可用其他胆盐代替指定的胆盐。
第七章 肠道致病菌的检验与鉴定
第一节 概述
一、食品中常见的肠道致病菌：沙门氏菌
二、生物学特性
1、形态与染色
均为革兰氏阴性杆菌，中等大小，无芽胞，多数具有周身鞭毛，能运动，志贺氏菌属无鞭毛无动力。
2、培养和生化反应
（1）、需氧或兼性厌氧，菌落中等大小，表面光滑，液体培养基混浊生长。
（2）、肠道致病菌一般不分解乳糖，而非致病菌多能分解乳糖、葡萄糖产酸或产酸产气。
（3）、可还原硝酸盐为亚硝酸盐。
三、抗原类型
四、致病性
（一）、致病物质
1、内毒素：能引起机体发热，白细胞减少，低血糖，血压降低，严重者休克。
2、外毒素：对小肠粘膜细胞具有物殊毒害作用，引起腹泻。
（二）、所致病疾
1、伤寒和副伤寒 、2、食物中毒 、3、细菌性痢疾
五、微生物检验的基本程序
检样→处理→增菌培养→分离培养→生化试验→血清学鉴定→报告
思考题
1、肠道致病菌具有哪些生物学特性?
2、肠道致病菌具有哪些抗原？又称为什么？有什么特点？
3、写出肠道致病菌检验的基本程序
第二节、沙门氏菌检验
一、概况
（一）沙门氏菌的发现与食物中毒
（二）沙门氏菌的命名
根据所致疾病命名、根据菌的发现地区命名、以发现者的名字命名
（三）沙门氏菌的抵抗力
60℃30′可杀死
（四）沙门氏菌的分类地位及定义
1、地位：是肠杆菌科、埃希氏菌族、沙门氏、菌属中的细菌
2、定义：是肠杆菌科中形态和培养特征，生化反应及抗原结构相似，被O1噬菌体裂解的一群革兰氏阴性杆菌。
二、生物学特性
（一）、形态与染色：
革兰氏染色阴性，无荚膜，无芽胞，多数有鞭毛，有动力，短小杆菌。
（二）、培养特性
1、需氧或兼性厌氧，最适温度37℃，PH7.2~7.4
2、对营养要求不高，在普通培养基生长良好，37℃，24h，能形成菌落中等大小，直径2～3mm，圆形或卵形，表面光滑湿润，无色半透明，边缘整齐的菌落
（三）、生化特性
1、发酵GLU，甘露醇，山梨醇产酸产气（伤寒鸡伤寒沙门氏菌少数不产气）
2、不发酵乳糖，蔗糖，侧金黄花醇
3、多数产生、多数产生H2S（+），不产靛基质（-），不分解尿素（-），不产生乙酰甲基甲醇（V—P）（-），
4、能还原硝酸盐为亚硝酸盐（+）
5、在KCN培养基中生长（-），苯丙氨酸脱氨酸（-）
（四）、抗原结构
主要两种：A、O抗原 B、H抗原 C、表面抗原（K抗原） D、菌毛抗原
2、O抗原
（1）O抗原的表示方法
共有58种，用字母O和阿拉伯数字标记：O1、O2、O3、O44
如：伤寒杆菌：O9、O12
（2）沙门氏菌的分群及表示方法
用大写字母及相关符号表示：A、B、C、D、E、F„„Z、O51 ~O63、O65~ O67
（3）沙门氏菌中的主要菌群及其群特异性抗原
A群-O2 ；B群-O4；C群-O6 ：C1群-O7、C2群-O6 O8、C3群-O8、C4群-O6 O7 O14 ；D群-O9 ；F群-O11 ；E群-O3 ：E2群-O3、O10族、E3群-O3、O15 、E4群-O1、O3、O19
3、H抗原（鞭毛抗原）
耐热性差：60℃15′或酒精处理可破坏
沙门氏H抗原有两种：
第1相：特异相，用英文小写字母表示相：a、b、c„„z z1~z55
第2相：非特异相，用阿拉伯数字表示：1、2、3„„其中也有用小写字母a、n、x等表示。
4、表面抗原：
沙门氏菌有三种：Vi、M、5抗原、K抗原
Vi抗原位于菌体的最表层，包围了O抗原，可阻碍O抗原的血清学凝集试验。破坏Vi抗原：60℃ 30′，100 ℃5′
含有含有ViVi 抗原的抗原的沙门氏沙门氏菌：菌：
伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌
三、沙门氏菌食物中毒
（一）、引起食物中毒最常见的沙门氏菌：
鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌
（二）、易引起沙门氏菌中毒的食品
肉、蛋、乳类食品
行业关注：美国两种花生酱含沙门氏菌
(三)、中毒原因
1、食用病畜禽的肉制品食品、食用病畜禽的肉制品食品
2、病畜禽、带菌人和动物使食品受污染、病畜禽、带菌人和动物使食品受污染
3、用不洁净水外理食品、用不洁净水外理食品
(三)、中毒原因
1、食用病畜禽的肉制品食品
2、病畜禽、带菌人和动物使食品受污染
3、用不洁净水外理食品
（四）、临床病状（所致病菌）
1、肠热病：伤寒与副伤寒病，为慢性发热的菌血病。
由伤寒与副伤寒菌引起，潜伏期7~20天
2、急性肠胃类：主要症状：头痛、发热、恶心、呕吐、腹泻、出冷汗、及全身不适，病程腹泻、出冷汗、及全身不适，病程2~3天
3、败血病：高烧、寒战、厌食、局部发炎、由猪霍乱沙门氏菌等引起门氏菌等引起
四、微生物检验
（一）、基本步骤（程序）
检样→增菌（前增菌）→分离培养→生化试验初步鉴定→血清学反应最后鉴定→报告
1、前增菌：用无选择性的培养基使处于濒死状态的M恢复活力;
2、选择性增菌：使沙门氏菌优势繁殖，基它细菌变到、选择性增菌抑制;
3、选择性平板分离培养：分离出所需的细菌;
4、生化试验：鉴定分离出来的细菌是否符合所检项目的细菌;
5、血清学鉴定：进一步鉴定。
（二）、检验操作关键点
1、增菌：使待检菌复壮，抑制杂菌生长，提高检出率。
前增菌：用于加工过的食品，37℃4~8h或18~24h，长有杂菌。
增菌培养基：增菌液一般用增菌培养基：MM和SC两种，如可能是伤寒沙门氏菌用TTB，用42℃培养。
2、平板分离
选择性培养基BS、DHL、HE、WS、SS BS中最好，DHL、HE、WS很好，SS最差
一般要用：BS和WS/SS两个平板，BS主要用于伤寒沙门氏菌的分离
3、五项生化试验
H2S、靛基质、PH7.2尿素酶、KCN、赖氨酸脱羧酶
（1）三糖铁培养的培养
典型沙门氏菌在三糖铁培养上的特征：
表面（-）粉红色、底层（+）黄色、H2S （+）底层有黑色、动力。
在TSI培养基中：表面（+）黄色、H2S （-）的培养物可排除，其它培养物均有可能是沙门氏菌。
（2）其余四项生化实验
靛基质靛基质、PH7.2尿素酶、KCNK、赖氨酸脱羧酶
反应序号A1A2多见，B1少见
（3）、典型沙门氏菌的五项生化反应及其检验的利用
A、典型五项生化反应：A1
H2S（+）靛基质（-）PH7.2尿素酶（-）KCN（-）赖氨酸脱羧E（+）
B、利用五项生化反应鉴定沙门氏菌的最简单方案
a、对于H2S阳性菌，利用五项生化反应试验可判别沙门氏菌和柠檬酸杆菌。
b、对于H2S阴性菌，查到B1时即：
H2S（-）靛基质（-）PH7.2尿素酶（-）KCN（-）
赖氨酸脱羧E（+），补做ONPE试验，可判定沙门氏菌属和埃希氏菌属（ONPE（-）为沙门氏菌，ONPE（+）大肠艾希氏菌
5、血清学试验（最后鉴定）
（1）、沙门氏菌诊断血清的种类：）
10种组合血清：主要用于伤寒和副伤寒沙门氏菌鉴定
26种组合血清：常见致病菌的定群与分型
57种组合血清：常见定型，初步鉴定A—F群以外的菌型
144种组合血清：全套装
（2）、血清学检验步骤
抗原准备→A-F多价血清检验（判定是否是沙门氏菌）→群特异性抗体血清（如O2、O4、 O3、O7、O8、O9、O10、O11（判定O群别）→O单因子血清检查→H因子血清检查（分型）→报告
五、检验结果的报告
1、凡血清学鉴定与生化反应均符合者，报告发现沙门氏菌。
经检验××××食品发现有沙门氏菌
2、凡血清学鉴定与生化反应均不符合者，报告未发现沙门氏菌。
思考题：
1、典型沙门氏菌的五项生化试验结果如何？
2、沙门氏菌的形态特征，培养特性是什么？
3、沙门氏菌检验时为什么要进行前增菌和增菌？
4、沙门氏菌有哪些抗原？各有何特点？O、H抗原如何表示，A—F群沙门氏菌中，代表每群O特异性抗原的独特因子是什么？
第八章 食品中霉菌、酵母菌数的测定
一、检验程序
检样→处理→稀释→平板分离培养 →菌落计数→报告
二、操作要点
（一）、采样
1、粮食（包括粮库贮粮，粮店或家庭小量存粮)
根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，一般可分三层五点，或分层随机采取不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检。小量存粮可使用金属小勺采取上、中、下各部位的混合样品。
2、海运进口粮、
.每一船仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓盛粮超过10000t，则应加采一个样品。必要时采取有疑问，的样品送检。
3、谷物加工制品(包括熟饭、糕点、面包等)、发酵食品、乳及乳制品以及其他液体 用灭菌工具采集可疑霉变食品250g，装入灭菌容器内送检。
（二）、样品处理（稀释）
1、以无菌操作称取检样、25g(或25mL)，放入含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。
2、用灭菌吸管吸取1∶10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。
3、取1mL1∶10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为1∶100稀释液。
（三）、培养
倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察，共培养5d。
（四）、计数
选取菌落数10～150之间的平板进行计数。（稀释度选择和菌落报告方式参考菌落总数的测定）